Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.

Bioteknologi Farmasi
FAR 40541 2 SKS

Penanggung jawab: Dr Amarila Malik
Departemen Farmasi FMIPA-Universitas Indonesia

Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.

SASARAN PEMBELAJARAN:
Mengetahui konsep-konsep dalam bioteknologi, keterkaitan beberapa disiplin ilmu dalam bioteknologi, teknologi rekayasa biologi organisme, teknologi DNA rekombinan/rekayasa genetika, pemanfaatan bioteknologi dalam bidang farmasi, dan penerapan bioteknologi dalam upaya pemeliharaan kesehatan masyarakat.

Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.

PUSTAKA :
•Wink, M. (Ed). An introduction to Molecular Biotechnology, 2006 •Glick, B.R & Paternak, J.J, 1998. Molecular Biotechnology, Principles and Applications of Recombinant DNA, ASM Press. •Jognson & Manasse, 1993. Biotechnology in Pharmacy, John E. Smith, 1985. Biotechnology Principles, Van Nostrand Reinhold (UK) •Wulf Crueger and Annelies Crueger, 1984. Biotechnology A Text Book of Industrial Microbiology. Sinaeur Association Inc. Sunderland, MA, USA •J. Sambrook, E.F. Fritsch, T. Maniatis, 1989. Moleculer Cloning A Laboratory Manual 2nd ed. Cold Spring Harbor Lab. Pres, USA •James D. Watson, John Tooze, Davit T.Kurtz, 1983. Recombinant DNA, Scientific American Books, New York, USA •Indra K. Vasil, 1990. Biotechnology, Science, Education, 2nd Commercialization (Editor), Elsevier Scientific Publish. Co.Inc.

•Teknologi bioproses •Pengembangan galur berpotensi dalam bidang farmasi: fermentasi dan kinetikanya. . proses hilir •Materi genetik •Rekayasa genetika dan Teknologi DNA rekombinan •Terapi gen pada manusia. •Pemanfaatan organisme prokariot dan eukariot dalam bidang farmasi.com For evaluation only.foxitsoftware.Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www. •Keamanan hayati produk rekayasa genetika dan bioetik. •Disiplin ilmu yang terkait dalam bioteknologi. Pokok-pokok Bahasan •Pendahuluan •Konsep-konsep dalam bioteknologi dan prospeknya dalam bidang farmasi.

Bioteknologi Farmasi • Dampak bioteknologi terhadap bidang farmasi • Rekayasa genetika-rekombinasi DNA – kloning gen • Aplikasi teknik molekular • Produk komersial dari mikroorganisma • Terapi Gen .foxitsoftware.Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www. Overview • Pendahuluan .com For evaluation only.

Vitamin à Diperlukan “molecular basic knowledge” .com For evaluation only.Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware. BIOTEKNOLOGI FARMASI Definisi: Aplikasi dari bioteknologi dalam farmasi àDampak terhadap : obat-obatan diagnostik vaksin BIOTEKNOLOGI: .Pemanfaatan mikroorganisme untuk memproduksi produk-produk yang penting dan Bermanfaat : protein dan enzim -Rekayasa genetika hewan dan tanaman agar menghasilkan protein asing tertentu. juga senyawa kimia lainnya. spt.

com For evaluation only.Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www. ENZIM UNTUK DRUG DISCOVERY DAN DRUG DESIGN .foxitsoftware. PATOFISIOLOGI PENYAKIT DRUG ACTION IDENTIFIKASI DAN PRODUKSI TARGET OBAT: RESEPTOR.

foxitsoftware.Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www. coli Gene cloning Teknik : Rekayasa Genetika Genetically modified/genetically engineered 1994: 21 produk farmasi turunan teknologi rekombinasi DNA 150 produk dalam taraf “clinical trial” . coli Kontrol ekspresi Human insulin di E. TEKNIK DASAR BIOTEKNOLOGI BERBASIS BIOLOGI MOLEKULER ORGANISME REKOMBINAN Human insulin (1978): produk farmasi pertama hasil rekayasa genetika Sepotong DNA penyandi hormon insulin manusia Transfer ke mikroorganisme : E.com For evaluation only.

Dampak Bioteknologi terhadap Farmasi TUGAS: Cari apa saja dampak bioteknologi terhadap farmasi.Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only. Diskusikan per kelompok Cari protein-protein yang diproduksi secara teknologi DNA rekombinan Terhadap profesi farmasis: àisu-isu ke arah farmakoekonomi dan etika (sosial) àMenjawab dan menjelaskan kepada pasien penanganan obat-obat dan efek/akibat penanganan yang tidak tepat .

efek samping berbeda dengan obat – obat yang berupa molekul. kecil Contoh : suhu refrigerator .com For evaluation only. formulasi. • Pertimbangan sistem ekspresi • Sistem ekspresi berbeda. penyimpanan. Obat – obatan berupa protein dan peptide • stabilitas. tidak boleh terkocok II.Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware. maka produk sedikit berbeda . DAMPAK BIOTEKNOLOGI TERHADAP BIDANG FARMASI I. Pilihan produk biotek ( protein & peptida).

. Hep B-vaccine (Engerix – BR Smith Kline Beecham) IV. Contoh : human insulin ( HumulinR Lilly ) . berupa potongan DNA spesifik Profesi FARMASIS “ • Isu – isu ke arah farmakoekonomi & etika (ethical ) • Menjawab dan menjelaskan kepada pasien penanganan obat – obat dan efek /akibat penanganan yang tidak tepat.com For evaluation only.Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware. Agents diagnostik model baru • Contoh : ELISA à monoclonal antibody (Enzyme – Linked immunosorbant Assay) àreaksi warna • probe untuk Plasmodium falciparum. III. Obat – obat kelas baru yang beredar di pasaran • Pemahaman patofisiologi penyakit yang sebelumnya tidak dapat diatasi .

KLON adalah organisme identik yang terbentuk secara genetik dan membawa seluruh potongan DNA yang telah disisipkan. sehingga memungkinkan penggabungan dan kelanjutan berkembang / diperbanyak di dalam sel inang yang baru.Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www. dan memperbanyak molekul yang baru. teknologi DNA rekombinan Contoh : domba Dolly . RAKAYASA GENETIKA Definisi Adalah proses pembentukan rekombinan baru dari material genetik dengan cara penyisipan suatu molekul asam nukleat asing ( yang dihasilkan di luar sel ) ke dalam suatu vektor.com For evaluation only.foxitsoftware. Kloning gen à rekayasa genetika.

foxitsoftware.com For evaluation only. RAKAYASA GENETIKA Material genetik : adalah material yang membawa informasi genetik yang diturunkan dari tetua ke turunannya. yaitu asam nukleat DNA : deoksi ribonucleic acid RNA : ribonucleic acid Vektor Kloning : adalah wahana pembawa gen target untuk mengintroduksi gen ke inang tertentu. .Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www. Gen : adalah sekuens DNA yang menyandikan protein.

02/08’97) sel sumsum tulang belakang diekrtraksi.Menerobos barier alamiah suatu spesies àInsulin manusia diproduksi oleh E.Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware. . dimanipulasi dengan sel – sel normal. diintroduksi kembali melalui pembuluh darah. coli à E.com For evaluation only. coli sebagai pabrik biologis -Memungkinkan memperoleh dan memanipulasi secara relatif potongan – potongan DNA yang menyandikan fungsi spesifik terapi gen penyebab penyakit keturunan Co : Sindrom Hurler ( KOMPAS. ASPEK KLONING .

Isolasi dan studi gen – gen tertentu àDiperoleh pengertian yang mendalam mengenai fungsi dan mekanisme regulasi gen 2. dalam hal ini galur – galur yang produktif. ASPEK KLONING Adanya rekayasa genetika memungkinkan kita tidak hanya mengisolasi dan menskrining.Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www. tapi juga dapat mengkonstruksi organisme.foxitsoftware. Peningkatan produksi oleh suatu gen spesifik .com For evaluation only. Mikroorganisme Tanaman Hewan BIOREAKTOR Dua dasar penerapan kloning gen 1.

coli ) à why ? Hampir semua pengembangan pertama teknik rekayasa genetika digunakan E. .Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.sudah lengkap peta genomnya.com For evaluation only. coli sebagai organisme inang : • Paling banyak dipelajari • Paling lengkap informasi material genetiknya : . sebagai dasar : Escherichia coli ( E.foxitsoftware. TEKNIK – TEKNIK DASAR YANG BERKAITAN DENGAN KLONING GEN •Metode isolasi DNA •Metode memotong dan menyambung molekul – molekul asam nukleat •Metode transformasi pada sel host/ inang .

Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.com For evaluation only.foxitsoftware. DEFINISI §Isolasi DNA mengekstraksi molekul DNA dari sel §Memotong DNA ( digestion ) memutus ikatan molekul DNA pada antara basa nt pada sekuens tertentu oleh suatu endonuklease restriksi §Menyambung DNA ( Ligation ) Potongan DNA / gen asing disambungkan dengan DNA vector yang terpotong linier oleh enzim Ligase §Transformasi §Mengintroduksi DNA ke dalam sel inang .

mekanik . atau proteinase-K 4.enzimatis 2. elektro.foxitsoftware. Presipitasi . Lisis sel : .com For evaluation only.Triton X – 100 3.sentrifugasi dilanjutkan dengan depresipitasi dengan solven organik Contoh : fenol.+ alkohol à sentrifugasi gradien CsCl .Penghancuran dinding sel : . CHCl3 kemudian disentrifugasi . Membersihkan debris sel .S D S : sodium dodesil sulfat . ISOLASI DNA 1.+ alcohol + NH4 asetat .Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.

Mobilitas di elektroforesis gel agarose àDNA plasmid lebih diskret /tajam pitanya CsCl / EtBr : DNA linier (kromosom) DNA Supercoiled (plasmid) . pemanasan . Beda struktur tersier : DNA plasmid : supercoiled à Covalently Closed Circular ( CCC ) DNA kromosom/genom : linier 2.foxitsoftware. Memisahkan DNA plasmid dan DNA kromosom/genom 1.com For evaluation only.dengan alkali.Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.DNA plasmid lebih mudah renaturasi 3. Sifat denaturasi . Ultrasentrifugasi : CsCl gradien à DNA plasmid berada di bawah 4.

foxitsoftware.Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www. Agarose gel electrophoresis lamda lamda +RE plasmid plasmid +RE DNA size .com For evaluation only.

mencegah degradasi oleh DNAse > TE buffer : mencegah degradasi oleh DNAse .Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.dilarikan pada gel agarose dari kutub (–) ke (+) . Fosfodiester putus Penyimpanan : > .200C .dapat diketahui adanya degradasi Degradasi : Ik.DNA diwarnai dengan Etidium bromida .foxitsoftware. ANALISIS KUALITAS DAN KUANTITAS DNA •Elektroforesis .com For evaluation only.DNAse tidak aktif .

midiprep •sentrifugasi gradien •alkalin lisis •metode ammonium asetat •metode partikel gelas ( glass milk ) •metode partikel magnetic ( magnetic beads ) •kromatografi ( exclusion chromatography) .Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www. METODE – METODE ISOLASI PLASMID §skala besar : sentrifugasi gradien CsCl §skala kecil ~ mini prep.foxitsoftware.com For evaluation only.

Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.

VEKTOR KLONING
PLASMID
bereplikasi diri ( self replicating ) utas ganda : d s molekul DNA sirkulator di maintain di dalam bakteria sebagai bentuk ekstrakromosomal copy number ( Jumlah kopi per sel ): high copy number 10 – 100 kopi / sel low copy number 1 – 4 kopi / sel medium copy number diantaranya Ukuran : 1 s/d 500 kb

Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.

VEKTOR KLONING
Spektrum inang : broad hostrange à dapat bereplikasi pada sejumlah spesies bakteri narrow hostrange à hanya dapat bereplikasi pada spesies khusus Beberapa ciri khas plasmid untuk vektor cloning : §Ukuran kecil §Mempunyai situs – situs pengenalan ER yang unik ( tunggal ), tempat insert disisipkan / diklon. §Satu atau lebih penanda seleksi genetic, untuk mengindentifikasi sel resipien yang membawa kontruksi DNA vektor - insert. §Plasmid cloning vector harus di-genetically engineered Contoh : pBR 322, pUC 19

Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only.

PLASMID
-Molekul DNA ekstrakromosom yang bereplikasi mandiri, berbentuk sirkular, utas ganda. - Terutama ditemukan pada bakteria, juga : Kapang Eukariotik ( beberapa ) - Plasmid alami menyandikan : 1. Resistensi AB 2. Colicin = Bakteriosin 3. Virulensi 4. Aktivitas metabolit

Plasmid rekayasa Untuk teknologi DNA rekombinan .foxitsoftware.Mandiri à tidak tergantung kromosom ada gen ORI : untuk replikasi mandiri .Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www. STABILITAS PLASMID kondisi optimum. stabil medium tumbuh .com For evaluation only.

PEMOTONGAN DNA (digesti ) Restriction Enzymes = enzim restriksi • Diperoleh dari bakteri sbg mekanisme pertahanan terhadap infeksi virus DNA Endonucleases = memotong (cleave) di dalam utasan DNA Telah diketahui ada 3.foxitsoftware.Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.139 enzyme • • .com For evaluation only.

atau 6.Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.pasangan basa . dengan sekuens palindromik (eg GAATTC) • . Enzyme Site Recognition = situs pengenalan enzim restriksi • Setiap enzim mendigesti (memotong) DNA pada sekuens spesifik = situs restriksi (restriction site) Enzim mengenali 4.com For evaluation only.

5’ versus 3’ overhang • Enzyme cuts à 3’ G GAATTC 3’ CTTAAG G 5’ 5’ G 3’ CTTAA 5’ 3’ 5’ 5’ 3’ AATTC 3’ G 5’ § Generates 5’ overhang .com For evaluation only.Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.

foxitsoftware.Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www. Common Restriction Enzymes • EcoRI – Escherichia coli – 5’ overhang GAATTC 3’ 3’ CTTAAG 5’ 5’ • PstI – Providencia stuartii – 3’ overhang 5’ CTGCAG 3’ 3’ CACGTC 5’ .com For evaluation only.

com For evaluation only.Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware. The DNA Digestion Restriction Buffer provides optimal conditions – – – NaCl provides the correct ionic strength Tris-HCl provides the proper pH Mg2+ is an enzyme co-factor .

killed J Too cool= enzyme activity lowered.foxitsoftware.Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www. DNA Digestion Temperature • Why incubate at 37°C? Body temperature is optimal for these and most other enzymes • What happens if temperature is too hot or cool? Too hot = enzyme may be denatured.com For evaluation only. requiring longer digestion time G .

foxitsoftware.com For evaluation only. .Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.

Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www. .foxitsoftware.com For evaluation only.

Agarose Electrophoresis • Arus listrik yang membawa DNA bermuatan negatif ke elektroda muatan (warna merah)positif melalui suatu gel agaros Gel agarose memisahkan fragmen DNA berdasarkan ukuran – • Fragmen kecil bergerak lebih di depan (front) di dibandingkan fragmen besar .com For evaluation only.foxitsoftware.Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.

com For evaluation only. PENYAMBUNGAN DNA ( Ligasi ) .Ligasi lebih mudah pada ujung – ujung sticky ( dengan ER sama / isoschizomer / isocaudomer). ) .Penyambungan gugus 3’OH dan DNA insert. Transformasi : vector utuh k.Ujung blunt end : dapat diligasi.Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www. walaupun didigesti dengan ER berbeda. . Pada reaksi Ligasi. ligasi : vector linier / terpotong + enz – ligase . selalu sertakan pula control – control : k.Reaksi Ligasi DNA vektor DNA insert Buter T4 DNA ligase 5x T4 DNA ligase dH2O ( destilata bebas ion ) Total 3 6 4 1 6 20 1 : 2 ( s/d 1: 10 ) •Inkubasi : 40 – 150 C semalam ( 18 – 24 jam ) .foxitsoftware. ( Gb.

Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware. .com For evaluation only.

foxitsoftware.Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www. GFP .coli dengan cara mengintroduksi DNA murni (purified) ke dalam sel yang sudah kompeten.com For evaluation only. TRANSFORMASI à Pengambilan DNA rekombinan oleh E.

: tidak mempunyai gen untuk endonuklease restriksi sehingga DNA rekombinan yang diintroduksi tidak didegradasi contoh : E. antara lain : > Rec A.foxitsoftware.coli HB101 .coli DH5α.com For evaluation only.coli sebagai sel inang : > sudah dimodifikasi genetik. E. TRANSFORMASI E.Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.

coli dibuat kompeten dengan cara kimia: -Peningkatan suhu dan CaCl2 à heat shock pada 370 C – 420 C. TRANSFORMASI • Electroporation – Electrical shock yang menyebabkan membran menjadi permeabel terhadap DNA • Calcium Chloride/Heat Shock – Chemically-competent cells mengambil DNA setelah heat shock E. disebar pada medium seleksi .Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.com For evaluation only.Setelah ditransformasi.foxitsoftware. dalam larutan CaCl2 .

Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.com For evaluation only. Electroporation Electric shock Membuat pori-pori kecil pada membran sel .

coli yang tidak membawa rekombinan Macam seleksi : ( 4 ) 1.Komplementasi = gen Lacz pada vector vs pada E.Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.dot blot. Enzim tsb mengubah substrat X.foxitsoftware.Seleksi langsung : contoh: ABR = ABS (inaktivasi penyisipan ) à perlu teknik cawan replika (replica plating) 2. coli DHS α ( inang ) 4.com For evaluation only. SELEKSI E.gal menjadi β-gal biru 3. β – galactosidase. memanfaatkan gen lacZ yang menghasilkan enz. seleksi warna koloni : X – gal ®. colony hybridization . Analisa hibridisasi : .coli ( plasmid DNA rekombinan ) di seleksi terhadap E.

REPLICA PLATING • Pertama sebar sel pada cawan agar mengandung AMPICILLIN – Semua TRANSFORMAN menghasilkan koloni (tumbuh) • Replika pada cawan mengandung Tetrasiklin – Hanya NON-REKOMBINAN yang tumbuh BLOCK PRESS Kain Beludru = Transforman AMPR AMP LATE .com For evaluation only.Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.

Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.com For evaluation only.foxitsoftware. REPLICA PLATING • Replika pada cawan mengandung Tetrasiklin – Hanya NON-REKOMBINAN yang tumbuh BLOCK PRESS Kain Beludru BLOCK AMP LATE AMP LATE BLOCK BLOCK TET PLATE AMP LATE .

foxitsoftware.Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www. REPLICA PLATING • Replika pada cawan mengandung Tetrasiklin – Hanya NON-REKOMBINAN yang tumbuh GROW TET PLATE TETRES NONRECOMBINANTS • Cawan TET dan cawan AMP dibandingkan – Ambil REKOMBINAN dari TETSENS AMPRES dari cawan AMP AMP LATE TETRES NONRECOMBINANTS TET PLATE .com For evaluation only.

Vertifikasi : àMemastikan adanya DNA insert / asing yang di klon pada vektor. VERIFIKASI DAN PEMETAAN DNA REKOMBINAN Dilakukan menggunakan Enzim endonuklease restriksi (ER). Untuk mengetahui ukuran DNA rekombinan berdasarkan situs – situs Enzim restriksi.foxitsoftware. berdasarkan ukuran DNA dengan di larikan (running) di elektroforesis gel agarose. à Disebut Physical mapping ( pemetaan fisik ): pemetaan fisik yang lengkap memerlukan berbagai ER.Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www. . Pemetaan : Manfaat ER dalam biologi molekuler.com For evaluation only. menggunakan satu dan dua (ganda) ER (single digest dan double digest).

foxitsoftware.Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www. KLONING SEKUENS DNA PENYANDI PROTEIN EUKARIOT Perlu teknik khusus àProkariot tidak dapat melakukan intron splicing àDNA eukariot besar karena mengandung banyak intron àEkspresi akan kacau oleh prokariot Oleh karena itu : -menggunakan MRNA mature .com For evaluation only.Enzim Reverse transcriptase yang mensintesis satu utas DNA dari RNA kmd dilanjutkan dengan kerja Klenow fragment yang mensintesis utas kedua DNA dari template DNA Sehingga akan diperoleh dua macam c DNA ( complementary DNA ) : yang utuh & parsial .

com For evaluation only.Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware. PRODUK BIOTEKNOLOGI MOLEKULER SEKTOR : Medicinal : -Human Therapeutic -Human Diagnostic Non medical : -Agriculture -Specialities -Non-medical Diagnostic Contoh : INDIGO à pewarna jeans .

INDIGO -diekstraksi dari tanaman -batubara -rekombinan DNA Lintasan Indigo : banyak dipakai untuk industri Blue Jeans Genencor International : green route to blue dye Indol diubah menjadi cis – indole 2.com For evaluation only.3 – dehydrodiol dengan gen dari Pseudomonas putida yang disisipkan pada E. coli .Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.

com For evaluation only. control.foxitsoftware. Untuk kepentingan pencegahan. fungi dll.Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www. DIAGNOSTIK MOLEKULER Kemajuan bidang pengobatan karena berhasil didapatkannya virus – virus spesifik. juga molekul – molekul kecil. bakteri. pengobatan dari penyakit – penyakit infeksi maka perlu identifikasi dini dan akurat terhadap organisme pathogen penyebab penyakit à ditumbuhkan/dikultur à amati sifat – sifat fisiologis KENDALA : lama mahal à ada yang tidak dapat ditumbuhkan/dikulturkan à sulit mendeteksi organisme penyebab penyakit .

com For evaluation only.Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www. coli ( Enzyme – linked immunosorbent assay ) 2. Nukleat Essei ini : cepat reliable spesifisitas tinggi : hanya berhibridisasi dengan sekuens nukleotida target . Metode deteksi DNA yaitu deteksi menggunakan pelacak DNA Prinsip hibridisasi asam.foxitsoftware. Untuk mengatasi kendala – kendala tersebut maka dikembangkan prosedur – prosedur diagnostik molekular: 1. Metode immunologi detection Co : ELISA monoclonal antibody yang diproduksi di E.

PRODUK KOMERSIAL REKAYASA MIKROBA HUMAN PROTEIN PHARMACEUTICALS .foxitsoftware. (Tabel 7.produksinya mahal -biological mode of action belum dikarakterisasi jelas + 300 macam protein terapeutis manusia yang potensial telah diklon. dan telah melalui berbagai uji selama bertahun–tahun sebelum tersedia secara komersial.1) .jumlah sangat terbatas .com For evaluation only.Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.

com For evaluation only. Pharmaceutical biotechnology Diabetes Haemophilia Stroke Growth failure Anaemia Viral infection Insulin Factor VIII Tissue plasminogen activator Human growth hormone Erythropoietin Interferon • • • • • • .Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.

foxitsoftware.Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.com For evaluation only. Strategi teknologi rekombinan DNA human protein pharmaceutical Isolasi cDNA Engineering (Rekayasa) Optimizing Gene Expression .

Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.com For evaluation only.foxitsoftware. §Isolasi cDNA Strategi I: Isolasi protein target Determinasi sekuens asam amino Deduksi menjadi sekuens DNA penyandi Sintesis oligonukleotida Gunakan sebagai probe utk mengisolasi gen atau cDNA dari pustaka genom atau pustaka cDNA .

MRNA (mature) Reverse transcribed cDNA . Strategi II: Jika suatu protein khusus disintesis di suatu jaringan khusus à Pustaka cDNA dapat dibuat dari mRNA . mRNA berfungsi sebagai probe untuk sekuens DNA target. tidak perlu dari protein. Contoh : Insulin à disintesis hanya dijaringan khusus di pancreas yaitu di pulau Langerhans.com For evaluation only.foxitsoftware.Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www. Oleh karena itu fraksi mRNA yang diisolasi dari jaringan tersebut 70 % menyandikan insulin.

agar dapat mempelajari mode of action suatu protein. §Optimizing Gene Expression -sistem ekspresi prokariot dan eukariot beda -jika menggunakan prokariot sebagai sel inang akan menurunkan biaya -namun dipertanyakan apakah efektifitas sintesis bentuk fungsional protein heterogous masih tetap?? . atau dengan cara mutagenesisis terarah. §Engineering Strategi untuk mendesain protein – protein.com For evaluation only. dengan cara mengatur kombinasi domain – domain fungsional suatu protein.foxitsoftware.Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.

foxitsoftware.Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www. coli. selain -mampu tumbuh dengan densitas sel tinggi -mudah dipurifikasi Contoh : human interleukin – 3 Produksi paling baik di Bacillus licheniformis meskipun produksi banyak di E. §Optimizing Gene Expression Harus dipilih berdasarkan kriteria : -memproduksi protein heterologus yang mirip dengan mature authentic protein. tapi menghasilkan protein interleukin-3 yang salah.com For evaluation only. .

com For evaluation only.Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www. C) D-glucose D-Sorbitol L-sorbose 2 KLG (2-keto-L-gluconic acid) L.ascorbic Acid à Satu tahap fermentasi mikroba à sejumlah tahap – tahap kimia Dari penelitian – penelitian biokimia mengenai lintasan – lintasan metabolit diketahui bahwa beberapa mikroorganisme menunjukkan kemungkinan untuk mensintesis 2 .foxitsoftware. Sintesis L-Ascorbic Acid ( Vit.KLG .

5 – DKG reduktase dari Corynebacterium di klon di Erwinia .glukonic acid (2.5-DKG reduktase 2.com For evaluation only. Acetobacter Gluconobacter Erwinia D.5 – DKG) melalui beberapa lintas metabolisme Corynebacterium Brevibacterium Arthrobacter 2.D.5 – diketo.Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www. glucose 2.5 – DKG 1 lintas metabolisme 2 – KLG Gen penyandi enzim 2.foxitsoftware.

yaitu dapat mengikat O2 dari medium kemudian menyalurkannya ke dalam sel. •MENINGKATKAN PRODUKSI ANTIBOTIK Produksi antibiotik dari Streptomyces spp dengan Fermentasi à lama – lama konsentrasi oksigen dalam media cair berkurang Pertumbuhan Streptomyces spp menurun dan produksi antibiotik menurun Vitreoscilla sp adalah bakteri aerob yang dapat hidup dalam kondisi miskin O2 Bakteri ini dapat memproduksi suatu protein hem homodimerik yang berfungsi mirip dengan hemoglobin eukariot.com For evaluation only.foxitsoftware.Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www. Gen yang menyandikan protein heme tersebut di klon di Streptomyces .

com For evaluation only. TERAPI GEN • Beberapa penyakit genetik manusia dapat dikaitkan terhadap suatu mutasi di suatu gen tunggal. dan bagaimana keadaan tersebut menyebabkan simtom penyakit genetik yang spesifik . yaitu terhadap sejumlah gen-gen berbeda yang bermutasi.foxitsoftware. • TUJUAN utama riset dalam genetika molekuler manusia à menentukan kecacatan pada level gen. atau mungkin juga lebih kompleks.Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.

foxitsoftware. PENDEKATAN Protein yang terlibat Isolasi dan karakterisasi Sekuensing asam amino Investigasi sekuen penyandi Buat pelacak spesifik Isolasi gen target dari pustaka genom .Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.com For evaluation only.

Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www. maka sangat berbuna untuk memperbaiki kecacatan/mutasi gen tersebut .foxitsoftware. • Dasar pemikiran terapi gen: – Jika versi normal dari gen untuk penyakit manusia telah berhasil diklon.com For evaluation only.

foxitsoftware.com For evaluation only.Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www. Ex vivo gene therapy Sel diambil dari orang penderita penyakit (pasien) Perbaiki cacat genetik dengan cara transfer gen Seleksi dan tumbuhkan sel-sel yang telah dikoreksi secara genetik (remedial cell) Infuskan atau transplantasikan kembali ke pasien Gen remedial diintroduksi ke sel oleh suatu retrovirus mencit yang seudah direkayasa sehingga tidak mampu mengkonversi sel normal menjadi sel kanker. Retrovirus (rekombinan) menginfeksi sel manusia sehingga gen remedial masuk .

In vivo gene therapy Menggunakan adenovirus : ds DNA low pathogenicity in human Gen remedial Konstruksi pada vektor virus di bawah promotor khusus yang spesifik menginfeksi sel khusus (sel target) .com For evaluation only.Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware.

com For evaluation only.bekerja pada tahap translasi (mRNA) Ada 2 cara: A.Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www. . Antisense therapy Dirancang untuk pencegahan. merupakan utas pasangan dari utas yang ditranskripsikan (utas sense).Menggunakan gen antisense yang diklon Antisense adalah utas asam nukleat DNA yang tidak ditranskripsikan.foxitsoftware. . .Menggunakan antisense oligonukleotida (satu utas) B.penurunan ekspresi gen tertentu.

com For evaluation only.foxitsoftware. A.Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www. Menggunakan antisense oligonukleotida (satu utas): DNA -----.A G C T G A T ----------------T C G A C T A ---------transcription mRNA AGCUGAU antisense oligonukleotida TCGACTA Base pairing AGCUGAU TCGACTA No translation .

Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.com For evaluation only. Menggunakan gen antisense yang diklon DNA -----. B.foxitsoftware.A G C T G A T ----------------T C G A C T A ---------transcription -------T G C G A C T A-------------A C G C T G A T------- mRNA AGCUGAU UCGACUA mRNA sense mRNA antisense Base pairing AGCUGAU TCGACTA No translation .

Maxam – Gilbert : chemical based .com For evaluation only.Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.foxitsoftware. PROSEDUR – PROSEDUR DALAM RISET MOLEKULER I. prosedur Dideoxynucleotide : . Penggunaan Bacteriophage M13 Untuk memperoleh ss.DNA Target DNA + 500 bp < 2000 bp : harus dipotong – potong menjadi beberapa fragmen overlap dengan ER • Primer Walking : • Uk.Sanger : enzymatic based 2. DNA > 5000 BP . DNA sequencing techniques 1.

PROSEDUR – PROSEDUR DALAM RISET MOLEKULER II. DNA polymerase yang thermostabil à mencapai suhu 950 C atau lebih 4.foxitsoftware.Esensial : 1. dGTP. Dua buah primer sintesis oligonukleotida (masing – masing ~ 20 nt ) 2.com For evaluation only. dCTP.Amplifikasi molekul DNA . Polymerase Chain Reaction ( PCR ) . Empat macam deoxynucleotidatriphosphat (dNTP) : dATP. sekuens target pada sampel DNA 3. dTTP .Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.

PROSEDUR – PROSEDUR DALAM RISET MOLEKULER II.foxitsoftware. Polymerase Chain Reaction ( PCR ) Tahap – tahap : -denaturasi : .Generated by Foxit PDF Creator © Foxit Software http://www.enzim Taq DNA polymerase . suhu optimum untuk fungsi katalisis enzim Taq DNA polymerase untuk mensintesis DNA.suhu dinaikkan sampai 750C. Ketiga tahap diulangi beberapa siklus sampai diperoleh molekul DNA dalam jumlah besar. .primer -renaturasi /annealing : suhu diturunkan perlahan sampai 550C primer berikatan dengan template DNA -sintesis : .suhu 950 C : ds-DNA menjadi ss-DNA .com For evaluation only.

Sign up to vote on this title
UsefulNot useful