Cabronio 5.

Medios de Cultivo y Pruebas Bioqumicas

Medios de Cultivo

INTRODUCCIN

Uno de los sistemas ms importantes para la identificacin de microorganismos es observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en el laboratorio.

El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es el Medio de Cultivo y el crecimiento de los microorganismos es el Cultivo.

Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial debe reunir una serie de condiciones como son: temperatura, grado de humedad y presin de oxgeno adecuado, as como un grado correcto de acidez o alcalinidad.

El agar es un elemento solidificante muy empleado para la preparacin de medios de cultivo. Se lica completamente a la temperatura del agua hirviendo y se solidifica al enfriarse a 40 grados. Con mnimas excepciones no tiene efecto sobre el crecimiento de las bacterias y no es atacado por aquellas que crecen en l.

Medios de Cultivo
Clasificacin de los medios de cultivo basndose en su composicin qumica
A.- Medios sintticos o qumicamente definidos. Llevan fuente de carbono, fuente de nitrgeno, sales que suplan iones (P, K, Mg, Fe, Ca), otros elementos como son estimuladores del crecimiento (eritritol para Brucella abortus) pero siempre a concentraciones conocidas.

B.- Medios complejos o de composicin indefinida. Estos medios llevan ingredientes como extracto de levadura, peptona, infusin de cerebro, extracto de carne, etc. que contienen nutrientes en abundancia pero sin saber con exactitud la composicin cualitativa ni cuantitativa de estos nutrientes.

C.- Medios de enriquecimiento. Son medios complejos (normalmente) con aditivos adicionales para favorecer el crecimiento de determinados microorganismos (particularmente hetertrofos exigentes). Ejemplo: adiccin de sangre, suero o extractos de tejidos de animales y plantas. D.- Medios selectivos. Son aquellos que favorecen por su diseo el crecimiento especfico de un microorganismo particular (o grupo de microorganismos). Es de gran utilidad para el aislamiento de microorganismos a partir de una poblacin microbiana mixta.

Ejemplo: CO2 como fuente de carbono es selectivo para auttrofos; adicionando cristal violeta se inhibe el crecimiento de los Gram. (+); utilizando maltosa como nica fuente de carbono slo crecern los que usen maltosa.

E.- Medios diferenciales. Son aquellos destinados a facilitar la discriminacin de microorganismos de una mezcla por sus propiedades diferenciales de crecimiento en dichos medios.

Ejemplo: Agar sangre diferencia hemolticos de no hemolticos; McConkey diferencia lactosa (+) de lactosa (-).

F.- Medios de mantenimiento. Suelen ser distintos a los de crecimiento ptimo ya que el crecimiento rpido y prolfico suele ocasionar la muerte rpida de las clulas. Ejemplo: al aadir glucosa y utilizarla los microorganismos producen cidos, acidificndose el medio por lo que es preferible no utilizar glucosa en los medios de mantenimiento.

Agar-Agar

Agar Nutritivo
Medio de cultivo utilizado para propsitos generales, para el aislamiento de microorganismos poco exigentes en lo que se refiere a requerimientos nutritivos. Su uso est descrito en muchos procedimientos para el anlisis de alimentos, aguas y otros materiales de importancia sanitaria.
Frmula (en gramos por litro) Pluripeptona
Extracto de carne

Instrucciones 5.0
3.0

Cloruro de sodio
Agar

8.0
15.0

Suspender 31 g de polvo por litro de agua destilada. Mezclar y dejar reposar 5 minutos. Calentar suavemente agitando y hervir 1 o 2 minutos hasta su disolucin. Distribuir y esterilizar a 121 C durante 15 minutos. 0.2

pH final: 7.3

Fundamento
Es un medio usado para el cultivo de microorganismos poco exigentes en sus requerimientos nutricionales. No contiene inhibidores del desarrollo bacteriano. La pluripeptona es la fuente de carbono y nitrgeno para el desarrollo bacteriano. El agregado de cloruro de sodio permite el enriquecimiento con sangre de carnero u otras sustancias para facilitar el cultivo de microorganismos exigentes.

Caractersticas del medio: mbar claro

a medio ligeramente opalescente.
Xanthomonas campestris

Base Agar Gelosa Sangre

Medio para propsitos generales, para el aislamiento y cultivo de numerosos microorganismos. Con la adicin de sangre, el medio es til tanto para el aislamiento y cultivo de microorganismos aerobios y anaerobios nutricionalmente exigentes a partir de una gran variedad de muestras, como para la observacin de reacciones de hemlisis. Tambin, este medio de cultivo, puede utilizarse como medio base para preparar el medio agar chocolate.

Frmula (en gramos por litro)

Infusin de msculo de corazn 375.0

Peptona Cloruro de sodio

Agar

10.0 5.0
15.0

pH final: 7.3

0.2

Fundamento
La infusin de msculo de corazn y la peptona, otorgan al medio un alto valor nutritivo, que permite el crecimiento de una gran variedad de microorganismos, an de aquellos nutricionalmente exigentes. El cloruro de sodio mantiene el balance osmtico. El agregado de sangre al medio de cultivo, en concentracin final de 5-10 %, aporta nutrientes para el crecimiento bacteriano, y permite detectar hemlisis.

Caractersticas del medio

Medio preparado: mbar. Medio preparado con 5% de sangre de carnero: rojo cereza.

E.M.B. Agar
Este medio es utilizado para el aislamiento selectivo de bacilos Gram negativos de rpido desarrollo y escasas exigencias nutricionales. Permite el desarrollo de todas las especies de la familia Enterobacteriaceae.

Frmula (en gramos por litro)

Instrucciones Suspender 36 g del polvo en un litro de agua destilada. Reposar 5 minutos; mezclar, calentando a ebullicin durante 1 o 2 minutos hasta su disolucin. Esterilizar en autoclave a no ms de 121 C durante 15 minutos. Enfriar a 45 C y distribuir agitando suavemente.

Peptona Lactosa
Sacarosa

10.0 5.0
5.0

Fosfato dipotsico Agar

Eosina

2.0 13.5
0.4

Azul de metileno

0.065

pH final: 7.2

0.2

Fundamento
Este medio combina las frmulas de Holt-Harris y Teague con la de Levine, para obtener un mejor rendimiento en el aislamiento selectivo de enterobacterias y otras especies de bacilos Gram negativos. La diferenciacin entre organismos capaces de utilizar la lactosa y/o sacarosa, y aquellos que son incapaces de hacerlo, est dada por los indicadores eosina y azul de metileno; stos ejercen un efecto inhibitorio sobre muchas bacterias Gram positivas. Muchas cepas de Escherichia coli y Citrobacter spp. presentan un caracterstico brillo metlico. Las cepas que utilizan la lactosa poseen centro oscuro con periferia azulada o rosada, mientras que las que no lo hacen son incoloras.

Candida spp. como colonias rosadas y puntiformes

Enterococcus spp. crece en este medio como colonias puntiformes y transparentes,

La siembra en profundidad permite el desarrollo de clamidosporas en C. albicans

Mientras que Acinetobacter spp. y otras bacterias oxidativas pueden dar colonias de color azul lavanda. esto puede ocurrir aunque las cepas no sean capaces de acidificar a partir de lactosa al 0.5% y ello se debe a la incorporacin de azul de metileno a sus membranas. En este medio se obtiene adems, un buen desarrollo de especies de Salmonella y Shigella.

Resultados
Microorganismos Escherichia coli
Klebsiella pneumoniae

Tipo de Colonia Verdosas con brillo metlico y centro negro azulado

Mucosas, rosa prpura, confluentes

Proteus mirabilis Enterococcus faecalis

Shigella flexneri

Incoloras Incoloras, pequeas, puntiformes

Incoloras

Salmonella typhimurium

Incoloras

Caractersticas del medio

Mac Conkey Agar

Este medio se utiliza para el aislamiento de bacilos Gram negativos de fcil desarrollo, aerobios y anaerobios facultativos. Permite diferenciar bacterias que utilizan o no, lactosa en muestras clnicas, de agua y alimentos. Todas las especies de la familia Enterobacteriaceae desarrollan en el mismo.
Frmula (en gramos por litro) Instrucciones

Peptona Pluripeptona
Lactosa

17.0 3.0
10.0

Mezcla de sales biliares Cloruro de sodio

Agar

1.5 5.0
13.5

Suspender 50 g del polvo por litro de agua destilada. Reposar 5 minutos y mezclar hasta uniformar. Calentar suavemente y hervir 1 a 2 minutos hasta disolver. Esterilizar en autoclave a 121 C durante 15 minutos.

Rojo neutro Cristal violeta

0.03 0.001
pH final: 7.1 0.2

Fundamento
En el medio de cultivo, las peptonas, aportan los nutrientes necesarios para el desarrollo bacteriano, la lactosa es el hidrato de carbono fermentable, y la mezcla de sales biliares y el cristal violeta son los agentes selectivos que inhiben el desarrollo de gran parte de la flora Gram positiva. Por fermentacin de la lactosa, disminuye el pH alrededor de la colonia.

Esto produce un viraje del color del indicador de pH (rojo neutro), la absorcin en las colonias, y la precipitacin de las sales biliares. Los microorganismos no fermentadores de lactosa producen colonias incoloras.

Resultados
Microorganismos
Escherichia coli

Colonias
Rojas con halo turbio

Klebsiella pneumoniae Salmonella typhimurium

Shigella flexneri

Rosadas mucosas Incoloras, transparentes

Incoloras, transparentes

Proteus mirabilis Enterococcus faecalis

Incoloras, transparentes Diminutas, incoloras, opacas

Caractersticas del medio

Medio preparado: rojo prpura

Estafilococo 110 Agar

Es un medio selectivo para el aislamiento y diferenciacin presuntiva de estafilococos, en base a la produccinde pigmentos, la fermentacin de manitol y la hidrlisis de gelatina, a partir de alimentos y otras muestras.
Frmula (en gramos por litro) Extracto de levadura Triptena Gelatina Lactosa D-Manitol
Cloruro de sodio

Instrucciones

2.5 10.0 30.0 2.0 10.0

75.0 Suspender 149 g del medio en un litro de agua destilada. Reposar 5 minutos y mezclar calentando a ebullicin durante 1 o 2 minutos. Esterilizar en autoclave durante 15 minutos a 121 C. Verter en placas y mezclar para dispersar el precipitado.

Fosfato dipotsico Agar

5.0 15.0

pH final: 7.0

0.2

Fundamento
Staphylococcus aureus es un microorganismo que puede causar intoxicacin alimentaria, y para su aislamiento, pueden usarse distintos medios slidos selectivos: Baird Parker Medio, Manitol Salado Agar, o Estafilococo Medio 110. En el medio de cultivo, el extracto de levadura y la triptena aportan los nutrientes para el desarrollo de microorganismos. La gelatina es el sustrato de la enzima gelatinasa. La lactosa y el manitol son los hidratos de carbono fermentables. El cloruro de sodio, se encuentra en alta concentracin, para inhibir el desarrollo de la flora acompaante excepto Staphylococcus spp., logrndose as un medio selectivo para el desarrollo de estos microorganismos. Las ventajas de este medio por sobre los otros mencionados anteriormente, es que permite, en la misma placa, obtener pruebas de identificacin presuntiva de especie como ser: desarrollo de pigmentos, fermentacin de manitol e hidrlisis de la gelatina.

Resultados
Observar las caractersticas de las colonias y realizar las pruebas de identificacin de microorganismos. 1-Fermentacin de manitol: agregar unas gotas de prpura de bromocresol a las zonas donde se encuentran las colonias sospechosas y en una zona de la placa donde no hay desarrollo bacteriano. Comparar el color desarrollado entre estas dos zonas. Prueba positiva: cambio de color del indicador del medio en la zona de crecimiento bacteriano. El medio sin desarrollo de microorganismos permanece sin cambio. Prueba negativa: no hay diferencias de color entre las zonas de crecimiento bacteriano y la zona sin inocular.

2-Hidrlisis de la gelatina: cubrir la placa 5 ml de una solucin saturada de sulfato de amonio y colocar en estufa, a 35-37 C, en aerobiosis durante 10 minutos. Positiva: halo transparente alrededor de las colonias. Negativa: ausencia de halo transparente alrededor de las colonias.

Resultados
Microorganismo Pigmento Fermentacin de manitol +
+

Hidrlisis de la gelatina +
+

Prueba de la coagulasa +
+

S. aureus
S. aureus

+
+

S. epidermidis

Caractersticas del medio

Medio preparado: mbar claro, opalescente con precipitado.

Sal y Manitol Agar

Medio de cultivo selectivo y diferencial, utilizado para el aislamiento y diferenciacin de estafilococos. Es recomendado para el aislamiento de estafilococos patognicos a partir de muestras clnicas, alimentos, productos cosmticos y otros materiales de importancia sanitaria. Tambin, este medio puede utilizarse para el cultivo de especies halfilas de Vibrio, si no se dispone de medios apropiados (TCBS Medio, Medio Marino, etc.), aunque algunas especies pueden no desarrollar.
Frmula (en gramos por litro)
Extracto de carne 1.0

Instrucciones
Suspender 111 g de polvo por litro de agua destilada. Reposar 5 minutos y mezclar calentando a ebullicin durante 1 o 2 minutos. Distribuir y esterilizar en autoclave a 118-121 C durante 15 minutos. 0.2

Pluripeptona d-Manitol
Cloruro de sodio

10.0 10.0
75.0

Agar Rojo de fenol

15.0 0.025

pH final: 7.4

Fundamento
Se trata de un medio altamente selectivo debido a su alta concentracin salina. Los estafilococos coagulasa positiva hidrolizan el manitol acidificando el medio; las colonias aparecen rodeadas de una zona amarilla brillante. Los estafilococos coagulasa negativos, presentan colonias rodeadas de una zona roja o prpura. Las colonias sospechosas, se repicarn en un medio sin exceso de cloruro de sodio para efectuarles, posteriormente, la prueba de la coagulasa.

En el medio de cultivo, el extracto de carne y la pluripeptona, constituyen la fuente de carbono, nitrgeno, vitaminas y minerales, el manitol es el hidrato de carbono fermentable, el cloruro de sodio (que se encuentra en alta concentracin) es el agente selectivo que inhibe el desarrollo de la flora acompaante, y el rojo fenol es el indicador de pH.

Las bacterias que crecen en un medio con alta concentracin de sal y fermentan el manitol, producen cidos, con lo que se modifica el pH del medio y vira el indicador de pH del color rojo al amarillo. Los estafilococos crecen en altas concentraciones de sal, y pueden o no fermentar el manitol. Los estafilococos coagulasa positiva fermentan el manitol y se visualizan como colonias amarillas rodeadas de una zona del mismo color.
Los estafilococos que no fermentan el manitol, se visualizan como colonias rojas, rodeadas de una zona del mismo color o prpura.

Resultados
Microorganismos
Staphylococcus aureus ATCC 25923

Crecimiento
Excelente

Caractersticas de las colonias

Amarilla

Staphylococcus epidermidis ATCC 14990 Escherichia coli ATCC 25922 Klebsiella pneumoniae ATCC 700603

Bueno Inhibido Inhibido

Roja Inhibido Inhibido

Caractersticas del medio

Medio preparado: rojo

Salmonella Shigella Agar

Medio de cultivo utilizado para el aislamiento de Salmonella spp. y de algunas especies de Shigella spp. a partir de heces, alimentos y otros materiales en los cuales se sospeche su presencia.
Frmula (en gramos por litro) Pluripeptona
Extracto de carne

Instrucciones 5.0
5.0

Lactosa Mezcla de sales biliares Citrato de sodio Tiosulfato de sodio Citrato frrico Agar
Verde brillante

10.0 8.5 8.5 8.5 1.0 13.5

0.00033

Suspender 60 g del polvo por litro de agua destilada. Reposar 5 minutos y mezclar hasta homogeneizar. Calentar a ebullicin durante 2 o 3 minutos. NO ESTERILIZAR EN AUTOCLAVE. Enfriar a 45-50 C y distribuir unos 20 ml por placa. Secar la superficie del medio unos minutos en la estufa.

Rojo neutro

0.025 pH final: 7.0 0.2

Fundamento
Es un medio de cultivo selectivo y diferencial. La selectividad, esta dada por la sales biliares y el verde brillante, que inhiben el desarrollo de bacterias Gram positivas, de la mayora de los coliformes y el desarrollo invasor del Proteus spp. Es diferencial debido a la fermentacin de la lactosa, y a la formacin de cido sulfhdrico a partir del tiosulfato de sodio. Los pocos microorganismos fermentadores de lactosa capaces de desarrollar, acidifican el medio haciendo virar al rojo el indicador de pH, obtenindose colonias rosadas o rojas sobre un fondo rojizo. Salmonella, Shigella y otros microorganismos no fermentadores de lactosa, crecen bien en el medio de cultivo, y producen colonias transparentes. La produccin de cido sulfhdrico se evidencia como colonias con centro negro debido a la formacin de sulfuro de hierro.

Resultados
Microorganismos Colonias

Salmonella typhimurium Shigella flexneri Shigella sonnei Proteus mirabilis Escherichia coli Klebsiella pneumoniae Enterococcus faecalis

Transparentes, centro negro Incoloras Incoloras Transparentes, centro negro Rosadas a rojas Rosadas cremosas y mucosas
Incoloras, de muy escaso crecimiento

Caractersticas del medio

Medio preparado: rojo naranja.

A. Klebsiella pneumoniae. Acid + Lac + B. Escherichia coli .Acid + Lac + C: Salmonella sp..H2S D: Proteus mirabilis H2S E: Pseudomona aeruginosa

Mueller Hinton Agar

Este medio de cultivo ha sido recomendado universalmente para la prueba de sensibilidad a los antimicrobianos. Adems es til con el agregado de sangre para el cultivo y aislamiento de microorganismos nutricionalmente exigentes.

Frmula (en gramos por litro)

Instrucciones

Infusin de carne Peptona cida de casena

Almidn

300.0 17.5
1.5

Agar

15.0

Suspender 37 g del medio deshidratado en un litro de agua destilada. Dejar embeber de 10 a 15 minutos. Calentar con agitacin frecuente y hervir durante 1 minuto. Esterilizar a 121 C durante 15 minutos. Enfriar a 45 -50 C y distribuir a cajas de Petri (o agregar los suplementos que se desee) hasta un nivel de 4 mm sobre una superficie horizontal (25-30 ml en placas de 9 cm de dimetro).
0.1

pH final: 7.3

Fundamento
El Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), recomend su uso en forma rutinaria para la realizacin del antibiograma en medio slido, debido a una serie de factores : presenta buena reproducibilidad lote a lote en las pruebas de sensibilidad, su contenido en inhibidores de sulfonamidas, trimetoprima y tetraciclina es bajo, la mayora de los patgenos crece satisfactoriamente Cuando se suplementa con sangre de carnero al 5%, es til para realizar las pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos en especies de estreptococos.

Resultados
Consultar en la seccin prueba de sensibilidad a los antimicrobianos, la metodologa apropiada.

Caractersticas del medio

Medio preparado: mbar.

Chromobacterium violaceum

Pseudomona aeruginosa

Streptococcus pyogenes

Cerebro Corazn Infusin

Medio lquido adecuado para el enriquecimiento y cultivo de bacterias aerobias y anaerobias, de microorganismos exigentes como estreptococos, neumococos y otros microorganismos de difcil desarrollo. Con el agregado de 20 Ul de Penicilina y 100 g/ml de amicacina, se utiliza este medio para el cultivo de hongos patgenos.
Frmula (en gramos por litro) Infusin de cerebro de ternera
Infusin corazn vacuno

Instrucciones Suspender 37 g del polvo en un litro de agua destilada. Calentar a ebullicin hasta disolver completamente. Esterilizar en autoclave a 121 C durante 15 minutos. Los tubos que no se usen inmediatamente debern calentarse en un bao hirviendo para la eliminacin del oxgeno retenido. Enfriar rpidamente sin agitar. 0.2

200.0
250.0

Peptona Cloruro de sodio

Glucosa

10.0 5.0
2.0

Fosfato disdico

2.5

pH final: 7.4

Fundamento
Es un medio muy rico en nutrientes, que proporciona un adecuado desarrollo microbiano. La infusin de cerebro de ternera, la infusin de corazn vacuno y la peptona, son la fuente de carbono, nitrgeno, y vitaminas. La glucosa es el hidrato de carbono fermentable, el cloruro de sodio mantiene el balance osmtico y el fosfato disdico otorga capacidad buffer. Los nutrientes de este caldo son muy apropiados para los hemocultivos, ya que en esta infusin desarrollan todas las especies de estreptococos excepto los tiol y piridoxal dependientes. Los estafilococos que crecen en esta infusin suelen dar mejores reacciones en la prueba de la coagulasa.
Con el agregado de 20 Ul de Penicilina y 100 g/ml de amicacina, se inhibe la flora bacteriana cuando se utiliza este medio para el cultivo de hongos patgenos.

Resultados
Examinar los tubos para evaluar el crecimiento por turbiedad. Cuando sea necesario, subcultivar en medios slidos apropiados y realizar la identificacin bioqumica.
Microorganismos
Neisseria meningitidis

Crecimiento
Bueno a excelente

Neisseria gonorrhoeae Streptococcus pyogenes

Streptococcus pneumoniae

Bueno a excelente Bueno a excelente

Bueno a excelente

Caractersticas del medio

Medio preparado: mbar claro, sin precipitado.

: uninoculated tube

: Neisseria meningitidis : Strepcococcus pyogenes

Tetrationato Caldo.
Medio de cultivo utilizado para el enriquecimiento selectivo de Salmonella spp. a partir de heces, orina, alimentos y otros materiales de importancia sanitaria.

Frmula (en gramos por litro) Peptona Sales biliares Carbonato de calcio
Tiosulfato de sodio

Instrucciones Suspender 46 g del polvo en 1 litro de agua destilada. Mezclar vigorosamente y llevar a ebullicin. Enfriar a 45 C o menos. Agregar 20 ml de solucin iodurada. Mezclar y distribuir 10 ml por tubo, en tubos estriles. No debe calentarse luego de agregar la solucin iodada. El medio base puede mantenerse a 4 C , dura varios meses, pero una vez agregada la solucin iodada debe usarse en el mismo da.

5.0 1.0 10.0

30.0

pH final: 8.4
Iodo

0.2
6.0

Solucin iodo iodurada Ioduro de potasio Agua 5.0 20.0

Fundamento
El medio de cultivo contiene peptona que provee los nutrientes necesarios para el desarrollo bacteriano, y carbonato de sodio que neutraliza y absorbe metabolitos txicos. La selectividad est dada por la presencia de tiosulfato de sodio, tetrationato (generado en el medio por el agregado de la solucin iodo-iodurada) y sales biliares, los cuales permiten el desarrollo de bacterias que contienen la enzima tetrationato reductasa, como ser la Salmonella spp. e inhiben el desarrollo de la flora acompaante. Para evitar la proliferacin de especies de Proteus spp., se recomienda agregar 40 mg/l de Novobiocina, antes de la solucin iodada

Resultados
Microorganismos Salmonella typhi
Salmonella typhimurium

Crecimiento Escaso
Bueno-excelente

Salmonella enteritidis Escherichia coli

Bueno-excelente Escaso

Caractersticas del medio

Medio preparado: suspensin blanco lechosa.

Stuart Medio de Transporte

Medio destinado a la recoleccin, transporte y preservacin de muestras clnicas aptas para exmenes bacteriolgicos. Es til para mantener la viabilidad de gonococos y de otros microorganismos de difcil desarrollo.

Frmula (en gramos por litro) Tioglicolato de sodio

Glicerofosfato de sodio

Instrucciones Suspender 14,1 g del polvo por litro de agua destilada. Reposar 5 minutos. Calentar a ebullicin hasta disolucin total. Distribuir en tubos con cierre a rosca (para evitar oxidacin) llenndolos hasta 2/3 del tubo. Esterilizar 15 minutos a 121C. Dejar solidificar en posicin vertical. 0.2

0.9
10.0

Cloruro de calcio Azul de metileno Agar

0.1 0.002 3.0

pH final: 7.4

Fundamento
Medio semislido, no nutritivo. Contiene tioglicolato de sodio, el cual provee un ambiente reducido y es til para suprimir cambios oxidativos en el medio de transporte, y azul de metileno, que es el indicador de oxido reduccin. De esta manera se favorece la viabilidad de los microorganismos durante su envo al laboratorio. Cooper encontr que usando hisopos impregnados con carbn bacteriolgico se recuperan en forma exitosa numerosos patgenos entricos y respiratorios.

Resultados

Los tubos con medio de transporte se subcultivan en medios slidos apropiados segn la muestra y el microorganismo que se quiera aislar. Luego de la incubacin, debe haber escasa o nula reduccin de la viabilidad de los microorganismos.

Caractersticas del medio

Medio preparado: ligeramente opalescente con tonalidad azul dependiendo del grado de oxidacin.

Pruebas Bioqumicas

INTRODUCCIN
Con frecuencia, la identidad de una especie requiere que se conozca de manera detallada su actividad bioqumica, porque otras caractersticas no son suficientemente distintivas o diferenciales.

En el laboratorio disponemos de numerosas tcnicas para la caracterizacin bioqumica de una especie. Adems de los productos finales de los procesos metablicos, tambin se necesita conocer con detalle como se producen estos cambios, como ocurren paso a paso las reacciones qumicas, cules enzimas intervienen, cuales son los productos intermediarios adems de que se deben reconstruir las secuencias de las reacciones bioqumicas que tienen lugar dentro de la clula. En general el microorganismo se cultiva en medios que contienen una sustancia nutritiva especfica o sustrato y despus de la incubacin del cultivo se examina para ver los cambios qumicos que hayan ocurrido.

Enterotube II

Kligler Hierro Agar

Medio de cultivo frecuentemente usado en microbiologa de alimentos para la diferenciacin de enterobacterias, en base a la fermentacin de glucosa y lactosa, y a la produccin de cido sulfhdrico.
Frmula (en gramos por litro) Instrucciones

Peptona de carne Cloruro de sodio Lactosa Tripteina Glucosa Citrato de hierro y amonio
Tiosulfato de sodio

13.0 5.0 10.0 10.0 1.0 0.5

0.3

Rojo de fenol Agar

0.025 15.0

Suspender 54.8 g del polvo por litro de agua destilada. Mezclar bien y calentar con agitacin frecuente, hervir 1 o 2 minutos hasta disolucin total. Llenar hasta la tercera parte de los tubos de ensayo. Esterilizar a 121 C por 15 minutos. Enfriar en pico de flauta profundo.

pH final: 7.3

0.2

Fundamento
En el medio de cultivo, la peptona de carne y la triptena, aportan los nutrientes adecuados para el desarrollo bacteriano. La lactosa y la glucosa son los hidratos de carbono fermentables. El tiosulfato de sodio es el sustrato necesario para la produccin de cido sulfhdrico, el citrato de hierro y amonio, es la fuente de iones Fe 3+, los cuales se combinan con el cido sulfhdrico y producen sulfuro de hierro, de color negro. El rojo de fenol es el indicador de pH, y el cloruro de sodio mantiene el balance osmtico. El agar es el agente solidificante. Por fermentacin de azcares, se producen cidos, que se detectan por medio del indicador rojo de fenol, el cual vira al color amarillo en medio cido. El tiosulfato de sodio se reduce a sulfuro de hidrgeno el que reacciona luego con una sal de hierro proporcionando el tpico sulfuro de hierro de color negro.

Resultados
1-Pico alcalino/fondo cido (pico rojo/fondo amarillo): el microorganismo solamente fermenta la glucosa. 2-Pico cido/fondo cido (pico amarillo/fondo amarillo): el microorganismo fermenta glucosa, y lactosa. 3-Pico alcalino/fondo alcalino (pico rojo/fondo rojo): el microorganismo es no fermentador de azcares. 4-La presencia de burbujas, o ruptura del medio de cultivo, indica que el microorganismo produce gas. 5-El ennegrecimiento del medio indica que el microorganismo produce cido sulfhdrico.

Caractersticas del medio

Medio preparado: rojo

TSI Agar
Medio universalmente empleado para la diferenciacin de enterobacterias, en base a la fermentacin de glucosa, lactosa, sacarosa y a la produccin de cido sulfhdrico.
Frmula (en gramos por litro) Extracto de carne Pluripeptona Cloruro de sodio Lactosa
Sacarosa

Instrucciones

3.0 20.0 5.0 10.0

10.0

Glucosa Sulfato de hierro y amonio

Tiosulfato de sodio

1.0 0.2
0.2

Suspender 62,5 g del polvo por litro de agua destilada. Mezclar bien y calentar con agitacin frecuente, hervir 1 o 2 minutos hasta disolucin total. Llenar hasta la tercera parte de los tubos de ensayo. Esterilizar a 121 C por 15 minutos. Enfriar en pico de flauta profundo.

Rojo de fenol Agar

0.025 13.0
pH final: 7.3 0.2

Fundamento
En el medio de cultivo, el extracto de carne y la pluripeptona, aportan los nutrientes adecuados para el desarrollo bacteriano. La lactosa, sacarosa y glucosa son los hidratos de carbono fermentables. El tiosulfato de sodio es el sustrato necesario para la produccin de cido sulfhdrico, el sulfato de hierro y amonio, es la fuente de iones Fe3+ , los cuales se combinan con el cido sulfhdrico y producen sulfuro de hierro, de color negro.
El rojo de fenol es el indicador de pH, y el cloruro de sodio mantiene el balance osmtico.

Por fermentacin de azcares, se producen cidos, que se detectan por medio del indicador rojo de fenol,el cual vira al color amarillo en medio cido. El tiosulfato de sodio se reduce a sulfuro de hidrgeno el que reacciona luego con una sal de hierro proporcionando el tpico sulfuro de hierro de color negro.

Caractersticas del medio

Medio preparado: rojo

Resultados

Lisina Hierro Agar

Medio de cultivo utilizado para diferenciar microorganismos, especialmente Salmonella spp., basado en la decarboxilacin / desaminacin de la lisina y en la produccin de cido sulfhdrico.

Frmula (en gramos por litro)

Instrucciones Suspender 35 g del medio deshidratado en un litro de agua destilada. Dejar embeber unos 15 minutos. Calentar cuidadosamente, agitando con frecuencia y hervir durante un minuto hasta la disolucin completa. Distribuir y esterilizar a 121 C durante 15 minutos. Enfriar en pico de flauta dejando un fondo vertical apto para la puncin. 0.2

Peptona de gelatina Extracto de levadura

Glucosa

5.0 3.0
1.0

Lisina Citrato de hierro y amonio

Tiosulfato de sodio

10.0 0.5
0.04

Prpura de bromocresol Agar

0.02 15.0

pH final: 6.7

Fundamento
En el medio de cultivo, la peptona y el extracto de levadura aportan los nutrientes para el desarrollo bacteriano. La glucosa es el hidrato de carbono fermentable, y la lisina es el sustrato utilizado para detectar la presencia de las enzimas decarboxilasa y deaminasa. El citrato de hierro y amonio, y el tiosulfato de sodio, son los indicadores de la produccin de cido sulfhdrico. El purpura de bromocresol, es el indicador de pH, el cual es de color amarillo a pH igual o menor a 5.2, y de color violeta a pH igual o mayor a 6.8. Por decarboxilacin de la lisina, se produce la amina cadaverina, que alcaliniza el medio y esto produce el viraje del indicador al color violeta. La decarboxilacin de la lisina, tiene lugar en medio cido, por lo que es necesario que la glucosa sea previamente fermentada.

Los microorganismos que no producen lisina decarboxilasa, pero que son fermentadores de la glucosa, producen un viraje de la totalidad del medio de cultivo al amarillo, pero a las 24 hs de incubacin se observa el pico de color violeta debido al consumo de las peptonas, y el fondo amarillo. La produccin de sulfuro de hidrgeno, se visualiza por el ennegrecimiento del medio debido a la formacin de sulfuro de hierro.
Las cepas de los gneros Proteus, Providencia y algunas cepas de Morganella, desaminan la lisina, esto produce un cido alfa-ceto-carbnico, el cual, con la sal de hierro y bajo la influencia del oxgeno forma un color rojizo en la superficie del medio.

Resultados
1- Decarboxilacin de la lisina: -Prueba Positiva: Pico violeta/fondo violeta. -Prueba Negativa: Pico violeta/fondo amarillo.
2-Desaminacin de la lisina: Pico rojizo/fondo amarillo. Esto sucede con cepas del gnero Proteus, Providencia y alguna cepas de Morganella spp. 3-Produccin de cido sulfhdrico: -Prueba positiva: Ennegrecimiento del medio (especialmente lmite del pico y fondo)

en

el

Caractersticas del medio

Medio preparado: color violeta.

Microorganismos

Color en el pico de flauta Rojo Prpura Prpura Rojo

Prpura

Color en la base del tubo

Ennegrecimiento del medio Negativo Positivo Positivo Negativo

Positivo

Proteus mirabilis Salmonella typhimurium Salmonella enteritidis Providencia spp.

Citrobacter freundii

Amarillo Prpura Prpura Amarillo

Amarillo

Morganella spp. Edwarsiella spp.

Klebsiella pneumoniae

Rojo Prpura
Prpura

Amarillo Prpura
Prpura

Negativo Positivo
Negativo

Escherichia coli

Prpura

Prpura

Negativo

MIO Medio
Medio usado para la identificacin de Enterobacteriaceae en base a su movilidad, actividad de ornitina decarboxilasa y produccin de indol.

Frmula (en gramos por litro) Dextrosa Extracto de levadura

Peptona

Instrucciones

1.0 3.0
10.0

Triptena Clorhidrato de L-ornitina

Agar

10.0 5.0
2.0

Suspender 31 g del polvo en un litro de agua destilada. Calentar a ebullicin hasta completa disolucin. Distribuir en tubos y esterilizar 15 minutos a 121 C.

Prpura de bromocresol

0.02 pH final: 6.5 0.2

Fundamento
Medio de cultivo semislido, altamente nutritivo debido a la presencia de extracto de levadura, peptona y triptena.

Adems, la triptena aporta grandes cantidades de triptofano, sustrato de la enzima triptofanasa, para la realizacin de la prueba del indol. La dextrosa es el hidrato de carbono fermentable, la ornitina es el sustrato para la deteccin de la enzima ornitina decarboxilasa, el prpura de bromocresol es el indicador de pH, que en medio alcalino es de color prpura y en medio cido es amarillo. Por su composicin, es posible detectar 3 reacciones en un mismo tubo: movilidad, presencia de ornitina decarboxilasa e indol.

La movilidad se demuestra por un enturbiamiento del medio o por crecimiento que difunde mas all de la lnea de inoculacin. La reaccin positiva a la ornitina est dada por un color prpura del medio. Debido a la fermentacin de la glucosa se reduce el pH produciendo una condicin cida y originando que el indicador de pH prpura de bromocresol vire al amarillo. La presencia de acidez, otorga condiciones ptimas para la actividad de la enzima ornitina decarboxilasa, la cual decarboxila la ornitina presente. Por decarboxilacin, se alcaliniza el medio, con el consecuente viraje del indicador hacia el color prpura. El indol, es producido a partir del triptofano por los microorganismos que contienen la enzima triptofanasa. El desarrollo de un color rojo luego de agregar unas gotas de reactivo de Kovacs o de Erlich, indica un resultado positivo.

Resultados
1-Movilidad:

-Resultado positivo: presencia de turbidez o crecimiento mas all de la lnea de siembra. -Resultado negativo: crecimiento solamente en la lnea de siembra. 2-Ornitina decarboxilasa: -Resultado positivo: color prpura. -Resultado negativo: color amarillo. A veces se puede desarrollar un color violceo en la superficie del medio. 3-Prueba del indol: La prueba de indol se realiza una vez que se ha determinado la movilidad y la prueba de ornitina. -Resultado positivo: color rojo al agregar el reactivo revelador. -Resultado negativo: el color del reactivo revelador permanece incoloroamarillento.

Caractersticas del medio

Medio preparado: prpura transparente a ligeramente opalescente.

SIM Medio

Es un medio semislido destinado a verificar la movilidad, produccin de indol y de sulfuro de hidrgeno en un mismo tubo. Es til para diferenciar miembros de la familia Enterobacteriaceae.

Frmula (en gramos por litro) Triptena

Peptona

Instrucciones 20.0
6.1 Suspender 30 g del polvo por litro de agua destilada. Mezclar hasta disolver; calentar agitando y hervir durante un minuto. Distribuir unos 4 ml en tubos de hemlisis y esterilizar en autoclave a 121 C durante 15 minutos. Solidificar en posicin vertical.

Sulfato de hierro y amonio Tiosulfato de sodio Agar

0.2 0.2 3.5

pH final: 7.3

0.2

Fundamento
El triptfano es un aminocido constituyente de muchas peptonas, y particularmente de la triptena, que puede ser oxidado por algunas bacterias para formar indol. En el proceso interviene un conjunto de enzimas llamadas triptofanasa. El indol producido se combina con el aldehido del reactivo de Kovac s o de Erlich, para originar un compuesto de color rojo. Las cepas mviles pueden apreciarse en este medio, por la turbidez que producen alrededor de la puncin de siembra, mientras que aquellas cepas productoras de sulfhdrico se distinguen por la formacin de un precipitado negro de sulfuro de hierro a partir del tiosulfato siempre que el medio se mantenga a un pH mayor a 7.2.

Resultados
Cepas mviles: producen turbidez del medio, que se extiende mas all de la lnea de siembra. Cepas inmviles: el crecimiento se observa solamente en la lnea de siembra. Cepas SH2 positivas: ennegrecimiento a lo largo de la lnea de siembra o en todo el medio. Cepas SH2 negativas: el medio permanece sin cambio de color. Cepas indol positivas: desarrollo de color rojo luego de agregar el reactivo de Kovac s o de Erlich. Cepas indol negativas: sin cambio de color.

Caractersticas del medio

Medio preparado: mbar.

Urea
Medio utilizado para la identificacin de microorganismos, en base a la actividad uresica. Es particularmente til para diferenciar Proteus spp. de otros miembros de la familia Enterobacteriaceae.

Frmula (en gramos por litro)

Instrucciones

Urea Fosfato monopotsico Fosfato disdico

Extracto de levadura

20.0 9.1 9.5

0.1 Suspender 3, 87 g del medio deshidratado por cada 100 ml de agua destilada. Disolver sin calentar y esterilizar por filtracin. Distribuir en tubos pequeos estriles, entre 0,5 y 2 ml.

Rojo fenol

0.01 pH final: 6.8 0.2

Fundamento
Este medio de cultivo, formulado por Rustigian y Stuart, presenta bajo contenido de nutrientes y alta capacidad buffer. El extracto de levadura es la nica fuente de carbono, nitrgeno, vitaminas y cofactores, y aporta los nutrientes esenciales para el desarrollo bacteriano. Las sales de fosfatos constituyen el sistema buffer, el rojo de fenol es el indicador de pH y la urea es el sustrato de la enzima ureasa.

Aquellas bacterias que poseen la enzima ureasa, pueden utilizar el nitrogeno proveniente de la urea, la hidrolizan, liberando amonaco y dixido de carbono. Estos productos metablicos alcalinizan el medio, haciendo virar el indicador rojo fenol del amarillo al rojo. Su uso, se recomienda para diferenciar Proteus spp. de otros gneros.

Caractersticas del medio

Medio preparado: anaranjado.

Urea1 Uninoculated Control, 2 Proteus Vulgaris, 3 E. coli

Simmons Citrato Agar

Medio utilizado para la diferenciacin de enterobacterias, en base a la capacidad de usar citrato como nica fuente de carbono y energa.

Frmula (en gramos por litro) Citrato de sodio Cloruro de sodio Fosfato dipotsico
Fosfato monoamnico

Instrucciones Suspender 24,2 g del medio deshidratado por litro de agua destilada. Dejar reposar 5 minutos y mezclar calentando a ebullicin durante 1 o 2 minutos. Distribuir en tubos y esterilizar en autoclave a 121 C durante 15 minutos. Enfriar en posicin inclinada. 0.2

2.0 5.0 1.0

1.0

Sulfato de magnesio Azul de bromotimol

Agar

0.2 0.08
15.0

pH final: 6.9

Fundamento

En el medio de cultivo, el fosfato monoamnico es la nica fuente de nitrgeno y el citrato de sodio es la nica fuente de carbono. Ambos componentes son necesarios para el desarrollo bacteriano. Las sales de fosfato forman un sistema buffer, el magnesio es cofactor enzimtico. El cloruro de sodio mantiene el balance osmtico, y el azul de bromotimol es el indicador de pH, que vira al color azul en medio alcalino.

El medio de cultivo es diferencial en base a que los microorganismos capaces de utilizar citrato como nica fuente de carbono, usan sales de amonio como nica fuente de nitrgeno, con la consiguiente produccin de alcalinidad.

El metabolismo del citrato se realiza, en aquellas bacterias poseedoras de citrato permeasa, a travs del ciclo del cido tricarboxlico. El desdoblamiento del citrato da progresivamente, oxalacetato y piruvato. Este ltimo, en presencia de un medio alcalino, da origen a cidos orgnicos que, al ser utilizados como fuente de carbono, producen carbonatos y bicarbonatos alcalinos. El medio entonces vira al azul y esto es indicativo de la produccin de citrato permeasa.

Resultados
-Positivo: crecimiento y color azul en el pico, alcalinidad. -Negativo: el medio permanece de color verde debido a que no hay desarrollo bacteriano y no hay cambio de color.
Microorganismo Klebsiella pneumoniae Citrato permeasa Positivo Color del medio Azul

S. typhimurium E. coli S. flexneri

Positivo Negativo Negativo

Azul Verde Verde

Caractersticas del medio

Medio preparado: verde.

Gracias!