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MASTITIS BOVINA: ENFOQUE BIOTECNOLÓGICO

Autor:

HERNANDO MORALES LÓPEZ

LAVERLAM S. A. - UNIVERSIDAD DEL VALLE CALI – COLOMBIA 2011

MORALES LÓPEZ, HERNANDO

MASTITIS BOVINA: ENFOQUE BIOTECNOLÓGICO

Información de los Autores: Hernando Morales López Médico Veterinario Zootecnista candidato a Ms.C. en Biología, Universidad del Valle Director de Control de Calidad y Diagnostico en LAVERLAM S. A. Dirección postal Carrera 5º # 47 – 165 Santiago de Cali, Valle del Cauca, Colombia e-mail: h.morales@laverlam.net

Las opiniones expresadas en este documento no son necesariamente opiniones de la Revista ReCiTeIA, de sus órganos o de sus funcionarios. ReCiTeIA no se hace responsable de materiales con derecho de autor tomados sin autorización por los propios autores.

Edición: 2011 © ReCiTeIA. ISSN 2027-6850 Cali – Valle – Colombia e-mail: reciteia@gmail.com, reciteia@live.com url: http://revistareciteia.es.tl/

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Mastitis bovina: Enfoque biotecnológico
Hernando Morales López LAVERLAM S. A. – Colombia CONTENIDO
Lista de Tablas ............................................................................................................................ 213 Lista de Figuras ........................................................................................................................... 213 Resumen...................................................................................................................................... 214 Abstract ....................................................................................................................................... 214 1 Introducción ....................................................................................................................... 215
1.1 Antecedentes ............................................................................................................................... 215

2 3 4

Definición de mastitis. ....................................................................................................... 217 Etiología. ............................................................................................................................ 218 Epidemiología. ................................................................................................................... 218
4.1 Características bacterianas........................................................................................................... 219 4.1.1 Adaptabilidad y resistencia bacteriana. .............................................................................. 219 4.1.2 Plásmidos de resistencia. ................................................................................................... 221 4.2 Mecanismos de transmisión. ....................................................................................................... 224 4.3 Prevalencia. ................................................................................................................................. 224 4.4 Pérdidas económicas. .................................................................................................................. 224

5 6 7 8 9

Patogenia. ........................................................................................................................... 225 Manifestaciones clínicas. ................................................................................................... 226 Patología clínica y diagnostico. .......................................................................................... 226 Tratamiento. ....................................................................................................................... 228 Prevención. ......................................................................................................................... 232
9.1 Inmunización. .............................................................................................................................. 233 9.1.1 Factores nutricionales. ....................................................................................................... 234 9.1.2 Factores genéticos. ............................................................................................................. 234 9.2 Uso de autovacunas. .................................................................................................................... 236 9.2.1 Breve descripción de elaboración y acción de la autovacuna. ........................................... 238

10 11

Conclusiones. ..................................................................................................................... 239 Referencias bibliografía. .................................................................................................... 240

LISTA DE TABLAS Tabla 1. curación) Tabla 2. Antibióticos más usados para el control de la mastitis en lactancia (tasa de 229 Antibióticos más usados para el control de la mastitis en periodo seco 231

LISTA DE FIGURAS Figura 1. Esquema de un plásmido bacteriano. 223

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Mastitis bovina: Enfoque biotecnológico
RESUMEN El incremento de la resistencia antibiótica por parte de los microorganismos, mediados principalmente por la incorporación de plásmidos bacterianos R y el afinamiento de mecanismos de evasión del sistema inmune, especialmente por el crecimiento en biofilms, recubiertos por exopolisacaridos, ha provocado grandes pérdidas a la industria láctea, debido a la capacidad de las infecciones a persistir largo tiempo en la glándula mamaria. Esto ha conducido al fracaso de la terapia antibiótica. Lo anterior ha obligado a retomar acciones en las áreas de inmunización y genética contra este mal. En el pasado se presentaron resultados poco alentadores en la búsqueda de una respuesta inmune adecuada, a partir del uso de bacterinas, soportada en la poca o nula comprensión de los mecanismos moleculares que intervienen en el desarrollo de la respuesta protectora celular y humoral. Con la invención de nuevas técnicas de estudio molecular, el descubrimiento y la comprensión del mecanismo de acción de proteínas y enzimas celulares, se ha ampliado el horizonte en el campo de la inmunización con resultados más consistentes y duraderos para el control eficaz de la mastitis bovina. Palabras clave: Recuento de Células Somáticas, Resistencia, Plásmido de Resistencia.

ABSTRACT The increase of the resistance antibiotic on the part of the microorganisms happened by the incorporation of bacterial plasmids and the tune-up of mechanisms of evasion of the immune system, especially for the growth in biofilms, covered for exopolysaccharides, has provoked big losses the lacteal industry, due to the increase of become chronic of the infections
in the mammary gland. This has driven to the failure of the antibiotic therapy.

The previous thing has forced to take again actions in areas of immunization and genetics against this evil. In the past they presented slightly encouraging results in the search of an immune suitable response, from the use of bacterins, supported in small or void comprehension of the molecular mechanisms that intervene in the development of the protective cellular response and humoral. With the invention of new technologies of molecular study, the discovery of polymers and the comprehension of the cellular pacemaker the horizon has been extended in the field of the immunization by more consistent and lasting results for the effective control of the bovine mastitis. Keywords: Somatic Cells Counter, Bacterial Resistance, Resistance Plasmids.

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INTRODUCCIÓN

A través de la evolución nutricional del ser humano, este se ha servido de variados alimentos, entre ellos la leche de diversos mamíferos, especialmente la de los herbívoros rumiantes. Debido a su composición es catalogado como el alimento más completo que existe en la naturaleza, con un adecuado balance entre proteínas, vitaminas, minerales, lípidos, azucares y agua, lo que lo hace altamente susceptible a la colonización bacteriana indeseada (26). En el antiguo Medio Oriente donde las tribus nómadas Beréberes, Beduinos y Berberiscos empezaron a buscar cómo combatir las consecuencias de la contaminación bacteriana en leche de camella (controlando la fermentación butírica y gaseosa), utilizando enzimas de origen animal para lograr derivados de la leche fresca y así prolongar su conservación (26). Solamente fue hasta finales del siglo XIX y principios del XX cuando se aceleró el desarrollo de la industria de conservación de alimentos, inventando y descubriendo nuevas tecnologías y por ende nuevos productos. Es así, que actualmente encontramos procesos que eliminan el 100% de los microorganismos en la leche y mecanismos que permiten que esta se conserve así por largos periodos aun sin refrigeración. Si bien el hombre ha logrado procesos notables a nivel de post-cosecha de la leche, se sigue enfrentando a retos cada vez más grandes a nivel de la producción en hato, debido a múltiples factores, que los podemos clasificar en tres grupos fundamentales: El primero obedece al incremento en la presión de selección para obtener animales más productivos, sacrificando con ello la resistencia natural del sistema inmune a las infecciones; el segundo depende del manejo medico inadecuado e insuficiente de los antibióticos y el tercer factor que no depende directamente del hombre, es la adaptación de los sistemas enzimáticos bacterianos a las dos anteriores condiciones (26). 1.1 ANTECEDENTES

Existe mucha literatura referente a la Mastitis bovina, a nivel mundial y el consenso general es que esta es la enfermedad más importante en la producción bovina, debido a la prevalencia y a las pérdidas económicas por disminución en la cantidad y calidad de la leche obtenida de animales enfermos en forma subclínica, donde la principal característica del producto obtenido es que a simple vista se ve normal, es decir, carente de sangre, coágulos de caseína, pus o suero desde la ubre, pero al practicarle pruebas básicas como el California Mastitis Test revela un alto contenido en el número de células somáticas, las cuales no son otra cosa que células epiteliales y del sistema inmune que llegan a la ubre por factores quimiotácticos propios de una respuesta defensiva ante las agresiones de tipo microbial al cual está expuesta la glándula mamaria. Hay dos aspectos de importancia capital en la prevalencia y manifestaciones clínicas de la mastitis bovina, los cuales son inherentes a la evolución bacteriana permitiendo una mejor adaptación a su entorno, como son a saber:

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Crecimiento bacteriano en forma de biofilms y la incorporación de plásmidos de resistencia Estos dos aspectos moleculares del desarrollo bacteriano han traído serias consecuencias biológicas y económicas a los consumidores, procesadores industriales de leche y ganaderos. Desde el descubrimiento de la penicilina por Alexander Fleming se ha descubierto un gran número de sustancias pertenecientes a diferentes grupos, dependiendo de su naturaleza química y su modo de acción en contra de los microorganismos, sustancias estas, se presumía, eran una solución eficaz y definitiva contra las enfermedades de origen bacteriano, lo cual no resulto ser del todo cierto. Si bien es irrefutable que la primera línea de defensa que tiene el hombre, los animales y aun las plantas son este tipo de sustancias, también es cierto que con el transcurrir del tiempo, las bacterias adaptan sus sistemas biológicos para defenderse de estas sustancias, permitiendo que el hombre contribuya a una buena medida a seleccionar súperbacterias que son potencialmente mortales para los eucariotas, debido a su mayor capacidad de adaptarse a diferentes especies incluyendo al hombre. En el documento RIMSA 11/10 correspondiente al punto 12 del orden del día provisional y emitido posteriormente en la ciudad de Washington, D. C., 13 – 15 de abril de 1.999, en la XI REUNION INTERAMERICANA DE SALUD ANIMAL A NIVEL MINISTERIAL, de la ORGANIZACIÓN PANAMERICANA DE LA SALUD, podemos encontrar conclusiones como las siguientes: “El papel del uso veterinario de los antibióticos para el tratamiento de enfermedades como para la “promoción del crecimiento” ha propiciado la cambios en la legislación de algunos países, respecto a limitar su uso, e incluso a prohibirlos en la producción de alimentos de origen pecuario.“El concepto de resistencia de un microorganismo a un antibiótico no es nuevo. En realidad, la resistencia ha aparecido con cada antibiótico nuevo, aunque con variaciones en cuanto al tiempo y la intensidad.” “Muchos hongos del suelo y bacterias producen antibióticos para controlar y matar a los microorganismos competidores que ponen en peligro su nicho ecológico. Estos microorganismos productores de antibióticos portan un gen para producir el antibiótico, pero también portan genes de resistencia a los antibióticos para que el propio microorganismo no sea destruido. Por lo tanto, por cada antibiótico existe un mecanismo natural de resistencia (Harris, et. al., 1.995)” Ejemplos de fármacorresistencia: La Salmonella presenta resistencia múltiple (de 8 a 10 antibióticos). El ciprofloxacino llegó a ser el único antibiótico eficaz contra la fiebre tifoidea, pero ya ha surgido la tifoidea resistente al ciprofloxacino. La neumonía y meningitis por neumococo se han tratado regularmente con penicilina, pero hay un aumento de las cepas resistentes a esta; algunas cepas presentan fármacorresistencia múltiple. Es importante reconocer dos mecanismos: Uno es la transferencia de microorganismos resistentes a los antibióticos; el otro es la selección de la resistencia a

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los antibióticos en las poblaciones bacterianas comensales no patógenas a las cepas patógenas. La resistencia a los antibióticos ocurre ampliamente en las bacterias de los animales domésticos y varía enormemente según las prácticas de gestión, el uso de antimicrobianos y el grado y la naturaleza de las enfermedades presentes en las unidades pecuarias. La industria láctea no ha sido la excepción al paradigma del uso de antibióticos para el control de enfermedades bacterianas, de hecho para muchos productores de leche no sería posible hoy en día tener explotaciones lecheras sin el uso de antibióticos, aun con el riesgo biológico tan alto que conlleva su uso, debido a que los microorganismos (bacterias y hongos especialmente), producen sustancias antibióticas por medio de codificación genética para defender su nicho (enzimas de restricción) de otros competidores, pero también trae implícita la producción de moléculas que inactivan su propio mecanismo de defensa, para no ser autodestruidas, este mecanismo esta mediado por material genético denominado Plásmidos de resistencia los cuales se describieron en otro aparte de este documento (13, 18). Para determinar la prevalencia de infecciones mamarias subclínicas se ha utilizado en forma standard a nivel mundial la prueba de California Mastitis Test (CMT) la cual presenta una escala de calificación que va de cero a cinco, siendo cero la mejor calificación, debido a la no-formación de grumos por la escasa presencia de células somáticas y 5 la peor calificación debido a la formación de gelatina por la presencia de un numero alto de células somáticas. Existen otros sistemas de calificación de cuartos mamarios, utilizando métodos electrónicos de detección de cloruros. Determinación de células somáticas mediante sistemas electrónicos, estos dos métodos usan la escala de Wisconsin como regla de calificación; va de cero a nueve, siendo cero la mejor calificación y nueve la peor. Estas pruebas son consideradas una variación de CMT. Existe también otra prueba similar a CMT, llamada prueba de Brabante. También se recurre a determinaciones bacteriológicas por medio de cultivos o pruebas indirectas como la reducción del azul de metileno u otras sustancias colorantes como indicadoras del número de bacterias presentes en la leche cruda (6, 25).

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DEFINICIÓN DE MASTITIS.

Etimológicamente se define la mastitis clínica como la afección que produce inflamación a nivel de la glándula mamaria trayendo consigo cambios en las características organolépticas, físicas, químicas y microbiológicas de la leche. La mastitis subclínica se puede definir como una enfermedad caracterizada por la presencia de una cantidad significativamente aumentada de células en la leche, procedente de glándulas enfermas con cambios físico-químicos, organolépticos y microbiológicos aun en ausencia de síntomas inflamatorios o de manifestaciones sistémicas. El diagnóstico y calificación de la mastitis subclínica depende en gran medida de pruebas indirectas basadas en el recuento de células somáticas.

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ETIOLOGÍA.

Se ha responsabilizado a muchos agentes infecciosos, entre ellos los más importantes son las bacterias, con predominio de las bacterias Gram positivas que incluyen aproximadamente 23 serotipos de Streptococcus agalactiae (23) y alrededor de 20 serotipos de Staphylococcus aureus (24). Las bacterias Gram negativas (mastitis medioambiental) como Escherichia coli con más de 80 serotipos está incrementando su prevalencia, en parte debido al uso de antibióticos betalactamicos para el control de bacterias Gram positivas (mastitis contagiosa; incluye la mastitis por Mycoplasma bovis) como las dos especies bacterianas citadas, mencionadas en primer término (6, 25). Si bien existen muchos otros microorganismos encargados de producir mastitis, estos son menos frecuentes de encontrar como causa primaria de la enfermedad. Podemos mencionar específicamente a gérmenes como: Bacillus céreus, Clostridium perfringens, Salmonella sp (más de 180 serotipos), Listeria monocytogenes, Pseudomona aeuruginosa, Enterococcus faecalis, Klebsiella sp (6, 20, 26). También dentro de los microorganismos productores de mastitis podemos citar a los hongos de los géneros Trichosporon sp, Aspegillus sp, Pichia sp, y otras levaduras. La glándula mamaria, también puede ser afectada por infecciones sistémicas, que alcanzan el epitelio mamario vía hematógena; las principales entidades son: La Leptospira interrogans (algunos de sus serovares), Brucella abortus y Mycobacterium tuberculosum; Staphylococcus epidermidis y Corynebacterium bovis, son un hallazgo habitual en la glándula mamaria de los rumiantes pero clínicamente no tienen importancia por su baja patogenicidad. Eso sí, son un indicador valioso sobre el adecuado manejo sanitario de las ubres. En infecciones experimentales por Corynebacterium bovis se produce un leve incremento no significativo del recuento de células somáticas en la leche, acompañado de una infección persistente en el conducto del pezón, sin cambios en la composición de esta (6).

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EPIDEMIOLOGÍA.

La infección de la glándula ocurre a través del conducto del pezón, a partir de dos fuentes principales de contaminación: La ubre infectada y el medio ambiente (manos de ordeñadores, pezoneras, paños de lavado y secado). Las diferencias entre bacterias, en lo que se refiere a la capacidad de producir un estado de infección mamaria, dependen de por lo menos dos grupos importantes de factores: Características bacterianas y mecanismos de transmisión (6).

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4.1    

CARACTERÍSTICAS BACTERIANAS. Capacidad del microorganismo para vivir en el medio cercano a la vaca, es decir, capacidad de resistir a las influencias medioambientales naturales y las inducidas por el hombre como por ejemplo los métodos de limpieza y desinfección. Capacidad para colonizar el conducto del pezón. Capacidad de adherirse al epitelio mamario y establecer una reacción infecciosa. Resistencia al tratamiento antibiótico (6, 9).

4.1.1 Adaptabilidad y resistencia bacteriana. El mayor problema que enfrenta la industria láctea mundial es sin lugar a dudas la tendencia a la persistencia de las infecciones mastiticas debido a factores inherentes a la capacidad de evolucionar de las bacterias, quienes al igual de todos los seres vivos buscan la supervivencia y perpetuación de la especie por medio de mecanismos moleculares especializados en evadir el sistema inmune y eliminar moléculas que bloquean la síntesis de proteínas y enzimas necesarias para su replicación, bien sea por medio de la creación de nuevas rutas metabólicas que sustituyan las vías bloqueadas por moléculas medicamentosas o por la síntesis de enzimas que desnaturalicen sustancias toxicas para la bacteria en metabolitos inocuos para estas. Ello ha traído a los ganaderos grandes pérdidas económicas, debido a mermas en la producción láctea por los siguientes aspectos: 1. Daño irreversible del tejido secretor. 2. Disminución del volumen de producción por incapacidad del tejido secretor de expresar todo su potencial genético debido a la inflamación. 3. Perdidas por retención de leche de cuartos afectados. 4. Retiro de producción (si se hace) por presencia de antibióticos en leche. 5. Tratamientos antibióticos muchas veces infructuosos. 6. Por sacrificio de animales inservibles. Igualmente los industriales se han encontrado con problemas de producción debido a la persistencia de productos antibióticos en leche que no permiten la elaboración de derivados, porque los inóculos utilizados en la manufactura de estos mueren o pierden capacidad enzimática, trayendo como consecuencia la variación en la calidad de los productos, perdidas de mercado y retiros en la línea de producción, cuando son detectados. Si estos productos contaminados no se detectan, llegan al consumidor final, quien es el gran perdedor debido a todas las implicaciones para la salud que trae el consumo “per se” de sustancias terapéuticas en microdosis o dosis subterapeuticas. En la leche procedente de vacas tratadas con antibióticos contra la mastitis, se han identificado bacterias viables, potencialmente patógenas para el hombre, en presencia de

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concentraciones antibióticos más altas que en el suero sanguíneo, lo que hace más complejo el panorama para la industria y el consumidor final (25). La persistencia bacteriana en el tejido secretor y en la leche se debe básicamente a dos mecanismos desarrollados por los microorganismos: Síntesis de biofilms e incorporación de plásmidos de resistencia bacterianos (9, 13, 14). 4.1.1.1 Biofilms. Los biofilms son comunidades bacterianas recubiertas de una matriz de aspecto gelatinoso poco densa, producida por las bacterias adheridas a una superficie viva o inerte. Esta estrategia bacteriana es un medio eficaz alcanzado por estas para crecer y supervivir en un medio hostil (9). Los biofilms se cohesionan en forma de microcolonias, recubiertas laxamente, lo que les permite nutrirse y excretar metabolitos; igualmente por causa de la cobertura por exopolisacaridos (serotipo), cualquier proteína de alto peso molecular como por ejemplo los anticuerpos tipo IgM o IgD y proteínas del complemento se hundirán en esta gruesa capa de gelatina, lo que no permite que la fracción Fc de las Ig quede expuesta a los receptores Fc de superficie de los macrófagos para promover la fagocitosis y mucho menos la presentación antigénica mediante las moléculas pertenecientes al Complejo Principal de Histocompatibilidad (MHC) (1, 27). Una ventaja del desarrollo de biofilms para las bacterias que lo realizan, es el crecer en forma de empalizada, siendo las bacterias superficiales las que expresan toda su capacidad de trascripción génica para la síntesis de las cadenas sacaridicas que cubren la pared bacteriana externa del biofilm (9). Las bacterias de las capas más bajas se encuentran en latencia, haciéndolas poco o nada sensibles a los antibióticos que logran pasar la capa polisacaridica, por dos razones: La baja actividad metabólica de las bacterias de las capas inferiores y a la distribución en forma de ladrillos de la película bacteriana (14). Los biofilms bacterianos logran sobrevivir aun en presencia de concentraciones adecuadas de antibióticos sintéticos o de bacteriocinas, lactoferrina, lactoperoxidasa (antibióticos naturales de la leche) en el epitelio mamario, debido a la baja penetración de estas sustancias a todas las capas del biofilm y a la baja absorción del antibacteriano por el escaso metabolismo de las células bacterianas ubicadas en la parte baja del biofilm. Las bacterias solas sin exopolisacaridos son fácilmente opsonizadas por anticuerpos y fagocitadas por los macrófagos. Si están en forma de biofilm y no existen los anticuerpos específicos contra el polisacárido externo, la bacteria no podrá ser opsonizada y pasara desapercibida para el sistema inmune, logrando evadirlo. Por lo anteriormente expuesto, es necesario buscar la producción de anticuerpos contra epítopes específicos del exopolisacarido, para lograr una respuesta inmune adecuada y duradera.

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4.1.1.2 Bacterias productoras de biofilms. Bacterias de importancia a nivel de patología de la glándula mamaria son algunas productoras de biofilms, lo que incrementa el riesgo de cronicidad y adquisición de resistencia a los agentes quimioterapeuticos, lo que permite concluir que dichas especies bacterianas son difíciles de erradicar de las explotaciones una vez se han establecido, porque han logrado afinar su maquinaria bioquímica a las condiciones medio-ambientales y biológicas presentes en dicho entorno (5). Se puede mencionar entre las bacterias productoras de biofilms los siguientes grupos: Streptococcus sp., Staphylococcus sp., Pasteurella sp., Actinobacillus sp., Mycoplasma sp., Haemophylus sp. (8). Cuando las bacterias colonizan tejidos vivos, utilizan mecanismos de adhesión para salvar la primera línea defensiva del sistema inmune innato: Las barreras físicas y químicas (moco, saliva, leche, pH, movimientos peristálticos). Básicamente las bacterias utilizan para este fin estructuras como adhesinas, cilios, fimbrias, flagelos (8). 4.1.2 Plásmidos de resistencia. 4.1.2.1 Definición. Aunque en general es adecuado decir que el genoma de los procariotas consta de un solo cromosoma, muchas bacterias poseen, además uno o varios elementos génicos accesorios extracromosomicos (18). Estos tienen capacidad de replicación autónoma (es decir, constituyen replicones propios). En otras palabras son dúplex de ADN circulares cerrados covalentemente, superenrollados con un PM de 5 x106 y un número de copias por célula que varía entre una o dos hasta veinte y un tamaño por copia que va desde 2 hasta 500 Kb como el de Pseudomona sp (13). 4.1.2.2 Tipos de plásmidos. Los hay de dos tipos: Conjugativos o autotransmisibles y transductibles o no conjugativos (13, 18). 4.1.2.2.1 Plásmidos conjugativos. Son aquellos que se transmiten entre cepas bacterianas por fenómenos de conjugación, lo que permite que algunos plásmidos no sólo sean transmitidos entre cepas de la misma especie, sino entre especies y géneros bacterianos diferentes, recibiendo el nombre de plásmidos promiscuos o de amplio espectro de hospedadores, permitiendo la transferencia horizontal de información genética entre grupos bacterianos filogenicamente alejados (18). 4.1.2.2.2 Plásmidos no conjugativos. Estos no son transmisibles entre especies y géneros de bacterias, pero si son replicados de una generación a otra de bacterias. Dentro de esta categoría existe un subgrupo de

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plásmidos movilizables que pueden ser transferidos a otra célula bacteriana por acción de un plásmido conjugativo coexistente en la misma bacteria (18). 4.1.2.3 Determinación del fenotipo bacteriano. Está comprobado que los plásmidos por lo general no determinan la traducción y trascripción de proteínas y productos esenciales para el crecimiento bacteriano (son dispensables), pero en la naturaleza resultan favorecidas las bacterias que los poseen, pues ellos traen ventajas selectivas en determinados ambientes o condiciones. Existe una amplia variedad de fenotipos y funciones determinados por los plásmidos (18): 1. Resistencia a antibióticos (plásmidos R). 2. Resistencia a metales pesados (Por ejemplo, resistencia al mercurio). 3. Plásmidos de virulencia: Producción de toxinas, factores de penetración de tejidos, adherencia a tejidos del hospedador (por ejemplo, polisacáridos determinantes del serotipo de las bacterias productoras de mastitis). 4. Producción de bacteriocinas. 5. Producción de sideróforos. 6. Utilización de determinados azucares o hidrocarburos (Pseudomonas spp). 7. Inducción de tumores en plantas. 8. Interacciones simbióticas y fijación de nitrógeno en plantas (Rhizobium) y otras funciones más. Los ejemplos anteriores han permitido concluir que en la mayoría de los casos, los plásmidos no tienen nada que ver con el proceso de crecimiento bacteriano en forma directa, sino que se catalogan como responsables de funciones para ocupar nichos ecológicos y resistir circunstancias adversas (18). Vale la pena resaltar que cuando una bacteria no está sometida a una presión selectiva grande, los rasgos fenotípos adquiridos por la presencia de los plásmidos se pueden perder por curación espontánea de estos en parte de la población bacteriana. Pero cuando existe dicha presión (p. ej., un antibiótico), sobreviven y se multiplican preferentemente las bacterias que poseen el plásmido, de modo que en un corto tiempo. La población contiene mayoritariamente dicho elemento génico. Además como muchos plásmidos son autotransmisibles, pueden ser transferidos a cepas bacterianas que originalmente carecían de ellos (13, 18). Por lo expuesto anteriormente en este capítulo, debe ser razón suficiente para incursionar en el campo preventivo de la mastitis en tres aspectos fundamentales: Educación sanitaria de operarios de ordeño; lograr a nivel de explotaciones el control de la enfermedad con una autovacunas mono o polivalente que se ajuste a las necesidades de la vacada y selección genética por medio de toros que comprueben en una progenie lo suficientemente grande un TPA (para todas las razas se parte de 3,0 como base) para bajo número de recuento de células somáticas. Lo anterior no es viable si no se observan normas

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mínimas de higiene en vacas lactantes, adecuado manejo de la vaca seca y Buenas Practicas Agropecuarias (BPA). Con la inmunización se busca el incremento de la resistencia natural del epitelio glandular a las infecciones; Tomemos como ejemplo la vacuna contra la meningitis humana, que contiene varios serotipos de Streptococcus pneumoniae, lo que supone abarca alrededor del 25% de los serotipos implicados en este proceso, trayendo grandes beneficios en las regiones del mundo donde ha sido aplicada la vacuna, por disminución notable de la prevalencia de la entidad. Existe en el mercado mundial vacunas contra Escherichia coli (J5) y Staphylococcus aureus (Redumast) las cuales han demostrado efectividad en el control de la mastitis bovina (11) Las ventajas en el corto plazo para el uso de la estrategia de inmunización en las explotaciones que tienen infecciones mamarias crónicas, serian notables, porque disminuiría el costo de tratamientos antibióticos, retenciones de leche, baja en el rechazo de leches frescas en planta de procesamiento, debido al alto contenido de células somáticas y residuos antibióticos. A nivel biológico, se disminuiría la presión selectiva sobre bacterias poseedoras de plásmidos de resistencia a antibióticos de uso común en la explotación, permitiendo en el largo plazo, la curación de dichos elementos génicos, encargados de transcribir la producción de enzimas que degradan los antibióticos.

Figura 1.

Esquema de un plásmido bacteriano.
Tomado de García Vallejo, Felipe

Estructura general de un plásmido conjugativo que porta genes de resistencia a antibióticos. El plásmido R1 cuyo tamaño molecular es de 100 Kb posee tres regiones funcionales (1).

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Región de replicación contiene todos los genes y secuencias Cis para control de replicación (2) Región de transferencia para conjugación, contiene los genes Tra (3) Región de estabilización (4) Región de los genes de resistencia a antibióticos. 4.2 MECANISMOS DE TRANSMISIÓN.

Dependen de lo siguiente:      4.3 Grado de infección del medio, incluyendo cuartos infectados. Eficiencia del personal y aparatos para ordeño, en especial, la higiene de la sala de ordeño y/o manos de los ordeñadores. Susceptibilidad de la vaca, que guarda relación con: Fase de lactación, edad de la vaca, nivel de resistencia hereditaria, posiblemente relacionada con la forma del pezón y la anatomía del conducto del pezón. Lesiones de la piel del pezón, en especial el orificio. Factores inmunitarios de cada glándula. PREVALENCIA.

La mayoría de estudios realizados en diferentes países ha mostrado una morbilidad cercana el 40% en vacas lecheras y una tasa de infección de los cuartos de la ubre alrededor del 25%, con una tasa del10% de mastitis clínicas. Igualmente los estudios son muy similares en cuanto a la prevalencia de los agentes infecciosos causantes de la enfermedad, notándose en los países industrializados un aumento en la etiología por organismos Gram negativos tipo Escherichia coli, Pseudomona ssp, Aerobacter aerogenes y algunas especies de Klebsiella spp, relacionado con el incremento en las practicas sanitarias de desinfección de la ubre. Igualmente en donde se ha utilizado intensivamente los tratamientos con penicilina sodica, potasica, procainica, benzatinica, se ha incrementado la prevalencia de mastitis subclínicas y crónicas mediadas por Staphylococcus aureus. De otra parte se observa que la prevalencia en mastitis clínicas agudas, corresponde principalmente a Streptococcus agalactie (6). Aunque el Corynebacterium bovis no se considera como causa de enfermedad, se puede utilizar su prevalencia como medidor de la eficiencia del estado de desinfección de las ubres, ya sea en cuanto a utilización de soluciones desinfectantes como a la eficiencia de las mismas (6). 4.4 PÉRDIDAS ECONÓMICAS.

“En términos de pérdidas económicas, es sin duda la enfermedad más importante a la que se enfrenta la industria lechera. Esta pérdida se debe mucho menos a muertes (si bien, en efecto, ocurren casos mortales), si a la reducción de la producción de leche en los cuartos infectados (6)”.

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El cuadro clínico varía desde síntomas hiperagudos con toxemia manifiesta, hasta una pérdida gradual no detectable del epitelio secretor que solo se puede apreciar cuando hay grandes áreas de tejido fibroso y manifiesta baja en la producción. Existe el peligro adicional de que la contaminación bacteriana de la leche en vacas afectadas pueda convertirla en producto inapropiado para el consumo humano; obstaculizar el proceso industrial y en casos no poco frecuentes, diseminar enfermedades al hombre. La Tuberculosis, la faringitis estreptococcica y la brucelosis pueden diseminarse de esta forma (6). Numerosos estudios han demostrado que la producción de un cuarto afectado pierde un 30% de su capacidad productiva en fases iniciales de la lactancia y que una vaca afectada pierde el 15% de su productividad durante toda la lactancia. La infección artificial de vacas en periodo seco reduce en un 35% la producción de leche en el siguiente ciclo de lactancia por cuarto afectado. En fases tardías del periodo de lactancia las pérdidas de los cuartos afectados están alrededor de 48%, pero si la infección se produce después del parto las pérdidas son cerca del 11%. A estas pérdidas cabe añadir un 1% de sólidos totales por cambios en la composición (disminución de grasa, caseína y lactosa mientras que aumentan los cloruros, glicógeno, proteínas de tipo inflamatorio, el pH y el suero) lo cual obstaculiza el proceso de elaboración (6, 26).

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PATOGENIA.

Si bien es importante conocer como es la patogenia de la infección, no se hará mucho hincapié en este apartado, ya que el objetivo de este trabajo en extenso no es el sentar cátedra en el aspecto evolutivo de las infecciones mamarias in vivo, sino el ampliar un poco más el horizonte en el campo preventivo, mediante el proceso de inmunización (autovacunas), siendo este último un aspecto importante en el que deben profundizar los médicos veterinarios que se enfrentan a esta patología, definiendo localmente a nivel de las explotaciones lecheras los principales agentes etiológicos incluyendo los serotipos que intervienen en esta entidad, buscando el incremento de la resistencia natural de la glándula por medio de la aplicación de vacunas que contengan sino todos los determinantes antigénicos mostrados por las bacterias in vivo, si los más importantes, entre ellos podemos citar: Antígenos capsulares, pared bacteriana, fracciones de ADN, etc., aprovechando todos los avances que se ha logrado a nivel de adyuvantes en la medicina humana, pues las bacterias o sus fracciones por si solas son antígenos muy débiles que no logran despertar una respuesta inmune adecuada cuando se aplican las bacterias muertas completas con sales de aluminio o calcio (29). Con los modernos adyuvantes (muchos de ellos en fase de investigación) se busca incrementar la respuesta inmune por dos mecanismos: Inmunomodulacion y adyuvancia (15, 32, 33), entre estas sustancias podemos citar por ejemplo:

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   

Derivados bacterianos como: CpG´s, LPS, PGN, BLP, Mánanos. Adyuvantes oleosos como Oleato de Manitol ®, Montanide ®, Marcol ®, Drakol ®. Partículas microscópicas biodegradables o no de poliestireno o ácidos polilactico, poliglicolico, poli B-hidroxibutirato y fibrina o co-polimeros de polioxietileno llamadas micro partículas y nanoparticulas. Los complejos inmunoestimulantes o ISCOMs y otros muchos más.

Estas sustancias logran la activación de las células presentadoras de antígenos como los macrófagos, células dendríticas y Linfocitos B, atrapando estas moléculas por medio de receptores de membrana muy especializados. Para citar un ejemplo, los Toll Like Receptors (por sus siglas en ingles TLR´s) de los macrófagos que pertenecen a una familia de moléculas receptoras de membrana llamados PRR´s (Pattern Recognition Receptors), moléculas estas que reconocen los PAMP´s (pathogen Associated Molecular Patterns) logrando la activación estas células, haciéndolas más eficientes en la fagocitosis (3). En el contexto de lo que es el desarrollo de la enfermedad en el hospedero, se puede decir que se divide en tres fases la colonización de la glándula mamaria (6); para el autor de este artículo serian cuatro las fases:     Fase de invasión Fase de infección Fase de inflamación Fase de cronificación

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MANIFESTACIONES CLÍNICAS.

“Los síntomas clínicos de la mastitis incluyen anormalidades de la secreción, tamaño, consistencia y temperatura de las glándulas mamarias, y con frecuencia reacción sistémica. Las formas clínicas de mastitis suelen clasificarse según la gravedad: La inflamación con reacción intensa sistémica se clasifica de sobreaguda; la inflamación grave sin reacción sistémica, es aguda; la inflamación leve con anormalidades persistentes en la leche se define como subaguda y los ataque recurrentes de inflamación con pocos cambios en la leche se considera crónico (6)”.

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PATOLOGÍA CLÍNICA Y DIAGNOSTICO.

Básicamente centraremos en forma somera la atención en algunos de los métodos existentes para el diagnóstico de la mastitis, partiendo de la base de que un recuento celular que este por debajo de 100.000 células/mL. es indicador de una glándula mamaria sana, pudiendo llegarse a considerar como aceptable conteos por debajo de 250.000 células/mL (6).

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Los métodos de diagnóstico de mastitis los podemos dividir en directos e indirectos. Los primeros tienen la limitante de ser costosos y los aspectos tácticos de la vigilancia pueden ser derrotados por el elevado número de vacas que deben estudiarse en forma sistemática. Entre estos métodos tenemos los siguientes:    Cultivos bacterianos de leche proveniente de cuartos enfermos. Muestreo de leche para examen por cultivo. Recuentos celulares de leche: podemos citar algunos métodos que requieren el uso de aparatos de electromicroscopía, siendo poco alcanzables en nuestro medio: recuento microscópico de células somáticas (DMSCC); recuento electrónico de células somáticas (ESCC); recuento de las células de la leche en tanque (BMCC) y recuento de células en vaca individual (ICCC).

Los métodos indirectos se refieren a aquellos que utilizan reacciones de precipitación, dependiendo del número total de células somáticas en la ubre de las vacas estudiadas. Entre mayor sea el número de células, más denso será el coagulo que se forma por la reacción de precipitación. Se puede calcular en forma aproximada el número de células somáticas/mL. Con la siguiente calificación: Negativa, indicios, reacción de tipo 1, 2 y 3 con un recuento celular de menos de 300.000 células/mL; 400.000 células/mL; 1.000.000 células/mL; 2.000.000 células/mL y 4.000.000 células/mL respectivamente. La prueba reina de este tipo de proceso diagnóstico es la prueba de California Mastitis Test (CMT) (6). Existen métodos químicos de detección de mastitis no tan exactos como el CMT, por citar uno: Detección de cloruros y sodio. Cuando hay mastitis estos se incrementan provocando cambios en el gradiente de conductividad eléctrica en leche proveniente de vacas enfermas (6, 25, 26) La prueba de CMT se ha utilizado ampliamente en el laboratorio y en el campo. Se han utilizado otras pruebas de laboratorio en relación con el desarrollo de gel y valoración de su viscosidad. Entre ellas la prueba de Brabante, Wisconsin y el test de NAGasa de la mastitis, esta última prueba es apropiada para el manejo de muchas muestras por su facilidad de automatización (6)”; Se basa en la medición de la enzima N-Acetil-B-D-Glucosaminidasa en la leche, la cual es la responsable de participar en la hidrolización del peptidoglicano (PGN), que es el principal componente de la pared de las bacterias Gram positivas, especialmente actuando sobre la síntesis del dipéptido de N-Acetil-B-D-Glucosamina, que se enlaza con el dipéptido Muramico (dipéptido N-Acetil-Muramico), formando el tetrapeptido de NAG-NAM o Peptidoglicano. Se considera que esta prueba tiene la misma seguridad que los contadores de células y requiere de instrumentos de lectura menos sofisticados que el contador de células automático promedio (10). “El CMT tiene la ventaja de que puede utilizar leche de un cuarto, toda la ubre, muestras contenidas en recipientes individuales, muestras totales de leches en tanque, así como muestras de cuartos independientes. Es obvio que los resultados se hacen menos exactos a medida que toma una dilución mayor. Las muestras de tanques de leche de un rebaño

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toleran un promedio de cerca del 18% de vacas positivas antes de dar una reacción 1.Un grado de reacción 1 en la leche del rebaño, sugiere la presencia de mastitis, mientras que un grado 2 o 3 constituye índice de un situación grave (6)”.

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TRATAMIENTO.

Es importante y obvio anotar que el tratamiento depende del agente productor de la enfermedad y para ello es necesario la verificación por medio de cultivos e identificación del agente etiológico, incluyendo pruebas de sensibilidad a los agentes bacterianos de uso veterinario, puesto que en muchas de estas pruebas se usan sensidiscos que no son prácticos en la farmacopea veterinaria, por razones que no son motivo de discusión en este documento. Lo anterior es admisible solo si la enfermedad no es concomitante con síntomas generales, lo que impone un tratamiento de urgencia con antibióticos de amplio espectro y terapia de apoyo con fluidos, electrolitos, antiprostaglandinicos, antipiréticos o glucocorticoides. Como norma general, es conveniente decir que, el tratamiento depende de la agudeza clínica del cuadro, es así como los casos hiperagudos y agudos se deben tratar de forma parenteral, teniendo en cuenta que la difusión de antibióticos desde el torrente sanguíneo hasta el tejido mamario y el espacio alveolar es escaso, no obstante, la difusión se incrementa en los tejidos inflamados. Los antibióticos del grupo Macrolido tienen mayor probabilidad de difundirse en el epitelio mamario, al igual que el Trimetropim. Los antibióticos Aminoglicosidos como norma general se distribuyen mal (6). Las Tetraciclinas, Penicilinas y Novobiocina se distribuyen mal (6, 30); lo anterior implica que las dosis de antibióticos deben ser mayores a las normales, siendo recomendable la aplicación de antibióticos, previo análisis de sensibilidad bacteriana, pero en los casos de campo lo aconsejable es usar Macrolidos, previa toma de muestra para identificación y prueba de sensibilidad. Si se han aplicado antibióticos vía parenteral, lo aconsejable para la toma de muestras después de la aplicación es esperar al menos 12 horas, siempre y cuando no sean antibióticos vehiculizados en sales de larga acción o diluyentes de liberación lenta (30). En todas las mastitis es aconsejable el tratamiento intramamario con soluciones antibióticas en vehículos hidrosolubles y/o soluciones acuosas, rompiendo con esta última presentación el esquema de que son más efectivas las preparaciones antibióticas que tienen un vehículo hidrosoluble y están adicionadas de antiinflamatorios o fibrinoliticos, en el pie de la tabla 1 se describe que no hay una diferencia estadísticamente significativa entre los antibióticos vehiculizados con sustancias hidrosolubles más otros fármacos y los formulados solamente en agua (6). Otro paradigma que es necesario sea roto, es el creer que el producto antibacteriano después de aplicado vía intramamaria, alcanza por si solo todo el tejido mamario, por lo que debe tener en cuenta las siguientes consideraciones:

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La glándula mamaria debe ser evacuada en forma permanente para evitar que las proteínas resultantes de la reacción inflamatoria bloqueen la difusión del antibiótico a nivel de canales, conductos galactóforos y alvéolos. Siempre se debe realizar la aplicación del antibiótico intramamario después del último ordeño, buscando que este permanezca dentro de la glándula el mayor tiempo posible (6).

Un aspecto importante del control de la mastitis es el tratamiento de la vaca seca con antibióticos de muy lenta difusión y metabolización, teniendo como consideración que estos productos se deben aplicar inmediatamente se tome la decisión de secar la vaca, buscando una adecuada difusión del antibiótico en todo el tejido mamario, lo que no se lograría si la aplicación se hiciera días después de iniciado el proceso de secado de la ubre. Los fármacos que tienen mejores antecedentes de difusión a través de la ubre son penetemato, ampicilina, amoxicilina, novobiocina, eritromicina, tilosina. Aquellos de difusión intermedia son penicilina G, cloxacilina y tetraciclinas. Las sustancias que se difunden mal incluyen la estreptomicina y neomicina. En la tabla 1, se puede apreciar la eficiencia comparativa de algunos tratamientos intramamarios habituales de mastitis en cuartos lactantes.
Tabla 1.
Preparados Penicilina G Cloxacilina Cloxacilina + Ampicilina Espiramicina Rifamicina Estreptomicina + Penicilina Tetraciclinas Cloramfenicol Neomicina

Antibióticos más usados para el control de la mastitis en lactancia (tasa de curación)
Dosis 100000U.I. 500 mg 200 mg 75 mg 250 mg 100 mg 1 mg 100000 U.I. 200 – 400 mg 200 mg 500 mg Estafiloc 47 - 70 30 - 60 64 45 - 82 59 - 73 40 - 70 50 28 36 Estreptoc 100 Hasta 100 94 56 74 100 Hasta 100 24 30 - 67 Coliformes Ninguna 97 80 Pobre 50 25 Uso recomendado Producto de acción retardada. Dos aplicaciones con un intervalo de 48 horas. Muchas resistencias Producto de acción retardada, una aplicación Tres aplicaciones una vez al día durante tres días Tres aplicaciones a intervalos de 24 horas Dos aplicaciones a intervalos de 24 horas Tres aplicaciones a intervalos de 24 horas Dos o tres aplicaciones una vez al día a intervalos de 24 horas Cuatro aplicaciones a intervalos de 24 horas Diariamente a intervalos de 48 horas, dos aplicaciones

Tomado de Blood, Henderson, Radostis y Arundel, (1992)

Otros ingredientes incluidos en los tratamientos de mastitis se han usado en múltiples y variadas ocasiones, como la hialuronidasa para favorecer la difusión en la ubre, algunas enzimas como la estreptodornasa, para facilitar la salida del pus, corticoesteroides para reducir la inflamación, inmunoglobulinas para controlar el crecimiento bacteriano, cobalto para aumentar la actividad de los antibióticos y muchos otros. Se han realizado pocas investigaciones para conocer su valor y las realizadas solo han desacreditado el uso de estas sustancias. No tienen cabida en el tratamiento, y por lo tanto no se recomienda su uso. (6)

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Como puede observarse en el cuadro anterior, una vez declarada la enfermedad, diagnosticada e instaurado el tratamiento, los porcentajes de curación no son tan altos como se teóricamente se espera bajo cobertura antibiótica, especialmente con referencia a las mastitis causadas por bacterias Gram positivas. Es en la fase de lactancia donde se justifica la aplicación de las autovacunas, que permita alertar el sistema inmune respecto al reconocimiento de epítopes de los organismos causales de enfermedad que no pueden ser identificados por las células de la inmunidad adaptativa debido a mecanismos de evasión que han desarrollado los microorganismos a través de su evolución. Algunas de las ventajas que la estrategia de vacunación trae como consecuencia directa es una mejora en el volumen de producción y en la calidad de la leche por los siguientes aspectos:     Permite disminuir los costos por tratamientos antibióticos. Baja en los niveles de retenciones y rechazos de leche tanto por recuentos bacterianos como por residuos de sustancias antibióticas. Mejores y más productivas lactancias. Mejora en la calidad bioquímica y microbiológica de la leche, haciéndola apta para la elaboración de derivados y consumo humano sin riesgo para la salud reduciendo la probabilidad de producir reacciones indeseables por la presencia de antibióticos y /o gérmenes patógenos en leche o sus derivados.

Con los avances recientes en el campo de la biología molecular, se han elaborado productos biológicos para el tratamiento de la mastitis bovina. La fabricación de vacunas utilizando fracciones de microorganismos con los adyuvantes adecuados, que son aditivos de crucial importancia en el proceso de elaboración de biológicos para una inmunización activa de bovinos productores de leche, los hacen imprescindibles en las formulaciones vacunales, debido a que muchos de los microorganismos bacterianos son por norma general antígenos débiles, siendo ello uno de los factores que inducen al fracaso de las bacterinas contra la mastitis (6, 8, 9, 21). Es importante considerar que muchos autores recomiendan hacer o no tratamiento, dependiendo de la fase del periodo de lactancia; algunos de ellos plantean que si la vaca está en fase final de lactación, se recomienda esperar hasta el periodo de secado, para iniciar tratamiento a la glándula afectada con productos antibióticos de alta residualidad, que permitirán la posible curación de la afección, que se halla presente en ese momento en la glándula, pero que no protegerá a la vaca contra una futura infección en la lactancia subsiguiente. Este aspecto táctico del tratamiento, podría contaminar con antibióticos la leche de los primeros días de lactancia (25). Los tratamientos antibióticos realizados en periodo seco teóricamente buscan esterilizar la glándula mamaria durante esta etapa de recuperación fisiológica de la vaca, (pero en la

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práctica no se consigue) trayendo como consecuencia un incremento en la susceptibilidad de la glándula, porque disminuye el estado de alerta del sistema inmunitario por disminución del número de macrófagos y neutrofilos en el epitelio glandular (por inhibición de la diapédesis), situación que para muchos investigadores no es deseable (6). La gama de productos idóneos para usarse en el tratamiento de la vaca seca no es amplia. Algunos aparecen listados en la tabla 2:
Tabla 2.
Preparados Cloxacilina Benzatinica Pen. Procainica + Novobiocina Pen. Procainica + Estreptomicina Pen. Procainica + Estreptomicina Neomicina Pen. Procainica + furaltadona

Antibióticos más usados para el control de la mastitis en periodo seco
Dosis 500 mg 1 millón U.I. 500 mg 1 millón U.I. 1 gramo 100000 U.I. 100 mg 500 mg 100000 U.I. 500 mg Estafiloc 84 84 87 54 62 67 Estreptoc 94 94 96 90 65 94 Coliformes No efectiva No efectiva Efectiva Desconocida 89 100 Uso recomendado Efectiva, costosa, útil para cuartos glandulares infectados, preparados baratos para no infectados Resultados idénticos a la Cloxacilina benzatinica, recomendación idéntica Debe tener ventajas contra coniformes La dosis de estreptomicina es pequeña, barata, útil para cuartos no infectados Usada en cuartos infectados con coniformes Buen resultado de amplio espectro

Tomado de Blood, Henderson, Radostis, Arundel., (1992)

Como se puede apreciar, los porcentajes de curación en el periodo de secado son más altos que los tratamientos para el periodo de lactancia, pero no alcanza el 100%, lo que permite concluir que el problema está lejos de solucionarse por medio de esta parte del aspecto táctico del control de mastitis. Dando por entendido que existen mecanismos más radicales para el control de la enfermedad en el hato como son por ejemplo: Secado permanante de los cuartos infectados cronicamente, eliminacion de vacas multirresistentes del hato. Otro paradigma existente entre los productores de leche es que el uso de antibacterianos intramamarios y parenterales son suficientes para el control de la infección, concepto que riñe con la realidad, ya que una vez se ha establecido la infección en el hato, se hace muy difícil erradicarla por los factores biológicos descritos anteriormente, éxito logrado por los microorganismos tras millones de años de evolución. En la legislación de los países industrializados se controlan las dosis máximas de antibacterianos que se usan en el tratamiento de la mastitis, buscando controlar la cantidad de medicamento que puede llegar a ser ingerido involuntariamente por el consumidor final. Aspecto al que no hemos llegado en nuestro país, agravando el problema de la industria local en varias direcciones:  Incremento en la prevalencia de la mastitis en regiones y explotaciones donde se han usado masivamente los antibióticos sin un criterio adecuado. “En un estudio llevado a cabo por Roberts y Visconti en el año de 1972, se analizaron los expedientes de 340

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pacientes humanos que habían recibido terapia antibiótica durante su hospitalización. Un equipo de expertos, opino que las prescripciones habían resultado razonables en un 12.9 % de los casos, discutibles en un 21.5% y completamente inadecuada en el 65.6% de los casos. Entre los 340 pacientes, 48 presentaron reacción adversa a la droga en el transcurso de la terapia. En el 92% de los pacientes que sufrieron una reacción a la droga, se estimó que el tratamiento prescrito era discutible o francamente irracional (19).” Es presumible que con los médicos veterinarios ocurra lo mismo y lo que es peor, en nuestro medio los antibióticos se adquieren sin prescripción médica y sin ningún control sanitario.  Presencia en leche de cantidades inadmisibles de bacterias y células somáticas, que son posibles focos de transmisión de enfermedades zoonoticas en los consumidores de productos lácteos contaminados con estos microorganismos (20). La presencia de sustancias antibióticas en la leche impide su adecuada industrialización afectando el rendimiento de los subproductos obtenidos (25). Otro aspecto importante a ser tenido en cuenta es la posibilidad de generar reacciones de multirresistencia a los antibióticos en el ser humano, debida al consumo de productos contaminados con trazas de estas sustancias. Se presenta perdida en el rendimiento en producción de derivados lácteos, especialmente quesos debido al menor rendimiento, provocado por la baja en la calidad físico-química de la leche proveniente de vacas enfermas de mastitis (26).

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PREVENCIÓN.

Básicamente la prevención ha estado orientada a la toma de medidas poco estandarizadas de control higiénico a nivel del medio ambiente que rodea la ubre, en gran parte de nuestros hatos. Si bien estas medidas son la primera decisión a tomarse dentro de una estrategia macro sobre el control de mastitis, deben ser parte de un sistema de aseguramiento de calidad, que permita tener estructurados los procesos y procedimientos que conduzcan a establecer un plan global que asegure la calidad del producto que llega al proceso industrial, que satisfagan las expectativas del consumidor final y generen rentabilidad tanto a ganaderos como industriales. Hoy en día, el autor ha incursionando en el campo del control de mastitis por medio de autovacunas, que se adapten a la necesidad de la vacada, teniendo en cuenta los tipos de microorganismos existentes en la explotación. Como se discutió en anteriores apartados de este documento, las ventajas de la inmunización son múltiples, logrando disminuir los costos de producción en las explotaciones lecheras.

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9.1

INMUNIZACIÓN.

La inmunización es el procedimiento que busca mantener alerta el sistema inmune contra agresiones generalmente provocadas por agentes externos o por mutación de proteínas de origen endógeno (tumores mediados por oncogenes). Esta se logra por medio de la introducción de un agente microbiano completo o la fracción inmunogenica de este en el huésped, buscando la respuesta inmune satisfactoria, que lo proteja de agresiones futuras por medio de células de memoria. A esta técnica se le conoce genéricamente como vacunación, procedimiento que se hace utilizando microorganismos inactivados, compuestas por las fracciones naturales, semisintéticas o sintéticas antigénicas de los agentes productores de la enfermedad; estas a su vez pueden ser según el número de antígenos, mono o polivalentes. Siempre deben estar mezcladas con adyuvantes, quienes cumplen tres funciones una vez estas han sido aplicadas:    Atracción quimiotáctica de células presentadoras de antígenos (APC). Liberación lenta del antígeno (acción depot) Incremento de la inmunogenicidad de los antígenos.

En el reciente pasado se intentó la vacunación contra mastitis, con resultados poco alentadores a la aplicación de bacterinas para su control. Los fracasos generalmente obedecen a aspectos en la fabricación de las vacunas como:  Cultivo inadecuado de las cepas bacterianas encontradas en los cuartos enfermos. Las condiciones intramamarias, son muy limitantes para el crecimiento bacteriano, lo que permite que el agente colonizador de los tejidos manifiesten al máximo su fenotipo mediado por plásmidos, creando estructuras y proteínas necesarias para la supervivencia. Estas estructuras desaparecen bajo condiciones de cultivo In Vitro convencionales (27). Utilización de adyuvantes inadecuados, p. e. tipo sales minerales en cantidades inadecuadas o que no tienen en cuenta el gradiente eléctrico y otras características físico-químicas para adsorber el antígeno. La utilización de toda la bacteria quien presenta epitopes que no se manifiestan in vivo. Baja concentración de inmunógeno por dosis. Aplicación de una dosis, siendo necesaria la aplicación de refuerzos (dosis booster) cuando se utilizan antígenos no proteicos. Utilización de serotipos diferentes a los que se hallan en la explotación.

    

Igualmente, hay factores de orden intrínseco de cada individuo de la vacada, que tienen que ver con la adecuada respuesta inmune, ellos son:   Factores nutricionales. Factores genéticos.

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9.1.1 Factores nutricionales. La nutrición en todos los seres vivos es fundamental para el mantenimiento de la vida comprendiendo las funciones de sostenimiento, protección y producción. En este apartado se hará referencia solamente a dos componentes importantes en el mantenimiento de la homeostasis de la glándula mamaria: Selenio y vitamina E (7). Estos dos elementos son componentes importantes de enzimas que desnaturalizan los radicales libres producto de la peroxidacion de los lípidos celulares (componentes de la pared celular y bacteriana).Los radicales libres afectan en forma insidiosa la integridad celular. El epitelio glandular no es ajeno a este mecanismo de defensa originado por células como los macrófagos y los neutrofilos (Respiratory Burst), incrementando la vulnerabilidad a la colonización bacteriana por perdida de la regulación del calcio y la enzima calcioATPasa trayendo como consecuencia la muerte celular de células epiteliales y del sistema inmune (7). El mecanismo de acción de estos dos componentes son si se quiere, sinérgicos. La vitamina E es en un 90% tocoferoles que tienen mayor afinidad por los radicales libres R que son la fuente de la oxidación de las cadenas lipídicas componentes de la pared celular eucariota (7, 31). Cuando el radical libre R se une a una molécula lipídica LH seguida con una reacción de oxígeno, se forma un radical lipídico peroxil (LOO), si no se reduce este radical, se descompone en dos radicales libres, iniciando una reacción en cadena de peroxidacion de lípidos. Sin embargo el tocoferol transfiere una molécula de hidrogeno al radical peroxil, convirtiéndolo en un lípido oxidado menos dañino (LOOH) para las células (31). El selenio entra en la formación de enzimas que intervienen a nivel reproductivo, somático e inmunitarios como lo es el caso para este último, de la PHG-Px (Phospholipid Hyperoxide Glutathione peroxidase) que toma el lípido oxidado y lo convierte en un lípido alcohólico, que es necesario para dar el primer paso en la reparación de la membrana lipídica de la célula, evitando de esta manera la destrucción de la pared celular (7, 31). 9.1.2 Factores genéticos. Las enfermedades infecciosas son uno de los problemas principales que afectan frecuentemente a la crianza de animales, representando un factor limitante en la producción, esto se refleja en un aumento en los niveles de mortalidad ó en bajos índices de crecimiento y fertilidad, así como en la disminución de la cantidad y calidad de carne, lana y leche. Una serie de factores resaltan la importancia de la resistencia genética a infecciones en los animales domésticos (2, 21). Primeramente, representa un ahorro en gastos de operación en las explotaciones animales, ya que se ha estimado que el costo de enfermedades puede llegar a representar entre el 10-

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20% el valor de la producción. Además, se economizan gastos en el manejo: como en la aplicación de fármacos, cuarentenas, etc. Por otro lado, el contar con animales resistentes a enfermedades es un recurso muy importante para contrarrestar el aumento creciente en la frecuencia de patógenos resistentes a fármacos. Igualmente, el empleo de animales resistentes da la oportunidad de establecer explotaciones pecuarias en áreas infestadas. El uso preferente de estos animales puede facilitar las campañas de erradicación de enfermedades (4). Dentro de los mecanismos involucrados en la resistencia genética a infecciones se han identificado varios niveles: 1. Primera defensa: Consisten aquellas barreras del huésped contra las cuales se enfrenta el patógeno al momento de la infección: barreras epiteliales, ausencia de receptores, mucus, lisozima, lactoferrina, defensinas, etc. 2. Defensa no específica: Son aquellos mecanismos inmunológicos innatos como: neutrófilos, macrófagos, células NK, sistema del complemento, interferón alfa y beta, etc. 3. Defensas específicas: Son las que se desencadenan después de la exposición a un antígeno específico: activación, proliferación y diferenciación de linfocitos T y B, producción de inmunoglobulinas, linfocinas: MIF, interleucinas, interferón gamma, etc. En todos estos niveles existen en las poblaciones animales diversos genes (y sus variantes alélicas) que determinan diferentes capacidades de responder con distintos grados de susceptibilidad y resistencia ante los embates de los agentes infecciosos (2, 21). La mastitis es una de las enfermedades más frecuentes en el ganado bovino lechero. En varios países la incidencia de la mastitis clínica, por vaca al año se ha reportado entre 20 y 40%. Por lo mismo, es la enfermedad más costosa en el ganado lechero (4). Se ha estimado que hay una correlación genética entre la producción de leche y la mastitis. Numerosos estudios concluyen que los niveles de correlación son en promedio 0.4. Esto representa que se espera un aumento de 4.3 casos de mastitis por 100 vacas /año como una respuesta correlacionada a un incremento genético en la producción de leche de 500 kg (12). El mejoramiento genético para aumentar los niveles de resistencia a mastitis, puede ser efectuado por selección directa usando registros de mastitis clínica, o por selección indirecta, usando rasgos que se correlacionan genéticamente, o ambos. Las medidas indirectas más comúnmente usadas has sido el conteo de células somáticas (SCC), rasgos de tipo, así como la rapidez de ordeño y el escurrimiento. La cuenta de células somáticas es usada frecuentemente como un indicador de mastitis. Se ha evaluado extensamente que existe una correlación genética en promedio de 0.7 de este rasgo con la mastitis clínica. Además, la cuenta de células somáticas presenta valores de

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heredabilidad ente 0.04 a 0.11, valores mayores a los estimados para la mastitis clínica (12, 16). Estos hallazgos sugieren que los valores de la cuenta de células somáticas podrían usarse para la mejorar la resistencia a la mastitis. Se ha reportado que las hijas de toros que transmiten los valores más bajos de células de somáticas tuvieron menor incidencia de mastitis clínica durante las dos primeras lactancias. Sin embargo diversos cálculos muestran que, el considerar solo la cuenta de células somáticas no es tan efectivo como los registros de la mastitis clínica (12, 16). La respuesta a la selección es proporcional a la desviación estándar genética aditiva. A pesar de la baja heredabilidad, la exactitud de la selección y el potencial de la ganancia genética, puede ser bastante alto, especialmente cuando el tamaño de la progenie evaluada es grande. Asumiendo un índice de selección simple, para un rasgo con heredabilidad 0.03, se predicen exactitudes en la selección de 0.66, 0.78 y 0.83 con grupos de progenie de 100, 200 y 300, respectivamente (16). Actualmente se están buscando genes que influyen en la susceptibilidad o resistencia asociadas a la enfermedad. Estos pueden ser tanto loci de rasgos cuantitativos (QTLs), ó genes candidatos con funciones fisiológicas importantes en el establecimiento de la mastitis. Entre estos últimos se han considerado a los alelos del complejo principal de histocompatibilidad o BoLA (Antígenos Leucocitarios Bovinos), los cuales participan de forma importante en modular la respuesta inmune (17, 28). El detectar genes o segmentos genómicos implicados en la susceptibilidad y resistencia a mastitis presenta la oportunidad de emplear ensayos de ADN como un auxilio complementario en reforzar las estrategias y oportunidades de selección, estableciendo factores de riesgo genético a padecer la enfermedad. La tipificación del locus DRB3.2 mediante la amplificación por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y digestión con enzimas de restricción ha identificado alelos implicados con la susceptibilidad a mastitis. Así el alelo 23 se ha asociado significativamente con la ocurrencia de mastitis severa y el alelo 16 como un factor que aumenta el riesgo de infección aguda intramamaria con valores elevados en el conteo de células somáticas (10, 28). Asimismo, estudios genéticos en los cuales se tamiza todo el genoma han detectado QTLs que influyen en la cuenta de células somáticas en los cromosomas 5, 7, 21, 22, 23 y 26 (17). 9.2 USO DE AUTOVACUNAS.

Actualmente el autor está trabajando en la inmunización de bovinos lecheros con autovacunas, utilizando fracciones bacterianas especialmente de la pared celular que es uno de los componentes responsables de la determinación fenotípica bacteriana conocida comúnmente como serotipo. Hay que tener en cuenta que la utilización de las sales de aluminio o calcio, no son los adyuvantes ideales para este tipo de vacunas. Esto constituye uno de los factores que

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ocasiona se presenten resultados inconsistentes en la respuesta inmunitaria después del uso de vacunas de origen bacteriano para el control de la mastitis. La razón es la siguiente: El hidróxido de aluminio tiene un punto de isoelectrico de 11,1 por lo tanto esta cargado positivamente así que puede adsorber proteínas cargadas negativamente y adsorber débilmente las proteínas básicas. El grado de adsorción depende de la naturaleza y concentración del antígeno, de la presencia de sales e iones bufferantes y del pH de la mezcla resultante. Las fuerzas de atracción electrostáticas y las interacciones hidrofóbicas son las responsables de la adsorción de los antígenos a los adyuvantes que contienen aluminio o calcio, pero probablemente contribuyan a la adsorción las fuerzas de Van der Waals y los enlaces de hidrogeno (21). Lo que se busca con la autovacuna para el control de la mastitis es activar una respuesta mediada por anticuerpos, pero que a su vez, estos sean timo-dependientes y no timoindependientes (1). Los anticuerpos timo-dependientes son aquellos que se generan por la acción de linfocitos T colaboradores o T CD 4 previo reconocimiento de antígenos de tipo proteico. Ello conduce a una serie de eventos de orden molecular mediado principalmente por citoquinas que actúan sobre los linfocitos B, permitiendo que se presente en estos la activación, expansión clonal, cambio de isotipo, maduración de la afinidad y selección de células de memoria ante el antígeno. Los linfocitos T, se subdividen en CD 4, CD 8 y células NK (asesinas naturales), los dos primeros grupos reconocen antígenos peptídicos (lineales) por medio de una estructura muy especializada llamada TCR (T Cell Receptor) alfa-beta, que son presentados a ellos por APC´s sobre el MHC II o MHC I (Complejo Principal de Histocompatibilidad clase I y II). Existe a nivel de epitelios, en cantidad variable y en menor proporción a los dos grupos anteriores, según la especie, una población de linfocitos T que no reconoce antígenos peptídicos. Tiene un TCR gama-delta que probablemente reconoce sustancias no peptidicas como glucanos y otros componentes de las bacterias, al parecer orquestando una respuesta celular parecida a la que montan los linfocitos T alfa-beta. Hasta donde se ha descubierto, esta población de linfocitos es la encargada de vigilar los tejidos epiteliales (1). Los anticuerpos timo-independientes son producidos por los linfocitos B sin la participación de células colaboradoras. Estas respuestas son la generalidad para sustancias como LPS, PGN, ácido teicoico y estructuras lipídicas bacterianas. Los anticuerpos generados en esta respuesta no son muy específicos, por lo general no se generan células de memoria, y si hay cambio de isotipo, este es muy limitado (1). Este es uno de los escollos que se ha tenido que salvar en la elaboración de muchas vacunas bacterianas mediante una técnica denominada “conjugación” (22). Esta metodología está siendo utilizada por el autor en el caso de las autovacunas contra mastitis bovina.

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9.2.1 Breve descripción de elaboración y acción de la autovacuna. Se toman muestras de cuartos enfermos, determinando el incremento de células somáticas por medio de la reacción de precipitación de CMT. Estas muestras son tomadas bajo adecuadas condiciones de asepsia de pezones, manos y control de medio ambiente, en recipientes estériles. Se procede al cultivo, incubación e identificación de los agentes bacterianos; una vez identificados se hacen pruebas de sensibilidad y se procede a hacer replicación de los gérmenes, en medios de cultivo que traten de reproducir las condiciones a las que se deben enfrentar las bacterias cuando están “in vivo”; solo así se podrán manifestar las características fenotípicas propias del grupo o grupos bacterianos (serotipos) determinadas por los genes de resistencia ubicados en los plásmidos, que son al final los determinantes antigénicos que se requieren para producir en el huésped una adecuada respuesta inmune post-vacunal. Es importante tener en cuenta que esta estrategia solo se puede utilizar a nivel de cada hato; por decirlo en forma coloquial, este tipo de vacunas solo se hacen a la medida de cada explotación lechera. La razón estriba en la gran cantidad de serotipos de cada especie bacteriana, mediada por las muy pequeñas variaciones en los grupos sustitutivos de los polisacáridos que recubren la pared bacteriana de cada serotipo bacteriano (27). Los polisacáridos están constituidos por dos o tres moléculas de azúcar unidas unas a otras de forma lineal y aunque se ramifican de forma repetitiva, estas macromoléculas casi no tienen forma tridimensional, si no bidimensional, esta falta de variedad y la homogeneidad de estas macromoléculas hacen que su poder antigénico sea muy pequeño y apenas se produzcan anticuerpos contra el mismo, pero a su vez como sus epitopes son tan repetitivos, permiten que haya un activación de los receptores de la superficie de membrana tipo Ig en los linfocitos B, desencadenando una respuesta humoral T-independiente; este tipo de respuestas son de corta duración debido a la falta de especificidad contra el antígeno en mención y por lo tanto generalmente no activa células de memoria que permitan que haya una anamnesis ante posteriores ataques de los gérmenes implicados en la infección. Como se informó anteriormente, esta ha sido el eje de los fallos que se ha presentado con muchas de las vacunas bacterianas preparadas con sales de aluminio ya que estas sales funcionan muy bien con antígenos proteicos porque estos son presentados a los linfocitos T sobre moléculas dipeptídicas generadas en una zona génica llamada BoLA (Bovine Leukocite Antigen) análoga a la región humana llamada HLA (Human Leukocyte Antigen), que está compuesta por varios genes, con un tamaño aproximado de 4.000 Kb; se conocen como moléculas del MHC I y II que están ubicadas sobre la membrana de las APCs (Antigen Presenting Cells), las cuales presentan los antígenos proteicos en forma peptidos lineales previamente procesados en su interior después de fagocitar, endocitar o pinocitarlos agentes causantes de enfermedad en fagolisosomas o ser procesados en el proteasoma si el agente infeccioso penetro al citosol celular, obteniendo como resultado una respuesta inmune muy específica en contra del agente.

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Esto no sucede los con antígenos conformacionales no proteicos (polisacaridicos o de otra naturaleza) como son los de gran parte de las bacterias productoras de mastitis. Lo que se logra evitar en gran parte por medio de la aplicación de técnicas de conjugación, logrando de esta forma la producción de anticuerpos T- dependientes contra los agentes de la mastitis.

10 CONCLUSIONES.  La problemática mundial de la producción láctea está conduciendo a los investigadores del mundo a buscar soluciones diferentes o por lo menos complementarias al uso de los antibióticos en el tratamiento y prevención de la mastitis, enfermedad que se calcula provoca pérdidas que oscilan entre 220 y 250 $ U.S. por vaca afectada en una lactancia. Las bacterias patógenas, quienes llevan millones de años de evolución sobre la faz de la tierra, han afinado su estructura génica para adaptarse a condiciones adversas. La práctica terapéutica antibiótica es en la actualidad un escollo más que están superando en forma acelerada, incrementando las pérdidas a la industria. El mal uso de las sustancias antibióticas en el mundo en el tratamiento de las infecciones bacterianas en general y específicamente de la mastitis, ha tenido consecuencias funestas para el desarrollo de los procesos productivos y de vigilancia a nivel decampo, industrial y sanitario, provocando pérdidas a ganaderos e industriales y perdidas sociales no cuantificadas por los sistemas nacionales de salud, debido a la aparición de síndromes de hipersensibilidad a los antibióticos; el encarecimiento de los tratamientos a personas afectadas por bacterias resistentes a muchos de los antibióticos de primera elección, obligando al cuerpo médico a utilizar antibióticos costosos y prácticamente de última instancia en tratamientos que teóricamente respondían a los antibióticos convencionales. La excesiva presión de selección para lograr vacas genéticamente más productivas, ha provocado un incremento en la susceptibilidad a enfermedades, incrementando con ello los costos de producción, por un aumento en los tratamientos médicos a los animales afectados, quienes difícilmente recuperan la curva productiva durante ese periodo de lactancia. El mal uso dado a los antimicrobianos ha generado en estos una selección positiva sobre los microorganismos, logrando con ello la aparición de superbacterias potencialmente zoonoticas; provocando cronificación de las infecciones mamarias. Actualmente se está buscando la disminución en la presión del uso de antibióticos permitiendo disminuir la presión de selección genética positiva bacteriana por medio de dos estrategias: Utilización de autovacunas y selección genética usando toros con

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progenie comprobada de bajo recuentos somáticos de células en hijas con baja susceptibilidad a contraer mastitis por medio de análisis de registros sanitarios y bajo número de células somáticas.  El uso de autovacunas logra resultados positivos en el tratamiento y control de mastitis en el corto plazo, debido a la activación del sistema inmune contra el o los principales gérmenes que afectan un hato en particular, siempre y cuando se utilice la técnica adecuada de elaboración y aplicación de la autovacuna (datos no entregados en este artículo). Estamos lejos de la consecución de una vacuna universal contra la mastitis, debido a los muchos serotipos que pueden afectar la glándula mamaria. Esto se debe a que no se ha hecho un trabajo sistemático de identificación y prevalencia de estos para encontrar la adecuada combinación de bacterias y sus serotipos que cubra buena parte de las bacterias de mayor prevalencia como lo es el caso de la vacuna contra la meningitis humana.

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