You are on page 1of 4
Tehnica patch clamp Tehnica patch clampeste o tehnica de laborator utilizata în electrofiziologie, aceasta permite studiul de canalelor ionice unice sau multiple în celule.Tehnică poate fi aplicată la o mare varietate de cellule fiind deosebit de utilă în studiul celulelor excitabile, cum ar fi neuroni, cardiomiocite, fibre musculare și celulele beta pancreatice. Tehnica patch clamp este un rafinament al tehnicii voltage clamp. Erwin Neher și Bert Sakmann au dezvoltat tehnica de patch clamp la sfârșitul anilor 1970 și începutul anilor 1980. Această descoperire a făcut posibilă înregistrarea curenților de canale de ioni unice, pentru prima dată, dovedind implicarea lor în procesele celulare fundamentale, cum ar fi potentialul de actiune. Neher și Sakmann a primit Premiul Nobel pentru Fiziologie sau Medicină în 1991 pentru această lucrare. Tehnica de patch-clamp permite investigarea unui set mic sau canale ionice chiar singur. Un canal de ioni singur desfasoara aproximativ 10 milioane de ioni pe secundă. Cu toate acestea, curentul este doar câteva picoampi. Inregistrarea curentilor in acest ordin de mărime reprezinta o provocare atat pentru cercetători cat si pentru echipament. Principiul general al înregistrărilor patch-clamp. O pipetă de sticlă care conține soluția de electrolit este aplicata etans pe membrana celulară , astfel izolează electric membrane creeandu-se un sigiliu. Curentii care trec prin aceste canalele în e varsă în pipetă și poate fi înregistrată de către un electrod de argint clorat care este conectat la un amplificator diferential extrem de sensibil. În tehnica voltage clamp un curent este injectat în celulă printr-o buclă de feedback negativ pentru a compensa schimbările potentialuluil de membrană. Înregistrarea acestui curent permite concluzii cu privire la conductantei membrana. Potențialul de membrană poate fi manipulat independent de curenții ionici și aceasta permite investigarea relațiilor curent-tensiune ale canalelor membranare. fig1.Schema tehnicii patch clamp Astfel, aceasta tehnica ofera posibilitatea masurarii curentului electric mediat de un singur canal ionic, deschizand noi perspective practice de a caracteriza procesele de permeatie si „gating” ale canalelor ionice.Se pot adapta mai multe configuratii de lucru a tehnicii patch-clamp: • configuratia „celula atasata\" (cell-attached) care permite inregistrarea unor curenti unitari care traverseaza fragmentul izolat sub pipeta; • configuratia „celula in intregime\" (whole cell) ofera posibilitatea de a face experiente de potential impus asupra unei celule individuale; • configuratia „interiorul spre exterior\" (inside-out) obtinuta prin excizia unui fragment demembrana, de o maniera ce face ca fata sa interna sa se afle scaldata in mediul de perfuzie;aceasta configuratie este obtinuta pornind de la configuratia „celula atasata\" (cel l-attached); • configuratia „exteriorul spre exterior\" (outside-out), obtinuta pornind de la configuratia„celula atasata\" permite studierea unui fragment de membrana a carei fata externa se aflascaldata de mediul de perfuzie. Schematizarea procedurii de izolare a canalelor ionice membranare: in principiu, o pipeta speciala de sticla (pipeta patch-clamp),tratata termic special, cu diametrul lavarf de 0.54μm, este pusa in contact cumembrana celulara ce contine N canale ionice, fiecare avand o anumita probabilitate de deschidere si permitetrecerea unui curent. In conditiiexperimentale speciale se obtine situatia in care rezistenta electrica a mediului dintre varful pipetei si membrana celulara, ce separa portiunea („patch”)de membrana ce contine canalul ionic de interes de mediul extern, devine de ordinul 5-100GΩ. In aceste conditii, daca aplicam inte mediul intern pipetei si cel extern o diferentade potential, curentul electric (i) mediat de canalul ionic astfel izolat poate fi relativ usor deseparat de zgomotele electrice externe si analizat.Din analiza unui semnal obtinut prin aceasta metoda se poate obtine atat probabilitatea de deschidere a canalului ionic prin evaluarea diferentei dintre amplitudinea semnalului atunci cand canalul este inchis si deschis, cat si conductanta acestuia in anumite conditii fizice prin evaluarea timpului pe care semnalul il petrece in pozitia „deschis”.Figura urmatoare. Experimente patch-clamp sunt utilizate pentru a aborda o varietate de intrebari fiziologice, nu numai in neurostiinta. În ultimele două decenii, inregistrari patch-clamp au devenit, de asemenea, mult mai importante pentru investigarea canalelor de ioni in celule neexcitabile. De asemenea reprezinta o metodă foarte importantă în cercetarea medicală, deoarece multe boli sunt legate de functionarea canalelor ionice . În cercetarea farmacologică,tehnica de patch clamp este utilizata pentru a selectia substantelor . Bibliografie • "Improved patchclamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell-free membrane patches". Pflügers Archiv European Journal of Physiology 391 (2): 85–100. Hamill OP, Marty A, Neher E, Sakmann B, Sigworth FJ. (1981).