METROLOGIA

Micropipetas
As micropipetas são instrumentos volumétricos utilizados para a medição de um determinado volume de líquido quando são necessários valores na ordem dos microlitros. São instrumentos de medição muito importantes em áreas como a química, biologia, saúde, farmácia e genética, que trabalham com o doseamento volumétrico em pequena escala. Existem dois tipos de micropipetas: as micropipetas de deslocamento positivo utilizadas para líquidos específicos e as de deslocamento de ar, sendo estas últimas as mais utilizadas em laboratórios. O princípio da operação de pipetagem é simples: o enchimento das micropipetas é realizado através dum êmbolo accionado manualmente que aspira o líquido de calibração. A quantidade de ar entre o êmbolo e a pipeta determina o volume pretendido. O mesmo êmbolo também provoca o escoamento do líquido por impulsão do ar.

Calibração

IMPORTÂNCIA DA

CALIBRAÇÃO DE MICROPIPETAS
NOS ENSAIOS ANALÍTICOS
A medição de volume é um passo crítico em qualquer laboratório analítico, especialmente quando se trabalha em ensaios muito sensíveis onde existem poucas quantidades de amostra a analisar e onde um pequeno erro de pipetagem pode causar um erro bastante significativo no resultado. Para se conseguir identificar e corrigir erros provenientes do manuseamento de líquidos é essencial a calibração dos instrumentos volumétricos nas mesmas condições em que são utilizados no laboratório.
Elsa Batista Laboratório de Volume Instituto Português da Qualidade

Acalibração de micropipetas consiste na determinação do volume escoado de uma micropipeta através do método gravimétrico, utilizando água como líquido de calibração, à temperatura de referência de 20ºC, utilizando fórmulas adequadas, e que permite obter o erro volumétrico associado à micropipeta. O procedimento experimental é baseado na norma ISO 8655(1) e consiste em efectuar cinco enchimentos sucessivos de forma a que a micropipeta atinja o equilíbrio de humidade. Muda-se de seguida a ponta e faz-se um novo enchimento. Determina-se o peso do recipiente com 3mm de água e pipeta-se o volume pretendido. Pesa-se o recipiente com água e, por diferença, determina-se o valor do volume da micropipeta. Repete-se os ensaios 10 vezes sem limpar o recipiente. Em cada medição deve-se registar o valor da massa. O valor médio dos 10 ensaios corresponde à massa escoada da micropipeta. Para se determinar qual o volume correspondente à massa escoada da micropipeta utiliza-se a seguinte fórmula descrita na ISO 4787(2):

Nesta equação temos: V20 – volume, à temperatura de 20ºC, em µl;

38 QUALIDADE EM SAÚDE

METROLOGIA
IL – resultado da pesagem com o recipiente cheio com água, em mg; IE – resultado da pesagem com o recipiente vazio, em mg; ρW – massa volúmica da água, à temperatura de calibração t, em mg/µl; ρA – massa volúmica do ar, em mg/µl (para temperaturas muito próximas de 20ºC e à pressão atmosférica normal pode ser usado o valor médio de 0,0012 mg/µl); ρB – massa volúmica de referência das massas da balança (para massas conformes com a OIML 33, normalmente utilizados, este valor é de 8,0 mg/µl); γ – coeficiente de expansão cúbica do material de que é constituída a micropipeta, em ºC–1; t – temperatura da água usada na calibração, em ºC. A temperatura do líquido de calibração é um elemento essencial para o cálculo do volume, uma vez que a sua variação implica a obtenção de diferentes valores de densidade. Assim, é de extrema importância que o líquido de calibração se encontre à temperatura de trabalho do laboratório para que os valores obtidos na calibração possam ser utilizados no decorrer de ensaios laboratoriais. Atemperatura de referência deverá ser de (20 ± 0.5)ºC. O líquido de calibração deverá ser água destilada com uma condutividade inferior a 5 µS/cm(3). que descreve como a grandeza V20 é influenciada pelas variações de cada um dos componentes da fórmula utilizada. Assim, a fórmula de cálculo da incerteza padrão é a seguinte: A incerteza padrão é de seguida multiplicada por um factor de conversão k (normalmente é 2 para um número de graus de

liberdade superior a 50) para se obter a incerteza padrão expandida que corresponde a um intervalo de confiança de 95%.(6) Assim, o resultado final da calibração irá ser representado por: V20= Volume ± Incerteza

Variação do erro
Asoma do módulo do erro obtido (diferença entre o volume nominal e o volume convencionalmente verdadeiro) com o módulo da incerteza deverá ser igual ou inferior à tolerância do instrumento indicada na norma ISO 8655, de forma a que o instrumento possa ser utilizado nos ensaios a que se destina.

Testes de desempenho Cálculo da incerteza
A incerteza de medição é o parâmetro associado ao resultado de uma medição, que caracteriza a dispersão dos valores que podem ser razoavelmente atribuídos à mesuranda(4). Para calcularmos a incerteza do volume escoado temos de ter em conta os factores que vão influenciar essa medição ou seja os componentes de incerteza. O cálculo da incerteza na calibração de micropipetas é semelhante ao descrito no trabalho de E. Batista et.al., Metrologia 2000(5). Neste caso específico as componentes da incerteza vão ser as seguintes: a incerteza da pesagem (um) a incerteza da massa volúmica da água (uρw), dos pesos da balança (uρB) e do ar (uρA) a incerteza da temperatura (ut) a incerteza da evaporação (uevap) a incerteza do coeficiente de expansão cúbica do material (uγ) Para se obter a incerteza padrão multiplica-se cada componente pelo respectivo coeficiente de sensibilidade, O erro volumétrico obtido na calibração da micropipeta pode ser alterado indevidamente (invalidando todo o processo de calibração) devido a vários factores de manuseamento deficiente do material, tais como um mau funcionamento do êmbolo causado pela fadiga da mola da micropipeta ou erros associados ao tipo de ponta, entre outros. Assim sendo, foram efectuados dois tipos de ensaios de desempenho a uma micropipeta de 1000 µl para se avaliar a sua resposta em condições específicas e como isto pode influenciar o volume escoado: o ensaio das pontas e o ensaio de fadiga. No primeiro caso a micropipeta foi calibrada sempre com a mesma ponta cinco vezes. No caso da fadiga foram realizadas 100 medições consecutivas, 10 testes com 15 minutos de intervalo e cinco testes com 24 horas de intervalo. Cada teste possui 10 medições. Os resultados obtidos(7) estão indicados nas figuras da página seguinte. Como se pode observar pelas figuras, no ensaio de fadiga a micropipeta necessita de algum tempo para recuperar depois de ser utilizada continuamente. O volume vai diminuindo ao longo das 100 medições (figura 1) possivelmente devido a um problema mecâ-

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METROLOGIA
nico de aspiração do líquido, o êmbolo não consegue voltar à posição inicial. Por outro lado, se houver um intervalo de 15 minutos de espera (figura 2) entre 10 medições consecutivas, a micropipeta já tem tempo para recuperar e o problema mecânico é suprimido, o mesmo acontece se o intervalo de espera for de 24 horas (figura 3), mas como é óbvio este tempo de espera não é viável em laboratórios analíticos. Para o ensaio das pontas (figura 4) verifica-se que se a mesma ponta for utilizada em todas as medições não existe alteração de volume, mas é mais seguro proceder à substituição da ponta em cada medição porque, se existir algum defeito de fabrico que possa influenciar o resultado, pode não ser identificado durante os ensaios. Outro problema que pode ocorrer se não houver substituição de pontas é o da contaminação no caso de medições químicas ou biológicas.

Conclusão
Acalibração das micropipetas é de muita importância para os testes analíticos, pois permite verificar quais os erros e incertezas associados ao material utilizado, sendo assim possível a correcção do volume doseado nas análises realizadas, obtendo-se um resultado final mais correcto e realista. Por outro lado, uma utilização cuidada das micropipetas também é importante, visto que os testes de desempenho indicam claramente que as micropipetas não devem ser usadas continuamente sem nenhum intervalo de espera devido à fadiga do êmbolo que irá levar a resultados de medição de volume incorrectos. Recomenda-se assim um intervalo de espera de pelo menos 15 minutos entre 10 medições consecutivas se a precisão do resultado for importante na medição de volume. Através do teste das pontas pode-se concluir que é melhor utilizar diferentes pontas em cada medição para evitar contaminações e identificar problemas de construção da ponta.

Bibliografia [1] ISO 8655-1/2/6, 2002 – Piston-operated volumetric apparatus; [2] ISO 4787, 1984 – Laboratory glassware - Volumetric glassware - Methods for use and testing of capacity; [3] Guia Relacre – Calibração de material volumétrico, 1995; [4] VIM – Vocabulário Internacional de Metrologia, IPQ (1996); [5] E. Batista, A. Sabrosa, M. Ferreira, I. Castanheira, A.M.H. Van der Veen – "Uncertainty calculation in the calibration of volumetric laboratory glassware", Congresso de Metrologia, Brasil, 2000; [6] BIPM, IEC, IFCC, ISO, IUPAC, IUPAP, OIML– Guide to the expression of uncertainty in measurement (GUM), Geneva, 1995; [7] E. Batista, L.Pinto, E. Filipe, A.M.H. Van der Veen – "Calibration of micropipettes: test methods and uncertainty calculation", Congresso de Metrologia, Toulon, 2003. Agradecimentos AEduarda Filipe e Luís Pinto o permanente apoio e disponibilidade na elaboração deste artigo.

40 QUALIDADE EM SAÚDE

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