Amplificación de DNA in vitro: PCR (Polymerase Chain Reaction

)

Laboratorio de Genética BIOL 3300L

Objetivos
Conocer:

Los fundamentos de la técnica de amplificación de DNA por PCR

Usos y aplicaciones del PCR
Ventajas y desventajas del PCR Métodos de secuenciación de DNA

PCR
Polymerase Chain Reaction
Es

la amplificación de DNA in vitro por medio de la polimerización en cadena de DNA utilizando un termociclador. propósito del PCR es hacer muchas copias de un fragmento de DNA.
realiza la amplificación de un segmento específico de DNA, teniendo poco material disponible.

El

Se

Ganó el premio Nóbel de Química en 1993 por su invento. Utilizo el PCR para amplificación del gen de -hemoglobina humana.   . Kary Mullis en 1987.Polimerasa Chain Reaction: Reacción en Cadena de la Polimerasa  Fue diseñada por el Dr. y el diagnostico prenatal de anemia falciforme.

.Termociclador La PCR se realiza en un “Thermo Cycler” Termociclador. Es una máquina que calienta y enfría la reacción en periodos cortos de tiempo.

por 15 a 40 segundos –el tiempo depende del tamaño del genoma- .El proceso de “PCR” incluye 3 pasos básicos que se repiten 25 veces o más:  1. -Típicamente se usa una temperatura de 95˚C .97˚C. Desnaturalización: Consiste en separar la doble hebra de DNA y convertirla en hebra sencilla.

se baja la temperatura -ej: 55˚C por 30 segundos-. La temperatura y el tiempo puede variar entre cebadores según sea el caso. Apareamiento o “anneling”:  Los cebadores “primers” previamente diseñados.2. . reaccionan con la hebra sencilla de DNA y se pegan en lugares específicos por complementariedad de bases. Para esto.

. Polimerización o Extensión. en el espacio comprendido entre ambos “primers”. 2 y 3 se repiten cuantas veces sea necesario. y coloca dinucleotidos trifosfatados (dNTP’s) de 5’a 3’ leyendo el DNA de 3’a 5’.3. Una Polimerasa de DNA extiende los “primers”. De estas forma sintetiza la secuencia complementaria de las hebras de DNA molde Se efectúa a 70˚C por 1½ minutos (puede variar según sea necesario) Los pasos 1.

.

En el PCR hay una amplificación exponencial .

dTTP. dCTP. se usa una concentración de 200M de cada uno. 10mM Tris.Reactivos necesarios para PCR: Amortiguador (Buffer): 50mM KCl. dGTP.5 mM MgCl2.  MgCl2: Puede estar en forma de MgCl2. -Generalmente. -La concentración de dNTPS. Se usa 25mM -Es un cofactor para la función de la polimerasa dNTP’s (Dinucleotidos trifosfatados): dATP. MgSO4. Ej: Si vamos a amplificar un fragmento de 500pb vs uno de 5500 pb. es proporcional al tamaño del fragmento que se desea amplificar.  . Cl (pH 8. necesitamos más concentración de dNTPS para el de 5500pb.3 a temperatura ambiente) y 1.

y el máximo entre 400-500 ng. . Polimerasa: Generalmente se usa 2 unidades por reacción. complementarias a una región del DNA que se quiere amplificar.000 nucleótidos de longitud. El mínimo va de 10-100 ng.Reactivos necesarios para PCR:    Cebadores “primers”: Son secuencias cortas de nucleótidos 20-24 nucleótidos de longitud. -Se usa a concentración de 1MDNA molde: El DNA a amplificar puede tener desde 50 a 2.

El adyuvante más utilizado es el BSA. Se usa DMSO. glicerol o BSA.ADYUVANTES DE LA PCR  Son elementos que mejoran el rendimiento y la especificidad de la PCR. A concentraciones por encima de 0.8 µg/µl el BSA incrementa la eficiencia de la PCR ya actúa como una proteína captadora de iones que pueden ser inhibidores de la Taq polimerasa   .

pero esta es sensitiva a alta temperatura.Polimerasa •En un principio. coli. •Se reemplazo la enzima por la de la bacteria “Thermus aquaticus” conocida como Taq pol . la polimerasa de DNA que se utilizaba era de la bacteria E. por lo que había que añadir enzima fresca al comenzar el tercer ciclo.

Dependiendo del tamaño de la amplificación y la resolución que deseemos utilizaremos diferentes medios (agarosa.Análisis de la Muestra  La detección del producto de la PCR se realiza normalmente mediante corrido electroforético. poliacrilamida) a distintas concentraciones.  .

fluorescencia.Análisis de la Muestra • La posterior visualización se puede realizar con bromuro de etidio (lámpara de luz UV). radioactividad Ladder: pesos conocidos 1: Fragmento a 1857 pb 2 y 4: Fragmento a 800 pb 3: No hay producto 5: Multiples bandas (primers inespecíficos se pegan a varios sitios) . tinción de plata.

Southern Blot . los productos amplificados poseen secuencias que son reconocidas por endonucleasas Hibridación.Análisis de la Muestra   En algunos casos.

entre otros Análisis de DNA de cualquier organismo vivo o muerto. análisis de fósiles  Mutagénesis dirigida (cambios en la información contenida a través de “primers” con mutaciones)    Investigación forense Pruebas de paternidad .Se puede amplificar directamente de:   ADN genómico cDNA (RT-PCR) Aplicaciones Detección de agentes infecciosos como: hepatitis B y C. HIV. papiloma virus.

Si se observan los patrones bandas podrá comprobarse como los perfiles obtenidos en las manchas de sangre encontradas en el sombrero (Hat) y pantalón (Jeans) del sospechoso (S) coinciden con el perfil genético de la víctima (V)  .Aplicaciones Criminalística  Ejemplo de un caso de criminalística resuelto utilizando electroforesis en gel vertical de acrilamida.

Utilidad del PCR .

secuenciar y análisis.Ventajas del “PCR”  A partir de una muestra pequeña de ADN se puede obtener una cantidad considerable para el estudio que se vaya a realizar. El producto se puede utilizar para clonar.  .   Se puede amplificar ADN de cualquier organismo vivo o muerto. análisis prenatales. Sus aplicaciones son múltiples: medicina forense. diagnósticos. etc.

Desventajas del “PCR”  Se puede reproducir solamente partes del genoma en donde se conoce por lo menos una mínima secuencia de 20 – 40 pb. Se necesitan “primers” específicos que sean complementarios al fragmento que se desea sintetizar. La polimerización puede tener errores al sintetizar el ADN Puede contaminarse con otro ADN (puede ser del mismo investigador o de cualquier otro)    .

dGTP de [25 μM] c/u) 10X buffer para PCR (Solución amortiguadora para “PCR”) MgCl2 (25 mM)     BSA Polimerasa Taq . dCTP. estériles Puntas estériles Agua destilada. desionizada y estéril    ADN molde (ADN en estudio) Primer Forward y Reverse dNTP’s (dATP.Materiales Para PCR       Termociclador “Thermo cycler” Microcentrífuga Micropipetas de 2. 20 y 200 ul Microtubos para “PCR”. dTTP.

Fenotipo Puertorriqueño .

Primer Directo H34. primer reverso L15829 . Hebra liviana (L).Herencia del DNA mitocondrial •Amplificaremos una region hipervariable. Genoma de 16571 pares de bases: Hebra pesada (H).

9% Centrifugar por 5 minutos a 7K Descarta sobrenadante Resuspender el precipitado “pellet” en 500ul de chelex al 10% Incubar a 100˚C por 20 minutos Centrifugar por 5 minutos a 7K Tomar el sobrenadante ( DNA en solución) Dejar la muestra a -20 grados hasta cuando se va a trabajar con ella Nota: El chelex actúa como agente desestabilizador de membranas y quelante.Procedimiento para extracción del DNA genómico (previamente realizado)  Se realizó un frotis bucal         El contenido del hisopo “swab” se resuspende en 1000ul de NaCl 0. .

Diagrama de la extracción del DNA genómico (previamente realizado) .

3’-5’ Buffer 10X 0.0 Mix 1 17.0 Mix 2 2.3 3.2 5.0 Taq pol DNA en estudio Total: 25 ul .5 0.5 1.5 1. 5’-3’ Primer L15829.0 1.7 2.Procedimiento para amplificar el DNA (PCR)  Añada los siguientes reactivos en el orden indicado: Cantidad (ul) Componente 10.3 Agua estéril (dH2O) MgCl2 25mM BSA 100X 2.5 Mm de dNTPs Primer H34.

32 ciclos: 94 °C por 30 segundos 54 °C por 1 minutos 72 °C por 70 segundos 1 ciclo: 72 °C por 10 minutos Lleve a reaccionar en el termociclador.5 minutos.  . Condiciones para reacción en el termociclador: 1 ciclo : 94°C por 2.

 Se examinan en electroforesis. obteniéndose fragmentos de diferente tamaño.Secuenciación de DNA Método enzimático de terminación de cadena (método dideoxi de Sanger)  Polimerización interrumpida de ADN  Se lleva a cado polimerización de ADN en presencia de derivados dideoxi que detienen la polimerización en diferente momento. se “lee” secuencia directamente del gel .

Método dideoxi de Sanger .

Método dideoxi de Sanger (2) .

Método dideoxi de Sanger (3) .

Método secuenciación automática .

Electroferograma de la secuenciación automática .

Geles de secuencia Secuencia automática Secuencia Manual .

Direcciones de animaciones Dirección PCR http://www.mx/enp-unam/03EstructuraDelGenoma/animaciones/secuenci a.sumanasinc.com/webcontent/anisa mples/molecularbiology/pcr.swf  .html  Dirección de secuenciación http://smcg.unam.cifn.