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Universidad Andrés Bello Facultad de Ciencias de la Salud Departamento de Ciencias Biológicas Laboratorio de Biología Celular Bio035

“Organización subcelular”
Observación de componentes subcelulares por medio de fraccionamiento subcelular y microscopía óptica

Lilly Akentjew Felipe Chamorro Claudia Betancourtt Sección 13 Profesores: Catalina Fernández Mauricio Valdivia

Santiago, 10 de Junio de 2013

Introducción La célula es la estructura más pequeña capaz de realizar tres funciones vitales: nutrición, relación y reproducción. Todos los organismos vivos están formados por células, algunos organismos como las bacterias y protozoos son unicelulares, es decir, formados por solo una célula, en cambio existen otros como las plantas, los animales y los hongos que son pluricelulares, es decir, formados por más de una célula que actúan de forma coordinada. La célula a su vez se puede clasificar de acuerdo a la presencia o ausencia de un núcleo verdadero, en dos grandes grupos, las células procariontes y las células eucariontes. Las procariontes son aquellas que tienen un núcleo difuso en el citoplasma, esto se refiere a que no poseen un núcleo celular rodeado por membrana. Este tipo de células está constituido por membrana plasmática, pared celular, ribosomas, mesosoma y material genético (DNA) que se encuentra libre en el citoplasma sin ninguna estructura que lo delimite. Otra característica importante es que no presentan organelos membranosos. En cambio las células eucariontes son aquellas que poseen un núcleo celular delimitado por una doble membrana y organelos membranosos (mitocondrias, RER, REL, peroxisomas, cloroplastos, Golgi, Pared celular, centriolos, citoesqueleto, núcleo, etc.). Las células del tipo eucariotico se pueden dividir en dos tipos de células distintas las vegetales y las animales. Las eucariotas vegetales aunque son similares a las animales, presentan diferencias como la carencia de centriolos y poseen algunos organelos y estructuras exclusivas como los cloroplastos, pared celular y vacuolas. Las células eucarioticas de tipo animal presentan la mayoría de los organelos membranosos exceptuando los organelos exclusivos de la célula vegetal e incluyendo los centriolos. Se han descrito numerosas tinciones basadas en la permeabilidad selectiva de la membrana plasmática como por ejemplo la eosina/nigrosina (Colas, 1980) y Tripán azul (Suttiyotin y Thawaiter, 1991) que permiten el estudio de componentes subcelulares membranosos. Los organelos celulares que conforman las células también pueden ser separados de las células para ser estudiados más detalladamente, este proceso de separación de organelos se llama fraccionamiento subcelular, proceso que permite obtener componentes celulares aislados, en grandes cantidades y con alto grado de pureza. Esta técnica fue desarrollada entre otros por Alberte Claude y Christian Duve entre 1940 y 1950, y consiste en la separación de los componentes de la célula basándose en su tamaño y densidad. Todo proceso de fraccionamiento subcelular tiene dos etapas:1) rotura de la células o tejido para obtener un lisado celular en el que la fracción deseada se encuentre en condiciones adecuadas para su purificación 2) separación de la fracción deseada del resto del componente de la célula o tejido mediante algún criterio como puede ser una diferencia de densidad, la presencia de algún antígeno, etc. Esto se logra mediante instrumentos llamados centrifugas que permiten someter a las muestras a intensas fuerzas que producen la sedimentación en poco tiempo de las partículas que tienen una densidad mayor que la del medio que las rodea. En una centrifuga el elemento determinante es el rotor, dispositivo que gira y en el que se colocan los tubos. Al terminar la centrifugación se distinguen dos fases; una

donde al fondo del tubo de ensayo se obtiene un pellet o sedimento, la parte sólida, y sobre él una parte liquida llamada sobrenadante.

Objetivos El objetivo general de éste trabajo consiste en el reconocimiento de los componentes subcelulares a través de métodos empíricos y su observación directa por microscopía óptica. Objetivos específicos Conocer las técnicas de homogenización en un fraccionamiento subcelular Comprender los fundamentos de la utilización de centrifugación en el fraccionamiento subcelular Conocer las moléculas marcadoras y su utilización en la evaluación de fraccionamiento subcelular

Materiales y métodos Se proporcionó un hígado de rata picado en pequeños trozos contenido en un vaso precipitado, éste se lavó con suero fisiológico (pH 7,2 – 7,4) para eliminar la mayor cantidad de sangre presente en la muestra. Luego el hígado picado se sometió a una homogenización en Ultraturrex a 1600 rpm manteniendo el vaso en un contenedor con hielo para mantener baja la temperatura de la muestra. El homogenizado se filtró a través de una gasa y se transfirió a un tubo Falcon de propileno para ser sometido a una centrifugación inicial de 2500 rpm por 6 minutos en una ultracentrífuga, el sobrenadante 1 (SN1) se mantuvo en un tubo en hielo y el pellet 1 (P1) fue resuspendido con suero fisiológico para luego volver a centrifugar durante 20 min a 2500 rpm (sobrenadante 2, SN2 y pellet 2, P2). Por último se mezcló SN1 con SN2 y se sometieron a una última centrifugación, esta vez a 6000 rpm por 20 min. (obteniéndose SN3 y P3) Todas las centrifugaciones se realizaron a 4º C y los tubos se mantuvieron en hielo entre cada proceso. Las fracciones nuclear y mitocondrial fueron observadas en un microscopio óptico con y sin tinción (azul de tripan) Se observó además una muestra fijada previamente de un corte de hígado de rata utilizando el objetivo de inmersión (100x) Para observar la reacción de las diferentes fracciones frente a otros compuestos se prepararon 4 tubos de ensayo de la siguiente forma:

Luego de añadir la fracción correspondiente en cada tubo, se agregaron 2 ml de vaselina líquida para evitar que la muestra reaccione con el oxígeno del aire.

Resultados Contenido de los pellet obtenidos tras cada centrifugación: P1: Fracción nuclear P2: Fracción mitocondrial P3: Fracción microsomal

Observación de las fracciones nuclear y mitocondrial: Pellet 1 (Fracción nuclear) Muestra: Fresca Objetivo: 40x Tinción: Ninguna. Observación: Es posible distinguir glóbulos rojos en movimiento en la muestra. También se observan trozos de membranas. Muestra: Fresca Objetivo: 40x Tinción: Azul de tripán Observación: Se distinguen esferas de color azul que corresponden a los núcleos de las células del hígado teñidos. Pellet 2: Fracción mitocondrial Muestra: Fresca Objetivo: 40x Tinción: Ninguna. Observación: No se pudieron observar estructuras

Muestra: Fresca Objetivo: 40x Tinción: Azul de tripán Observación: No se observaron estructuras Corte de hígado fijado Muestra: Fija Objetivo: 100X Tinción: Sin tinción Observación: En las células del hígado, llamadas hepatocitos, se visualizan claramente los núcleos. También se ve la división entre el citoplasma y el núcleo que corresponde a la membrana nuclear. Se identifica además la membrana plasmática. En el experimento de las diferentes fracciones frente al Succinato y Azul de metileno se observaron cambios con la exposición al calor en los tubos que contenían la fracción nuclear (verde azulado), la fracción mitocondrial (azul opaco) y la fracción microsomal (celeste), el blanco tomó la coloración azul típica de la tinción. Discusión La centrifugación es un método por el cual se pueden separar diversos componentes de diferente densidad mediante una centrifugadora, la cual imprime a la mezcla un movimiento rotatorio con una fuerza de mayor intensidad que la gravedad, provocando la sedimentación del sólido o de las partículas de mayor densidad. Este es uno de los principios en los que se basa la densidad: Todas las partículas, por poseer masa, se ven afectadas por cualquier fuerza (origen de una aceleración). La centrifugación impone, gracias a la aceleración centrífuga, un efecto parecido al gravitacional: Las partículas experimentan una aceleración que las obliga a sedimentar. La centrifugación puede dividirse en primera instancia en dos grandes grupos: La preparativa y la analítica. En la primera, se obtienen grandes cantidades del material que se desea estudiar (pellet), mientras que en la segunda (sobrenadante) se procede al análisis de las macromoléculas por medio de una ultracentrifugación. El objetivo de la centrifugación es separar partículas de diferentes características. Para ello, se aplica un fuerte campo centrífugo, con lo cual las partículas tenderán a desplazarse a través del medio en el que se encuentren con la aceleración de gravedad. ¿Por qué el procedimiento de fraccionamiento se realiza a temperatura baja? Se suele aplicar en frio el procedimiento de fraccionamiento para evitar el sobrecalentamiento de las muestras que podría provocar la desnaturalización de las proteínas y en este caso de deja a 4 ºC ya que minimiza la activación de daño generado por fosofolipasas y proteasas.

El suero fisiológico funciona en este caso como buffer, éste es un sistema constituido por un ácido débil y su base conjugada o por una base y su ácido conjugado que tiene capacidad "tamponante", es decir, que puede oponerse a grandes cambios de pH en una disolución acuosa, en este caso se utiliza para homogenizar la muestra. ¿Por qué la tinción con azul de tripano nos permite tener una mejor visualización del núcleo? El azul de tripano[4] se utiliza para diferenciar células vivas de células muertas. Las células vivas o tejidos con la membrana celular intacta no son coloreados debido a que las células son muy selectivas a los compuestos que dejan pasar a través de la membrana. En las células viables el Azul de Tripano no es absorbido; sin embargo, atraviesa la membrana de las células muertas. Por lo tanto, las células muertas se muestran de un distintivo color azul bajo el microscopio. Debido a que las células son excluidas de la tinción, este método también es llamado Método de tinción por exclusión. Así las células que aparecen en la imagen visualizada en el microscopio (en este caso en 40x), claramente de color azul, son consideradas no viables (núcleo). Al visualizar la muestra del pellet homogenizado de hígado de rata con 1 ml de buffer en un microscopio a 40x del pellet del núcleo sin tinción, es muy difícil poder observar el núcleo, ya que se visualiza con poca nitidez, en cambio en la muestra que fue teñida con una gota de azul de tripano se puedo observar claramente como fue absorbido por los núcleos de la célula y gracias a ello se pudo observar con mayor nitidez. ¿Por qué reacción el tubo de fraccionamiento de núcleo y no el de fraccionamiento mitocondrial? La reacción debiese ocurrir con la fracción mitocondrial debido a que el succinato deshidrogenasa, es una flavoproteína (proteínas que contienen un ácido nucleícos) ligada a la membrana interna mitocondrial que interviene en el ciclo de Krebs y en la cadena de transporte de electrones. Pero la reacción que se obtuvo fue de la fracción nuclear lo cual podría ser explicando que La mayoría de las proteínas mitocondriales están codificadas en genes nucleares, y su mRNA es traducido en el citosol. Esto hace necesaria la existencia de "péptidos guía" o secuencias guía, que señalan el destino de estas proteínas mitocondriales que se sintetizan en el citosol. De esta forma estas proteínas mitocondriales codificadas en el genoma nuclear llegan a su destino correcto; es decir, al lugar donde llevarán a cabo su función estructural y/o metabólica, sea la matriz mitocondrial, la membrana interna, el espacio intermembrana o la membrana externa. Solo una pequeña parte de las proteínas mitocondriales son codificadas por el genoma mitoocondrial en humano. Sin embargo esto no ocurre igual en todos los organismos; en los organismos menos evolucionados la mitocondria tiene un gran genoma que codifica un gran número de proteínas, aparte de otros elementos como rRNAs, tRNAs y RNA, pero este genoma es reducido drásticamente en el curso de la evolución hasta alcanzar

su

mínima

expresión

en

la

especie

humana.

Conclusión En síntesis podemos mencionar que la identificación de una fracción subcelular son de suma importancia ya que permiten identificar las distintas funciones que poseen los organelos celulares y la importancia de su existencia en la célula debido a que estos producen en general todas las reacciones de una célula. De una manera general, podemos constatar que finalizada la actividad práctica, se pudo establecer un análisis a cerca del fraccionamiento subcelular, permitiéndonos distinguir e identificar los componentes del una fracción subcelular y los organelos presentes en cada uno de ellos siendo parte de los componentes celulares, los cuales cumplen importantes funciones para el buen funcionamiento celular. Posteriormente se pudo identificar mediante investigaciones los principales elementos que conforman a los distintos organelos (enzimas, ribosomas, membrana, etc.) y conocer cada uno de los metabolismos existentes en ellos. Como fue de esperar pudimos comprobar que los conocimientos, estudios y posteriores investigaciones al terminar el práctico nos dio paso a la comprobación de la hipótesis planteada con antelación. Obteniendo que el fraccionamiento subcelular es una técnica que nos permite obtener diferenciadamente cada uno de los organelos celulares, los cuales poseen diferentes componentes los que reaccionaran de distinta manera según sea su metabolismo enzimático.

Bibliografía [1] TOOD, STANFORD. Diagnóstico y tratamiento clínico por el laboratorio. 1988. Salvat. Tomo I. Pág 14. [2] DEVLIN, THOMAS. Bioquimica. 1999. Revertré. Pág. 4. [3] BEYNON RJ Y EASTERBY JS. Basic Concepts. En: Buffer Solutions: The Basics. Oxford: BIOS Scientific, Publishers; 1996. [4] RUIZ, LOURDES Y MARTÍNEZ, ALBERTO. BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL III. Departamento de Biología Molecular. [5] COLAS B. & MAROUX S., (1980) Simultaneous isolation of brush border and basolateral membrane from rabbit enterocytes. Presence of brush border hydrolases in the basolateral membrane of rabbit enterocytes. Biochim Biophys Acta. 1980 Aug 4; 600(2): 406-20 pp. [6] SUTTIYOTIN D. & THAWAITER C., (1991) The ability of trypan blue to differentiate live and dead ram spermatozoa. Anim. Reprod. Sci., 25: 209-224 pp.