[INFORME DE LABORATORIO DETERMINACIN DE BIOMASA] 17 de abril de 2013

DETERMINACIN DE BIOMASA
I. INTRODUCCIN

En la agroindustria y en sus aplicaciones es importante conocer el nmero de microorganismos presentes en una muestra. Este conocimiento puede ser utilizado en estudio de curvas de crecimiento, anlisis de alimentos, preparaciones de inculos para fermentacin, etc. Un parmetro clave en el modelado y monitoreo del funcionamiento de plantas de agroindustriales dedicadas a procesos de fermentacin, panificacin entre otros en donde se utilicen inculo es la concentracin de biomasa. Biomasa es un trmino general que se refiere a los microorganismos presentes en un sistema. Existen muchas maneras de medir la concentracin de biomasa, como por ejemplo masa, volumen, extensin linear de filamentos, dispersin de luz, conteo de clulas u organelas. Existen diferentes mtodos para cuantificar el nmero de microorganismos o peso (biomasa) de clulas microbianas en un cultivo; los mtodos pueden ser directos e indirectos. Entre los directos se puede mencionar a la determinacin de peso seco y el recuento de clulas en cmara de Neubauer. La determinacin de peso seco es un mtodo de cuantificacin muy utilizado en cultivos de gran densidad, sobre todo para hongos y levaduras. Como los cultivos se someten a varios procesos (filtracin, lavado, secado) se pueden causar prdidas importantes de biomasa y errores en la cuantificacin. El mtodo de cuenta directa en cmara tiene la ventaja de ser muy rpido y econmico, aunque no se pueden distinguir las clulas viables y no viables. Se puede calcular el nmero de microorganismos en una muestra a partir del volumen de la cmara y de las diluciones de la muestra que sean necesarias. Sin embargo, tiene el inconveniente de que la observacin y cuantificacin se dificultan en clulas muy pequeas (1 5 m) o en poblaciones de baja densidad debido al pequeo volumen de muestra que se utiliza (0.1 0.2 mm3) (Aquiahuati, 2004). Entre los indirectos podemos mencionar a Turbidimetra y Nefelometra las cuales nos permiten obtener aproximadamente la cantidad de biomasa de una muestra. II. OBJETIVOS

Determinar la biomasa presente en una solucin de levadura mediante diferentes mtodos de determinacin de biomasa. Aprender y conocer los mtodos ms empleados en la determinacin de Biomasa.

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III. A.

MARCO TERICO Mtodos directos de determinacin de biomasa: Se basan en el nmero de clulas o en el peso celular, dentro de estos mtodos podemos distinguir a los siguientes: 1. Mtodos gravimtricos 1.1 Peso hmedo

Se obtiene a partir de una muestra en suspensin que es pesada luego de la separacin de las clulas por filtracin o centrifugacin. Es una tcnica til para grandes volmenes de muestra. La principal desventaja es que el diluyente queda atrapado en el espacio intercelular y contribuye al peso total de la masa. La cantidad de lquido retenida puede ser importante, por ejemplo, un pellet de clulas bacterianas muy empaquetadas puede contener un espacio intercelular que aporta entre el 5-30% del peso, de acuerdo a la forma y deformacin celular. Para corregir el peso hmedo se determina la cantidad de lquido que queda retenida en el espacio intercelular luego de una centrifugacin, para ello se utilizan soluciones de polmeros no inicos (como el Dextran) que pueden ingresar en el espacio intercelular pero no pueden atravesar las paredes bacterianas. 1.2 Peso seco La cantidad total de biomasa presente en una muestra puede medirse en trminos de peso seco por unidad de volumen, ya sea como slidos en suspensin totales (SST) o slidos en suspensin voltiles (SSV). Las clulas se separan del lquido bien por centrifugacin bien por filtracin. Se expresan en g.m.s/mL. La principal desventaja de estas tcnicas es que su determinacin incluye no slo microorganismos activos sino microorganismos muertos, material inerte, polmeros extracelulares y materia orgnica adsorbida. Adems, no puede aplicarse cuando los sustratos a degradar son insolubles. Los mtodos gravimtricos son simples, pero consumen bastante tiempo y son poco reproducibles. A la vez este mtodo este mtodo los componentes voltiles de las clulas pueden perderse en el secado y puede existir alguna degradacin. Tambin la muestra seca pude recobrar humedad durante el pesado, principalmente si el ambiente tiene humedad relativa alta.

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2. Mtodos microscpicos de recuento celular en cmaras Existen diversos tipos de cmaras para el recuento de microorganismos tales como la cmara de Neubauer. Thoma, Brker, Ttirk, Fuchs-Rosenthal, Mal assez, Petroff H ttrser, etc. El recuento de microorganismos se realiza en la cuadrcula central de la cmara y se multiplica por la profundidad, obtenindose el nmero de microorganismos por unidad de volumen (nmero de clulas/ml, generalmente). El recuento de microorganismos en cmaras no es un mtodo muy exacto debido a las irregularidades en la distribucin de la muestra. Adems, pueden confundirse las clulas con otras formas orgnicas e inorgnicas existentes en el medio y no permite distinguir clulas vivas de clulas muertas. CMARA DE NEUBAUER Es un instrumento utilizado en medicina y biologa para realizar el recuento de clulas en un medio lquido, que puede ser un cultivo celular, sangre, orina, lquido cefalorraqudeo, lquido sinovial, etc. (Ames & Caedo, 2004).

Figura 1.Camara de Neubauer comercial.

Esta cmara de contaje est adaptada al microscopio de campo claro o al de contraste de fases. Se trata de un portaobjetos que tiene dos zonas ligeramente deprimidas y que en el fondo de las

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cuales se ha marcado con la ayuda de un diamante una cuadrcula de dimensiones conocidas. Se cubre la cmara con un cubrecmaras que se adhiere por simple tensin superficial. Luego se introduce el lquido a contar, al que generalmente se ha sometido a una dilucin previa con un diluyente, por capilaridad entre la cmara y el cubrecmara; puesto que tiene dos zonas esto permite hacer dos recuentos simultneamente. Para contar las clulas se observa el retculo al microscopio con el aumento adecuado y se cuentan las celulas. Con base en la cantidad de clulas contadas, conociendo el volumen de lquido que admite el campo del retculo, se calcula la concentracin de clulas por unidad de volumen de la muestra lquida inicial. La frmula de valoracin del nmero de clulas (vlida universalmente) es la siguiente: Partculas por mL=(partculas contadas) / (superficie contada (mm) x profundidad de la cmara(mm) x dilucin) (Castillo, 2004).

En el retculo central, la cmara de Neubauer posee un cuadrado primario que contiene nueve cuadrados secundarios cada uno de ellos divididos a su vez en 16 cuadrados terciarios, el cuadrado central contiene 25 cuadrados, cada uno de ellos dividido a su vez en 16 cuadrados cuaternarios. En los bordes de este cuadrado central se cuentan los hemates, utilizando slo los cuadrados de los bordes del terciario central y uno de los centrales. Ventajas equipo sencillo rapidez para obtener los resultados facilidad para observar la morfologa de los microorganismos presentes. Desventajas No se diferencian los microorganismos vivos de los muertos, Es tedioso No es til para recuento de poblaciones con baja concentracin de bacterias. No se usa en hifas o mohos.

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3. Mtodos microscpicos mediante epifluorescencia La microscopa de epifluorescencia comenz a emplearse a principios de los 70 y hoy en da se considera como uno de los mejores mtodos para la estimacin de la biomasa.

La epifluorescencia es debida a un agente fluorocromo, a la adicin de algn anticuerpo marcado con fluorescencia (inmunofluorescencia) o a una autofluorescencia natural debida a la existencia de algn componente celular autofluorescente.

Cuando la epifluorescencia se debe a un agente fluorocromo, el procedimiento consiste en la tincin de las bacterias con dicho agente y posterior recuento mediante microscopa ptica con iluminacin de epifluorescencia. Los sustratos fluorescentes o fluorocromos que se han empleado para la observacin directa de bacterias se clasifican en dos grupos. En el primero de ellos quedaran englobados aquellos fluorocromos que tras ser adsorbidos actan especficamente sobre cidos nuclecos u otros componentes celulares. El segundo incluira a todos aquellos que tras ser sustratos de una determinada actividad metablica, son convertidos en molculas fluorescentes.

Al primer grupo pertenecen los principales fluorocromos utilizados para la estimacin de la poblacin total de una muestra: el naranja de acridina y el 4,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI). Estos fluorocromos permiten distinguir clulas de partculas e identificar bacterias no slo por su color, sino tambin por su forma y tamao. El naranja de acridina colorea tanto el ADN como el ARN de las clulas emitiendo a una longitud de onda aproximada de 470 nm. Los cidos nucleicos de hebra simple se colorean de un color naranja-rojo fluorescente, mientras que los de doble hebra adoptan un color verde fluorescente. EI fluorocromo DAPI es un colorante especfico del ADN y su pico de excitacin se encuentra prximo a la regin ultravioleta (365 nm). A pesar de las ventajas que supone el uso de estos fluorocromos, no permiten distinguir entre las clulas muertas, metablica- mente inactivas, y las vivas, ya que el ADN conserva sus propiedades incluso en clulas muertas. El quelato de europio, al igual que el naranja de acridina o el DAPI, es un colorante especfico de cidos nucleicos. Otros fluorocromos como las sales de magnesio del cido 1 -anilino-8 naftalensulfnico (Mg-ANS) tien principalmente componentes celulares como

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protenas, lpidos o membranas celulares. En cambio, el comportamiento de estos agentes fluorocromos es el comentado anteriormente, sobrestiman el nmero de clulas viables al no distinguir clulas vivas de muertas.

En el segundo grupo quedaran englobados fluorocromos como el cloruro de 5-ciano-2,3-ditolil tetrazolio (CTC) el 5 y 6 diacetato de sulfofluorescena (SFDA) .Ambos fluorocromos, a diferencia con los anteriores, distinguen bacterias metablicamente activas de las que no lo son mediante la observacin microscpica del producto fluorescente resultado de la actividad metablica para la que son especficos. En el caso del CTC 1a actividad metablica es la respiratoria y en el del SFDA es la actividad esterasa. La epifluorescencia basada en fluorocromos como el CTC y el SFDA pondr de manifiesto aquellos microorganismos en los cuales estn presentes dichas actividades metablicas, pero sin cuantificarlas. Salvando este obstculo se encuentran las medidas bioqumicas de determinacin indirecta de la biomasa, que s cuantifican actividades metablicas.

La epifluorescencia es un mtodo simple y rpido. No obstante, su reproducibilidad est cuestionada y necesita un equipamiento relativamente caro. La fluorescencia mediante anticuerpos marcados con agentes fluorescentes est basada en las propiedades inmunolgicas de las clulas. Es una tcnica muy sensible y especfica, y puede realizarse in situ. Tambin puede llevarse a cabo mediante hibridacin de sondas fluorescentes de ADN o ARN (Fluorescent in situ hybridization, FISH), cada vez ms utilizadas en Ecologa Microbiana. 4. Mtodos de siembra El recuento de microorganismos viables se fundamenta en la capacidad de dichas clulas viables de desarrollar una colonia visible en un medio de cultivo apropiado. En los recuentos en placa por vertido, un volumen de 0,1- 1 ml de la suspensin microbiolgica se mezcla con el medio de cultivo fundido y parcialmente enfriado en una placa de Petri. En los recuentos en placa por siembra en superficie, se extiende un volumen de aproximadamente 0,1 ml de la suspensin sobre la superficie del medio de cultivo. Los resultados de los recuentos en placa se expresan como unidades formadoras de colonia (UFC) por unidad de volumen de la suspensin microbiolgica. Para que el recuento sea estadsticamente significativo, el nmero de colonias deber estar comprendido entre 30 y 300 colonias. En el caso de muestras muy diluidas se puede emplear la ING.AGROINDUSTRIAL Pgina 6

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filtracin de membrana, en la que tras la filtracin de la muestra es el filtro el que es colocado finalmente sobre el agar. Otro tipo de recuentos los constituyen aquellos que emplean un medio de cultivo lquido como es el caso de la estimacin del nmero ms probable (NMP). El recuento de microorganismos viables se fundamenta en el desarrollo de una colonia visible a partir de cada organismo viable. El principal problema de este mtodo es que no todas las bacterias presentes en una muestra pueden crecer en el medio y las condiciones de cultivo seleccionado. Suelen ser, por tanto, mtodos infraestimativos y estadsticamente cuestionables.

En el mtodo de conteo celular se expresa en cel/mL, en el mtodo de Peso Seco se expresa en g.m. s/mL, en el mtodo de Peso Hmedo se expresa en g. h /mL y en el mtodo de Conteo de Colonias o Recuento en Placa se expresa en UFC/mL. B. Mtodos indirectos de determinacin de biomasa 1. Mtodos espectrofotomtricos Se basan en la existencia de una relacin directa entre el nmero total de microorganismos presentes en una muestra y su valor de turbidez. Tras la determinacin de la turbidez de la suspensin celular mediante espectrofotometra, el resultado se expresa en unidades de absorbancia. Sin embargo, antes de utilizar la turbidez como mtodo de recuento, hay que realizar una recta de calibrado que relacione medidas directas (microscpicas, por recuento en placa o peso seco) con las indirectas de la turbidez. Esta recta contiene datos sobre el nmero de clulas, permitiendo la estimacin de tal parmetro a partir de una sola medida de la turbidez. Se trata de mtodos rpidos, Pero de baja sensibilidad y que presentan problemas de calibracin (tipo de cultivo, medio de cultivo) y de interferencias con partculas.

Cuando un haz de luz paralelo (colimado) golpea una partcula en suspensin, parte de la luz es reflejada, parte es diseminada, parte es absorbida y parte es transmitida. La nefelometra mide la luz dispersada por una solucin de partculas. La turbidimetra mide la luz dispersada como un decrecimiento de la luz transmitida a travs de la solucin. Con relacin a la longitud de onda y al tamao de la partcula pueden existir tres tipos de dispersin.

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Los mtodos de dispersin de la luz son las tcnicas ms utilizadas para monitorear el crecimiento de los cultivos bacterianos. Son muy tiles y poderosos pero pueden llevar a resultados errneos. Principalmente, dan informacin sobre el peso seco (contenido macromolecular). 1.1 Turbidimetra La turbidimetra mide la reduccin de la transmisin de luz debido a partculas de una suspensin y cuantifica la luz residual transmitida. Estudios tericos y experimentales han mostrado que soluciones diluidas de diferentes tipos de bacterias, independientemente del tamao celular, tienen casi la misma absorbancia por unidad de concentracin de peso seco. Esto quiere decir que, en soluciones diluidas, la absorbancia es directamente proporcional al peso seco, independientemente del tamao celular del microorganismo. Sin embargo, se encuentran absorbancias muy diferentes por partcula o por UFC (Unidad Formadora de Colonia) cuando los tamaos de las clulas bacterianas son diferentes. Por esta razn, para estimar el nmero de microorganismos totales o el nmero de microorganismos viables de una suspensin bacteriana debe realizarse una "curva de calibracin" con cada tipo de microorganismo, slo de esta forma es posible relacionar Absorbancia (Densidad ptica) con el nmero de microorganismos totales o con UFC.

Figura 2. Absorbancia en funcin del Peso Seco K: constante que vara con la longitud de onda utilizada y representa la inversa del peso seco del microorganismo que produce un aumento de 10 veces en el valor de la absorbancia (1/W0). Peso seco: Concentracin celular bacteriana expresada en unidades de peso seco (g/ml-mg/ml). ING.AGROINDUSTRIAL Pgina 8

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La relacin directa entre la absorbancia y el peso seco slo se aplica para suspensiones diluidas de bacterias. Estas suspensiones no deben tener una absorbancia mayor a 0.3, ya que valores mayores producen desviaciones de la ley de Beer. Sin embargo, el inconveniente de utilizar suspensiones diluidas puede involucrar un mayor error de pipeteo y menor sensibilidad por el bajo nivel de absorcin.

Figura 3. Absorbancia en funcin del Peso Seco.

Figura 4. Absorbancia en funcin del Nmero de Microorganismos Totales.

Otros Mtodos indirectos de determinacin de biomasa. Estos mtodos se basan fundamentalmente en la determinacin de algn componente celular especfico, en la cuantificacin de alguna actividad enzimtica (mtodos bioqumicos) o en la medida de consumo de sustrato o de la formacin de algn producto (mtodos cinticos). Tambin se incluyen en este apartado algunos mtodos fisicoqumicos. Los mtodos bioqumicos y cinticos determinan, ms que la viabilidad de las bacterias la actividad ya que dependen ms del estado metablico de los microorganismos que del nmero de individuos (Arniz et al, 2000). 1. Componentes celulares. Cualquier componente celular seleccionado para la estimacin de la biomasa viva de una muestra debe responder a tres criterios fundamentales: Estar presente nicamente en clulas vivas, ser rpidamente degradado en clulas vivas, ser relativamente constante en concentracin respecto a cambios en el estado fisiolgico celular y entre distintas especies.

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Hasta el momento no existe ningn componente celular que cumpla estos tres requerimientos. Sin embargo, los ms adecuados para estimar biomasa viva (Arniz et al, 2000), son: cidos nucleicos, El ADN y el ARN son dos componentes de las bacterias cuya sntesis es proporcional a la tasa de crecimiento. Mientras que las concentraciones de ARN varan considerablemente con el estado fisiolgico celular, la cantidad de ADN es relativamente ms constante. La cantidad de ADN se determina mediante espectrofotometra, tras su extraccin y purificacin. Existen diversas tcnicas, si bien presentan la desventaja de que los procedimientos de purificacin son complejos, con diversas interferencias y bastante costosos (Arniz et al, 2000). Protenas, Existen varias tcnicas para el anlisis de protenas totales de una muestra biolgica. Algunos estn muy extendidos y se caracterizan por su sensibilidad, rapidez y simplicidad. Es el caso de las tcnicas de Lowry et al. y Bradford. La principal desventaja de la determinacin de protenas es que su cantidad en las clulas est sujeta a fuertes variaciones debido, fundamentalmente, a cambios en las condiciones fisicoqumicas y al estado fisiolgico celular (Arniz et al, 2000). Polisacridos, La mayora de las clulas procariotas contienen cido murmico (un peptidoglicano) como componente de la pared celular. Existen varias tcnicas para 1a determinacin del cido murmico en muestras que contengan microorganismos. Todas ellas se basan en la conversin del cido murmico a lactato, seguida del anlisis enzimtico o qumico de la concentracin de lactato. El cido murmico se extrae de 1as clulas mediante una hidrolisis alcalina y se purifica posteriormente mediante cromatografa de intercambio inico. Otros anlisis ms sensibles necesitan del uso de cromatografa lquida (HPLC) o gaseosa (GC). Todas estas tcnicas son laboriosas. Muy largas y necesitan de un equipamiento caro (Arniz et al, 2000).

2. Lpidos. Los lpidos son un componente fundamental de las membranas celulares. Su determinacin para la estimacin de la biomasa de una poblacin bacteriana ofrece muchas ventajas sobre otros mtodos. La principal ventaja es su alto contenido especfico y que se encuentran en cantidades relativamente constantes. Otra ventaja muy importante es que los lpidos no forman parte de las reservas ceiulares y se degradan rpidamente durante la lisis bacteriana. Aproximadamente, entre un 90-98 % de los lpidos de las membranas celulares ING.AGROINDUSTRIAL Pgina 10

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est en forma de fosfolpidos. Las tcnicas de anlisis se basan, fundamentalmente, en la extraccin celular de los fosfolpidos con un disolvente orgnico, su posterior hidrlisis cida para liberar el fosfato y, por ltimo, 1a determinacin colorimtrica de ste. Son tcnicas relativamente sencillas, reproducibles y sensibles (de 0,1 a 1 nmol de fosfato) (Arniz et al, 2000).

ATP, El ATP presenta las ventajas de ser un componente bioqumico central presente en todos los microorganismos y especfico de los microorganismos vivos, circunstancias ambas que permiten relacionarlo con la biomasa viva. Una de las tcnicas ms utilizadas para medir ATP se basa en la reaccin luciferina-luciferasa, proceso responsable de la luz emitida por las lucirnagas y que ha sido ampliamente estudiado. En este mecanismo de luminiscencia se sabe que intervienen luciferina (fenol heterocclico, LH2), luciferasa (enzima, E), ATP, cationes de magnesio y oxgeno en un proceso de oxidorreduccin que ocurre en doble etapa: Ya que por cada molcula de luciferina oxidada se emite un cuanto de luz, la determinacin del ATP en una muestra biolgica puede hacerse mediante extraccin por ebullicin en tampn Tris (hipocloruro de tris-hidroximetil-aminoetano) del ATP, incubacin con luciferina-luciferasa y posterior medida de la luz producida en un fotmetro con registro. La mayor desventaja de esta tcnica es 1a necesidad de procesar la muestra con rapidez, ya que el estado fisiolgico de las clulas cambia rpidantente tras la toma de muestra. La relacin entre el ATP, el ADP y el AMP y el contenido total de desoxirribonucletidos refleja la carga energtica de las clulas [(ATP + 0,5 ADP)/(AMP + ADP + ATP). Esta relacin puede duplicarse en slo unos segundos. Algunos autores sugieren que la carga energtica es un valor mucho ms preciso que el contenido absoluto de ATP ya que la composicin celular de desoxirribunucletidos vara con el estado fisiolgico de los microorganismos: durante el crecimiento bacteriano el pool energtico disminuye, al disminuir la concentracin de ATP y aumentar las de ADP y AMP (Arniz et al, 2000). 3. Mtodos bioqumicos. Las medidas de alguna actividad enzimtica pueden considerarse como una alternativa a los mtodos tradicionales. Los ensayos enzimticos son simples de realizar y sus resultados se obtienen rpidamente. Adems. El equiparamiento necesario no es ni costoso ni complejo. La mayora de las medidas de actividad enzimtica se realiza mediante la conversin de sustratos especficos a productos coloreados que son cuantificados fotomtricamente. ING.AGROINDUSTRIAL Pgina 11

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La principal desventaja de los mtodos bioqumicos es la variacin de las actividades enzimticas celulares con los cambios fisiolgicos y que, una vez que los microorganismos mueren, las enzimas liberadas pueden seguir activas .Entre las distintas medidas de actividad enzimtica cabe destacar: Actividad esterasa Actividad deshidrogenasa

4. Mtodos cinticos. La base de estos mtodos es la medida del consumo de sustrato o de la formacin de producto en ensayos en discontinuo. El ejemplo ms tpico en microorganismos aerobios es la determinacin de la DBO, que indica la biodegradabilidad de un sustrato en disolucin a travs del consumo de oxgeno del medio.

Adaptaciones del Respirmetro de Warburg Tasa de respiracin Tasa de desaparicin de sustrato Potencial bioqumico de produccin de metano

5. Mtodos en continuo. Durante los aos 90 se han desarrollado mtodos cuantitativos para la determinacin on-line de la biomasa de un proceso biolgico. Las tcnicas ms importantes se basan en propiedades elctricas, microcalorimtricas o espectrofotomtricas de los cultivos biolgicos. Sin embargo, a pesar del desarrollo tecnolgico, no existe un sensor ideal para la monitorizacin en continuo de la biomasa.

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EL COEFICIENTE DE VARIACIN Es una medida que se emplea fundamentalmente para: 1. Comparar la variabilidad entre dos grupos de datos referidos a distintos sistemas de unidades de medida. Por ejemplo, kilogramos y centmetros. 2. Comparar la variabilidad entre dos grupos de datos obtenidos por dos o ms personas distintas. 3. Comparar dos grupos de datos que tienen distinta media. 4. Determinar si cierta media es consistente con cierta varianza. El Coeficiente de Variacin muestral se denota y se define como:

DESVIACIN ESTNDAR

La desviacin estndar o desviacin tpica es la raz cuadrada de la varianza. Es decir la raz cuadrada de la media de los cuadrados de las puntuaciones de desviacin. Esta medida se representa por .

As la varianza es la media de los cuadrados de las diferencias entre cada valor de la variable y la media aritmtica de la distribucin. Aunque esta frmula es correcta, en la prctica interesa realizar inferencias poblacionales, por lo que en el denominador en vez de n, se usa n-1 (Correccin de Bessel) Esta ocurre cuando la media de muestra se utiliza para centrar los datos, en lugar de la media de la poblacin.

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[INFORME DE LABORATORIO DETERMINACIN DE BIOMASA] 17 de abril de 2013 IV. MATERIALES Y MTODO

A. Materiales 4.1.1 Materiales biolgicos Levadura saccharomyces cerevisae. Agua destilada Material de laboratorio

4.1.2

Tubos de ensayo Lminas cubreobjetos Vaso de precipitacin Pipeta

4.1.3

Equipos

Centrifugadora Microscopio Estufa (105C por 3 horas) Balanza electrnica Cmara de Neubauer Espectrofotmetro

B. Metodologa a) Para determinacin utilizando cmara de Neubauer. PASO 1. Preparacin de la muestra. Dependiendo del tipo de muestra a medir, se ha de habr de preparar una muestra con una concentracin apta para su recuento.

Figura 5.Preparacin de la muestra. ING.AGROINDUSTRIAL Pgina 14

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PASO 2. Introduccin de la muestra en la cmara de Neubauer

Figura 6. Introduccin de la muestra en la cmara de Neubauer PASO 3. Preparacin y enfoque del microscopio.

Figura 7. Clulas viables para conteo.

Figura 8. Orden de conteo en zig-zag.

Figura 9.Los sectores de conteo en la cmara de Neubauer. ING.AGROINDUSTRIAL Pgina 15

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PASO 4. Clculo de la concentracin.

b) Para determinacin de Peso Hmedo Se tomaron muestras de 5 mL de la solucin inicial y se colocaron en tres tubos de ensayos previamente pesados. Luego los tubos son llevados a la centrifuga donde se hacen girar a 4 000 RPM, por un tiempo de 10 minutos. Luego pasamos a pesar cada tubo de ensayo en la balanza analtica, anotamos los pesos y luego promediamos.

c) Para determinacin de Peso Seco Se tomaron muestras de 5 mL de la solucin inicial y se colocaron en cuatro tubos de ensayos previamente pesados. Los tubos de ensayo son llevados a la centrifuga donde se hacen girar a 4 000 RPM, por un tiempo de 10 minutos. Luego pasamos a pesar cada tubo de ensayo en la balanza analtica y anotamos los pesos. Posteriormente, se llevan los tubos a estufa, a una temperatura de 105 C por un tiempo promedio de 3 horas. Pasado el tiempo anotaremos, los pesos y luego pasamos a sacaremos un promedio.

Las ecuaciones que se determinarn son: ( ( ) )

Hallaremos el coeficiente de Variabilidad de las 4 repeticiones.

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MUESTRA ORIGINAL

4 tubos de ensayo previamente pesados e identificados, para luego agregar a cada tubo 5 mL de muestra original.

CENTRIFUGADO

Los tubos pasan por un proceso de centrifugado a 4000 RPM por un tiempo de 10 minutos.

ESCURRIDO

Se somete un escurrido para separar las clulas que fueron sometidas a centrifugacin. Obteniendo el peso de muestra hmeda/ mL de muestra original. Para la determinar el peso seco la muestra anterior se somete a un proceso de secado, colocando dichas muestras a la estufa a una temperatura de 105C x 3 horas. Obteniendo el peso de muestra seca/ mL de muestra original.

ESTUFA

Figura 10.Esquema de Mtodo Peso Hmedo y Peso Seco.

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d) Para determinacin de turbidimetra Se prepar una solucin acuosa con levadura, a partir de la cual se procedi a preparar diluciones (4/100, 6/100, 8/100 1/10, 2/10, 4/10, 6/10, 8/10) De la muestra original se tom 5 ml en dos tubos para determinar la concentracin en peso seco y peso hmedo. Para determinar la concentracin por conteo celular se tom una muestra de la dilucin 1/10. Con todas las diluciones y muestra original se procedi a colocarlas uno por uno en celdas para leer la absorbancia en el espectrofotmetro. Con estos datos se pas a realizar las siguientes graficas absorbancia vs peso seco, absorbancia vs peso hmedo y absorbancia vs conteo celular.

MUESTRA ORIGINAL

A partir de la muestra original se prepararon, distintas diluciones en tubos de ensayos.

LECTURA DE ABSORBANCIA A 550 NM.

Figura 11.Esquema de Mtodo Turbidimetra.

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[INFORME DE LABORATORIO DETERMINACIN DE BIOMASA] 17 de abril de 2013 V. RESULTADOS Y DISCUSINES

5.1 METODOS DIRECTOS DE DETERMINACIN Segn Rodrguez et al (2005), los mtodos para estimar el nmero de microorganismos medirn la cantidad de clulas. Los mtodos que cuantifican la cantidad de clulas son tiles principalmente para enumerar organismos como bacterias o levaduras, mientras los que miden la masa o actividad celular pueden utilizarse para todos los microorganismos, incluidos los hongos filamentosos, en los que es difcil cuantificar las clulas individuales. Segn lo expuesto por el autor en nuestra prctica hicimos conteo de levadura de Saccharomyces cerevisae por mililitro, para la determinacin de su biomasa utilizando el mtodos directos. Tabla1.Nmero de clulas y anlisis estadstico de la muestra analizada utilizando la Cmara de Neubauer Metdo Cmara de Neubauer CELULAS PROMEDIO /mm3 DESVIACIN ESTANDAR COEFICIENTE DE VARIACIN Nmero de clulas/mL 286.10 30.9603689 10.8215201 7.15E+07

Segn Unam (1986), en la tcnica de conteo de clulas hay que tener en cuenta que en esta tcnica uno de los factores que afecta la observacin de las clulas de levadura es la correcta dilucin de la muestra empleada se puede decir que si durante el conteo se observan aproximadamente 69 clulas la muestra se encuentra muy concentrada, mientas que si se observan menos de 20 clulas, la muestra se encuentra muy diluida. En nuestra experiencia se observ las clulas sin dificultad lo que permite obtener un resultado ms confiable. La concentracin de levaduras (levaduras/mL) encontradas, por el mtodo de conteo directo en la cmara de Neubauer fue de 7.15E+07 Clulas de levaduras/mL.

Los datos encontrados despus del conteo nos arrojan valores promedios de levaduras, con una desviacin estndar de 30.96, por consiguiente un coeficiente de variacin de 10.82%. Podemos observar que el coeficiente de variabilidad es 10.82% aproximadamente; esto nos indica el grado de variabilidad o dispersin que existe entre los datos. Segn Nuez (1992) si CV es menor o igual que 20% se dice que el promedio es representativo, o que los datos son

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homogneos y si el CV es mayor al 20%, el promedio no es representativo de los datos, o los mismos no son homogneos, es por ello que afirmamos que los datos son homogneos y el mtodo de recuento en microscopio utilizando la cmara de Neubauer es adecuado para la determinacin de biomasa. En nuestro caso tomamos como referencia un CV menor a 30% para aceptar los datos. Muoz (2007), el conteo en la cmara de Neubauer debe efectuar en los 25 cuadrantes de la cmara, hasta obtener un nmero de 300 clulas con el fin de tener una confianza del conteo del 90% en nuestro caso por motivos de tiempo no se puedo efectuar el conteo de todos estos, se tom datos de 10 de ellos estos datos pueden verificarse en la tabla de anexos; a pesar de ello se obtuvo un CV aceptable debido a que todos estos cuadrantes presentaban similar nmero de clulas. Es importante contar en total 10 cuadrados, cinco en cada cmara, es decir de la cmara de arriba y la de abajo (Aquiahuati, 2004).

Tabla 2.Peso seco, peso hmedo y anlisis estadstico de la muestra analizada utilizando peso hmedo y peso seco.

Metdo PESO PROMEDIO DESVIACIN ESTANDAR COEFICIENTE DE VARIACIN

Peso Hmedo (g.m.h/mL) 0.05484 0.002441366 4.45179748

Peso Seco (g.m.s/mL) 0.009615 6.60808E-05 0.687267381

Segn Arniz, et al (1992), el peso hmedo se obtiene a partir de una muestra en suspensin que es pesada luego de la separacin de las clulas por filtracin o centrifugacin. Demostrando una tcnica til para grandes volmenes de muestra. La principal desventaja es que el diluyente queda atrapado en el espacio intercelular y contribuye al peso total de la masa. Esto se puede contrastar en la Tabla 2, hay una diferencia entre el peso hmedo y el peso seco debido a que el primero contiene agua del diluyente de la solucin. Este peso hmedo tiene una masa de 0,0834 gramos la cual es mayor a 0.009615 obtenida para el peso seco. Segn Gil (2003), el recuento de clulas por rea presentes en una solucin, su coeficiente de variacin se encuentra dentro de lo aceptable si no hay mucha diferencia significativa, ya que dentro de la determinacin de biomasa, su variacin ING.AGROINDUSTRIAL Pgina 20

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poda ser significativamente cuando es menor (CV= 12,3 %), indicando que la exactitud de la determinacin vara con los laboratorios y el personal. Esto se comprueba con las muestras de peso seco y hmedo calculadas donde se obtienen valores menores al mencionado: 4.45 % en cuanto a peso hmedo y 0.68% en peso seco el cual casi no presento variacin entre las cuatro muestras analizadas.

5.2 METODOS INDIRECTOS DE DETERMINACIN MTODO TURBIDIMETRIA

Tabla 3.Valores de absorbancia, nmero de clulas, peso hmedo y peso seco obtenidos por calculo a partir de dilucin 1/10. Concentracin de Diluciones T1 4/100 T2 6/100 T3 8/100 T4 1/10 T5 2/10 T6 4/10 T7 6/10 T8 8/10 T9 M.O A 0.490 0.611 0.925 1.025 1.549 1.924 2.140 2.306 2.453 cel/ml 1.08E+07 1.62E+07 2.16E+07 2.70E+07 5.40E+07 1.08E+08 1.62E+08 2.16E+08 2.70E+08 g.m.s/ml. g.m.h/ml 0.000385 0.0021936 0.000577 0.0032904 0.000769 0.0043872 0.000962 0.005484 0.001923 0.010968 0.003846 0.021936 0.005769 0.032904 0.007692 0.043872 0.009615 0.05484

Segn Arniz et al, 2000 este mtodo se basa en la existencia de una relacin directa entre el nmero total de microorganismos presentes en una muestra y su valor de turbidez. Tras la determinacin de la turbidez de la suspensin celular mediante espectrofotometra, el resultado se expresa en unidades de absorbancia. Sin embargo, antes de utilizar la turbidez como mtodo de recuento, hay que realizar una recta de calibrado que relacione medidas directas (microscpicas, por recuento en placa o peso seco) con las indirectas de la turbidez. Lo cual se realiz en la prctica ya que se trabaj para ello con tres mtodos directos: conteo de clulas mediante la Cmara de Neubauer, peso seco y peso hmedo cuyos datos de muestran en la tabla 3 con los cuales se obtuvieron las rectas que permiten obtener su factores de conversin.

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1.200 1.000 Absorrvancia (A) 0.800 0.600 0.400 0.200 0.000 0.00E+00 y = 4E-08x R = 0.9404

Series1 Linear (Series1)

1.00E+07

2.00E+07

3.00E+07

Nmero de clulas/mL

Figura 12. Absorbancia en funcin nmero de clulas de la solucin de levadura.

1.200 1.000 Absorvancia (A) 0.800 0.600 0.400 0.200 0.000 0 0.0002 0.0004 0.0006 0.0008 0.001 0.0012 Peso seco (g.m.s/mL) y = 1120.7x R = 0.9404

Series1 Linear (Series1)

Figura 13. Absorbancia en funcin Peso seco de la solucin de levadura.

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1.200 1.000 Absorvancia (A) 0.800 0.600 0.400 0.200 0.000 0 0.002 0.004 0.006 Peso Hmedo ( g.m.h/mL) y = 196.5x R = 0.9404

Series1 Linear (Series1)

Figura 14. Absorbancia en funcin Peso hmedo de la solucin de levadura.

Tabla 4.Ecuaciones y factores de conversin obtenidos mediante Turbidimetra. Figura 12 13 14 Ecuacin Y=4E-08X Y=1120.7X Y=196.5X R2 0.9404 0.9404 0.9404 Factores de conversin 4E-08 1120.7 196.5

En la tabla 5 se muestran los factores de conversin obtenidos de las ecuaciones para la muestra de levadura, segn lo mencionado por Arniz et al (2000), esta recta contiene datos sobre el nmero de clulas, permitiendo la estimacin de tal parmetro a partir de una sola medida de la turbidez asimismo nos dice que se trata de mtodos rpidos, pero de baja sensibilidad y que presentan problemas de calibracin (tipo de cultivo, medio de cultivo) y de interferencias con partculas. De acuerdo en lo expresado por el autor estos factores nos permiten obtener el de manera aproximada el nmero de clulas teniendo la medida de absorbancia de la solucin.

Segn Rodrguez, et al (2005), nos seala que para que sean visibles las trazas de turbidez es necesario ms de un milln de clulas por ml., como para ser medida por un espectrofotmetro. ING.AGROINDUSTRIAL Pgina 23

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Por lo que la turbidimetra no es un mtodo til para medir la contaminacin de lquidos para un nmero relativamente pequeo de bacterias y o levaduras. Se comprob en la prctica con xito en el experimento ya que tanto la muestra original analizada como la muestra problema sobrepasaban dicha cantidad; adems, todas las muestras de concentraciones diferentes se leyeron 550nm de longitud de onda, cercano a 540 nm, (longitud de onda comnmente utilizada para la determinacin de crecimiento por el mtodo de turbidimetra en las investigaciones). Segn Toro (2005), la relacin directa entre la absorbancia y el peso seco slo se aplica para suspensiones diluidas de bacterias. Sus absorbancias no deben ser mayores a 0.3, ya que valores mayores producen desviaciones. Esto se evidencio en la prctica aunque en nuestro caso fue levadura el peso Seco de la muestra problema, presentaba valores mayores a esta cifra motivo por el cual se tom los menores valores de absorbancia para peso seco; asimismo se tom estos valores para obtener las curvas de calibracin en funcin de peso hmedo y conteo nmero de clulas mediante la cmara de Neubauer con los cuales pudimos obtener valores de R2 cercanos a la Unidad y a lo mencionado en la bibliografa citada en el presente informe.

VI.

CONCLUSIONES

Se determin la biomasa presente en una solucin de levadura utilizando la cmara de Neubauer y expres en unidades de clulas/ml obtenindose un resultado de 7.15E+07, con un promedio de 286.10 clulas por cada cuadro de 0,2mm x 0,2mm y un coeficiente de variabilidad de10.82% aproximadamente.

Se determin la biomasa de la levadura mediante el mtodo de peso hmedo, peso seco obtenindose valores de 0.05484 (g.m.h/mL) y 0.009615 (g.m.s/mL).

Mediante el mtodo de Turbidimetra, se construy la curva de calibracin y se hall el factor de conversin en los tres mtodos para determinar sus resultados tericos comparndolos con los reales, obtenidos en laboratorio. .

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[INFORME DE LABORATORIO DETERMINACIN DE BIOMASA] 17 de abril de 2013 VII. RECOMENDACIONES

Para realizar un recuento en cmara de Neubauer se recomienda agitar bien la dilucin con el fin de tener una muestra ms homognea y al momento de colocar la muestra sobre la cmara tener la precaucin para no derramarla sobre la placa cubreobjetos de tal manera que el conteo sea el adecuado. Calibrar el espectrofotmetro antes de tomar las medidas, ya que este pudo haber sido utilizado con otras sustancias en experimentos anteriores. Del mismo modo calibrar la balanza analtica par que nuestro porcentaje de error sea mnimo.

VIII.

BIBLIOGRAFA

Arniz,C., Isac,L. Y Lebrato, J. (2000).Determinacin de la biomasa en procesos biolgicos. Sevilla. Aquiahuati M. (2004), Manual de Prcticas: Laboratorio de Microbiologa Celular, Universidad Autnoma Metropolitana, Unidad Iztapalapa, Departamento de Biotecnologa, 1era Edicin, Pg. 63-68. Gil, E. (2003). Elementos clave en la uniformidad de distribucin de abonos. Escuela superior de agricultura de Barcelona. Muoz, A. (2007). Microbiologa. Madrid: Editorial Paraninfo. Nuz, A. (1992). Estadstica Basca para planificacin. Madrid: Siglo XXI Editores.

Rodrguez, E., Gamboa, M., Hernndez, F. Garca, J. (2005). Bacteriologa General: Principios y prcticas de laboratorio. Editorial Universidad de Costa Rica.

TORO R. (2005), Manual de Introduccin al Laboratorio De Microbiologa, editorial universidad de caldas, 2005.

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[INFORME DE LABORATORIO DETERMINACIN DE BIOMASA] 17 de abril de 2013 IX. ANEXOS

CALCULO DEL NUMERO DE CELULAS

Tabla 5. Nmero de clulas contadas en el retculo central con el mtodo cmara de Neubauer de muestra original. Cuadrante X1 X2 X3 X4 X5 X6 X7 X8 X9 C10 1 9 29 15 11 10 9 20 11 7 13 2 16 18 14 30 37 32 22 27 12 14 3 10 14 21 15 29 12 23 16 23 21 4 12 21 13 19 16 24 17 14 21 11 5 9 22 10 24 38 18 18 16 24 9 6 26 16 29 18 14 14 8 17 14 15 7 25 23 15 20 15 16 14 36 28 13 8 19 15 12 23 27 28 19 8 17 31 9 15 26 19 10 31 16 17 23 16 23 10 13 26 9 16 11 11 20 13 17 16 11 23 31 25 15 18 44 23 22 18 23 12 18 27 13 11 11 22 15 13 24 12 13 17 31 11 16 16 14 21 14 19 13 14 17 28 17 17 19 13 17 16 10 15 15 20 8 25 22 21 26 11 9 11 11 16 21 7 12 14 16 15 16 7 5 16

270 342 260 281 329 314 281 262 266 256

Tabla 6. Nmero de clulas contadas en el retculo central con el mtodo cmara de Neubauer en la dilucin 1/10. Cuadrante X1 X2 X3 X4 X5 1 4 5 27 4 9 2 26 8 7 7 8 3 9 5 11 12 15 4 2 3 2 1 3 5 5 3 6 18 0 6 1 5 3 9 3 7 4 1 3 3 11 8 3 3 16 12 16 9 9 8 6 8 8 10 7 14 2 3 10 11 4 5 3 11 2 12 4 4 8 5 3 13 17 13 5 2 3 14 17 6 8 6 6 15 1 6 6 3 3 16 6 2 3 3 7 119 91 116 107 107

Tabla 7. Pesos promedio empleando el mtodo peso hmedo y peso seco. Datos T1 T2 T3 T4 Pesos de Hmedo (g.m.h/mL) 0.05368 0.05706 0.05666 0.05196 0.05484 Peso Seco (g.m.s/mL) 0.00954 0.00962 0.0096 0.0097 0.009615

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