Cromatografia de lichide de nalt performan (HPLC) Introducere

Cromatografia de lichide de nalt performan (HPLC [112]) acoper azi, n proporie aproximativ 80%, analiza substanelor moleculare: organice, organo-metalice i anorganice inclusiv compuii foarte polari sau labili termic pecum i compuii cu mas molecular ridicat (naturali sau sintetici). De aceea, mpreun cu cromatografia de gaze constituie un punct de sprijin important n analizele chimice moderne. Dei eficacitatea coloanelor nu o egaleaz nc pe cea din GC, prin faptul c se poate modifica, pe lng faza staionar, i faza mobil, cromatografia de lichide (LC) face posibile separri i analize uneori imposibil de realizat prin alte tehnici. Cuplajul cu spectrometria de mas a transformat, n ultimul timp, aceast metod n principalul mijloc de analiza a compuilor moleculari naturali sausintetici , constituind unul din pilonii pe care s-a dezvoltat biochimia i biotehnologia modern.

Metoda constituie o evoluie a unei metode mai vechi, cromatografia pe coloan clasic, care servea n primul rnd la izolarea preparativ a compuilor naturali. Prin introducerea pompelor i n consecin, lucrndu-se la presiuni tot mai ridicate (200atm), dezvoltarea unor faze staionare performante, de dimensiuni tot mai mici (recent constituite din granule de faze staionare sferice, cu diametre 2-5m), n coloane tot mai scurte (3-10cm) s-a ajuns, ncepnd cu anul 1969, la configuraia actual (fig. 1). Se poate observa c din rezervoarele coninnd unul sau mai muli solveni pompa (sau pompele), alimenteaz coloana cu eluent (de regul un amestec de doi sau mai muli solveni). n imediata vecintate a coloanei se introduce proba, automat, prin intermediul unui ventil cu by pass.

n coloana aflat ntr-o etuv termostat, are loc separarea propriu-zis. Efluentul coloanei intr ntr-un detector de unde componentul, dac este separat complet, poate fi colectat i izolat, cu ajutorul unui colector de fraciuni. Semnalul este nregistrat fie cu un nregistrator, fie direct n memoria unui calculator. n esen, un cromatograf analitic HPLC are structura din fig. 2 unde nu s-a mai prezentat colectorul de fraciuni, interesant doar din punct de vedere preparativ. Se poate observa asemnarea cu GC singura deosebire major constituind-o sursa de eluent - pompa. Pompe pentru HPLC Pompa este considerat una dintre cele mai importante componente ale HPLC deoarece permite realizarea unui debit constant al eluentului prin ntreg sistemul: injector, coloan, detector mrind deosebit de mult viteza separrii.

ntr-un cromatograf de lichide pot exista una sau mai multe pompe, fiecare furniznd o presiune care poate atinge 20mii kPa (cca. 200atm). Presiunea deosebit este necesar deoarece coloana are o umplutur de finee mare i, n lipsa presiunii, debitul ar fi nepractic de mic. Exist n uz dou tipuri principale de pompe, clasificate astfel n funcie de debit: pompe cu presiune constant (i debit variabil) i pompe cu debit constant. Pompele cu presiune constant sunt mai simple (a se citi ieftine) i nu prezint pulsaii n funcionare (care nu ar permite obinerea unei linii de baz netede). Acestea, prezint dezavantajul c debitul trebuie frecvent modificat pentru a se menine ct mai constant, ceea ce la separri de durat pune probleme, deoarece prin obturarea coloanelor debitul se modific continuu. Se nelege c orice modificare de debit (datorit viscozitii sau temperaturii eluentului i a structurii umpluturii) afecteaz timpul de retenie i totodat semnalul detectorilor, n majoritate sensibili la concentraie. Pompele cu debit constant nu mai prezint dezavantajele de mai sus. De-a lungul timpului s-au selecionat dou variante: pompele cu piston (alternative) i pompele de tip sering (cu deplasare pozitiv). La primele, cele mai utilizate, micarea du-te-vino a pistoanelor i a supapelor cu bil permit o funcionare indefinit dar presupun existena unor atenuatoare de pulsaii dispozitive care s elimine micile variaii de debit. Acestea constau dintr-o alternan de mai multe rezistene, de exemplu tuburi subiri i capaciti - care pot fi incinte cu perei elastici, fie chiar manometre. Pompele cu presiune constant, asemntoare cu o sering dar avnd o capacitate mai mare, pompeaz continuu pe toat durata separrii, pistonul deplasndu-se cu o vitez liniar constant dar dup fiecare curs este necesar oprirea debitului i reumplerea cu solvent a corpului pompei. Dei solvenii utilizai se degazeaz pentru a se reduce efectele corozive ale oxigenului, datorit presiunilor ridicate la care se lucreaz, coroziunea este totui deosebit.

De aceea aceste pompe (corpul, cilindrii, garniturile i supapele) se execut din materiale rezistente la coroziune: safir, agat, teflon sau aliaje speciale. Sisteme de introducere a probei n cazul HPLC injecia probei trebuie fcut ntr-un timp ct mai scurt, pentru a nu deranja regimul dinamic al eluentului prin coloan i detector. Dificultatea provine de la presiunea ridicat la care lucreaz coloana (20mii kPa). Sistemul cel mai utilizat n cromatografele de lichide este ventilul cu 6 ci, numit i ventil de introducere a probei, prevzut cu bucle interschimbabile (fig. 3). Deoarece eluentul ader la perei, pentru completa ndeprtare a sa n momentul alimentrii buclei cu prob, este necesar injectarea prin bucl a unui volum de cel puin de trei ori volumul acesteia, nainte de comutarea pe analiz. Bucla lucreaz n dou etape. Etapa A (fig. 3-A) n care bucla este umplut cu prob cu ajutorul unei seringi sau n alt mod. Apoi are loc comutarea pe analiz (fig. 3-B) cnd prin rotire cu 60, n direcia acelor de ceasornic, manual sau automat, bucla este parcurs de eluentul de la pomp i coninutul acesteia este antrenat n coloan. Volumul probelor pentru coloane obinuite

(25cmx4.6mm) este de 10-50l. Evident aceste ventile sunt confecionate din materiale rezistente la coroziune i la solveni (oel inoxidabil, tantal, teflon etc).