Quimotripsina

INSTITUTO TECNOLÓGICO DE TEPIC

DEPARTAMENTO DE INGENIERÍA QUÍMICA Y BIOQUÍMICA

CINÉTICA QUÍMICA BIOLÓGICA UNIDAD 4: CINÉTICA ENZIMÁTICA.

QUIMOTRIPSINA

PRESENTA:

AVEDOY CORTÉZ ISIS. CÁRDENAS CASTRO ALICIA PAULINA. FLORES JIMÉNEZ NITZIA THALÍA. LÓPEZ MONTEÓN CYNTHIA JAZMÍN.

M.C. SALVADOR YUNIOR AGUILAR RAMÍREZ.

Isis Avedoy Cortéz; Alicia Paulina Cárdenas Castro; Nitzia Thalía Flores Jiménez; Cynthia Jazmín López Monteón.

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Quimotripsina

INTRODUCCIÓN
Las enzimas son catalizadores específicos que participan y tiene vital importancia en la regulación química de las células y los organismos. La catálisis es esencial para hacer que muchas reacciones bioquímicas y biológicas de importancia crucial se produzcan en condiciones fisiológicas a velocidades útiles y de la manera correcta. La vida aprovecha hábilmente el hecho de que la mayoría de las reacciones deban estar catalizadas. En el complejo medio de la célula, hay innumerables reacciones posibles entre las moléculas. La célula se aprovecha de la catálisis específica para canalizar las sustancias hacia rutas que sean útiles en vez de reacciones colaterales despilfarradoras. Las enzimas son, entonces, unas moléculas esenciales para la buena salud producidas por el cuerpo. A cada instante millones de ellas trabajan en el organismo para que podamos respirar, saltar o comer. Un grupo muy importante de enzimas son las digestivas ya que favorecen la digestión y absorción de los nutrientes a partir de los alimentos que ingerimos. El páncreas también participa en la digestión y absorción de los alimentos mediante la secreción de enzimas al intestino conocidas como las enzimas pancreáticas. En la degradación de proteínas, en el aparato digestivo de mamíferos y de otros organismos, participan un cierto número de enzimas proteolíticos 1. Una de estas enzimas es la quimotripsina; esta es una enzima digestiva (proteasa pancreática) que rompe selectivamente los enlaces peptídicos contiguos al extremo carboxilo de aminoácidos hidrofóbicos voluminosos, como triptófano, tirosina, fenilalanina y metionina. La quimotripsina es secretada por el páncreas como un precursor inactivo llamado quimotripsinógeno, el cual forma parte del jugo pancreático. El quimotripsinógeno (quimotripsina inactiva) es enviado a través del ducto pancreático al duodeno (intestino delgado) donde es activado como quimotripsina.

Isis Avedoy Cortéz; Alicia Paulina Cárdenas Castro; Nitzia Thalía Flores Jiménez; Cynthia Jazmín López Monteón.

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Cynthia Jazmín López Monteón. Nitzia Thalía Flores Jiménez. 3 . Alicia Paulina Cárdenas Castro. Isis Avedoy Cortéz.Quimotripsina Esto último es una de las características más interesantes de esta enzima y es tan sólo un poco del amplio estudio que se le ha hecho a la quimotripsina.

Figura 1: Resumen de las Clases enzimáticas y de las principales Subclases (Devlin. Isis Avedoy Cortéz. Nitzia Thalía Flores Jiménez. El grupo al que pertenece la quimotripsina se presenta (desglosa) en el diagrama 1. Serina Proteasas Diagrama 1: Clasificación de la quimotripsina. Cynthia Jazmín López Monteón. Alicia Paulina Cárdenas Castro. 2004). Hidrolasas •Su acción consiste en transferir el grupo escindido del sustrato al hidroxilo del agua. las enzimas se clasifican de manera general en seis grupos.Quimotripsina CLASIFICACIÓN Para comenzar con la amplia descripción de la quimotripsina es necesario primero conocer la clasificación de esta enzima. •Se sintetizan en una forma inactiva denominada zimógeno. en la figura 1 se muestra dicha clasificación. Pertenece a este grupo la quimotripsina. 4 . Peptidasas2 (Proteasas) •Enzimas que hidrolizan enlaces peptídicos.

posee un significado adicional como miembro de una familia importante de proteínas (Stryer. Para introducir al grupo de las serina proteasas.Quimotripsina Serina proteasas. Nitzia Thalía Flores Jiménez. hecho este que tiene poca importancia fisiológica. químicas. La mayoría de las serina proteasas tienen unas estructuras tridimensionales semejantes y una relación evolutiva evidente. una enzima digestiva. Alicia Paulina Cárdenas Castro. 5 . la trombina. Isis Avedoy Cortéz. 1995). Quimotripsina. Las regiones del lugar activo de todas las serina proteasas tienen diversos factores comunes. el porqué de su denominación es importante. Estas enzimas se denominan proteasas porque catalizan la hidrólisis de los enlaces peptídicos en los polipéptidos y las proteínas. Cynthia Jazmín López Monteón. Cada una de las serina proteasas corta preferentemente una cadena polipeptídica en el lado carboxilo de aminoácidos específicos. físicas y genéricas (Voet. 2009). En concreto. Algunos miembros de la familia de las serina proteasas son la tripsina. Se denominan serina porque tiene un mecanismo catalítico común caracterizado por la posesión de un residuo Ser peculiarmente reactivo que es esencial para su actividad enzimática. Las serina proteasas constituyen la familia de enzimas comprendida en su totalidad como resultado de su examen extenso en un período de casi 50 años por técnicas cinéticas. un residuo de histidina y un residuo de serina agrupados alrededor de la depresión del lugar activo. Las serina proteasas hidrolizan también una amplia gama de ésteres. la cual. Es la naturaleza de este bolsillo lo que le da a cada serina proteasa su especificidad (Mathews. pero que los bioquímicos utilizan en los estudios cinéticos. Una cuarta característica del lugar activo difiere de una serina proteasa a otra. siempre existe un residuo de aspartato. una enzima de la coagulación y la quimotripsina. 2006). Se trata de un “bolsillo” que está situado siempre cerca de la serina del lugar activo.

El papel biológico de la quimotripsina consiste en catalizar la hidrólisis de proteínas en el intestino delgado. el cual es profundo y estrecho. El bolsillo de la quimotripsina está recubierto de residuos hidrófobos para acomodar una cadena lateral hidrófoba como la de la fenilalanina (figura 4). Nitzia Thalía Flores Jiménez. Esto es lo mencionado como “bolsillo” (lugar activo) en las serina proteasas. La quimotripsina contiene varias regiones de hojas plegadas β antiparalelas y una s pocas de hélice α. La quimotripsina está constituida por tres cadenas polipeptídicas conectadas mediante dos puentes disulfuro intercatenario3. Alicia Paulina Cárdenas Castro. En la quimotripsina. La molécula es un elipsoide compacto de dimensiones 51 x 40 x 40 Å. Isis Avedoy Cortéz. Los residuos que se encuentran en la quimotripsina (características de las serina proteasas) son: Asp 102. importantes se La quimotripsina es selectiva para los enlaces peptídicos contiguos al extremo carboxílico de las cadenas laterales aromáticas de tirosina. el bolsillo es más ancho en comparación con el de la tripsina. Figura 2: Estructura tridimensional de la quimotripsina.Quimotripsina La quimotripsina es un enzima digestivo de 25 kD. triptófano y fenilalanina de grandes residuos hidrofóbicos como la metionina. CARACTERÍSTICAS DE LA ENZIMA. La estructura tridimensional del enzima fue resuelta por David Blow con una resolución de 2 Å (figura 2). 6 . con un carboxilato cargado negativamente en su parte inferior. Los residuos catalíticamente señalan en color. His 57 y Ser 195 (figura 3). Cynthia Jazmín López Monteón.

El bolsillo del lugar activo se encuentra situado inmediatamente por debajo y a la derecha de la Ser 195 Figura 4: Bolsillos de los lugares activos de las serina proteasas. Nitzia Thalía Flores Jiménez.Quimotripsina Figura 3: Estructura de la quimotripsina. Cynthia Jazmín López Monteón. Proteasas pancreáticas: Activación mediante ruptura: Zimógenos. Alicia Paulina Cárdenas Castro. Isis Avedoy Cortéz. Los aminoácidos cruciales del lugar activo se indican en rojo y azul. 7 .

se elaboran en forma de moléculas ligeramente más grandes. Este cambio desencadena a su vez otros Isis Avedoy Cortéz. es una enzima activa. en respuesta a una señal hormonal generada cuando el alimento sale del estómago. y se segregan a través del duodeno del intestino delgado. grupo al que pertenecen diversas enzimas como la tripsina. Cynthia Jazmín López Monteón. que es el adyacente al lugar activo Ser 195 (véase figura 3). que también está. En el primer paso. Todas se sintetizan en el páncreas. denominadas zimógenos. Alicia Paulina Cárdenas Castro.quimotripsina.Quimotripsina Un tipo completamente distinto de activación enzimática covalente. Los zimógenos deben romperse proteolíticamente en el intestino para producir enzimas activas. proelastasa. protegido por su superficie glucosilada. de alguna manera. Este residuo desplaza su posición y forma un puente salino con Asp 194. Estas enzimas se degradan tras haber cumplido sus fines. catalíticamente inactivas. elastasa. puesto que una batería de potentes proteasas libres en el páncreas causarían una digestión del jugo pancreático. 8 . Nitzia Thalía Flores Jiménez. La activación del quimotripsinógeno a quimotripsina es uno de los ejemplos más complejos y mejor estudiados de la activación proteolítica de un enzima. por lo que no ponen en peligro el tejido intestinal. carboxipeptidasa y la quimotripsina. la ruptura proteolítica. En su lugar. La ruptura del enlace peptídico entre los residuos 15 y 16 crea un nuevo residuo N-terminal cargado positivamente en Ile 16. El producto. procarboxipeptidasa y quimotripsinógeno respectivamente. Los nombres que se dan a los zimógenos de las enzimas citadas anteriormente con tripsinógeno. denominado π. Sin embargo. puede describirse mediante el ejemplo de las proteasas pancreáticas. La forma en que la ruptura de un enlace peptídico transforma una proteína totalmente inactiva en una activa puede comprenderse ahora como resultado de los estudios de difracción de rayos X detallados del zimógeno y la enzima. El quimotripsinógeno está constituido por una sola cadena polipeptídica de 245 restos que se mantiene unida mediante cinco puentes disulfuro intracatenarios. no se sintetizan en su forma final activa. la tripsina rompe el enlace entre la arginina 15 y la isoleucina 16. El péptido N-terminal continúa unido al resto de la molécula debido al enlace disulfuro entre los residuos 1 y 122.

la histidina 57 y la serina 195. Estos cambios incluyen el modelado correcto del bolsillo del lugar activo y el movimiento de los grupos amino de la cadena principal de los residuos 193 y 195 a un lugar en el que puedan establecer enlaces de hidrógeno con el sustrato oxianión (átomo de oxígeno carbonílico cargado negativamente) en el estado de transición tetraédrico. los dos restos específicos que son esenciales para la actividad catalítica. La quimotripsina activa producida por este método está constituida por tres cadenas polipeptídicas que se mantienen unidad mediante dos puentes –S-S-. para producir la α-quimotripsina final. es capaz de digerir finalmente la mayor parte de las proteínas ingeridas a aminoácidos libres. tanto el bolsillo de unión como el lugar catalítico se forman correctamente sólo después de que se haya roto el enlace peptídico entre Arg 15 y Ile 16. tripsina. de manera que nunca llegan a acumularse concentraciones Isis Avedoy Cortéz.Quimotripsina reordenamientos conformacionales en la proximidad del lugar activo. 9 . Cynthia Jazmín López Monteón. se hallan situados en dos cadenas diferentes. mediante análisis por rayos X de la estructura terciaria de la quimotripsina. y autodigestión. 1991). Esta batería de enzimas. gracias a la acción consecutiva de la tripsina y de la quimotripsina. Así. La quimotripsina no está completamente “terminada” con esta ruptura. que es la forma principal y totalmente activa de la enzima que se encuentra en el tubo digestivo (Mathews. Así pues. en la figura 6 se muestra la representación lineal de la conversión del quimotripsinógeno en quimotripsina. 2009). Las propias enzimas están sometidas continuamente a una digestión mutua. El quimotripsinógeno se convierte en -quimotripsina activa por la hidrólisis enzimática de cuatro enlaces peptídicos. que pueden absorberse por el epitelio intestinal. que ambos restos se hallan realmente muy próximos en la conformación del enzima nativo (Lehninger. carboxipeptidasa y quimotripsina. elastasa. Se producen nuevas rupturas autocatalíticas que eliminan de la molécula los residuos 14-15 y 147-148. se ha podido establecer directamente. en esta hidrólisis se liberan dos dipéptidos. Sin embargo. Alicia Paulina Cárdenas Castro. junto con la pepsina del estómago y otras proteasas secretadas por las células de la pared intestinal. En la figura 5 se muestra la activación del quimotripsinógeno. Nitzia Thalía Flores Jiménez.

2009). Figura 6: Representación del lineal de la a conversión quimotripsina. Una serie de rupturas dan lugar a la enzima quimotripsina. Figura 5: Esta figura muestra esquemáticamente la molécula de quimotripsinógeno. incluso los zimógenos inactivos son una posible fuente de peligro para el páncreas4 (Mathews. Alicia Paulina Cárdenas Castro. 10 .Quimotripsina elevadas de estas enzimas en el intestino. Nitzia Thalía Flores Jiménez. quimotripsinógeno MECANISMO DE ACCIÓN Isis Avedoy Cortéz. La posterior eliminación de los segmentos que se indican en negro produce α-quimotripsina. con los enlaces disulfuros que continúan manteniendo la estructura unida. La ruptura inicial entre los aminoácidos 15 y 16 (flecha) da lugar a la formación de π quimotripsina. Cynthia Jazmín López Monteón.

Alicia Paulina Cárdenas Castro. una molécula de agua se coloca entre el grupo Isis Avedoy Cortéz. Las serina proteasas no cortarán. formando el estado de transición tetraédrico (que se muestra en el paso 2 de la figura 7). pues. Los residuos de serina no suelen ser reactivos. En la figura 7 se ilustra cómo se produce la catálisis de la hidrólisis del enlace peptídico por una serina proteasa. por su carga negativa. El protón de la serina se transfiere al anillo de histidina (paso 2). pero la cadena lateral del residuo del lado N-terminal (Ile 16) del enlace peptídico que se va a romper debe ajustarse al bolsillo del lugar activo. Normalmente. estabiliza la protonación del anillo de histidina adyacente. para formar un nuevo grupo amino terminal. dejando en la serina una carga negativa. la cadena lateral se proyectaría en la dirección incorrecta. sino también la esteroespecificidad de las serina proteasas. pero parece facilitarse por Asp 102. Nitzia Thalía Flores Jiménez. que. pero éste se encuentra en un entorno poco habitual. La serina activada es un fuerte nucleófilo y puede atacar al carbonilo del sustrato. La ruptura del enlace peptídico (paso 3) se produce en este estado activado. al igual que muchas proteasas. Esta unión es muy específica de un tipo concreto de aminoácido sitúa a la serina del lugar activo próxima al grupo carbonilo del enlace a romper. la cadena polipeptídica que se rompe se una a la superficie enzimática (paso 1). dado un intermediario acilo-enzima en el que la parte N-terminal del sustrato polipeptídico se une de forma covalente a la enzima. el H2O no ha entrado en acción. ya que está muy próximo a His 57. Este bolsillo define no sólo la posición del corte. La porción C-terminal del polipéptido extrae el protón (que originalmente era el protón de la serina) de la histidina. Esta parte de la cadena del sustrato no está unida por si misma de manera fuerte a la enzima. Si hubiera un aminoácido D en esta posición. 11 . En primer lugar. hidroliza enlaces éster además de los enlaces peptídicos. pero sí lo hace ahora para desplazar la porción C-terminal de la cadena y posteriormente romper el intermediario acilo. cerca de los aminoácidos D. La mayoría de los polipéptidos se unen de manera inespecífica.Quimotripsina La quimotripsina. Cynthia Jazmín López Monteón. En el paso 4. alejándose del receptáculo. Hasta este punto. esta transferencia sería improbable debido a los pKa elevados de los grupos alcohol-OH.

Cynthia Jazmín López Monteón. este enlace de hidrógenos estabiliza dichos intermediarios (Mathews. Isis Avedoy Cortéz. Por último (paso 6) el protón se transfiere desde la histidina de nuevo a la Ser 195 5. que son muy semejantes a los estados de transición esenciales. y el enlace de hidrógeno puede producirse sólo con la formación del estado tetraédrico. que señalan que los protones amino del esqueleto de los residuos Ser 195 y Gly 193 pueden formar enlaces de hidrógeno con uno de los oxígenos del complejo tetraédrico. y que la molécula de agua desempeña el papel de la parte liberada de la cadena polipeptídica. Nitzia Thalía Flores Jiménez. 2009). La enzima vuelve a su estado original y está preparada para catalizar la hidrólisis de otra cadena. Figura 7: Catálisis de la hidrólisis del enlace peptídico por la quimotripsina. Alicia Paulina Cárdenas Castro. en el paso 5 se transfiere un protón a la His 57 y.Quimotripsina acilo y la His 57. ¿Por qué son tan estables? Una posibilidad muy probable surge de los estudios detallados de las estructuras de rayos X de los compuestos intermedios atrapados. Este oxígeno es el que estaba en el carbonilo del sustrato. Obsérvese que este proceso es esencialmente una inversión de la formación del intermediario acilo inicial. La zona indicada en marrón corresponde a la enzima. Una clave de la catálisis de las serina proteasas se encuentra en la estabilidad de los dos estados intermedios tetraédricos. y se libera el resto de la cadena polipeptídica. De esta forma. se une al intermediario acilo para formar un segundo estado de transición tetraédrico. a continuación. 12 .

Isis Avedoy Cortéz. Nitzia Thalía Flores Jiménez. La producción más lenta de p-nitrofenol. El enlace éster del sustrato se rompe. De esta manera. Esta etapa es la denominada de acilación. En general. donde P1 es el fragmento amina (o alcohol) del sustrato. el complejo acetil-enzima para producir ión acetato y regenerar el enzima (figura 10) la producción rápida explosiva inicial de p-nitrofenol corresponde a la formación del complejo acetil-enzima. 1995). el complejo acetil-enzima es lo suficientemente estable para poder ser aislados bajo condiciones apropiadas. en el estado estacionario. E-P2 es un intermediario acil-enzima (Stryer. Uno de los productos. Cynthia Jazmín López Monteón. es mucho más lenta que la primera. en primer lugar. Esta segunda etapa denominada desacilación. es el intermediario covalente y P2 el fragmento ácido del sustrato (figura 11 y 12). En la reacción comentada con anterioridad un grupo acetilo queda unido covalentemente al enzima. seguida por la formación del producto a una velocidad mucho más lenta en régimen de estado estacionario (figura 8). Cuando se emplean grandes cantidades de enzimas se produce una explosión rápida inicial del producto pnitrofenol.Quimotripsina PARÁMETROS CINÉTICOS La quimotripsina cataliza la hidrólisis de enlaces peptídicos o éster en dos etapas distintas. De hecho. 13 . el mecanismo catalítico de la quimotripsina puede representarse por el esquema adyacente. pero eso es lo que determina la velocidad total de hidrólisis de ésteres por quimotripsina. mediante la investigación sobre la cinética de hidrólisis del acetato de p-nitrofenilo. Por ello. La primera etapa es la combinación del acetato de p-nitrofenilo con la quimotripsina para formar el complejo enzimasustrato (ES). E-P2. Alicia Paulina Cárdenas Castro. el grupo ligado a la quimotripsina EP2 es un grupo acilo. El agua ataca entonces. corresponde a la hidrólisis del complejo acetil-enzima para regenerar el enzima libre. Un aspecto característico de este mecanismo es la aparición de un intermediario covalente. el pnitrofenol. Esto fue descubierto. queda liberado de la enzima mientras que el grupo acetilo del sustrato queda ligado al enzima de forma covalente (figura 9).

Alicia Paulina Cárdenas Castro. 14 . Figura 10: Desacilación: hidrólisis del intermediario acetil-enzima. Isis Avedoy Cortéz. Figura 11: Esquema del mecanismo catalítico. Nitzia Thalía Flores Jiménez. Cynthia Jazmín López Monteón.Quimotripsina Figura 8: Al mezclar quimotripsina y acetato de dos p-nitrofenilo fases en se la distinguen formación de p-nitrofenol Figura 9: Acilación: formación del intermediario acetil-enzima en la catálisis por quimotripsina.

Nitzia Thalía Flores Jiménez.Quimotripsina Figura 12: Catálisis covalente en el centro activo de la quimotripsina. 15 . Alicia Paulina Cárdenas Castro. Cynthia Jazmín López Monteón. Isis Avedoy Cortéz.

a un grupo amino α que no esté comprometido en una unión Isis Avedoy Cortéz. y de una base protonada. La velocidad de la hidrólisis por la catálisis enzimática cambia con la variación de la acides del medio reaccionante. Nitzia Thalía Flores Jiménez. La velocidad es máxima para un pH de 7. según la cinética. ambas bases están protonadas. A pH bajo (solución ácida). El análisis secuencial del éster de la enzima demostró que el grupo acetilo del sustrato estaba unido a la Ser 195. la velocidad alcanza un máximo. de la que se cree que es la implicada en la actividad enzimática. Ahora bien. estudios que comprenden la catálisis por medio del propio imidazol.4 (el pH fisiológico) y es más lenta tanto en solución más ácida como más básica. el examen de la conformación de la quimotripsina demuestra que hay un residuo histidina muy cercano a la Ser 195: His 57. de Kb de aproximadamente 3 x 10-5. ambas están libres. que puede aislarse si se detiene la reacción con ácido. ¿Qué hay acerca de la base más fuerte que. El análisis de los resultados experimentales indica lo siguiente: la hidrólisis requiere de la presencia de una base libre. No obstante. por tanto. La hidrólisis alcanza su velocidad máxima cuando la base más débil está mayormente libre y cuando la más fuerte se encuentra casi totalmente protonada. para luego decaer. La Kb de la base más débil iguala la del anillo imidazólico de la histidina y hay pruebas adicionales de que es efectivamente ésta la base: por ejemplo. de Kb alrededor de 10-7. 16 . estaría involucrada en forma protonada? Su Kb se ajusta al grupo amino α de la mayoría de los aminoácidos. hay pruebas de que otros residuos de aminoácidos también son vitales para la acción enzimática. se obtiene una curva con forma de campana: a medida que aumenta el pH.Quimotripsina ¿Cuál es la estructura del éster intermediario que se forma con la enzima? Para dar respuesta a esto se crea una concentración estacionaria apreciable del éster intermediario. esto es. Cynthia Jazmín López Monteón. Alicia Paulina Cárdenas Castro. Si se construye el gráfico de la velocidad de hidrólisis en función del pH de la solución. la enzima reacciona en el grupo –OH de dicho aminoácido en particular. a pH elevado (solución básica).

Estabilización del estado de transición. Luego. la pequeña fracción de moléculas de sustrato que existe con la geometría del estado de transición será convertida rápidamente en producto. Cynthia Jazmín López Monteón. se supone que este grupo amino no debe acetilarse. Alicia Paulina Cárdenas Castro. Cualquier factor que incremente la población de moléculas de sustrato que se asemeja al estado de transición contribuirá a la catálisis. todo el sustrato puede ser convertido rápidamente en producto. (a) (b) Figura 13: Intermedios tetraédricos. Nitzia Thalía Flores Jiménez. por acción de masas. Isis Avedoy Cortéz. 17 . respectivamente. salvo uno: isoleucina 16. Los intermediarios tetraédricos formados se ilustran en la figura 13 (Devlin. De este modo. 2004). Dado que el centro activo fija el estado de transición con una mayor afinidad que el sustrato. la unidad N-terminal de la cadena B. Sin embargo. 1990). sin que se pierda la actividad por completo. sino quedar libre para que pueda protonarse cumpliendo así con su parte de la tarea (Morrison y Boyd.Quimotripsina peptídica. pueden acetilarse todos los grupos amino (libres) en la quimotripsina. (a) Modelo de intermedio tetraédrico #1 que precede a la formación del intermedio de acil-enzima (b) Modelo de intermedio tetraédrico #2 resultante del ataque del agua sobre el intermedio de acil-enzima.

mientras que la hidrólisis de los enlaces peptídicos por la quimotripsina se realiza rápidamente a pH neutro. Nitzia Thalía Flores Jiménez. que se muestra en el paso (b). Alicia Paulina Cárdenas Castro. El intermediario tetraédrico. Cynthia Jazmín López Monteón. está estabilizado por enlaces de hidrógeno con el NH amida de la Ser 195 y la Gly 193. la Hs 57 y la Ser 195 están alineados. El estudio cuantitativo de este efecto conduce a la conclusión de que la hidrolisis del éster se verifica en dos etapas: 1) Quimotripsina + acetato de p-nitrofenilo  acetil-quimotripsina + p-nitrofenol 2) Acetil-quimotripsina + H2O  acetato + quimotripsina En la figura 14 se detalla de manera resumida el mecanismo de acción de la quimotripsina. Isis Avedoy Cortéz. En ausencia de enzimas. 2003). En el paso (f) (el complejo final enzima-producto) se ha roto el enlace entre el oxígeno de la serina y el carbono carbonilo.Quimotripsina En resumen. se forma un intermediario tetraédrico (oxianión). Con el agua actuando como nucleófilo atacante. La His 57. El oxígeno del hidroxilo nucleófilo de la Ser 195 desencadena un ataque nucleófilo sobre el carbono carbonilo. Además. promovida por la catálisis acido-base general en el centro activo (Lehninger. 18 . de períodos de reacción prolongados y de temperaturas elevadas. se cree que facilita esta descomposición. el anillo aromático del residuo de fenilalanina del sustrato está asentado en un bolsillo de unión hidrófobo. 1991). y el enlace peptídico del sustrato tiene un enlace de hidrógeno con los grupos NH amida de la Ser 195 y la Gly 193. El paso (a) de la figura muestra el complejo inicial enzima-sustrato. El Asp 102. se invierten los dos pasos previos. se descompone para formar el intermediario acil-enzima unido covalentemente paso (c). actuando como ácido general. La serina vuelve a formar un enlace de hidrógeno con la His 57 (Mckee. En los pasos (d) y (e). la hidrólisis de los enlaces peptídicos precisa de concentraciones muy elevadas de H+ o de OH-.

Isis Avedoy Cortéz. 19 . Alicia Paulina Cárdenas Castro. Nitzia Thalía Flores Jiménez. Cynthia Jazmín López Monteón.Quimotripsina Figura 14: Mecanismo probable de la acción de la quimotripsina.

Alicia Paulina Cárdenas Castro. En esta técnica. puesto que el grupo fenilo se Isis Avedoy Cortéz. Estas observaciones establecen que His 57 es un residuo del sitio activo esencial de la quimotripsina. reacciona con His 57 (figura 16). Cynthia Jazmín López Monteón. en la que se bloquea el sitio activo. Un inhibidor irreversible es la N-tosil-L-fenilalaninaclorometil cetona (TCPK). un inhibidor competitivo de la quimotripsina que tal vez compita con TCPK por su sitio de fijación enzimático. estos análogos de sustrato reactivos se describieron como los “caballos de Troya” de la bioquímica). uno de los residuos preferidos de la quimotripsina).Quimotripsina TIPOS DE INHIBICIÓN Las serina proteasas se inhiben de forma irreversible por el diisopropilfluorofosfato (DFP). La TCPK es un excelente inhibidor de la quimotripsina. donde reacciona para formar un enlace covalente estable con un grupo susceptible cercano (por consiguiente. Los grupos marcados por afinidad pueden identificarse con posterioridad por un mapeo del péptido. un reactivo desnaturalizante. el inhibidor está unido de forma covalente sólo a la Ser 195 y no a ninguna otra de las otras 29 serinas. la reacción TCPK no se produce en urea 8M. 20 . Es más. En las enzimas inhibidas por el DFP. La reacción TCPK es inhibida por β-fenilpropianato (figura 17). o con DIP-quimotripsina. El grupo clorometilcetona fijado al sitio activo es un agente alquilante fuerte. de ese modo inactiva la enzima. La quimotripsina fija en forma específica la tosil-L-fenilalaninaclorometil cetona (TCPK) (figura 15). Nitzia Thalía Flores Jiménez. Por su semejanza con el residuo Fe (fenilalanina. un análogo del sustrato que posee un grupo reactivo de fija de modo específico en el sitio activo de la enzima. Un residuo importante por su actividad catalítica se descubrió por medio de la marcación por afinidad. Figura 15: TCPK.

Figura 16: Reacción de TCPK con quimotripsina para formar un alquilo de la His 57. Isis Avedoy Cortéz. 21 .Quimotripsina ajusta exactamente en el bolsillo del lugar activo. Nitzia Thalía Flores Jiménez. Cynthia Jazmín López Monteón. Alicia Paulina Cárdenas Castro. colocando el cloro para el desplazamiento nucleófilo por un nitrógeno del anillo imidazol de la His 57. Figura 17: β-fenilpropianato.

total o parcial. Nitzia Thalía Flores Jiménez. puede utilizarse para realizar una purificación parcial regulando las condiciones para que sólo se una la quimotripsina a la columna cromatográfica. y ii) una etapa de purificación adicional. de tripsina y quimotripsina a partir de tejido pancreático porcion o bovino. empacar y preparar una columna cromatográfica con una resina de tipo hidrofóbica determinada.Quimotripsina MÉTODOS DE EXTRACCIÓN Método de extracción y purificación. ajuste de la concentración final de sólidos en el orden de 20-25% y secado final -si requiere-. iii) recuperación del sólido por filtración. Alicia Paulina Cárdenas Castro. o para una purificación total de ambas proteínas.2 volúmenes d agua acidulada -etapa N-. viii) activación de los zimogenos (si se requiere). respectivamente Un método de obtención y quimotripsina a partir de tejido pancreático animal comprende: I) una etapa de extracción y purificación parcial que comprende los pasos de: i) obtención de un extracto de páncreas ii)precipitación a partir del extracto original utilizando una concentración de sulfato de amonio que puede variar entre 360 y 400 g/dm3. vi. tanto en la forma cruda como la purificada. por lo que se estudió la posibilidad de realizar su purificación mediante la utilización de resinas de intercambio hidrofóbicas. se emplean en la preparación de composiciones farmacéuticas de dosificación oral o inyectable. iv) suspensión con 2. ix) diafiltración. tienen carácter hidrofóbico.) eliminación del sólido por filtración. La tripsina y la quimotripsina así obtenidas. vii) concentración mediante ultra filtración del líquido obtenido hasta llegar a una concentración de sólidos disueltos del 20 a 25% en peso.ajustando la concentración final de sulfato de amonio a 200 g/dm3 V) precipitación mediante tratamiento con cloruro de calcio del líquido recuperado para eliminar el ion sulfato. ii) equilibrar la resina hidrofóbica con una Isis Avedoy Cortéz. la cual según las condiciones de trabajo. y II) una etapa de purificación adicional que comprende los pasos de: i) montar. Ambas proteínas. 22 . Cynthia Jazmín López Monteón. El método de obtención comprende i) una etapa de extracción y purificación parcial.

xiii) A) si el material de origen estaba activado. La tripsina y la quimotripsina (como lo hemos descrito) son sustancias secretadas desde el páncreas durante la digestión normal y cuando este órgano no las produce en cantidad suficiente puede existir un problema pancreático. viii) descartar el material que eluyó de la columna durante la etapa de siembra y lavado.0-5. concentrar ambas soluciones por separado hasta una concentración de sólidos del orden de 20%. 23 . tripsina y quimotripsina. activar hasta llegar a la actividad específica buscada.0. vii) lavar la columna con una solución en condiciones salinas y de pH idénticas a las de la siembra.0-3. dializar y secar hasta obtener cada una de las proteínas al estado de polvo. concentrar y secar ambas soluciones hasta llegar a un residuo en forma de polvo. Los pasos del método son los siguientes: Isis Avedoy Cortéz. ix) eluir el material retenido en la columna por medio del agregado de una solución salina de 80-120 g/dm3 y a pH3. Determinación de quimotripsina en las heces fecales.Quimotripsina solución salina a pH 3.0-5-0. Nitzia Thalía Flores Jiménez. El test se conoce como “Secretina-Ceruleina (CCK-Pz).0. Alicia Paulina Cárdenas Castro. o B) si el material de origen no estaba previamente activado.5. xi) eluir el material retenido en la columna por medio del agregado de agua acidulada a pH 3.0-5.0-5. iv) clarificar por filtración o centrifugación la solución del material a ser purificado obtenido en la etapa I) antes del sembrado de la columna. x) colectar y reservar el material eluido para la recuperación de la tripsina. Cynthia Jazmín López Monteón. iii) se ajusta la concentración salina del material crudo a purificar de 80 a 220/ g/dm3 y a pH 3. Tripsina y quimotripsina en las heces es un análisis fecal que pueden observar cantidades menores a lo normal en una muestra de materia fecal. v) pasar la solución del material a purificar hasta que la columna se sature con los componentes de la mezcla. un test directo de función pancreática en la que se valora la capacidad secretora del páncreas exocrino. xii) colectar y reservar el material eluido para la recuperación de la quimotripsina.0. vi) agregar en forma continua la solución proteica desplazando de la resina la tripsina por medio de la quimotripsina. acidular los líquidos obtenidos a pH 3.

Quimotripsina     Precisa intubar al paciente con una sonda de doble luz a estómago y duodeno. Se recoge la secreción pancreática. Alicia Paulina Cárdenas Castro. Nitzia Thalía Flores Jiménez. 24 . Isis Avedoy Cortéz.V. Cynthia Jazmín López Monteón. Administrar secretina-ceruleina (CCK-Pz) I. lipasa y bicarbonatos. Se determina en ella volumen. quimotripsina.

antiinflamatorios. así como en la elaboración de quesos..Quimotripsina USOS INDUSTRIALES La importancia de las proteasas radica en su gran inclusión en el mercado al constituir uno de los grupos más importantes de las enzimas industriales debido a que ocupan una posición primaria en el campo comercial. 25 . ya que se utiliza dichas enzimas para formular antitrombióticos. coadyuvantes digestivos. galletería. esto es con la finalidad de lograr una hidrolisis más completa. En las industrias de producción de alimentos más del 60 % de las enzimas utilizadas son proteasas por poseer aplicaciones más prácticas y variadas ya que ocasionalmente son combinadas con péptidasas. Otros usos son el depilado de pieles en curtiduría y la recuperación de la plata de las películas fotográficas y radiográficas ya utilizadas. 1984). 1999). Nitzia Thalía Flores Jiménez. Alicia Paulina Cárdenas Castro.. panificaciones. adicionalmente una variedad de proteasas contienen importantes aplicaciones farmacéuticas (la quimotripsina) (Chandrasekaran y Dhar 1986. concentrados proteicos y producción de hidrolizados proteicos. Vázquez et al. ablandadores de carne. además de emplearse enzimas proteolíticas en la síntesis enzimática de péptidos y ésteres con actividad biológica y formulación de los llamados detergentes biológicos (Prado et al. 2008). ya que pueden ser utilizadas en procesos productivos como en la industria de los detergentes. Las proteasas son ampliamente utilizadas para la fabricación de bebidas. aceleradores de la coagulación sanguínea y para la activación del plasiminógeno. (Sánchez. Cynthia Jazmín López Monteón. 1993) clarificación de cerveza. (Kembhavi et al. síntesis del aspartame.. (Kembhavi et al. Además de se aplica de manera importante en la industria farmacéutica. Isis Avedoy Cortéz.. 1993) por lo que han adquirido especial relevancia. de alimentos y del cuero (Smith y Brekke. 2004) fabricación de productos fermentados de soya y de pescado. saborizantes.

muchas preguntas que resolver y más soluciones médicas qué proponer. las enzimas forman parte de la dinámica de la vida. Nitzia Thalía Flores Jiménez. tuvieron que pasar más de 50 años para encontrar cómo es su estructura. regulado y finalizado. sin embargo. mecanismo. todo ello y mucho más se encuentra estrictamente operado. Isis Avedoy Cortéz. se debe dar más impulso e interés en la investigación del funcionamiento biológico y bioquímico del cuerpo humano pues aún falta mucho por descubrir. aunque no todas. las funciones que realizan todos los órganos. El cuerpo humano es considerando la “máquina perfecta” pues las millones de reacciones que ocurren en el organismo día a día. 26 . Aunque el cerebro sea el órgano que coordine el cuerpo humano y sus funciones. se han realizado grandes logros en la industria alimentaria y farmacéutica. La mayoría. las enzimas son proteínas. La quimotripsina es una enzima digestiva que se encuentra bien estudiada y gracias a ello. Alicia Paulina Cárdenas Castro. uno o más sustratos se unen al lugar activo de una enzima. etc. En la catálisis enzimática. para formar el complejo enzima-sustrato. Cynthia Jazmín López Monteón. y por esto. son parte fundamental de la catálisis y control de las reacciones bioquímicas y la falta de una sola de ellas podría traer consecuencias fatales. tras ello se liberan los productos.Quimotripsina CONCLUSIONES Las enzimas son catalizadores biológicos que aumentan las velocidades de los procesos bioquímicos mientras se mantienen inalteradas.

Mckee. España. España. Páginas: 415. Editorial MÉDICA panamericana. Editorial Reverté. Editorial Reverté. Fecha de consulta: 4 de mayo del 2013. 2006.mx/CienciaCierta/CC27/6. México. A. hidrolizando los enlaces peptídicos con diferentes grados de intensidad y de selectividad.postgradoeinvestigacion. L. Tercera edición. Bioquímica. 446-448. México.. Alicia Paulina Cárdenas Castro. México 2009. Bioquímica. REFERENCIAS 1 Las enzimas proteolíticas (comúnmente llamadas proteasas) pertenecen al grupo de las hidrolasas (Guadix et al. T. Editorial Pearson. Páginas: 222-224. Bioquímica. 2003). Bioquímica.T. 2000). Montero. Cynthia Jazmín López Monteón. Isis Avedoy Cortéz. R. Stryer. Ediciones Omega. 2000) ya que degradan las cadenas polipeptídicas de las proteínas-sustrato (Carrera. 1995. 1998. Química Orgánica. Editorial Pearson. Bioquímica. Manual de técnicas de histoquímica básica. España. Editorial McGrawHill. 2004. Quinta edición. C. Un enlace peptídico es la unión que se realiza entre el grupo ácido de un aminoácido con el grupo amino de otro. M. Tercera edición. Cuarta edición. con la consecuente eliminación de una molécula de agua (Guadix et al. Páginas: 186-188. Argentina. y Mckee. Página: 122. Lehninger. Página: 533 y 535. 1991. Páginas: 1357-1358. J. Páginas: 227-250.html. C. 450-452. K. L. 2003. 1997.Quimotripsina BIBLIOGRAFÍA          Devlin. y colaboradores. Páginas: 416-419. Editorial Universitaria Potosina. 27 . http://www. Cuarta edición. Voet. 434. Mathews.. Morrison y Boyd. México. Bioquímica. Nitzia Thalía Flores Jiménez.uadec. Decimoquinta reimpresión. Tercera edición.

Quimotripsina 2 La Enzyme Commission (EC) del Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology (NC-IUBMB. 3 Los puentes intercatenarios estabilizan la estructura cuaternaria. 1992) recomienda el término general peptidasas para todas las enzimas que hidrolizan enlaces peptídicos. son los puentes que se dan entre aminoácidos de las distintas cadenas. Aunque en algunos textos siguen denominándolas proteasas. 5 La reactividad especial de la Ser 195 se atribuye a la proximidad de la His 57 y del Asp 102. Nitzia Thalía Flores Jiménez. Alicia Paulina Cárdenas Castro. es extremadamente doloroso y a veces resulta mortal. cuando existe una proteína conformada por más de una cadena polipeptídica (la hemoglobina. El grupo carboxilo del Asp 102 polariza a la His 57. Cynthia Jazmín López Monteón. El anillo imidazol de la His 57 se encuentra entre el grupo carboxilo del Asp 102 y el grupo –CH2OH de la Ser 195. denominado pancreatitis aguda. Esta recomendación es adoptada por Barret et al. 4 Dado que la activación de la tripsina puede ser autocatalítica. El trastorno. se fomenta la abstracción de un protón por el grupo imidazol). la presencia de una sola molécula activa de tripsina podría poner en marcha toda la cadena de manera prematura… [ ] Las enzimas activas inician entonces una digestión del propio tejido pancreático. es decir. por ejemplo). (1998) en un tratado actual sobre el tema. “Intercatenarios” es entre cadenas distintas. 28 . permitiéndolo de esta manera actuar como una base general (es decir. Isis Avedoy Cortéz.

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