Modificarea genetică a plantelor: Principii generale de realizare.

Aplicaţii şi controverse
C. P. Cornea Facultatea de Biotehnologii, Universitatea de Ştiinţe Agronomice şi Medicină Veterinară Bucureşti, B-dul Mărăşti 59, România Intr-o lume în care creşterea populaţiei este accelerată (se preconizează că până în anul 2050 populaţia globului va număra aproximativ 10 miliarde de locuitori), iar producţia agricolă creşte într-un ritm mai lent este necesară găsirea unor soluţii moderne prin care agricultura să asigure cantităţi suficiente de hrană, cu o calitate corespunzătoare. Agricultura tradiţională se confruntă în prezent cu o serie de limitări extrem de serioase: - limitări ce ţin de piaţă: în condiţiile globalizării, regulile unei pieţe libere îngrădesc politicile locale de preţuri, acestea fiind dictate de tendinţele şi politicile internaţionale - resursele naturale devin, din ce în ce mai mult, factori limitativi ai dezvoltării agriculturii tradiţionale datorită modificărilor climatice, a industrializării şi urbanizării care determină deteriorări ale solului, apei şi a calităţii aerului. - resursele biologice (genetice) sunt, în mod inevitabil, limitate. Astfel, deşi considerată la început foarte eficientă, obţinerea şi eliberarea în mediu a plantelor ameliorate prin metode tradiţionale a devenit extrem de înceată, nu fac faţă cerinţelor, iar numărul de însuşiri naturale care pot fi îmbunătăţite prin aceste metode este foarte mic. Specialiştii consideră că pentru depăşirea acestor probleme, pe lângă îmbunătăţirea continuă a practicii agricole, există două soluţii: găsirea unor surse alternative de hrană (de exemplu, valorificarea resurselor marine) sau ameliorarea plantelor prin metode biotehnologice (Altman, 1999). Cu toate că pentru unii oameni biotehnologia reprezintă un domeniu oarecum controversat, prin integrarea metodelor biotehnologice cu metodele clasice de ameliorare (atât la plante cât şi la animale) se pot obţine rezultate care să mulţumească pe toată lumea, declanşându-se o adevărată revoluţie „verde” în agricultură. „Prima generaţie” de cercetări în domeniul biotehnologiei vegetale a fost axată pe transferul de gene în plante de interes economic care să permită obţinerea unor beneficii mai mari în urma cultivării lor. De exemplu, au fost obţinute plante rezistente la atacul unor insecte sau la acţiunea unor erbicide ceea ce a condus la reducerea pierderilor datorate buruienilor sau dăunătorilor precum şi a cantităţilor de compuşi chimici aplicaţi culturilor de plante. Utilizarea plantelor transgenice, limitată iniţial doar la loturi experimentale, s-a extins în ultimii ani la suprafeţe semnificative mai ales în SUA, Canada, Argentina, China şi mai puţin în Europa. Deşi cercetările privind introducerea de noi gene de interes la plante va continua, este de aşteptat ca „noua generaţie” de cercetări în domeniul biotehnologiilor vegetale să aibă drept principal scop obţinerea de plante transgenice „sigure” pentru utilizarea lor în alimentaţia omului, cu rezistenţă la atacul fungilor astfel încât să nu se acumuleze compuşi toxici pentru om (compuşi de tipul aflatoxinelor), cu valoare nutritivă superioară (cum ar fi
83

C. P. Cornea

îmbogăţirea lor în vitamine, în uleiuri sau proteine care nu să nu determine reacţii alergice la persoanele sensibile) sau capabile să producă substanţe de interes medical (de exemplu vaccinuri „comestibile”). De asemenea, cercetările privind obţinerea şi utilizarea plantelor transgenice trebuie să fie corelate cu studii care să lămurească opinia publică asupra beneficiilor şi eventual a riscurilor pe care aceste plante şi mai ales produsele alimentare derivate de la ele le presupun. 1. Principii

generale privind obţinerea plantelor transgenice

Aşa cum se cunoaşte, plantele transgenice sunt obţinute în urma experimentelor „in vitro” de transfer de material genetic exogen: la nivelul lor s-au integrat în mod stabil secvenţe de ADN provenite de la alte organisme, care le conferă anumite însuşi fenotipice noi sau modificate. Obţinerea plantelor transgenice presupune o metodologie specifică, cu etape distincte, care prezintă elemente comune pentru toate tipurile de plante cu care se lucrează. In cazul anumitor specii vegetale metodologia utilizată este modificată conform particularităţilor acestora astfel încât rezultatul să fie cel dorit. Transferul de gene la plante a devenit posibil datorită descoperirii şi a utilizării sistemului de transformare genetică prin intermediul bacteriilor din genul Agrobacterium (A.tumefaciens şi A.rhizogenes). Rezultatele cercetărilor din domeniul geneticii vegetale, bazate în primul rând pe folosirea plasmidelor Ti de la Agrobacterium tumefaciens, se constituie într-un material faptic deosebit de bogat. Vectorii de clonare derivaţi de la plasmidele Ti, tehnicile de transformare genetică, structura şi exprimarea genelor în plantele transgenice au determinat obţinerea unor noi cunoştinţe importante atât pentru cercetarea fundamentală, cât şi pentru îmbunătăţirea însuşirilor unor plante de cultură. 1.1. Clonarea genelor în celulele vegetale prin utilizarea bacteriilor din genul Agrobacterium Pentru evidenţierea particularităţilor procesului de clonare în celulele vegetale vor fi prezentate în continuare unele aspecte legate de sistemul natural de transfer de gene prin intermediul bacteriilor din genul Agrobacterium precum şi elementele specifice ale vectorilor de clonare şi a markerilor de selecţie pentru celulele vegetale. 1.1.1. Particularităţile bacteriilor din genul Agrobacterium A.tumefaciens şi A.rhizogenes sunt bacterii ce trăiesc în sol, ele fiind capabile de a produce boli unor specii de plante dicotiledonate şi gimnosperme. S-a dovedit că tulpinile de A.tumefaciens determină apariţia unor tumori de tip "crown gall" pe tulpinile rănite ale unor plante (în special la nivelul coletului), în timp ce tulpinile de A.rhizogenes induc formarea de rădăcini adventive (de tip "hairy") la nivelul ţesuturilor vegetale rănite (Figura 1).

Figura 1. Tumori induse experimental la plante test prin infecţie cu Agrobacterium tumefaciens. 84

virA. izolate din tulpini de A. conţinând în schimb gena tsz. virE (2 gene) şi virG (o genă)(Weising şi Kahl. Aplicaţii.virC şi vir D codifică proteine ce asigură formarea unei copii de ADN-T monocatenar. Exprimarea genelor localizate în regiunea de virulenţă a plasmidelor Ti este inductibilă.. fiind formată din mai mult de 20 gene organizate în cel puţin 6 unităţi transcripţionale (operoni): virA (o genă). transferabil în celula vegetală. ele se pare că sunt implicate şi în procesul de integrare al ADN-T în genomul noii gazde. Regiunea de virulenţă cuprinde gene esenţiale pentru transferul de ADN bacterian în celulele vegetale. graţie prezenţei în celula lor a unei plasmide Ti ("tumor inducing") sau Ri ("root inducing"). virD şi virG sunt esenţiale pentru transferul ADN-T. Acestea sunt de dimensiuni mari (peste 200 kb)(Van Larebecke şi col. cu număr mic de copii/celulă bacteriană. de tipul acetosiringonei sau a α-hidroxiacetosiringonei. 1996). Studiile efectuate prin analiza heteroduplexurilor ADN ale regiunilor vir provenite de la diferite tipuri de plasmide Ti au evidenţiat o omologie extinsă a acestei regiuni. respectiv rădăcinilor anormale. la plante. Aceste plasmide constituie. prin compararea regiunii vir a unei plasmide Ti nopalinice cu cea a uneia octopinice s-a observat ca există unele deosebiri: prima nu prezintă locusul virF. plasmidele Ti conţin mai multe regiuni.virB codifică proteine care răspund de transportul complexului ADN-T-proteine prin membrana plasmatică bacteriană.virA şi virG codifică proteine responsabile de recunoaşterea celulelor vegetale rănite şi de inducerea celorlalte funcţii vir. Cele mai multe studii referitoare la structura plasmidelor de la Agrobacterium au fost realizate cu plasmidele Ti. sub acţiunea unor molecule semnal din exudatele plantelor sau la nivelul rănilor produse la plante. virB. ce se concretizează prin apariţia fenomenului tumoral. ce reprezintă factorul determinant al producerii tumorilor. Regiunea vir cuprinde un segment de aproximativ 30-40 kb (în funcţie de tulpina bacteriană). Spre exemplu. un sistem organizat şi complex de transfer de informaţie genetică naturală în celula vegetală.virD şi virE codifică proteine ce formează un complex împreună cu ADN-T ghidându-l spre nucleul celulei vegetale. Toţi aceşti operoni sunt induşi în prezenţa celulelor vegetale rănite (care produc o serie de compuşi fenolici cu rol inductor). Dintre aceste unităţi transcripţionale. fiind reglată de acţiunea unor factori din exterior. funcţiile lor fiind următoarele: . 1998). . Bacteriile din genul Agrobacterium prezintă un sistem genetic organizat care permite introducerea de gene noi în celula vegetală. 1974). care au acţiune asupra 85 . regiunea de virulenţă (genele vir). iar virC şi virE asigură o creştere a eficienţei transferului (de la Riva şi colab. ceea ce dă posibilitatea bacteriei să producă fitohormonul transzeatină. alături de virA. are loc o puternică activare a acestor gene. Această genă este localizată în cazul plasmidei Ti octopinice la nivelul extremităţii stângi a regiunii. Controverse Modificările morfogenetice determinate de infectarea plantelor cu tulpini de A.tumefaciens sau A. .rhizogenes se datorează transferului unor gene de origine bacteriană în celulele vegetale. cu funcţii distincte: regiunea ADN-T (conţinând genele de tumorigeneză). deşi apar şi unele mici zone neomoloage (care s-ar putea datora inserţiilor sau deleţiilor apărute în structura plasmidelor în cursul evoluţiei). primele două fiind însă cele mai importante pentru procesul de transformare a celulelor vegetale. regiunea ce controlează transferul conjugativ al plasmidei (genele tra) etc.Modificarea genetică a plantelor: principii generale de realizare. În principiu. regiunea de incompatibilitate (genele inc). .tumefaciens.. aşadar. dar numai în condiţii speciale. transferabile dintr-o celulă în alta. virB (11 gene). fără a fi însă ele însele transferate. virD (4 gene). Aceste molecule semnal sunt compuşi fenolici. Experimental s-a demonstrat că. fără influenţă asupra echilibrului ecologic. Transferul unei porţiuni din aceste plasmide în genomul celulei vegetale determină modificări funcţionale. virC (2 gene).

De remarcat că. Această regiune ADN-T (de la ADN transferat) are aproximativ 20-25 kb lungime (în funcţie de tulpina bacteriană gazdă) şi conţine toate genele (oncogenele) care transferate în celula vegetală vor determina fenotipul caracteristic al celulelor transformate. aux2. P. genele ce se transferă în celulele vegetale sunt grupate la marginile regiunii ADN-T. ADN-T conţinut de toate plasmidele Ti naturale este flancat de scurte secvenţe de nucleotide. Dintre aceste gene menţionăm: genele chvA şi chvB implicate în sinteza şi secreţia β–1. Produşii acestor gene sunt asemănători cu alte proteine membranare bacteriene cu rol în reglare (Env Z. 86 . gena chvE necesară pentru inducerea regiunii vir şi pentru chemotactismul bacterian. B. determină apariţia fenotipului caracteristic ("hairy root"). substanţe specifice pentru aceste tipuri de celule. se pare. 1. Nester şi colab. locusul cel responsabil de sinteza fibrilelor de celuloză implicate în ataşarea bacteriilor la celulele vegetale. Mecanismul transferului ADN-T în celula vegetală Mecanismul mobilizării şi transferului ADN-T din celula bacteriană în celula vegetală a fost intens studiat în ultimii ani fiind clarificate multe dintre etapele acestui proces. C şi D care sensibilizează celulele vegetale la acţiunea auxinelor. între altele. în funcţie de tipul de plasmidă Ti) şi o a opta genă ce interacţionează cu celelalte. iaaH. comparativ cu plantele regenerate dinţesut normal (figura 2). În cazul plasmidelor Ri. gene ocs sau nos.1991) Funcţiile de recunoaştere şi ataşare a bacteriilor la peretele celulei vegetale nu sunt codificate de gene plasmidiale ci de gene cromosomale. Plantele regenerate din ţesut vegetal transformat cu acestă bacterie prezintă un aspect modificat. (1984) au reuşit identificarea şi cartarea a opt gene aflate la nivelul ADN-T: aux1. gena pscA (exoC) implicat în sinteza glucanului ciclic şi a acidului succinoglicanic.C. responsabile de fenotipul de tip "hairy" al ţesuturilor vegetale transformate. locusul att implicat în sinteza unor proteine celulare de suprafaţă (Matthysse. localizate la nivelul cromosomului bacterian. la anumite specii vegetale. ops ce determină sinteza opinelor de către celulele transformate (de exemplu. De remarcat că. sinteza şi secreţia de opine. 1987). de asemenea. Aceste gene determină. alături de aceste gene se află cele responsabile de sinteza unor opine (manopina şi agropina)(Tepfer şi Casse-Delbart. S-a dovedit că. mărind se pare. ipt ce codifică sinteza de citochinine. structura exopolizaharidelor de la suprafaţa bacteriilor. iaaM. Genele localizate pe ADN-T determină două proprietăţi caracteristice pentru celulele vegetale tumorale: creşterea pe medii de cultură în absenţa fitohormonilor. Alături de genele vir plasmidiale au mai fost identificate unele gene.2. simpla prezenţă a genelor rol. de aproximativ 25 pb. analiza regiunii ADN-T a dovedit că aceasta conţine o serie de gene. ele fiind recunoscute de echipamentul enzimatic implicat în transferul ADN-T din celula bacteriană în celula vegetală. Cangelosi şi colab. integrându-se stabil în genomul celular. sensibilitatea celulelor transformate la auxină. Analiza acestor secvenţe terminale a arătat că acestea sunt conservate la diferitele tulpini de Agrobacterium. toate fiind implicate în codificarea sintezei de auxine.1. implicate. 1987. repetate direct. Regiunea ADN-T reprezintă o porţiune din plasmida Ti (sau Ri) care este transferată în celula vegetală. Omp R etc). într-o mai mică măsură în procesul de transformare genetică. Cu toate acestea rămân de elucidat unele aspecte ale sale. în partea stângă a ADN-T sunt localizate genele rolA. chiar în absenţa celorlalte gene din ADN-T. mai ales cele ce au loc în celula vegetală.. esenţiale pentru procesul de transfer în celulele vegetale. implicate în procesele de recunoaştere. Astfel.2 glucanului. Cornea genelor reglatoare virA şi virG. În partea dreaptă a ADN-T din plasmidele Ri se află două gene ce codifică sinteza de auxine (acid indolilacetic) în celulele transformate.

care servesc drept chemoatractanţi pentru agrobacterii. . . Aplicaţii. Figura 3. 87 .inducerea funcţiilor vir plasmidiale şi începerea procesului de transfer al ADN-T. procesul fiind denumit colonizare bacteriană. Controverse 1 2 3 Figura 2. 1996).Modificarea genetică a plantelor: principii generale de realizare. Aspectul plantelor de tutun regenerate din ţesut vegetal transformat cu A. Procesul de transfer al ADN-T poate fi împărţit în două etape: una ce se desfăşoară în celula bacteriană şi o alta ce are loc în celula vegetală (Figura 3). aminoacizi sau glucide (acid D-galacturonic sau acid D-glucuronic).recunoaşterea celulelor rănite şi ataşarea bacteriilor la nivelul acestora ca urmare a exprimării constitutive a genelor vir cromosomale. Etapele transferului natural ADN-T din celulele bacteriene în celulele vegetale rănite (adaptare după Weising şi Kahl. Primele etape ale interacţiunii dintre plante şi celulele de Agrobacterium sunt următoarele: . rhizogenes (poziţiile 2 şi 3) comparativ cu plantele normale (poziţia 1).celulele vegetale rănite eliberează o serie de compuşi fenolici (cum este acetosiringona).

Dintre aceste proteine. simultan având loc sinteza catenei lipsă. De remarcat că. Primele gene vir ce intră în acţiune sunt cele din operonii virA şi virG. virD. 1994). VirA şi VirG.C. Cele două proteine interacţionează şi determină activarea celorlalţi operoni vir (virB. Ea recunoaşte marginile ADN-T şi le clivează (de obicei are loc mai întâi secţionarea uneia dintre catenele ADN-T la nivelul marginii din dreapta) generând un segment de ADN monocatenar lung de aproximativ 20kb. denumit în limba engleză "overdrive". Figura 4. 1996). începând cu activarea funcţiilor vir plasmidiale de către compuşii fenolici sau glucidici eliberaţi din celulele vegetale rănite. la ADN-T se ataşează proteina VirE2 (aproximativ 600 molecule per ADN-T de 20kb) care. existenţa unui element suplimentar localizat în afara ADN-T (în partea dreaptă). ea prezentând trei domenii funcţionale: un domeniu periplasmic important pentru detectarea monoglucidelor inductoare şi două domenii transmembranare care recepţionează şi transmit semnalele inductoare. Proteina VirD2 rămâne ataşată la nivelul capătului 5' al ADNT monocatenar protejându-l. probabil. De asemenea. nu numai că protejează segmentul monocatenar ci îl şi converteşte la o formă corespunzătoare pentru transport (Figura 4). codificate de operonul virC (Lessl şi Lanka. La rândul său. Acest element. stimulează procesul de transformare (are funcţie de "enhancer"). Cornea Etapa bacteriană include toate evenimentele ce conduc la producerea şi exportul ADNT. rolul cel mai important îl are proteina VirD2 care este o endonuclează de restricţie (situs-specifică). Reprezentarea schematică a etapelor formării complexului ADN-T-proteine (după Weising şi Kahl. Se pare că proteina VirA este produsă într-o formă inactivă ce este activată (fosforilată) de inductorii vegetali (compuşii fenolici sau glucidici). 88 . de acţiunea exonucleazelor. 1988). pentru ca ADN-T să fie transferat este necesară prezenţa secvenţelor marginale de 25 pb (notate de obicei TL sau TR) şi. (Parkinson. Excizia ADN-T este iniţiată de acţiunea combinată a proteinelor VirD1 şi VirD2. codificate de operonul virD precum şi a proteinelor VirC1 şi VirC2. ADN-T conţine toate genele onc necesare transformării celulelor vegetale dar nici una dintre aceste gene nu este implicată în excizia şi transferul ADN-T. virE). cel puţin în cazul unor anumite plasmide Ti. virC. In esenţă. P. 1993). fiind sintetizate proteinele corespunzătoare. proteina VirG este activată (fosforilată) de proteina VirA (Zambryski.

linkată cu o genă selectabilă şi utilizarea pentru transformare a acestui "construct" s-a reuşit exprimarea eficientă (în 30% din cazuri) a genelor clonate. peretele celular vegetal. Această observaţie este susţinută şi de alte date experimentale. ADN-T adoptă trăsăturile cromatinei eucariote: formarea de nucleosomi şi sensibilitatea la acţiunea DN-azei I. Petunia hybrida. iar proteina virD2 prezintă doar un singur asemenea semnal. La procesul de translocare ar mai participa şi proteinele codificate de operonii suplimentari virF şi virH al căror rol ar fi legat de direcţionarea complexului ADN-T spre nucleul celulei vegetale şi de specificitatea de gazdă a tulpinilor bacteriene implicate în procesul de transfer de ADN. Spre deosebire de alte elemente genetice mobile cum sunt transpozonii sau retrovirusurile animale. 1. 1998). plasmalema celulei vegetale şi membrana nucleară. după integrare.. S-a dovedit că. Integrarea ADN-T în genomul celulei vegetale Ultima etapă a procesului de transformare genetică a plantelor este integrarea ADN-T în genomul celulei vegetale. cercetări recente au arătat că integrarea ADN-T s-ar realiza la nivelul unor "puncte fierbinţi" din genomul vegetal: la nivelul zonelor unde ADN a suferit unele modificări şi unde este necesară intervenţia enzimelor implicate în procesul reparator (Tinland. Mai mult. unde ADN-T este integrat în genom. Analiza genetică a plantelor transformate cu ajutorul bacteriilor din genul Agrobacterium a evidenţiat prezenţa uneia sau a mai multor copii ale ADN-T la nivelul unor cromosomi diferiţi. la Crepis capilaris s-a evidenţiat posibilitatea integrării ADN-T în oricare dintre cele trei perechi de cromosomi. Se consideră doar că. deşi acestea nu aveau promotor propriu. se pare că proteinele Vir participă şi la formarea unor pori la nivelul membranei plasmatice şi a membranei externe a bacteriei.. 1996). nu există o preferinţă pentru un anumit cromosom. Acest din urmă aspect sugerează o integrare preferenţială la nivelul regiunilor din genomul vegetal care sunt transcrise (Kahl şi col. În ceea ce priveşte mecanismul molecular al integrării ADN-T în genomul vegetal au fost elaborate mai multe modele. De asemenea. Lycopersicon esculentum. Nicotiana tabacum).3. 1987). Se pare că proteina bacteriană virE2 care însoţeşte complexul virD2ADN-T conţine două semnale pentru localizare nucleară (NLS = „nuclear location signals”). complexul ADN-T-proteine (complex T de 2nm în diametru şi aproximativ 3 µm în lungime) trebuie să traverseze cinci bariere majore: membrana plasmatică şi spaţiul periplasmic bacterian. procesul de integrare realizându-se randomic. Astfel. În ceea ce priveşte translocarea prin membrana plasmatică vegetală nu există o explicaţie satisfăcătoare. complexul T (ADN şi proteine) este preluat de proteinele vegetale şi transportat în nucleu. ADN-T nu codifică nici o proteină care să fie 89 . In etapa transportului prin membrana plasmatică bacteriană sunt implicate cele 11 gene ale operonului virB dar mecanismul exact al acestui proces nu este încă elucidat. în timp ce la tomate au fost cartate şapte segmente de ADN-T pe cinci cromosomi diferiţi. prin clonarea la nivelul ADN-T a unei gene marker (pentru β-glucuronidază) lipsită de promotor.Modificarea genetică a plantelor: principii generale de realizare. cel puţin pentru speciile studiate Crepis capillaris. De asemenea. Rolul proteinelor este complex: pe de o parte. protejează ADN-T de atacul exonucleazelor şi asigură transportul într-o formă corespunzătoare. odată pătruns în citoplasma celulelor vegetale. Date recente au evidenţiat că. o serie de date experimentale au condus la concluzia că integrarea ADN-T are loc atât la nivelul exonilor cât şi la nivelul intronilor fără a fi observată vreo preferinţă pentru una sau alta dintre secvenţe.1. Controverse Pentru a ajunge în nucleul celulei vegetale. Spre exemplu. Aplicaţii. Explicaţia acestor rezultate este aceea că integrarea a avut loc la nivelul unor regiuni active ale genomului vegetal (care sunt transcrise)(Cucu şi colab.

topoizomeraza. rolul său ar putea fi acela al protejării secvenţei terminale de 25 pb (marginea dreaptă a ADN-T).. Conform acestui model.C. ligaza. Figura 5. Proteina Vir E2 (posibil şi alte proteine) "acoperă" molecula de ADN-T monocatenar dar eficienţa procesului de integrare pare să fie independentă de proteina Vir E2. Aceste rezultate sugerează faptul că proteina Vir E2 protejează ADN-T de acţiunea nucleazelor plantei. în prezenţa proteinei Vir E2. în final este sintetizată o catenă complementară prin folosirea ADN-T inserat drept matriţă (Tinland. există zone foarte restrânse de omologie (microomologie)(secvenţele terminale de 25 pb) între ADN-T şi ADN vegetal care asigură un minim de specificitate pentru procesul de recombinare prin poziţionarea VirD2 pentru legare. în absenţa acestei proteine ADN-T suferă deleţii majore. Spre exemplu. Observaţiile discutate sugerează faptul că asocierea dintre ADN vegetal şi ADN-T este iniţiată la capătul 3' al ADN-T monocatenar. Cornea implicată în integrarea sa în cromosomii vegetali. ea nefiind implicată direct în procesul de integrare. majoritatea enzimelor implicate în integrare sunt furnizate de către celula vegetală (ADN-polimeraza. Extremitatea 3’ a ADN-T sau secvenţele adiacente prezintă o slabă omologie cu ADN al plantei. Are loc apoi degradarea fragmentului din catena de ADN vegetal îndepărtat de la nivelul crestăturii (cu ajutorul unor endonucleaze sau exonucleaze cu acţiune 3’-5’). iar prima nucleotidă de la capătul 5’ al complexului VirD2-ADN-T se împerechează cu o nucleotidă corespunzătoare de la nivelul catenei 5’-3’ din ADN vegetal. s-a putut evidenţia rolul în integrare a proteinelor implicate în procesul reparator. Puchta. consecinţa fiind formarea unei sinapse între catena transferată şi ADN al plantei şi a unei „deschizături” la nivelul catenei 3’-5’ a ADN vegetal. În acest fel. Mecanismul exact al integrării ADN-T în genomul vegetal nu a fost clarificat dar se consideră că integrarea se realizează prin recombinare nelegitimă (Finberg şi colab. P. capătul 3' al secvenţei de interes prezintă scurte deleţii. 1995). În acest fel. 1998). Model ipotetic al integrării ADN-T în genomul vegetal (după Tinland. în plus activează mecanismele reparatorii ale celulei vegetale astfel că. pătrunderea complexului ADN-T în nucleu este facilitată de proteinele însoţitoare Vir D2 şi VirE2 (prin intermediul regiunilor NLS ce interacţionează cu proteine vegetale de legare) la care se adaugă şi proteina VirF. Procesul este însoţit de crestarea catenei opuse şi. necesară procesului de recunoaştere şi integrare. 1995) 90 . helicaza). singurele proteine bacteriene care pot ajuta procesul de integrare sunt proteinele VirD2 şi Vir E2. ADN vegetal înlocuit este clivat la extremitatea sa 3’ cu ajutorul unei endonucleaze. iar ADN-T monocatenar îi ia locul (Figura 5). se poate concluziona că. Aşa cum s-a menţionat deja. Este posibil ca legătura fosfotirozinică prin care Vir D2 este ataşată la ADN-T să fie preferată de enzimele gazdei (cum ar fi ligaza) implicate în integrare. pe baza experimentelor efectuate cu mutante de Arabidopsis thaliana hipersensibile la radiaţii care erau incapabile de a realiza integrarea ADN-T. Deoarece proteina Vir D2 este ataşată covalent la capătul 5' al ADN-T monocatenar. Analizându-se structura ADN-T integrat s-a evidenţiat faptul că. cu rol mai mic în acest proces. 1995.

între extremităţile ADN-T prelucrat. în locul acestora pot fi inserate alte secvenţe de ADN. sau dacă ea se realizează eficienţa este foarte redusă iar plantele obţinute prezintă unele anomalii (Vatafu şi colab. Vectori de clonare pentru celula vegetală Pentru realizarea transferului eficient de gene în celulele vegetale ţintă au fost construiţi vectori de clonare specifici.2. gus. plasmidele Ti au fost modificate drastic. 1989). . În cazul capătului 5'. Un asemenea vector de clonare duce însă la obţinerea unui ţesut tumoral deoarece genele implicate în producerea fitohormonilor nu sunt inactivate. Aceştia conţin la nivelul regiunii ADN-T modificate a unei plasmide Ti o plasmidă de la E. Pornindu-se de la constatarea că. prin eliminarea genelor ce determină producerea tumorilor. .asimetria dintre capetele ADN-T sugerează că integrarea implică procese diferite.. 1. Existenţa acestor gene în stare activă împiedică regenerarea de plante întregi. pentru a se realiza transferul de material genetic în celula vegetală este suficient să existe extremităţile de 25 pb ale ADN-T. gfp) sub controlul unor promotori corespunzători (Pnos. P35S).capătul 3' al ADN-T este mai puţin conservat. mai multe elemente genetice: originea replicării (nefuncţională în Agrobacterium). 1.integrarea ADN-T conduce la apariţia unor mici deleţii (13-73 pb) ale ADN vegetal. de exemplu. el suferind unele scurtări cu 3-100 nucleotide.1.capătul 5' al ADN-T monocatenar este mai puternic conservat în genomul celulei vegetale. plasmida pGV3850) la nivelul cărora regiunile interne ale ADN-T răspunzătoare de oncogeneză au fost eliminate. au fost făcute diferite încercări de înlocuire a genelor din interiorul ADN-T cu alte gene. De asemenea.Modificarea genetică a plantelor: principii generale de realizare. In plus. . în scopul ameliorării plantelor. ca atare. prin menţinerea şi clonarea în alte plasmide. Pentru a putea fi aplicat. de obicei derivaţi de la plasmidele Ti sau Ri sau de la unele virusuri caracteristice unor specii vegetale. fiind deci vorba de un proces de recombinare "nelegitimă". iar regiunea de omologie cu situsul de inserţie se reduce la o singură nucleotidă. Controverse Sintetizând datele de până acum se pot enunţa câteva concluzii referitoare la procesul de integrare: . recombinarea sa presupune existenţa unui mecanism mult mai specific. la nivelul situsului de inserţie.integrarea ADN-T nu este situs-specifică şi nu necesită prezenţa în ADN vegetal a unor secvenţe omoloage. au fost introduse gene marker specifice (nptII. Vectori plasmidiali Sistemul natural de transfer descris mai sus este impropriu pentru a fi utilizat. Primele realizări în acest sens au fost cele privind obţinerea unor vectori co-integraţi. Acest capăt are o scurtă regiune de omologie (cel puţin 5 nucleotide) cu situsul la care va avea loc integrarea. de provenienţă străină. De exemplu.2. Recombinarea capătului 3' presupune implicarea unei foarte scurte regiuni de omologie fiind asemănătoare recombinării plasmidiale din celulele animale. mai mici. fiind în acest fel un exemplu de recombinare nelegitimă tipică. .coli ce conţine. un marker de selecţie pentru celulele bacteriene purtătoare (de obicei rezistenţa la un anumit antibiotic) şi gena (genele) străină clonată. cat. Aplicaţii. obţinându-se vectori de clonare foarte eficienţi. doar a regiunilor marginale şi a unor promotori ce sunt recunoscuţi de echipamentul de transcriere al celulelor vegetale. Pentru depăşirea acestui inconvenient s-au realizat plasmide Ti "dezarmate" (cum este. la rândul ei. clonarea la nivelul regiunii ADN91 .

dezarmată total (fără ADN-T) ce conţine genele vir. S-au obţinut astfel sisteme de vectori binari ce constau dintr-o pereche de plasmide. kanamicină). co-integrarea la acest nivel a celor mai multe plasmide folosite în tehnicile de clonare în E. capabilă de replicare în E.coli. în care gena clonată iniţial în pBR322 este introdusă în pGV3850 (după Schell şi colab.o plasmidă cu spectru larg de gazdă (o plasmidă de tip "navetă". provenite din transpozoni bacterieni. Pentru depăşirea acestui impas s-au construit gene himerice care combină un promotor al unei gene care este funcţională în celula vegetală (cum ar fi promotorii genelor pentru sinteza nopalin-sintetazei sau octopinsintetazei. promotori virali de la CaMV etc) cu regiunea ce codifică un marker de rezistenţă la un antibiotic şi o secvenţă de terminare a mesajului genetic. ambele capabile de replicare în Agrobacterium: . după transferul lor mediat de vectorii derivaţi de la plasmidele Ti. Figura 6.tumefaciens). . Cornea T dezarmate a plasmidei pBR322 permite.C. Obţinerea unei plasmide co-integrate.o plasmidă Ti modificată. ce conţine gena ce trebuie introdusă în celula vegetală. în care regiunile vir şi ADN-T (respectiv extremităţile de 25 pb repetate direct) sunt separate fizic pe plasmide diferite. urmată de regenerarea unor plante în care se exprimă gena respectivă. împreună cu un marker de selecţie pentru celulele vegetale transformate (Figura 7). printr-o singură treaptă de recombinare (Figura 6). au permis selecţia celulelor vegetale transformate pe medii de cultură ce conţin antibioticul respectiv (de exemplu. P. 92 . Prin inserarea unor asemenea gene "marker" în vectori dezarmaţi a fost posibilă transformarea celulelor vegetale. ulterior. Integrarea şi exprimarea acestor gene himerice. O problemă mai dificilă este selecţia celulelor vegetale transformate cu un asemenea tip de vectori. nu sunt exprimate prin mecanismul de transcriere al celulelor vegetale. tot din ADN-T.coli şi în A. 1985). O altă strategie în transferul de gene în celula vegetală o constituie utilizarea vectorilor "binari". Genele de rezistenţă la antibiotice..

2. în sensul introducerii între marginile acestei regiuni a genomului virusului variegării porumbului. eventual. sau a CaMV. Printre cele mai studiate virusuri vegetale se numără: virusul mozaicului conopidei (CaMV). 1.Modificarea genetică a plantelor: principii generale de realizare. Tehnica utilizării vectorilor binari (după Tourte. Controverse Figura 7. Toate aceste gene sunt situate între extremităţile unui ADN-T. virusul piticismului la grâu (WDV). pentru obţinerea de plante transgenice au fost testaţi şi vectori derivaţi de la diferite virusuri specifice plantelor. În ultimii ani. Vectori virali Deşi se cunoaşte că Agrobacterium tumefaciens nu infectează monocotiledonatele (cu foarte rare excepţii). Reprezentarea schematică a vectorului binar Bin19 (după Tourte. mobilizare prin conjugare. virusul latent al maniocului (CLV). Figura 8. s-a reuşit transferul respectivelor gene la cereale. funcţii de replicare şi. sub controlul unor secvenţe promotor şi terminator adecvate (Figura 8). prin prelucrarea plasmidei Ti a ADN-T. 1998). 1998). la plante acest lucru nu s-a realizat pentru că virusurile ce infectează plantele sunt mai puţin cunoscute la nivel molecular. virusul mozaicului galben al 93 . Acest tip de infecţie a primit denumirea de agroinfecţie. Aplicaţii. De asemenea.2. aceasta plasmidă mai conţine un marker de selecţie bacteriană. Deşi la animale cei mai utilizaţi vectori sunt cei derivaţi de la retrovirusuri.

gena pentru β-glucuronidaza bacteriană (gena gus). asemănătoare ca organizare retrovirusurilor animale. chiar şi în absenţa unor vectori derivaţi de la virusuri. deşi funcţiile genelor CaMV sunt asemănătoare celor ale retrovirusurilor. ce codifică patru polipeptide: cele două subunităţi ale replicazei. 1. virus cu genom ARN.microinjectarea ADN în celule sau în ţesutul conducător (macroinjectarea). 1. cu protoplaşti vegetali. este absolut necesar ca. . celule întregi sau protoplaşti) folosindu-se ADN plasmidial modificat. . cu suspensii celulare vegetale. plantele transgenice ce conţin o asemenea genă au primit denumirea de plante "lampion"). . dintre virusurile vegetale. Genomul viral a fost prelucrat "in vitro". spre deosebire de acestea. a cărui lungime este 6. o proteină de înveliş şi o proteină importantă în procesul de infecţie al celulelor vegetale învecinate.metoda co-cultivării celulelor bacteriene (A. Cornea tomatelor (TGMV) etc. transformarea se realizează în prezenţa CaCl2 şi a polietilenglicolului (PEG). gena pentru sinteza nopalinei (gena nos) sau octopinei (gena ocs).rhizogenes ce conţin vectorii de clonare specifici) cu fragmente de ţesut vegetal (discuri foliare sau fragmente de tulpină). In prezent.utilizarea lipozomilor care să asigure protejarea ADN de interes faţă de acţiunea nucleazelor celulelor transformate. Un alt exemplu este cel al virusului mozaicului tutunului (VMT). produce lumină. în prezenţa substratului specific. Modalităţi de introducere a genelor de interes în celulele vegetale Pentru introducerea vectorilor de clonare recombinaţi în celulele vegetale ţintă au fost elaborate numeroase metode. Dezavantajul constă în faptul că se pot transfera doar fragmente de ADN cu dimensiuni mici. luciferina.4. gena pentru luciferază (gena lux ce determină sinteza luciferazei care.5kb. integrarea genelor clonate în celulele vegetale. cel mai cunoscut este CaMV. Markeri genetici pentru selecţia şi caracterizarea celulelor vegetale transformate Pentru a se putea evalua rapid transferul şi. mai ales. în celulele vegetale să se integreze şi anumite gene marker specifice. ele nu se integrează în genomul celulei vegetale. În orice caz. Dintre cele mai utilizate gene marker de selecţie pentru celulele vegetale transformate menţionăm: gena pentru neomicin fosfotransferază (gena nptII ce determină rezistenţă la kanamicină. gena pentru cloramfenicol-acetiltransferază (gena cat ce conferă rezistenţă la cloramfenicol).transformarea directă a protoplaştilor vegetali cu ADN plasmidial purificat dintr-o gazdă bacteriană. odată cu gena de interes. a căror eficienţă variază în funcţie de specia vegetală testată sau de tipul de ţesut utilizat în experimente. gena pentru proteina cu fluorescenţă verde (gena gfp = "green fluorescence protein")(Jefferson. . înlocuindu-se genele pentru proteinele capsidale cu gene marker a căror exprimare s-a urmărit la plantele inoculate. Este cazul promotorilor genelor pentru ARN 19S şi 35S de la CaMV care sunt foarte eficienţi. 94 . 3. P. mai ales pentru cereale. o serie de elemente virale sunt deja utilizate pentru construirea vectorilor de exprimare pentru celula vegetală. Mai mult.metoda biolistică (bombardarea celulelor vegetale cu microproiectile reprezentate de particule de tungsten sau aur coloidal acoperite cu ADN de interes).tumefaciens sau A. genele utilizate drept markeri pentru celulele vegetale transformate sunt de două tipuri: markeri de selecţie care asigură doar diferenţierea între celulele vegetale normale şi cele modificate genetic şi markeri cuantificabili care permit şi determinarea nivelului exprimării genelor clonate.C. Cu toate acestea. Dintre acestea menţionăm: .electrotransformarea celulelor vegetale (ţesut intact. cu lăstari sau chiar cu seminţe. .

Ca şi în cazul vectorilor pentru alte tipuri de organisme. 1995). Figura 8. nivelul proteinei GFP (McClean. în timp ce drept markeri cuantificabili pot fi utilizaţi: activitatea NPT II. este pBI121 (Figura 9). respectiv A. Figura 9. 1998). ceea ce înseamnă că ei pot funcţiona în două gazde diferite: E. Vectorii de clonare în celulele vegetale sunt derivaţi de la plasmide naturale (plasmidele Ti sau Ri de la Agrobacterium tumefaciens.coli şi Agrobacterium sp. activitaea β-glucuronidazică. producerea de opine. activitatea luciferazică. activitatea cloramfenicol-acetiltransferazei.Modificarea genetică a plantelor: principii generale de realizare. vectori de tip navetă. a produsului genei gus sau a genei lux) (Figura 8) sau prin teste fluorimetrice (pentru produsul genelor gus sau gfp). mult utilizat în experimentele de transfer de gene în celulele vegetale. iar anumite porţiuni ale lor se exprimă în celulele eucariote.. de obicei. Controverse 1988. 95 .rhizogenes) sau de la virusuri specifice celulelor vegetale. vectorii de clonare cel mai recent construiţi conţin cel puţin două gene marker. de exemplu. Niedz şi colab. ce asigură funcţionarea unor anumite secvenţe de ADN după integrarea lor în genomul celulelor vegetale. prin teste histochimice aplicate celulelor vegetale (pentru evidenţierea. Aplicaţii. cloramfenicol. Harta genetică a plasmidei pBI121. 1994). De remarcat că. Un exemplu de asemenea vector. vectorii pentru celulele vegetale sunt. Selecţia celulelor vegetale transformate se poate realiza. Lăstar de viţă de vie transformat cu un vector de clonare specific ce conţine gena pentru βglucuronidază şi evidenţierea activităţii enzimatice cu ajutorul unui test histochimic (după Martinelli şi Mandolino.. higromicină). fie prin cultivarea acestora pe medii de cultură specifice ce conţin antibioticele corespunzătoare (kanamicină.

1993) 96 . gena de rezistenţă la kanamicină).C. 1997). până în prezent au fost obţinute o serie de rezultate semnificative. unele aplicate deja în practică aşa cum sunt: plante transgenice rezistente la viroze. a gradului de înrudire dintre diferite specii etc (Gresshoff. plante transgenice rezistente la erbicide (figura 10). P. Ea are 13 kb şi conţine o serie de elemente genetice ce îi permit menţinerea în E. facilitând cunoaşterea modului de acţiune a genelor acestor organisme. din care se pot obţine gene importante din punct de vedere practic. Cele două gene marker au fost clonate sub controlul unor regiuni promotor sau terminator specifice: gena nptII este controlată de promotorul NOS (de la gena pentru nopalin-sintetază)(P1) şi de terminatorul NOS. plante transgenice capabile să sintetizeze metaboliţi secundari în cantităţi crescute. a localizării unor gene de interes. Comparaţie între aspectul unor plante transgenice de tutun rezistente la acţiunea erbicidelor şi cel al unor plante normale (după Tarano. între care au fost clonate două gene marker: gena de rezistenţă la kanamicină (nptII) şi gena ce codifică sinteza β-glucuronidazei (gus). 2.coli şi în diferite tulpini de Agrobacterium (ori. 1995). De asemenea. Acestea sunt: secvenţele marginale de 25pb (derivate de la ADN-T din plasmida Ti de la A. iar cele sălbatice constituie un mare rezervor genetic. De asemenea. plante transgenice rezistente la atacul unor dăunători. vectorul pBI121 conţine şi secvenţe ce sunt transferate în genomul celulelor vegetale. Cercetările de inginerie genetică la plante prezintă o semnificaţie teoretică deosebită. iar gena gus se află sub controlul promotorului 35S de la virusul CaMV (virusul mozaicului conopidei)(P2) şi a secvenţei terminatoare NOS. Interesul deosebit al cercetătorilor pentru introducerea de gene heterologe în celulele vegetale şi pentru studiul funcţionării lor. a mecanismelor de inactivare a genelor etc. Acest tip de vector permite sinteza de proteine de fuziune prin clonarea genei de interes la nivelul MCS localizat după promotorul 35S. plante transgenice producătoare de anticorpi „comestibili” etc. a condus la construirea unor vectori din ce în ce mai perfecţionaţi.tumefaciens) esenţiale pentru transfer. Figura 10. plante transgenice de interes horticol (plante ornamentale cu fenotipuri noi. 1994. prin aplicarea tehnicilor de biologie moleculară se pot obţine informaţii utile asupra particularităţilor genomului plantelor folosite în ameliorare. În ceea ce priveşte aplicaţiile practice. Edwards şi Karp. Cornea Plasmida pBI121 este un derivat al plasmidei pBin19 construită de Bevan în 1984. Unii dintre asemenea vectori permit exprimarea diferenţiată a unor gene clonate: la nivelul unor organe specifice ale plantei sau în diferite momente ale dezvoltării acesteia. Aplicaţii ale transgenezei la plante Speciile vegetale prezintă o mare diversitate genetică. (Meyer. plante care produc fructe rezistente la înmuiere). a efectelor fitohormonilor asupra dezvoltării plantelor.

Aplicaţii. pe de o parte. gene de la plante ce codifică sinteza unor lectine specifice. în funcţie de tulpina bacteriană. pe de o parte extinderea numărului de specii de plante la care transferul de gene utile să fie eficient şi. în mod normal.. Insectele determină scăderea producţiei agricole atât prin acţiune directă cât şi prin acţiune indirectă. Aşa cum se poate vedea din cele spuse mai sus. Dintre acestea sunt de amintit: genele ce codifică producerea δ-endotoxinei de la Bacillus thuringiensis. 2. Obţinerea de plante rezistente la dăunători reprezintă poate domeniul cel mai spectaculos al ingineriei genetice aplicate la plante. pe de altă parte. estimate la un cost de aproximativ 10 miliarde de USD anual. lepidoptere. 2000). tenebrionis care sintetizează o δ-endotoxină eficientă împotriva gândacului de Colorado. In ultimii ani. Protecţia plantelor faţă de atacul insectelor Pierderile înregistrate anual de producţia agricolă globală datorită atacului insectelor dăunătoare sunt estimate la aproximativ 14%. fie nu au fost pe deplin rezolvate. de dimensiuni mari. tehnologiile respective nu sunt accesibile tuturor utilizatorilor posibili. 58% la soia şi 84% la bumbac (Oerke şi colab. care produc o toxină. 74% la cartof. Controverse Pe lângă aceste reuşite. au fost descoperite o serie de noi gene pentru rezistenţa la atacul insectelor. cercetările efectuate în prezent vizează. în continuare vor fi prezentate doar câteva dintre aceste tipuri de aplicaţii. Genele pentru δ-endotoxina de la Bacillus thuringiensis După descoperirea sa în 1901 de către Ishiwata. ca vectori ai unor fitopatogeni variaţi. Limitarea acţiunii acestora se realizează prin folosirea pesticidelor. capabilă să omoare o gamă foarte largă de insecte (coleoptere.Modificarea genetică a plantelor: principii generale de realizare. fie pot aduce noutăţi în plan fundamental şi practic. obţinerea de recolte mai bogate şi.1. la majoritatea tulpinilor bacteriene. Aceasta asigură. a efectelor asupra altor organisme decât cele ţintă sau asupra mediului. 83% la orez. gene care determină inducerea sintezei unor compuşi vegetali de tipul fitoalexinelor etc.1. numită delta-endotoxina sau proteina cristal. Tehnologia ADN recombinant oferă în prezent posibilitatea obţinerii de noi insecticide biologice care păstrează avantajele agenţilor biologici „clasici” de control având în plus unele caracteristici noi. În elaborarea metodologiei de clonare s-a pornit de la observaţia că există un grup de bacterii Gram pozitive. s-a dovedit că proteina cristal (δ-endotoxina) este exprimată. diptere). această bacterie a fost supusă unor cercetări asupra producerii unor substanţe inhibitorii pentru insecte astfel că în 1951 a fost elaborat un biopesticid care a stat la baza obţinerii unor produse cunoscute sub numele de Thuricid şi Dipel. reducerea cheltuielilor fermierilor pentru pesticide. gene pentru sinteza unor enzime sau a unor inhibitori enzimatici. în timp ce raportat la anumite specii vegetale în parte pierderile sunt mult mai mari: 52% la grâu. De mare interes este tulpina B. care suferă o 97 . Genele implicate în sinteza acestei proteine sunt localizate. din considerente comerciale. producerea toxinei făcându-se în cursul sporulării. aplicaţiile plantelor transgenice sunt extrem de diverse astfel că abordarea tuturor direcţiilor într-o singură lucrare nu este posibilă. ca o pro-toxină inactivă. transferabile la plante. studii asupra controlului dezvoltării plantelor şi a exprimării genelor (activarea şi silenţierea genelor) (Chua şi Sundaresan. Cu toate acestea. pe plasmide de dimensiuni mari (75 kb). De asemenea. deoarece a permis regenerarea de plante transgenice care conţin gene de origine bacteriană ce le asigura protecţie faţă de anumite insecte dăunătoare. 1994).thuringiensis var. aparţinând speciei Bacillus thuringiensis. Din acest motiv. 59% la porumb.1. insistându-se pe cele care fie au potenţial aplicativ spectaculos. pe de altă parte. 2. în plus au generat o serie de dezbateri publice asupra utilităţii lor. mai ales dacă aceştia sunt săraci şi.

1998). transferate în celule de A.endotoxine este foarte mare: 140 de gene cu specificitate pentru lepidoptere.tumefaciens ce conţin plasmide Ti dezarmate. 98 . pentru a mări exprimarea genei în plante.thuringiensis prin amplificare genetică (PCR).C. Aceste gene recombinate au fost introduse în vectori derivaţi de la plasmida Ti (vectori binari ce conţin promotorul CaMV duplicat. ceea ce conduce la moartea insectelor. 1992). ce conţine doar informaţia pentru porţiunea N-terminală a proteinei (aminoacizii 1-645) (Figura 11). Cornea prelucrare proteolitică în intestinul insectei sensibile. ce conţine codonii preferaţi de celulele vegetale. Figura 11. s-a realizat o genă modificată. Aceasta recunoaşte receptorii specifici de la nivelul celulelor intestinale şi blochează funcţiile acestor celule. P.genele cry de tipul IV codifică proteine inhibitorii pentru larvele de diptere. coleoptere şi diptere (Crickmore şi colb. S-a reuşit obţinerea genelor pentru proteina cristal de la mai multe tulpini de B. devenind toxină activă. fapt ce măreşte de 5 ori procesul de transcriere şi gene marker de selecţie – pentru rezistenţa la antibiotice sau la erbicidul fosfinotricin). Deoarece s-a dovedit că gena întreagă pentru proteina cristal se exprimă foarte slab în celulele vegetale transformate. Mai mult.genele cry de tipul II codifică proteine de 70 kDa active asupra larvelor de diptere şi lepidoptere .genele cry de tipul I codifică proteine de 130 kDa specifice pentru larvele de lepidoptere ..genele cry de tipul III codifică proteine de 70 kDa cu acţiune specifică asupra larvelor de coleoptere . Trebuie precizat însă faptul că numărul de gene identificate că sunt codificatoare pentru proteine de tip δ. bogată în GC. Studiile asupra genelor ce codifică proteinele inhibitoare produse de B.thuringiensis au condus la gruparea acestora în patru tipuri pe baza specificităţii de acţiune (de tipul de insectă ţintă) şi a secvenţei de nucleotide: .. folosite pentru obţinerea de plante transgenice rezistente la atacul unor dăunători (după Carozzi şi colab. secvenţa naturală pentru aminoacizii 1-415 bogată în AT a fost înlocuită de o secvenţă sintetică. Reprezentarea schematică a plasmidelor recombinate ce conţin gena cry A(b) de la Bacillus thuringiensis.

tutun. peroxidaza sau izopentenil transferaza (ipt) ar putea constitui o alternativă la utilizarea genei pentru δ endotoxină (Sharma şi colab. (1993) au utilizat o metodologie asemănătoare pentru a transforma plante de orez. 1989) sau în polen (prin folosirea unui promotor derivat de la gena pentru o protein kinază dependentă de calciu = CDPK)(Estruch şi colab. 1993).. Selecţia s-a realizat mai întâi în funcţie de markerii de selecţie purtaţi de vectori (rezistenţa la antibiotice.02% din totalul de proteine vegetale (din frunze). caracterul menţinându-se şi exprimându-se şi în cazul experimentelor în câmp. Arencibia şi colab. 1997). 1987).thuringiensis.2. plantele transgenice de tutun care 99 . clonată sub controlul unui promotor constitutiv astfel încât proteina inhibitoare reprezintă 0. enzime care acţionează asupra chitinei.. 2000). O altă variantă de clonare a genei pentru toxina bacteriană a fost aceea a utilizării unor elemente genetice care asigură exprimarea genei de interes exclusiv în porţiunile verzi ale plantei (promotorul derivă de la gena pentru PEPC)(Hudspeth şi Grula. Studiile de toxicitate efectuate asupra plantelor transgenice ce exprimă gena pentru δ endotoxină au dovedit că existenţa transgenei nu modifică particularităţile normale ale respectivelor plante.. Dată fiind semnificaţia practică a rezistenţei plantelor la insectele dăunătoare cercetările au fost extinse şi la alte specii de plante. 1998). testul GUS. Tulpinile bacteriene recombinate au fost apoi utilizate pentru infectarea plantelor test (cartof.(1993). modul lor de acţiune fiind asemănător cu al δ endotoxinei (Estruch şi colb. 1997).(1997) au utilizat pentru clonare o genă modificată cry 1A(b) sub controlul promotorului CaMV şi au obţinut plante transgenice de trestie de zahăr cu rezistenţă la larvele de Diatraea saccharalis. colesterol oxidaza. bumbac). au mai fost identificate şi alte specii de bacterii care produc proteine cu efect insecticid. Aplicaţii. rezistenţa la erbicid etc). astfel că nivelul exprimării genei de interes a condus la obţinerea unui nivel ridicat al toxinei: 0. component de bază al învelişurilor insectelor.Modificarea genetică a plantelor: principii generale de realizare. obţinându-se plante de vinete rezistente la atacul unor coleoptere (Arpaia şi colab. un loc aparte este ocupat de chitinaze. Controverse Mărimea plasmidelor recombinate obţinute variază între 5000 şi 10.1. VIP 1 şi VIP2 cu efect asupra unor insecte. Fujimoto şi colab. întreagă sau trunchiată. Prima plantă transgenică obţinută care manisfestă rezistenţă la atacul insectelor aparţine speciei Nicotiana tabacum (Vaeck şi colab. Gene pentru sinteza unor enzime sau a unor inhibitori enzimatici cu efect insecticid Exprimarea de către plantele transgenice a unor enzime cum ar fi chitinaza.. brocoli cu rezistenţă la anumite specii de lepidoptere (Selvapandian şi colab. Pe lângă δ endotoxina produsă de tulpini de B. Acesta este cazul unor tulpini de Bacillus cereus care produc două proteine. clonată sub controlul promotorul CaMV 35S sau sub controlul unui promotor şi a unei secvenţe pentru o peptidă de tranzit prin cloroplaste izolate de la Arabidopsis. fenol-oxidaza. 2. cu excepţia rezistenţei la atacul insectelor. 1999) etc precum şi o serie de progrese la plante leguminoase (Ortiz şi colab. Astfel. iar în final. ea exprimând gena cry 1A.Câţiva ani mai târziu (1992) au fost obţinute plante de bumbac în care a fost introdusă gena cry 1A(c) modificată.. lipoxigenaza. Dintre enzimele care pot asigura protecţie plantelor transgenice faţă de atacul insectelor. prin clonarea unei gene cry III sintetică au obţinut plante transgenice de tutun şi cartof rezistente la atacul gândacului de Colorado. 2000).1% din proteina totală. în funcţie de dimensiunea genei bacteriene şi a secvenţei promotor integrate în vector (Koziel şi colab. respectiv 1%.. iar Perlak şi colb. Mai recent. porumb cu rezistenţă la Busseola fusca (Rensburg şi colab... plantele regenerate au fost supuse atacului insectelor.000 pb. 1994).. Plantele transgenice regenerate au manifestat rezistenţă la atacul insectelor dăunătoare.

Yeh şi colab. introducerea şi exprimarea genei cho A pentru colesterol oxidază de la Streptomyces sp. Cu toate acestea... porumb etc. 1995). ceea ce a condus la o rezistenţă mai mare faţă de Collasobruchus sp. Cornea exprimă gene pentru chitinază izolate de la insecte (Ding şi colab.. 1993). proteinele codificate putând constitui adevărate "arme de apărare" pentru plantele transgenice ce le conţin (Foard şi colab. Bowman Birk proteinase inhibitor) sau lectine. O altă realizare importantă a fost aceea a introducerii în celulele vegetale a genei cpt2 ce codifică o proteină inhibitoare pentru tripsina.. Lectinele vegetale reprezintă un grup special de glicoproteine care au funcţii protectoare faţă de o serie de organisme dăunătoare. 1996.. depind de serin-proteaze (tripsină. Astfel. în plante de tutun a condus la o rezistenţă crescută a plantelor transgenice obţinute faţă de larve de Anthonomus grandis (Cho şi colab.persicae)(Smigocki şi colab. în cazul anumitor inhibitori. protejând în felul acesta plantele transgenice de atacul unor dăunători. În mod similar au fost clonate în diferite gazde şi alte gene ce codifică inhibitori proteazici (Kunitz trypsin inhibitor. este cunoscut faptul că numeroase insecte. cum sunt cei pentru serin-proteaze. 1983). nemodificate genetic (Edmonds şi colab. plantele transgenice obţinute au manifestat o rezistenţă crescută faţă de diferite insecte dăunătoare comparativ cu plantele normale.. Studiile asupra acestor glicoproteine au dovedit că acestea produc efecte puternice asupra dezvoltării unor tipuri variate de insecte. de exemplu)(Malone şi colab.. O serie de gene ce codifică diferiţi inhibitori pentru serin-proteaze au fost izolate din diferite surse (plante. (Schroeder şi colab. cum ar fi Medicago sativa. Utilizarea pentru clonare a genei pentru enzima izopentenil transferaza (ipt) bacteriană (implicată în biosinteza citochinelor) prin fuziune cu promotorul genei pentru inhibitorul proteazic II (PI-IIK) a determinat obţinerea unor plante transgenice de Nicotiana plumbaginifolia rezistente la acţiunea larvelor unor lepidoptere specifice (Manduca sexta sau M. microorganisme) şi clonate în diferite specii vegetale. Primul exemplu de plante transgenice ce conţin gene pentru lectine nespecifice şi care manifestă toxicitate pentru dăunători este reprezentat de plante tutun la nivelul cărora au fost clonate genele pentru lectina de la mazăre (Boulter şi colab. acestea fiind primele enzime ce realizează procesul de digestie. 1993) manifestă o rezistenţă crescută la lepidoptere. au fost izolate şi caracterizate genele pentru diferiţi inhibitori pentru α-amilază (de la grâu şi fasole). O altă enzimă de origine bacteriană care manifestă acţiune insecticidă este colesterol oxidaza. Spre exemplu.. 1998) sau de la fasole (Gatehouse şi colab. în anumite cazuri s-a remarcat faptul că introducerea în plante a unor gene suplimentare pentru inhibitori proteazici care să se alăture celor endogene determină un nivel crescut al rezistenţei la patogeni a plantelor transformate.C... P. după clonarea în plante de tutun a genei izolate de la grâu în tutun s-a observat o creştere a mortalităţii larvelor de lepidoptere de până la 40%. De asemenea. Cu toate acestea. 1997). cum ar fi lepidopterele. tutun.1995). chemotripsină sau elastază). 1996). efectul insecticid se manifestă şi asupra unor insecte utile (asupra albinelor. Metabolismul glucidelor de la insecte reprezintă o altă ţintă pentru agenţii inhibitori testaţi în numeroase studii. 1990). s-a observat faptul că prin clonarea genei pentru chitinază izolată de la bacteria Serratia marcescens s-a evidenţiat un efect sinergic al endochitinazei produse de plantele transgenice ce conţin suplimentar gena pentru δ-endotoxină faţă de larvele de Spodoptera litoralis (Rigev şi colab. Astfel. izolată de la Vicia faba.. multe 100 . utilizarea inhibitorilor proteazici pentru controlul insectelor dăunătoare necesită studii amănunţite asupra interacţiunilor dintre plante şi insecte deoarece s-a observat că. 1995). Mai mult. In cazul clonării în plante de mazăre a genei pentru inhibitorul α-amilazei de la fasole sub controlul promotorului genei pha 1 s-a obţinut o exprimare crescută a genei străine la nivelul seminţelor. Această proteină are efect antimetabolic.

a implicaţiilor ecologice ale utilizării lor şi.Modificarea genetică a plantelor: principii generale de realizare. în principal combinarea în aceeaşi gazdă a genelor pentru o δ-endotoxină de la B. 1999. afide. virali şi la nematode Rezistenţa plantelor la diferite boli a constituit un subiect pentru studii efectuate de multă vreme. De exemplu.. 1998).. cum este putregaiul provocat de Phytophtora infestans a trebuit abandonat deoarece rezistenţa la această boală a plantelor de cartof obţinute prin transferul celor 11 gene de rezistenţă pe baza încrucişărilor cu specia sălbatică Solanum demissum s-a dovedit a fi de scurtă durată (Landeo şi colab. lectinei cu specificitate pentru manoză de la ghiocel şi concanavalinei A: genele pentru aceste lectine au fost clonate în diferite specii de plante (tutun.. Cercetările efectuate sunt de dată relativ recentă şi vizează. Mai mult. Aplicaţii. a legumelor şi a plantelor oleaginoase. programul de control al anumitor boli. gena pentru inhibitorul tripsinei de la Vicia faba (CpTI) sau pentru serin-proteaze (Cornu şi colab. Stoger şi colab... genele utilizate pentru transformarea plantelor de cultură sunt fie prea specifice fie sunt doar parţial efective asupra ţintelor reprezentate de insectele dăunătoare. O atenţie specială a fost acordată. 1996. De aceea. la posibila toxicitate pentru om şi animale. gena pentru proteina din învelişul virusului Y de la cartof (Li şi colab. 2. grâu) iar proteinele heterologe sintetizate de acestea au determinat o sensibilitate redusă faţă de atacul unor insecte dăunătoare (larve de lepidoptere. coleoptere)(Nutt şi colab. 1999). mai puţine rezultate au fost raportate în cazul cerealelor.thuringiensis cu o altă genă cu efect inhibitor: de exemplu. de mulţi specialişti. Procesul este considerabil accelerat prin utilizarea markerilor moleculari generaţi prin aplicarea tehnicilor RFLP („restriction fragment lenght polymorphism”). inclusiv la grâu sau orez (Rao şi colab. Controverse dintre lectinele vegetale au efect toxic şi asupra mamiferelor. în ciuda rezultatelor remarcabile obţinute până acum. respectiv 28 de copii. reuşindu-se identificarea unui număr relativ mare de gene de rezistenţă. 2000). nu în ultimul rând la preţul de cost care trebuie să fie accesibil fermierilor şi ţărilor sărace(Riva şi colab... De asemenea. în cazul cartofului. cartof. ceea ce limitează utilizarea lor ca agenţi de mărire a rezistenţei plantelor la dăunători. Rezultatele obţinute sugerează că utilizarea plantelor transgenice ce conţin gene insecticide (cum ar fi cea pentru lectina din ghiocel) împreună cu un management integrat reprezintă posibilităţi promiţătoare pentru controlul dăunătorilor de la multe specii vegetale.(1997) care au introdus gena cry1A(c) într-o tulpină de Pseudomonas fluorescens capabilă să colonizeze trestia de zahăr prin intermediul a două plasmide. doar în foarte puţine cazuri acest lucru a fost adevărat. O altă abordare interesantă este aceea prezentată de Herrera şi colab.2. tomate. RAPD („random amplified polymorphic DNA”). trestie de zahăr. Testarea tulpinilor bacteriene recombinate asupra unor insecte dăunătoare specifice trestiei de zahăr a evidenţiat o rezistenţă mai mare a plantelor tratate cu bacteriile respective decât cele netratate.. pentru a folosi plantele transgenice ca adevărate „arme” pentru controlul dăunătorilor ar fi necesar ca la nivelul lor să existe transgene care să determine sinteza unor compuşi cu acţiuni diferite asupra aceleiaşi ţinte. Gene de rezistenţă la fitopatogeni microbieni. deşi s-au obţinute plante transgenice cu rezistenţă la insecte dăunătoare în cazul mai multor specii de plante cultivate. pDER405 şi pKT240 la nivelul cărora gena se găseşte în 13. Zhao şi colab. Ca o concluzie se poate spune că. identificarea eventualelor gene de rezistenţă în genomul diferitelor specii vegetale şi transferul lor la alte plante de cultură este extrem de dificilă şi consumatoare de timp dacă se utilizează metodele tradiţionale (hibridările intra. orez. Deşi s-a crezut că genele endogene de rezistenţă ar asigura un efect durabil pentru plantele corespunzătoare. 1995).şi interspecifice). în cazul acestor plante sunt necesare studii suplimentare referitoare la siguranţa lor. De asemenea. 1998). SSR („single sequence repeat”) sau SNP („single nucleotide polymorphism”) 101 . 1999).

Un comportament interesant a fost observat în cazul genei Myb1 care este indusă prin infecţia cu VMT a plantelor de tutun rezistente şi care determină sinteza unui factor de transcriere care se leagă la nivelul promotorului unei gene implicate în patogeneză (gena PR1a). 1999). Aplicarea markerilor moleculari a permis izolarea a aproape 20 de gene de rezistenţă (gene R) de la specii de plante bine caracterizate din punct de vedere genetic. 1997. izolată de la Arabidopsis thaliana. Cornea (Schneider şi colab. Aşa este cazul genelor Bs2 de la ardei şi Xa21 de la orez care asigură rezistenţa la diferite tulpini fitopatogene de Xanthomonas campestris sau X. după clonarea sa sub controlul unui promotor puternic cum este cel de 35S la CaMV determină rezistenţa plantelor de tomate transformate atât la tulpinile de Pseudomonas syringae pv. dovedindu-se că multe dintre ele sunt grupate la nivelul unor regiuni cromosomale specifice (formează „clusteri”). 1996). Supraexprimarea acestei gene măreşte rezistenţa plantelor de Arabidopsis thaliana sau de orez la o mare varietate de patogeni (Cao şi Dong.. Au fost examinate atât plante ce conţin gene R sau gene implicate în SAR. a enzimelor generatoare de H2O2. puţine gene R s-au dovedit a asigura un control durabil al bolilor la plante. unele au fost transferate altor specii de plante decât cele de origine.. Aşa cum s-a menţionat deja.C. se dovedeşte extrem de interesantă pentru dezvoltarea rezistenţei cu spectru larg. 1999). cum ar fi Xanthomonas campestris şi Cladosporium fulvum (Tang şi colab. 1998). Eforturile cercetătorilor de a obţine sisteme de rezistenţă aplicabile la un număr cât mai mare de specii vegetale nu se limitează doar la genele R ci includ şi mecanismele sistemice de apărare pe care le declanşează infecţia cu un anumit patogen („systemic acquired resistance” = SAR).. Gold şi colab. 2000). P. la tomate)(Wang şi colab. Rezistenţa în cazul acestor gene se datorează faptului că ele asigură recunoaşterea unor proteine pe care le produc bacteriile sau fungii fitopatogeni. cu ajutorul unor vectori specifici care asigură transferul unor fragmente de dimensiuni mari (Hamilton. prin acumularea în celulele vegetale a unui compus antifungic de tip fenolic denumit p-cumaroilhidroxiagmatina.oryzae în cazul unor specii în care genele respective au fost clonate (de exemplu. Prelucrarea „in vitro” a numitor gene R şi apoi introducerea lor în noi gazde conferă posibilităţi noi de rezistenţă. 1999). a β glucanazelor sau chitinazelor (Broekaert şi colab. Alături de aceasta.. Dintre aceste gene de rezistenţă. Un alt exemplu de genă R cu acţiune durabilă este gena recesivă mlo de la orz care asigură rezistenţa plantelor ce o conţin la toate tulpinile de Erysiphe graminis. Pad4. 1999). Au fost izolate şi caracterizate mai multe gene implicate în SAR.: supraexprimarea genei respective în plante transgenice sporeşte şi rezistenţa faţă de fitopatogeni (Jirage şi colab. dintre care. 1998). 1999). Spre exemplu. cât şi gene de tipul celor ce codifică glucooxidaza (AGO) de la Aspergillus sp.(Rommens şi Kishore.. Modificarea nivelului de exprimare a genei Myb1 în plantele transgenice de tutun conduce la o rezistenţă crescută faţă de infecţia virală (cu VMT) ca şi faţă de fungul patogen Rhizoctonia solani(Klessig şi Yang. gena Npr1 care codifică un reglator transcripţional constituie o genă cheie în acest sistem.tomato cât şi la patogeni neînrudiţi. deşi la nivel de laborator plantele transgenice de cartof ce conţineau gena fungică pentru glucozoxidază au manifestat o rezistenţă crescută faţă 102 . Se preconizează ca această genă să fie utilizată pentru supresia prin tehnica antisens a genei dominante Mlo de la grâu sau de la alte specii de plante sensibile la Erysiphe sp. 1997). evidenţiindu-se faptul că în acest fel că genele R acţionează sinergic şi asigură o rezistenţă durabilă la unele boli.. Acestea este cazul genei avrPto de la tomate care. numeroase companii biotehnologice şi universităţi au început să evalueze performanţele plantelor transgenice ce exprimă proteine antifungice atât prin experimente „in vitro” cât şi în câmp. rezultatul fiind declanşarea unui fenomen de hipersensibilitate al plantei şi necroza ţesuturilor afectate (Lauge şi colab. a defensinelor. prin tehnici de clonare moleculară. In ultimii ani.. o altă genă recent clonată.

Arakawa şi colab. HIV sau virusul hepatitei murine. Pseudomonas aeruginosa. s-a reuşit o creştere de 3-14 ori a acumulării antigenului în frunzele sau tuberculii de cartof transgenic. In acest sens au fost elaborate tehnologii de obţinere a vaccinurilor subunitare care au avantajul că elimină utilizarea de virusuri „vii” sau de microorganisme patogene active..Modificarea genetică a plantelor: principii generale de realizare. se asigură o stabilitate pentru produsul obţinut. sunt examinate posibilităţile de a îmbunătăţi exprimarea unor antigeni prin realizarea unor gene sintetice. Tackberry şi colab. prin demonstrarea caracterului imunogen al unui antigen bacterian recombinat produs de plante transgenice de cartof: administrarea „vaccinului” comestibil a condus la inducerea unui răspuns imun la nivelul mucoaselor (Tacket şi colab. Experimente recente efectuate de Brennan şi colab.. Proteinele antigenice derivate de la plantele transgenice elimină sau previn unele boli la animale. 1992. 1997..3-glucanaza intracelulară.tumefaciens cât şi pe folosirea unor virusuri vegetale recombinate drept vectori ai genelor. Producerea unor asemenea vaccinuri în plante elimină unele impedimente curente: preţul de cost ar fi mic. cum ar fi cele pentru chitinază şi pentru β-1. iar efectul antigenic s-a dovedit prin hrănirea şoarecilor (Mason şi colab. 1998). Aplicaţii.. Primele încercări de a obţine vaccinuri produse de plante datează din anul 1990 când Curtiss şi Cardineau au determinat exprimarea unei proteine antigenice de la Streptococcus mutans (proteina SpaA) după clonarea genei codificatoare în plante de tutun.. In cazul altor gene. supraexprimarea acestora în plante transgenice de tomate a determinat o rezistenţă semnificativă faţă de Fusarium oxysporum (Cornelissen şi colab. dar dezavantajul că sunt termosensibile şi foarte scumpe. După incorporarea de ţesut vegetal transformat în dieta şoarecilor. McGravey şi colab..3. Controverse de fitopatogeni.. 2000). 1998). 2000). s-a obţinut un răspuns imun la nivelul mucoaselor faţă de proteina Spa A. Una dintre direcţiile promiţătoare în acest sens este obţinerea de plante transgenice în care să se exprime gene pentru diferiţi antigeni. Cele mai recente studii referitoare la vaccinurile „comestibile” produse de plante transgenice ţin de stabilirea metodelor optime de administrare şi dozare. a subunităţilor toxinei holerice în plante transgenice de tutun sau cartof sau a glicoproteinei B de la citomegalovirusul uman în plante transgenice şi seminţe de tutun (Mason şi colab. atunci când au fost trecute în câmp rezultatele au fost neconcludente. Metodologia de transfer a genelor de interes în plante se bazează atât pe sistemele ce utilizează vectorii de clonare derivaţi de la plasmidele Ti de la A. a tipului de răspuns imun şi a duratei sale în cazul patogenilor de tipul Vibrio cholerae. S-a dovedit că răspunsul imun al unui organism faţă de un anumit patogen poate fi indus prin utilizarea unor polipeptide similare celor din structura epitopilor agenţilor etiologici (Vior. Cercetări ulterioare au permis exprimarea antigenului de suprafaţă de la virusul hepatitei B în plante transgenice de tutun şi salată. 1997) 2. iar administrarea se poate face pe cale orală şi nu prin injectare. ca în cazul subunităţii B a enterotoxinei termolabile de la Escherichia coli: prin îndepărtarea din gena „naturală” a unei secvenţe de nucleotide care determină prelucrarea ineficientă sau degradarea prematură a proteinei heterologe în plantă. 1995. a unei glicoproteine antigenice de la virusul turbării în plante transgenice de tomate. Primele testări clinice ale unui vaccin produs de plante au fost realizate în 1998. 1999). (1999) au evidenţiat posibilitatea folosirii unor proteine antigenice derivate de la Staphylococcus sureus produse de plante 103 . De asemenea. se elimină riscul contaminării de patogeni animali. iar în testele clinice în cazul oamenilor ele s-au dovedit a fi sigure şi funcţionale (Walmsley şi Arntzen. Plante transgenice producătoare de vaccinuri comestibile sau de anticorpi Progresele înregistrate în ultimii 10 ani în biologia moleculară şi în domeniul imunologiei au permis o mai bună înţelegere a numeroase boli şi au condus la dezvoltarea unor strategii noi pentru vaccinare.

Plantele transgenice au fost obţinute prin utilizarea sistemului de transformare mediat de Agrobacterium tumefaciens. au fost încrucişate între ele şi s-a examinat producerea de anticorpi funcţionali (asamblaţi) de către plantele apărute în descendenţă (Figura 12).(1989). respectiv uşor (catena L).C. în plantele transgenice descendente detectându-se prezenţa anticorpilor funcţionali. Cele două tipuri de plante transgenice regenerate. una exprimând catena H iar cealaltă catenă L. ce alcătuiesc anticorpii (de exemplu. Producerea primului tip de anticorp recombinat sintetizat de plante a fost descrisă de Hiatt şi colab. a genelor ce codifică lanţul greu (catena H). Rezultatele obţinute au fost încurajatoare. vaccin oral obţinut din cartof care conţine antigenul de suprafaţă al virusului hepatitei B (HbsAg). O a doua strategie interesantă este clonarea în plante a genelor ce codifică sinteza unor anticorpi specifici. P.coli. Prezentarea schematică a procedeului de obţinere de anticorpi prin clonarea genelor codificatoare în celulele vegetale (adaptare după Watson şi colab. ei reprezentând aproximativ 1-1. Cornea transgenice ca vaccinuri orale sau nazale: prin administrarea la şoareci a probelor respective şi examinarea ulterioară a unor fluide recoltate de la animalele tratate (de la nivelul bronhiilor sau a intestinului) au fost detectate imunogloguline de tipul IgA şi IgG specifice pentru antigenul folosit în toate fluidele testate. pentru obţinerea de „anticorpi monoclonali vegetali”.5% din totalul proteinelor celulare extrase din frunze. Mai mult. vaccin antidiareic (pentru formele de boală de origine virală) ((Walmsey şi Arntzen. 2000). în plante diferite. Figura12. urmărind clonarea separată. s-a dovedit că anticorpii funcţionali au fost produşi doar atunci când moleculele de ADNc ce codifică cele două tipuri de catene 104 . 1992). pentru anumite tipuri de vaccinuri produse de plante: vaccin antidiareic ce conţine o proteină sintetică derivară de la subunitatea B a toxinei termolabile de E. Experimentele realizate la tutun au presupus două etape. In paralel se realizează teste pe voluntari umani. produs de plante de cartof transgenic. IgG1).

rhizogenes sau genele iaaM şi iaaH de la Pseudomonas syringae pv. supraexprimarea în plante transgenice de A. permiţând exprimarea genelor clonate sub controlul lor.Modificarea genetică a plantelor: principii generale de realizare. Deşi promiţătoare.thaliana a uneia dintre genele pentru GA 20-oxidaza (enzimă cheie în procesul de biosinteză a GA) determină stimularea creşterii plantelor. aceste experimente sunt abia la început. consecinţa acumulării CK fiind formarea de muguri laterali. în schimb. Aplicaţii.tumefaciens genele aux de la A. Utilizarea drept plante test a speciilor Arabidopsis thaliana şi Nicotiana tabacum a evidenţiat faptul că există mai multe căi posibile de biosinteză ale IAA. Plante transgenice folosite pentru cercetări asupra unor procese fiziologice fundamentale Formarea ţesuturilor tumorale ca urmare a introducerii unor gene bacteriene în genomul vegetal prin transformarea realizată de bacteriile din genul Agrobacterium constituie un exemplu de modificare genetică naturală a procesului de biosinteză a fitohormonilor. introdusă în plante de rapiţă. Controverse ale unui anticorp conţin o secvenţă semnal derivată de la genele pentru anticorpi de şoarece. ulterior.tumefaciens. plantele transgenice ce conţin o genă antisens pentru gena normală At20ox1 prezintă o reducere a alungirii tulpinii. 1998). s-a dovedit că sinteza enzimei GA 20oxidaza este codificată de cel puţin trei gene diferite. plantele transgenice ce conţin gena antisens pentru gena At20ox2 prezintă o creştere normală deşi internodiile sunt mai scurte iar plantele produc mai puţine silicule. In cazul examinării biosintezei citokininelor au fost înregistrate niveluri crescute în cazul plantelor transgenice ce conţin gena ipt (pentru isopentenil transferaza) de la A. la nivel de bioreactor sau direct în câmp. prin clonarea genei tzs de la A. 1994). Pornind de la această observaţie.. O atenţie specială a fost acordată giberelinelor (GA) al căror nivel în plante poate fi controlat cu ajutorul unor substanţe chimice: prin inhibarea biosintezei GA este stimulată creşterea unor plante. Studiile efectuate asupra biosintezei de auxine au dovedit că aceasta este crescută în cazul plantelor transgenice ce conţin gene bacteriene cum ar fi: tms de la A. 105 . modularea exprimării genelor ce codifică biosinteza GA prin utilizarea plantelor transgenice asigură aplicaţii importante în agricultură. la un preţ de cost convenabil (Whitelam şi colab. Astfel. s-a obţinut o secvenţă notată hsp70-tzs care. fenomene asociate cu o acumulare de gibereline. planta se dezvoltă normal. 2000). unele implicând triptofanul ca intermediar iar altele presupunând implicarea indolului sau a unor alţi precursori timpurii.savastanoi. Clonarea genei ipt sub controlul unor promotori variaţi (constitutivi. are loc o reducere a lungimii hipocotilelor în cursul dezvoltării răsadului dar. iar nivelul GA este la o treime faţă de normal.tumefaciens (ce codifică un fitohormon cu acţiune similară produsului genei ipt) sub controlul unui promotor inductibil prin căldură. fenotipul este de semi-piticism. alungirea tulpinii şi o înflorire precoce. Spre exemplu. In cazul utilizării genei antisens pentru At20ox3. a determinat o creştere a nivelului transzeatinei şi a condus la creşterea numărului de seminţe per silicvă (Roeckel şi colb. Astfel. prin integrarea în genomul plantelor gazdă a genelor bacteriene care induc sinteza anormală a acidului indolilacetic (IAA) şi a citokininelor (CK) determină proliferarea necontrolată a celulelor vegetale. fiind necesare studii suplimentare în vederea optimizării producerii unor asemenea compuşi de către celulele vegetale. 2. proces cu implicaţii practice deosebite.. De asemenea. De aceea. pierderea dominanţei apicale şi reducerea formării de rădăcini (Hedden şi Phillips.4. De asemenea. au fost examinate căile de biosinteză ale fitohormonilor vegetali precum şi posibilităţile de modificare controlată a lor în scopuri aplicative. care prezintă variaţii în ceea ce priveşte exprimarea. Acest fapt sugerează că echipamentul enzimatic al celulelor vegetale recunoaşte secvenţe leader heterologe. ţesutspecifici sau inductibili – cum sunt cei induşi prin şoc termic sau prin acţiunea cuprului) determină exprimarea variată a acesteia.

IAA şi CK îşi inhibă reciproc sinteza. clonarea genei BAS1 de la Arabidopsis şi asigurarea condiţiilor de supraexprimare a acesteia în plante de tutun determină reducerea nivelului de brasinosteroizi şi producerea de plante pitice (Nef şi colab. un loc aparte fiind deţinut de sistemele inductoare reprezentate de diferite substanţe chimice care acţionează asupra genei de interes (ţintă). utilizându-se tot plante transgenice. Astfel. Utilitatea promotorilor inductibili a fost deja demonstrată prin elaborarea unui sistem de transformare genetică fără a folosi gene marker de selecţie şi prin utilizarea unui număr variat de transgene.: 106 . Sistemele inductoare de acest tip pot acţiona în sensul activării unor recombinaze specifice care să determine anumite „remodelări” ale ADN nuclear al plantelor transgenice. Fenomene similare au fost evidenţiate şi în cazul plantelor transgenice de Solamun dulcamara ce exprimă gena pentru aceeaşi enzimă izolată de la pepene (Hedden şi colab. In plus. Plantele rezultate. 1998). Modalităţile de reglare sunt variate. 1999). brocoli sau de Torenia fournieri (plantă ornamentală) în care a fost introdusă o genă antisens care blochează funcţionarea genei pentru ACCS (1-aminociclopropan-1-carboxilat sintetaza) sau ACCO (1-aminociclopropan-1-carboxilat oxidaza) prezintă modificări legate de procesul de înflorire şi de coacere (Hedden şi Phillips. prin controlul biosintezei sale. determină aplicaţii practice deosebite este etilena. plante transgenice de tomate. clonarea în planta test A. astfel că influenţele fiziologice sunt greu de estimat. 2000). cercetările complexe efectuate asupra biosintezei diferiţilor hormoni produşi de plante şi a interacţiunilor dintre aceştia pentru controlul proceselor fiziologice normale au condus la o serie de observaţii interesante: modificarea nivelului de exprimare a unui hormon afectează şi nivelul altora. P. De asemenea. De asemenea. prelucrarea genelor ce codifică enzimele implicate în biosinteza fitohormonilor demonstrează posibilitatea obţinerii de plante transgenice care să prezinte niveluri mai ridicate sau mai scăzute ale acestor hormoni. ce prezintă modificări ale procesului de dezvoltare sau ale răspunsurilor faţă de condiţiile de mediu. în funcţie de scopul urmărit cu aceste plante. activând-o sau inactivând exprimarea sa. 1999). pot avea aplicaţii comerciale astfel că pentru o reglare mai eficientă a proceselor respective genele de interes sunt clonate sub controlul unor promotori inductibili sau ţesut-specifici. De exemplu. Reducerea nivelului giberelinelor la diferite plante de interes se poate realiza şi pe alte căi. Cu toate acestea. Astfel. sunt necesare studii suplimentare pentru înţelegerea şi controlul acestor procese. Studii genetice recente asupra unor plante transgenice au permis realizarea unor progrese semnificative legate de rolul brasinosteroizilor şi de identificarea genelor ce îi codifică (Chory. La plantele transgenice de tutun s-a evidenţiat că auxina induce prelucrarea post-transcripţională a enzimei o-xilosiltransferaza care determină blocarea citokininelor. 1999). reglarea exprimării transgenelor reprezintă un element de bază atât pentru cercetările fundamentale de biologie moleculară vegetală cât şi pentru aplicaţiile biotehnologice. aplicaţiile practice par a fi promiţătoare prin utilizarea ca inductori a unor compuşi agrochimici înregistraţi. 1999).. pepene. iar IAA stimulează sinteza de etilenă. Cornea Concluzia acestor observaţii este aceea că produşii genelor menţionate prezintă ţinte tisulare diferite sau că influenţează etape diferite ale procesului de dezvoltare fără a necesita promotori specifici (Coles şi colab. Astfel. Aceasta ar permite activarea în câmp a funcţionării anumitor gene de interes prin folosirea unei substanţe specifice ceea ce ar elimina pierderile firmelor producătoare de seminţe transgenice datorate fermierilor care păstrează o parte din recoltă pentru însămânţările din anul următor (Gatz. deoarece interacţiunile dintre fitohormoni determină efecte pleiotropice neaşteptate în plantele transgenice.C..thaliana a genei pentru o GA 20-oxiadază de la fasole şi asigurarea condiţiilor de supraexprimare determină producerea de plante pitice. In concluzie. O altă substanţă produsă de plante care.

până în prezent nu au fost obţinute date concludente asupra existenţei transferului pe orizontală a genelor exogene de la plantele cultivate la cele de tip sălbatic. Două întrebări apar mai frecvent în mass media: sunt plantele transgenice toxice pentru om şi animale? sau. există posibilitatea transferului transgenelor din ţesuturile vegetale transformate la om? Răspunsul la aceste întrebări nu este atât de simplu cât ar părea la prima vedere. ele pot acţiona asupra unor organe specifice activând transgenele doar la nivelul ţesutului tratat (prin intermediul unor factori de transcriere particulari). însă. care însă nu se bazează pe dovezi concrete ci doar pe supoziţii. cel puţin teoretic există posibilitatea transferării transgenelor din plantele modificate genetic la plante înrudite din flora spontană. Dovedirea. Da sau nu plantelor transgenice? In cadrul biotehnologiilor vegetale. la această dilemă se adaugă şi genele de interes introduse în diferite plante de cultură care sunt utilizate în alimentaţie. consideră că folosirea vectorilor virali pentru transferul de gene ar face posibilă diseminarea transgenelor în natură nu numai la plante variate ci chiar şi la alte organisme (de exemplu. Aplicaţii. sau omul care se hrăneşte cu o gamă variată de alimente nu împrumută din însuşirile acestora. 2001). izolate de restul plantelor din flora spontană deoarece ele provin din alte regiuni decât cele în care se cultivă (de exemplu. elaborat de unii cercetători. 3. de exemplu. Absenţa dovezilor din prezent nu înseamnă că fenomenul trebuie exclus. acestea dobândind caractere noi (Ho. In prezent. a faptului că depăşirea barierelor interspecifice prin transferul de gene între organisme neînrudite (transfer pe orizontală) nu este invenţia omului ci este un fenomen care este întâlnit în natură (a se vedea transformarea celulelor vegetale de către bacteriile din speciile Agrobacterium tumefaciens şi A. porumbul sau cartoful pentru Europa). Explicaţia absenţei dovezilor referitoare la acest transfer (genom vegetal – genom 107 . încălcând astfel regulile naturale.rhizogenes) vine să contrazică acuzaţia menţionată. Ceea ce se reproşează deseori cercetătorilor care lucrează în domeniul tehnologiei ADN recombinant aplicată plantelor este că modifică natura în mod artificial. din contră. Se cunoaşte că multe plante de interes agronomic sunt. astfel că „poluarea genetică” de care se face caz nu este posibilă (Tourte. ADN ţintă (inclusiv transgena) poate fi activat sau inactivat. 1998). Testarea în câmp în 1986 a primelor plante transgenice şi apoi extinderea şi diversificarea experimentelor cu alte tipuri de asemenea plante modificate genetic. Încă din Antichitate înţelepţii şi-au pus deseori problema de ce. exprimarea genelor este temporară (Zuo şi Chua. a fost considerată de unii specialişti şi de o parte a publicului larg (mai mult sau mai puţin instruit în ceea ce priveşte principiile tehnologiei ADN recombinant utilizată pentru obţinerea acestor organisme) drept o adevărată deschidere a unei noi cutii a Pandorei. în plan reproductiv. obţinerea şi mai ales utilizarea practică a plantelor transgenice constituie subiectul unor controverse atât între diverşi membri ai comunităţii ştiinţifice cât şi între aceştia şi o serie de organizaţii neguvernamentale din diverse ţări. Cu toate acestea. Un scenariu mai recent. 2000). In mod similar. Controverse în funcţie de conformaţia situsul de legare pentru recombinază. microorganisme patogene). In acest caz. O altă problemă care este pusă frecvent se referă la influenţa transgenelor asupra omului. Adversarii plantelor transgenice s-au concentrat asupra a două direcţii principale: impactul asupra omului a consumului de produse alimentare rezultate din organisme modificate genetic (deci şi din plante transgenice) şi consecinţele eliberării organismelor vegetale modificate genetic asupra mediului. Ceea ce stă însă în picioare este faptul că. iepurele care mănâncă în principal morcovi nu se transformă în morcov.Modificarea genetică a plantelor: principii generale de realizare. este necesară o permanentă monitorizare a posibilităţii diseminării pentru a se putea lua măsurile corespunzătoare dacă acest lucru s-ar produce.

1. în acelaşi timp să nu se excludă utilizarea acestora. Se oferă consumatorului.... Aşa cum s-a prezentat pe parcursul acestui material.161-169 4. 20. M. P. A. Biol. fiind necesare studii extrem de laborioase asupra clarificării acestor aspecte. Cornea uman) se datorează proceselor de prelucrare la care sunt supuse alimentele în corpul uman. Rice. 2. N. A.. WarrenW.. 1998. De altfel. De altfel.N. J. D. 2002. aplicarea tehnologiei ADN recombinant plantelor de cultură în vederea obţinerii de noi soiuri cu caracteristici utile din punct de vedere economic constituie un demers economic cu implicaţii deosebite. în acest fel.. 1992. In ceea ce priveşte posibilitatea toxicităţii unor produse alimentare obţinute din organisme modificate genetic.. în controlul procesului de dezvoltare.Biol. 2. transgeneza la plante joacă un rol esenţial în cunoaşterea şi analiza genomului vegetal.. 1999. Gold. Hileman. Evola. De asemenea. M. Plant biotechnology in the 21st century: the challenges ahead. Manipulation of hormone biosynthetic genes in transgenic plants. 1997. Harder. recent s-a aprobat utilizarea plantelor de porumb transgenic ce conţin gena pentru proteina insecticidă Cry (derivată de la B. EJB. news.130-137. a diversificării cunoştinţelor asupra structurii şi funcţionării materialului genetic constituie argumente convingătoare pentru continuarea şi aprofundarea experimentelor de inginerie genetică la plante. Aung. Cu toate acestea. posibilitatea de opţiune în vederea utilizării sau nu a produselor obţinute din materii prime de origine transgenică. Koziel. 2002). în urma cărora ADN este şi el degradat pierzându-şi însuşirile transformate. Stefan.89-108.. 6.D. avantajele oferite de această tehnologie modernă sunt certe. 3.539-548. L. Altman. Modification of plant genome by genetic transformation: interaction of alogenes with the host genome.M. Current Opinion in Biotechnology. aici lucrurile nu sunt excluse. T. 7. p. EJB.. L. Plant Physiol.. Cucu.. Smith. 2. Bibliografie selectivă 1. p.C. p. Plant Molec. P. atât pe plan internaţional cât şi naţional au fost elaborate o serie de documente legislative care reglementează utilizarea organismelor modificate genetic pentru obţinerea de alimente de uz uman... benefice. F.thuringiensis) dar numai pentru hrana animalelor şi pentru prelucrare industrială. multe instituţii naţionale sau internaţionale iau măsuri pentru elaborarea de teste rapide şi eficiente de identificare a posibililor compuşi alergeni sau dăunători.. Rev. Development of a molecular marker for rust resistance genes Sr39 and Lr35 in wheat breeding lines. p. 108 . Carozzi. 2002. în înţelegerea metabolismului plantelor. Procunier.. 1999. p. 2. fiind unanim acceptată ideea etichetării obligatorii a produselor de acest tip.A. De asemenea. Plant Molec. J. pentru a elimina posibilitatea ca anumite substanţe produse de organismele modificate genetic să producă alergii dar.G.. nu şi pentru consumul uman deoarece există posibilitatea ca proteina respectivă să fie alergenă (Hileman. indiferent de curentele de opinie potrivnice obţinerii şi utilizării plantelor transgenice. 11. Spre exemplu.Ars Docendi. Mitru..S. 5.C.. Phillips. în Implicaţii ştiinţifice şi bioetice în analiza şi manipularea genomului. Ann. perfecţionarea permanentă a tehnicilor moleculare aplicate. Expression of chimeric CaMV 35S Bacillus thuringiensis insecticidal protein gene in transgenic tobacco. ian. date fiind unele accidente apărute în urma consumului unor alimente provenite din materii prime insuficient controlate. Edit. 48. Hedden.. 20-2. astfel că noile generaţii de plante transgenice obţinute vor fi sigure atât pentru mediul înconjurător cât şi pentru om. Chemical control of gene expression. What’s hiding in transgenic foods? Chemical Eng. nr. Gatz. B. Gavrilă. 2000.

World J.. C.. Y. nr. Microbiol. 17. Seetharama. 1999. 2001. 13. G. H. Current Opinion in Biotechnology.. Scientific Academic Books. Institute of Science in Society. Zuo.. Robinson. Current Opinion in Biotechnology.. Walmsley.. 1996. p. 19. Horizontal gene transfer – the hidden hazards of genetic engineering. Agrobacterium tumefaciens: a natural tool for plant transformation. p. Prospects for usig transgenic resistance to insects in crop improvement.p.... 1.940-943. Martinelli. L. N. J. A. EJB. Padron. J... K. K.. Riva. Recombinant DNA.. Edit.. H. 11. Controverse 8. Ortiz.6. 1994. Genie genetique et biotechnologie: concepts et methodes. N... Appl.178-183. Chua. 12. K. p. R.. C.. Cockburn.. G... M. 1998.. 22. Aplicaţii.. nr. M. Theor. J..621-628 10. Mandolino. J. A. Genetic transformation and regeneration of transgenic plants in grapevine (Vitis rupestris). Electronic Journal of Biotechnology. 2000. 14. C. The integration of T-DNA into plant genomes. Kahl. 2000. Watson. M. J. 9.Dunod 15. Cabrera. Tourte. 1994.2. 88. C. D. EJB. Geneti. Witkowski. Whitelam.. M..J. 1998.Biotechnol. W.146-151. Trends in Plant Science. Tinland. Sharma. 12. B.. Plants for delivery of edible vaccines.. Sharma. 3. G. nr. M. Natural genetic engineering of plant cells: the molecular biology of crown gall and hairy root disease. L. p.2.121-129.W. Society Transact. Antibody production in transgenic plants. 2000. 11. 1. 1996. 2. Ho. Owen.2.327351. Gilman. Zoller. 11. 18. Chemical inducible systems for regulated expression of plant genes. A.. nr. Arntzen. R.Modificarea genetică a plantelor: principii generale de realizare. Ethics and transgenic crops. 16. 1992.. G. Biochem.. Weising.. p. 109 . G.

Sign up to vote on this title
UsefulNot useful