You are on page 1of 6

Perlakuan Awal Sampel Biologis

a. Tujuan Diharapkan mahasiswa mampu melakukan berbagai tehnik presipitasi protein sesuai dengan sampel biologis yang diperoleh dan obat yang akan diteliti.

b. Pendahuluan Berbagai sampel biologis dapat diambil untuk penentuan kadar obat tubuh untuk penelitian farmakokonetika contoh : darah, urin, feses, saliva, jaringan tubuh, cairan spinal dan synovial. Metode pengambilan sampel specimen biologis pada umumnya melibatkan metode yang invasive kecuali untuk pengambilan sampel urin dan saliva. Sampel biologis yang paling umum diambil adalah darah yang walaupun tetap melibatkan metode yang invasive akan tetapi secara umum dapat ditoleransi dengan cukup baik oleh subyek penelitian. Darah merupakan sampel biologis yang mengandung berbagai komponen seluler seperti sel darah merah, sel darah putih, platelet,dan berbagai protein seperti albumin dan globulin. Pada umumnya bukan darah utuh (whole blood) tetapi plasma ataupun serum yang digunakan untuk penentuan kadar obat. Serum diperoleh dengan membiarkan darah untuk menggumpal dan supernatant yang dikumpulkan setelah sentrifugasi adalah serum. Sedangkan plasma diperoleh dengan

penambahan antikoagulan pada darah yang diambil dan supernatant yang diperoleh setelah sentrifugasi merupakan plasma. Jadi, plasma dan serum dibedakan dari protein yang dikandungnya.

Kandungan protein dalam sampel biologis yang akan dianalisa menyebabkan dibutuhkannya suatu tahap perlakuan awal dan/atau penyiapan sampel sebelum penentuan kadar obat dapat dilakukan yaitu dengan mengedapkan protein pada sampel. Hal ini dilakukan ketika akan melakukan uji farmakokinetik berikutnya. Perlakuan ini harus dilakukan karena adanya protein dalam sampel akan mengganggu uji farmakokinetik yang dilakukan. Perlakuan ini juga dimaksudkan untuk mengisolasi atau memisahkan obat yang akan diteliti dari matriks sampel yang diperoleh. Protein, lemak, garam dan senyawa endogen dalam sampel akan mengganggu penentuan kadar obat yang bersangkutan dan selain itu dalam hal analisa menggunakan metode seperti HPLC adanya zat-zat tersebut dapat merusak kolom HPLC sehingga usia kolom menjadi lebih singkat. Protein dapat diendapkan karena memiliki berbagai sifat

diantaranya bersifat sebagai amfoter yakni memiliki 2 muatan yang berlainan dalam 1 molekul, atau yang dikenal juga sebagai zwitter ion.

c. Prosedur 1. Sebanyak 250µL plasma blanko di ipet dan di masukkan kedalam tabung ekstraksi 2. Kemudian ditambahkan zat pengendap protein yang tersedia dengan perbandingan sebagai berikut:  Plasma 1:0,2 dengan 10% (b/v) trikloroasetat Sebanyak 250µL plasma di tambahkan 50µL trikloroasetat  Plasma 1:2 dengan Larutan jenuh (NH4)2SO4 10% (b/v)

Sebanyak 250µL plasma di tambahkan 500µL Larutan jenuh (NH4)2SO4  Plasma 1:0,2 dengan 10% ZnSO4-NaOH 0,5 N (1:1) Sebanyak 250µL plasma di tambahkan 500µL 10% ZnSO 4NaOH 0,5 N (1:1)  Plasma 1:0,2 dengan Asetonitril Sebanyak 250µL plasma di tambahkan 500µL Asetonitril  Plasma 1:0,2 dengan 10% (b/v) Metanol  Sebanyak 250µL plasma di tambahkan 500µL Metanol 3. Setelah itu di Vortex selama 1-2 menit 4. Dan disertifugasi dengan kecepatan 3500-6000 rpm selama 15 menit 5. Selanjutnya dilakukan pengamatan supernatant dan endapan yang diperoleh dan dibandingkan hasil yang diperoleh menggunakan berbagai zat pengendap protein.

d. Data Pengamatan Semua tabung menunjukan adanya endapan dengan hasil pengamatan sebagai berikut: No Zat Pengendap Protein yang di 1 2 tambahkan 10% (b/v) trikloroasetat Larutan jenuh   jernih Keruh Pemisahan Pemisahan baik   kurang baik

3 4 5

(NH4)2SO4 10% ZnSO4-NaOH 0,5 N (1:1) Asetonitril Metanol

  

  

e. Pembahasan Pengendapan protein dilakukan dengan denaturasi protein. Denaturasi dapat dilakukan akibat adanya perubahan pH, temperature, dan penambahan senyawa kimia. Cara denaturasi protein yang umum digunakan adalah dengan penambahan precipitating agent. Protein dapat diendapkan karena memiliki berbagai sifat diantaranya bersifat sebagai amfoter yakni memiliki 2 muatan yang berlainan dalam 1 molekul, atau yang dikenal juga sebagai zwitter ion. Sifat ini membuat potein memiliki muatan yang berbeda pada pH yang berbeda pula. Akibatnya protein dapat larut pada rentang pH tertentu dimana protein bermuatan. Suatu saat di pH tertentu protein akan mencapai titik isoelektrik, yakni pH dimana jumlah total muatan protein sama dengan nol (muatan positif sebanding dengan muatan negatif), hal ini akan mempengaruhi kelarutan protein. Pada titik isoelektrik, kelarutan protein sangat rendah, sehingga potein dapat mengendap. Selain itu, protein juga dapat membentuk ikatan dengan logam dimana beberapa asam amino dapat terikat pada satu logam sehingga molekulnya menjadi besar, beratnya juga menjadi besar sehingga potein mengendap. Selain itu terdapat juga beberapa sifa lain yang berhubungan dengan presipitasi protein ini yang dijelaskan pada mekanisme pengendapan oleh masing-masing reagen. Agen presipitasi atau agen pengendapan yakni ion negatif dari TCA akan bergabung dengan protein yang sedang berada pada kondisi sebagai kation (pH larutan dalam kondisi asam hingga pH isoelektrik

protein) hingga membentuk garam protein. Beberapa garam yang dihasilkan tersebut tidak larut dengan demikian metode ini dapat digunakan untuk memisahkan protein dari larutan. Umumnya agen presipitasi akan melarut sedangkan garam protein akan terdekomposisi dengan adanya penambahan basa (membentuk protein yang bermuatan negatif atau anionic protein). Larutan (NH4)2SO4 merupakan garam dengan konsentrasi tinggi. Mekanisme (NH4)2SO4 sebagai anti presipitasi protein dikenal sebagai salting out, yakni penurunan kelarutan protein dengan adanya peningkatan konsentrasi garam. Hal ini terjadi karena interaksi antara air dengan gugus polar dari protein menurun. Kelarutan protein akan berkurang bila terdapat garam-garam anorganik dalam konsentrasi tinggi mengakibatkan pengendapan protein tersebut. Sifat ini terjadi karena kemampuan ion garam untuk terhidrasi dan terjadi kompetisi antara garam dengan molekul protein untuk mengikat air. Mekanisme ZnSO4 – NaOH sebagai agen presipitasi adalah NaOH akan memberikan suasana basa pada larutan dan mengakibatkan protein berada dalam keadaan ion negatif atau anion. Anion protein ini akan berikatan dengan ion positif yang berasal dari logam berat yakni Zn 2+ membentuk logam protein yang tidak larut. Logam berat juga akan merusak struktur sekunder dan tersier dari protein. Ikatan dari ion logam bermuatan positif akan menurunkan kelarutan protein. Ion logam akan berkompetisi dengan proton-proton pada larutan untuk berikatan dengan asam amino. Semakin kuat ikatan ion-ion logam untuk menggantikan ikatan oleh proton-proton akan menurunkan pH larutan. Kombinasi dari perubahan pI, penurunan pH (baik akibat ion logam maupun NaOH) akan menyebabkan protein mengendap Metanol dan Asetonitril merupakan pelarut organik yang dapat mengendapkan protein. Pengendapan ini berkaitan dengan pI protein,

dimana semakin jauh dari titik isoelektrik maka kelarutan akan semakin meningkat dan semakin dekat dengan titik isoelektrik maka kelarutan akan semakin menurun. Penambahan larutan organik seperti metanol ataupun asetonitril pada larutan protein dalam air akan menurunkan Kd (Konstanta Dielektrik) pelarut/air yang meningkatkan tarikan antara molekul-molekul bermuatan dan memfasilitasi interaksi elektrostatik protein. Selain itu pelarut organik ini juga akan menggantikan beberapa molekul air di sekitar daerah hidrofob dari permukaan protein yang berasosiasi dengan protein sehingga menurunkan konsentrasi air dalam larutan dengan demikian kelarutan protein akan menurun dan memungkinkan terjadinya pengendapan. Pada hasil percobaan diperoleh bahwa keefektifan pelarut organik asetonitril lebih besar dibandingkan dengan metanol.

f. Kesimpulan Dari hasil praktikum diperoleh bahwa semua agen presipitasi dapat mengendapkan protein pada sampel plasma. Dari tabel data pengamatan dapat dilihat bahwa yang paling efektif adalah TCA 10% dan ZnSO4 – NaOH. Sedangkan yang kurang efektif adalah Larutan jenuh (NH4)2SO4 dan pelarut organik. Keuntungan metoda presipitasi plasma protein menggunakan agen presipitsi adalah mudah dilakukan dan cepat namun kerugiannya yakni tidak dapat mengendapkan protein secara sempurna.