UNIVERSITATEA DE ȘTIINȚE AGRICOLE ȘI MEDICINĂ VETERINARĂ

FACULTATEA DE ZOOTEHNIE ȘI BIOTEHNOLOGII

LOREDANA FLORINA LEZEU (LEOPOLD)

MARKERI DE CALITATE ȘI AUTENTICITATE A ULEIURILOR, SUCURILOR ȘI CEREALELOR DETERMINAȚI PRIN HPLC ȘI SPECTROSCOPIE IR/RAMAN

REZUMATUL TEZEI DE DOCTORAT

CONDUCĂTOR ȘTIINȚIFIC Prof. Dr. HORST DIEHL

Cluj-Napoca 2010

II

CUPRINS 
INTRODUCERE .........................................................................................................................................III I. EVALUAREA CALITĂŢII ULEIURILOR VEGETALE UTILIZÂND SPECTROSCOPIA FTIR ŞI RAMAN ...................................................................................................................................VIII MATERIALE ŞI METODE .............................................................................................................VIII REZULTATE ŞI DISCUŢII .............................................................................................................. IX Spectrele FTIR ale uleiurilor vegetale ............................................................................................ IX Amprenta spectrală Raman comparativă a uleiurilor vegetale .........................................................X Amprentele spectrale Raman specifice uleiurilor de palmier, măsline şi floarea-soarelui. ............ XI Amprentele spectrale Raman specifice uleiului de cătină ............................................................XIII Clasificarea uleiurilor vegetale folosind spectroscopia FTIR şi analiza PCA ............................... XV CONCLUZII ................................................................................................................................... XVI II. EVALUAREA CALITĂȚII SUCURILOR DE FRUCTE FOLOSIND SPECTROSCOPIA FTIR ȘI METODE CHEMOMETRICE ..................................................................................................... XVIII II.1 CUANTIFICAREA GLUCOZEI, FRUCTOZEI ȘI ZAHAROZEI ÎN SUCURI DE MERE UTILIZÂND SPECTROSCOPIA FTIR CUPLATĂ CU METODE CHEMOMETRICE ............... XVIII MATERIALE ȘI METODE .......................................................................................................... XVIII REZULTATE ȘI DISCUȚII ........................................................................................................... XIX Amprenta spectrală ATR-MIR a principalilor carbohidrați ........................................................ XIX Predicții cantitative bazate pe analiza PLS a concentraţiilor de carbohidraților din sucuri comerciale şi autentice .................................................................................................................. XX CONCLUZII .................................................................................................................................. XXII II.2 CUANTIFICAREA GLUCOZEI, FRUCTOZEI ȘI A ZAHAROZEI ÎN SUCURILE DE FRUCTE UTILIZÂND SPECTROSCOPIA FTIR ȘI ANALIZA STATISTICĂ MULTIVARIATĂ ............XXIV MATERIALE ȘI METODE ..........................................................................................................XXIV REZULTATE ȘI DISCUȚII .........................................................................................................XXVI Analiza de tip Principal Component Analysis (PCA) ...............................................................XXVI Regresia de tip Partial Least Squares (PLS) ............................................................................ XXVII Evaluarea capacității antioxidante a sucurilor prin FTIR și PLS ..............................................XXXI CONCLUZII .............................................................................................................................. XXXIII III. DETERMINAREA CAROTENOIDELOR ÎN GRÂU ........................................................... XXXV MATERIALE ŞI METODE ........................................................................................................ XXXV Purificarea SPE (extracţie în fazã solidã) ................................................................................ XXXV REZULTATE ŞI DISCUŢII ...................................................................................................... XXXVI Separarea cromatograficã a carotenoidelor prin HPLC din probele de grâu nesaponificate .. XXXVI Analiza cantitativã a carotenoidelor din varietãţile de Einkorn, Rosadur, Kamut şi Toronit nesaponificate ....................................................................................................................... XXXVII Separarea cromatograficã a carotenoidelor din grâu, folosind extracția în fază solidă . ..... XXXVIII Distribuţia carotenoidelor în fracţiunile de grâu .................................................................... XXXIX CONCLUZII .................................................................................................................................... XLI IV. DETERMINAREA CAROTENOIDELOR ŞI ANTOCIANILOR DIN ORZ ........................ XLIII MATERIALE ŞI METODE .......................................................................................................... XLIII REZULTATE ŞI DISCUŢII ......................................................................................................... XLIV Analiza cantitativă a carotenoidelor în genotipurile de orz ....................................................... XLIV Analiza probelor de orz negru .................................................................................................... XLV Separarea cromatografică a antocianilor din probele de orz prin metoda HPLC ..................... XLVII Analiza cantitativă a antocianilor din probele de orz negru, albastru şi purpuriu .................. XLVIII CONCLUZII ........................................................................................................................................ L BIBLIOGRAFIE ....................................................................................................................................... LII 

INTRODUCERE
Scopul prezentului studiu a constat în caracterizarea unor produse alimentare, cum ar fi uleiuri vegetale, sucuri de fructe şi cereale, folosind cromatografia HPLC precum și metode spectroscopice FTIR/Raman, în vederea determinării calității și autenticității acestora. Biomarkerii selectați pentru evidențierea calităţii şi autenticităţii acestor produse alimentare sunt în principal componente minore, provenind din plante (numite fitochimicale). Astfel, obiectivele sunt legate de metoda analitică, de tipul alimentului şi markerul de calitate /autenticitate utilizat. FTIR şi FT-Raman reprezintă metode spectroscopice rapide de evaluare a calităţii și autenticității uleiurilor vegetale. Probele de ulei pot fi investigate în mod direct, fără nici o pregătire a probei în prealabil. Astfel, analizând amprenta spectrală FTIR şi FTRaman, uleiurile vegetale au fost comparate pe baza conţinutului în acizi graşi saturaţi/nesaturaţi. Mai mult, profilul acizilor graşi a fost utilizat ca marker de autenticitate pentru uleiurile vegetale. Determinarea calităţii şi autenticităţii sucurilor de fructe reprezintă un domeniu de cercetare aplicată cu impact relevant în industrie, siguranţa alimentară şi protecţia consumatorului. Spectroscopia FTIR combinată cu metode de analiză statistică multivariată, cum ar fi cele de tip Principal Component Analysis (PCA) sau Partial Least Squares (PLS), au fost utilizate pentru determinarea conținutului de glucoză, fructoză şi zaharoză în diferite sucuri de fructe, ca markeri de calitate şi autenticitate. Astfel, a fost implementată o procedură rapidă pentru evaluarea carbohidraţilor din sucurile de fructe, confirmând autenticitatea pentru majoritatea probelor analizate, dar și adaosul de zaharoză în unele probe. Abordând o tematică modernă de cercetare, am urmărit extinderea potenţialului metodei spectroscopice FTIR combinată cu regresie de tip PLS, în vederea determinării capacităţii antioxidante a sucurilor de fructe. S-a obţinut astfel o bună corelaţie între valorile determinate prin predicție în urma regresiei PLS şi valorile măsurate prin metoda de referință TEAC pentru capacitatea antioxidantă totală (TAC).

III 

Cerealele reprezintă un produs alimentar din dieta zilnică. În ultimele decenii au fost cultivate specii de grâu cu un conţinut scăzut în carotenoide, în vederea obţinerii unei făini cât mai albe. Astăzi, efectele benefice al aportului de carotenoide din consumul zilnic de cereale sunt unanim recunoscute. Acum cercetătorii, sunt în căutare de specii de cereale cu conţinut cât mai ridicat în carotenoide. În această lucrare, este prezentată metodologia de determinare a carotenoidelor și antocianilor prin cromatografie HPLC din diverse specii de grâu şi orz Structura tezei. Teza este structurată în două părţi principale, şi anume, studiu de literatură şi contribuţii originale. Partea de studiu de literatură cuprinde trei capitole. Capitolul I introduce metodele spectroscopice de absorbţie UV-Vis, de absorbție în infraroşu (FTIR) şi împrăştiere Raman, precum şi potenţialul de aplicabilitate al acestora în chimia alimentului. De asemenea, în acest capitol sunt discutate pe scurt metodele statistice multivariate de tip PCA şi PLS. Capitolul II prezintă metoda HPLC, și cuprinde principiile, instrumentația şi aplicaţii generale în determinarea compuşilor minori din uleiuri, sucuri şi cereale. Capitolul III este dedicat fitochimicalelor din produsele alimentare studiate. Prin utilizarea metodelor HPLC, FTIR şi Raman în această lucrare au fost evaluate calitatea şi autenticitatea uleiurilor vegetale, a sucurilor de fructe și a cerealelor (grâu şi orz), pe baza profilului de acizi graşi saturați/nesaturați, carbohidrați şi a conținutului de carotenoide. Astfel, prezența şi proprietăţile chimice ale fitochimicalelor monitorizate sunt prezentate în detaliu în acest capitol. Cercetarea originală este organizată în patru capitole. În capitolul IV, au fost înregistrate spectrele FTIR şi FT-Raman a 13 tipuri de uleiuri vegetale şi identificate benzile marker pentru acizii graşi. Pe baza benzilor marker Raman a fost comparat gradul de saturare al acizilor grași pentru diferite tipuri de uleiuri. Spectrele FTIR a 25 uleiuri vegetale au fost supuse analizei PCA, permițând astfel gruparea uleiurilor în funcţie de originea lor biologică. În acest fel, este prezentată

IV 

posibilitatea discriminării FTIR/PCA între uleiurile de măsline, floarea soarelui, susan şi diferite uleiuri din sâmbure de fructe. De asemenea, conţinutul ridicat de carotenoide din uleiul de cătină este clar evidenţiat de benzi marker Raman. Capitolul V prezintă determinarea conținutului de carbohidrați (glucoză, fructoză și zaharoză) în 13 sucuri de mere şi 33 sucuri de fructe, prin combinarea metodelor FTIR şi chemometrice (PCA şi PLS). Valorile concentrațiilor prezise prin regresie PLS au fost validate prin metoda HPLC. Astfel, calitatea şi autenticitatea sucurilor a fost evaluată pe baza concentraţiilor de carbohidraţi. Spectrele FTIR a 22 sucuri de fructe au fost analizate prin metoda PCA, permițând astfel gruparea acestora în funcţie de originea lor biologică. Astfel, este demonstrată posibilitatea discriminării între sucurile de mere, portocale şi piersici prin spectroscopie FTIR și analiză PCA. De asemenea, a fost determinată capacitatea antioxidantă totală (TAC) a sucurilor de fructe prin combinarea metodelor spectroscopice FTIR şi regresie PLS, valorile prezise fiind în bună concordanță cu valorile determinate prin metoda de referință TEAC. Capitolul VI prezintă determinarea autenticității a patru varietăți de grâu prin realizarea amprentei carotenoidice. A fost optimizat protocolul de extracţie şi determinată eficienţa saponificării. Ca şi metodă alternativă de purificare și îndepărtare a lipidelor, s-a utilizat extracția în fază solidă (SPE). Conţinutul de carotenoide a fost evaluat în funcţie de varietate şi anul recoltei. De asemenea, în acest capitol s-a evaluat distribuția carotenoidelor în fracțiunile de măciniș. Capitolul VII tratează autenticitatea a patru genotipuri de orz (negru, galben, albastru și purpuriu) folosindu-se ca și markeri conținutul de carotenoide (luteina și zeaxantina) și antociani (cianidin glucozid, pelargonidin glucozid, delfinidină, peonidin glucozid şi cianidină). Capitolul tratează pe larg variația concentrațiilor de xantofile și antociani în funcție de genotip, varietate și condiții climaterice.

Scopul acestei teze a fost: Determinarea calității și autenticității uleiurilor vegetale, sucurilor de fructe și cerealelor, utilizând cromatografia HPLC, metode spectroscopice FTIR și Raman, precum și metode chemometrice de tip PLS și PCA. Elaborarea unei metode simple și rapide pentru discriminarea uleiurilor vegetale și sucurilor de fructe în funcție de originea lor biologică. Elaborarea unei metode simple și rapide în vederea determinării capacității anioxidante a sucurilor. Determinarea calității diferitelor varietăți de grâu și orz pe baza amprentei specifice de carotenoide și antociani.

Obiectivele acestei lucrări au fost: Identificarea benzilor marker IR și Raman ale acizilor grași din uleiurile vegetale. Identificarea benzilor marker Raman ale carotenoidelor din uleiul de cătină. Evaluarea comparativă a raportului de acizi grași saturați/nesaturați din uleiurile vegetale, ca marker al originii biologice. Discriminarea uleiurilor vegetale în funcție de originea biologică folosind metodele FTIR și analiza statistică PCA. Determinarea benzilor marker FTIR ale glucozei, fructozei și zaharozei din sucurile de fructe. Cuantificarea simultană a glucozei, fructozei și zaharozei din sucurile de fructeutilizând spectroscopia FTIR și regresia PLS. Discriminarea sucurilor de fructe în funcție de originea biologică folosind metodele FTIR și analiza statistică PCA. Determinarea capacității antioxidante totale a sucurilor de fructe utilizând spectroscopia FTIR și regresia PLS.

VI 

Determinarea amprentei HPLC a carotenoidelor luteină, zeaxantină, α- și βcaroten din fracții lipidice ale extractelor de grâu Einkorn (Ei), Rosadur, Kamut și Toronit din recoltele 2004-2007. Distribuirea carotenoidelor luteină și zeaxantină în fracțiuni de măciniș de diferite mărimi. Determinarea, cuantificarea și compararea xantofilelor luteină și zeaxantină, din patru genotipuri de orz decorticat negru, galben, albastru și purpuriu cultivate in anul 2007 și 2008. Elucidarea și cuantificarea antocianilor din genotipuri de orz decorticat negru, albastru și purpuriu.

VII 

REZULTATE EXPERIMENTALE
 

I. EVALUAREA CALITĂŢII ULEIURILOR VEGETALE UTILIZÂND SPECTROSCOPIA FTIR ŞI RAMAN
MATERIALE ŞI METODE Uleiurile vegetale au fost achiziţionate de la diferiţi furnizori locali. O scurtă descriere a probelor de ulei caracterizate prin spectroscopie IR/Raman este prezentată în Tabelul I.1.
 

Tabel I.1 Uleiuri vegetale analizate prin metode spectroscopice FTIR și FT-Raman Table I.1 Different vegetable oils analyzed by FTIR and FT-Raman spectroscopic methods
Probă Nr. Ulei Tip Prepararea probei Analiza Raman Raman analysis + +++ + + +++ + + ++ + + + + + Analiza FTIR FTIR analysis + + + + + + + +

Sample Oil Type Preparation of sample Nr. 1 Armurariu crud presat la rece 2a, 2b, 2c Cătină* crud Extras cu solvenți organici 3 Floarea soarelui refinat presat la rece 4 Porumb crud presat la rece 5a, 5b, 5c Măsline* crud presat la rece 6 Șofran crud presat la rece 7 Rapiță crud presat la rece 8a, 8b Soia** crud presat la rece 9 Cânepă crud presat la rece 10 Palmier crud presat la rece 11 Dovleac crud presat la rece 12 Nuci crud presat la rece 13 Susan crud presat la rece *-3 producători diferiți, **-2 producători diferiți, +-măsurători efectuate

Spectrele FTIR au fost obţinute în intervalul numerelor de undă 650-3500 cm-1, cu un spectrometru Bruker Equinox 55 cu o rezoluţie spectrală de 2 cm-1. Probele au fost înregistrate cu ajutorul unei unităţi Attenuated Total Reflectance (ATR), prin coadăugarea de 32 de scanări. Spectrele FT-Raman (50 la 3500 cm-1) au fost înregistrate cu

VIII 

un accesoriu Raman Bruker FRA 106/S ataşat la spectrometrul FTIR Bruker Equinox 55 echipat cu un detector Ge de înaltă sensibilitate, răcit cu azot lichid. Analiza tip Principal Component Analysis (PCA) este utilizată pentru a găsi sursele principale de variabilitate într-un set de date şi relaţia dintre / între obiecte şi variabile (Esbensen, KH et al., 2002). Programul Unscrambler (CAMO, Norvegia) a fost utilizat pentru a analiza componentelor mutiple prin utilizarea analizei de rutină PCA. Pentru analiza PCA, au fost înregistrate spectrele FTIR a 9 uleiuri de măsline, 10 de floarea-soarelui, 2 de susan şi 4 de sâmbure (2 de prune, 1 de caise, 1 de piersici), obţinute de la furnizori locali. Spectrele de absorbţie mid-IR (MIR) au fost înregistrate folosind un spectrometru FTIR (IR-Prestige, Shimadzu Europa GmbH, Duisburg, Germania), echipat cu un detector DLATGS. Rezoluţie spectrală a fost de 4 cm-1 iar pentru fiecare spectru s-au mediat 128 scanări. Accesoriul ATR utilizat constă dintr-o placă ZnSe cu reflexii multiple (10 reflexii) (Pike Technology, Madison, SUA). Ca referinţă, s-a înregistrat spectrul de fond al aerului. Probele de suc au fost măsurate direct pe cristalul ATR din ZnSe fără a fi necesară o pregătire a proei în prealabil. Între măsurători cristalul ATR a fost curăţat cu apă distilată şi apoi uscat.

REZULTATE ŞI DISCUŢII Spectrele FTIR ale uleiurilor vegetale Spectrele FTIR a uleiurilor vegetale (probele 1, 2a, 3, 4, 5a, 6, 7, 8a din Tabelul I.1) sunt prezentate în Figura I.1. Spectrele acestor uleiuri prezintă forme spectrale foarte asemănătoare, datorită structurii chimice apropiate ale acizilor graşi constituenți. Benzile IR sunt dominate de o vibraţie de întindere C=O la 1744 cm-1 foarte intensă. Vibrațile de deformare C-H sunt prezente în spectrele FTIR la 1466 cm-1, în timp ce vibraţile de întindere C-C şi C-O sunt prezente la 1097 şi respectiv 1161 cm-1. Spectrele FTIR conţin benzi caracteristice de absorbţie a acizilor graşi constituenţi a uleiurilor vegetale, dar din cauza polarităţii slabe a legăturilor, benzile de absorbţie IR sunt relativ slabe, cu excepţia legăturii polare C=O. Prin urmare, pentru evaluarea calitativă şi cantitativă exactă, se recomandă implementarea unor algoritmi chemometrici.

IX 

 

 

Figura I.1. Spectrele FTIR ale probelor de Figura I.2. Spectrele Raman ale uleiurilor uleiuri vegetale 1, 2a, 3, 4, 5a, 6, 7, 8a din vegetale 6, 1, 11, 12, 4 și 13 din Tabelul I.1 Tabelul I.1, în domeniul spectral 650-1800 în domeniul 800-1800 cm-1. cm-1. Figure I.1. FTIR spectra in the 650-1800 Figure I.2. Raman spectra of vegetable oil cm-1 spectral range of vegetable oil samples samples 6, 1, 11, 12, 4 and 13 from Table 1, 2a, 3, 4, 5a, 6, 7, 8a from Table I.1.
 

I.1, in the 800-1800 cm-1 range.

Amprenta spectrală Raman comparativă a uleiurilor vegetale Spectroscopia Raman reprezintă o tehnică mai potrivită pentru analiza uleiurilor, deoarece legăturile nepolare, C=C, apar foarte intens în spectrul Raman la aproximativ 1657 cm-1 (Figura I.2).

Figura I.2 prezintă amprenta spectrală Raman ale probelor de ulei vegetal 6, 1, 11, 12, 4 şi 13, descrise în Tabelul I.1. Vibrațile de deformare C-H sunt de asemenea evidenţiate de către o bandă intensă la 1439 cm-1. Caracteristic pentru spectrele Raman ale uleiurilor sunt şi două benzi de la 1264 şi 1301 cm-1 datorită deformărilor -CH2 şi respectiv =C-H. Vibraţiile de întindere C=O ale acizilor graşi apar de obicei ca o bandă mediu-slabă în spectrul Raman la 1747 cm-1. Atribuirea benzilor marker este prezentată pentru fiecare ulei investigat în Tabelul I.2.
 

Tabel I.2 Date cumulate – identificarea benzilor Raman marker a uleiurilor investigate Table I.2 Cumulative data – identification of Raman marker bands for the investigated oils
Mod de vibrație Nr. Crt Ulei întindere (C=C) Crt. Nr. 1 2 3 4 5 6   Oil Armurariu Porumb Șofran Dovleac Nuci Susan stretching (C=C) 1657 s 1657 s 1657vs 1657 s 1657 vs 1657 s deformare  (=C-H)  (-C-H)

Vibration mode (cm-1) bending  (=C-H) 1301 m 1302 m 1302 m 1302 m 1302 m 1302 m  (-C-H) 1264 w 1265 m 1264 m 1265 m 1265 ms 1265 m

Amprentele spectrale Raman specifice uleiurilor de palmier, măsline şi floareasoarelui. Figura I.3 prezintă spectrele Raman ale uleiurilor de floarea-soarelui, măsline şi de palmier în intervalul 800-1800 cm-1. Comparând intensităţile vibraţiilor de întindere a

XI 

C=C la 1657 cm-1 din aceste uleiuri, poate fi observat că cea mai mică intensitate corespunde uleiului de palmier. De asemenea, pentru uleiul de palmier, vibraţiile de deformare a legăturilor C-H a atomilor de carbon cu o singură legătură au intensitatea cea mai mică în comparaţie cu celelalte două uleiuri.

 

Figure I.3. Raman spectra of sunflower (sample 3), olive (sample 5a) and palm oil (sample 10) in the 800-1800 cm-1 range. Figura I.3. Spectrele Raman ale uleiului de floarea soarelui (proba 3), măsline (proba 5a) și de palmier (proba 10) în domeniul spectral 800-1800 cm-1.
 

Aceste rezultate sunt în excelentă concordanţă cu compoziţia cunoscută de acizi graşi a uleiului de palmier. Uleiul de palmier conţine 45% acid palmitic (C16: 0), 40 % acid oleic şi 10% acid linoleic; conţinutul ridicat de acizi graşi saturaţi conducând la intensităţi medii-slabe ale vibraţiilor atomilor de carbon dublu legaţi.

XII 

Cea mai intensă vibraţie de întindere C=C a fost observată în spectrul de ulei de floarea-soarelui. De asemenea, vibraţiile de deformare C-H ale carbonilor dublu legaţi arată cea mai mare intensitate, comparativ cu uleiurile de palmier şi de măsline. Aceste rezultate pot fi explicate prin conţinutul de acizi graşi al uleiului de floarea-soarelui. Uleiul de floarea soarelui conţine 68% acid linoleic (C18:2), 19% acid oleic (C18: 1) şi numai 12% acizi saturaţi (C16:0 şi C18: 0). Uleiul de măsline prezintă caracteristici spectrale faţă de uleiurile de palmier şi floarea-soarelui. Intensităţiile vibraților de întindere a legăturii C=C şi de deformare a legăturii =C-H a atomului de carbon dublu legat sunt mai mari decât cele ale uleiului de palmier, dar mai slabe decât cele ale uleiului de floarea-soarelui. Aceste caracteristici pot fi explicate prin conţinutul ridicat de acid oleic în uleiul de măsline (71%), acid linoleic (10%) şi conţinut de acizi graşi saturaţi (16%).

Amprentele spectrale Raman specifice uleiului de cătină Figura I.4 prezintă spectrul Raman a trei uleiuri de cătină obţinute de la trei producători diferiţi. Spectrul uleiului de floarea-soarelui a fost introdus pentru compararea amprentelor spectrale a acizilor graşi. După cum se poate observa în Figura I.4, uleiul de cătină conţine toate caracteristicile spectrale ale unui ulei vegetal. În plus, apar mai multe benzi noi în spectru la 1523, 1190, 1156 şi 1005 cm-1, atribuite conţinutului de carotenoide a uleiului de cătină.

XIII 

Figura I.4. Spectrele Raman ale uleiurilor de cătină de la trei producători diferiți (probele 2a, 2b și 2c) și comparativ uleiul de floarea soarelui (proba 3) în domeniul 800-1800cm-1. Figure I.4. Raman spectra of seabuckthorn oil from three different producers (samples 2a, 2b and 2c) and comparatively of sunflower oil (sample 3) in the 800-1800 cm-1 range.
 

Compoziţia acizilor graşi din uleiul de cătină este descrisă în literatura de specialitate după cum urmează: acizi graşi saturaţi 35%, acizi graşi mononesaturaţi 57%, şi acizii graşi polinesaturaţi 9%. Amprenta spectrală a acizilor graşi din cele trei uleiuri de cătină din Figura I.4, diferă foarte mult, dezvăluind raporturi diferite de acizi graşi saturaţi /nesaturaţi. Este cunoscut faptul că uleiul de cătină conţine diverşi carotenoizi, cum ar fi licopen sau β-caroten. Analizând intensităţile benzilor atribuite conţinutului de carotenoide, pot fi obţinute evaluări calitative privind uleiurile de cătină. De exemplu, luând ca benzi marker benzile de la 1523 şi 1156 cm-1, atribuite vibraţiilor de întindere a

XIV 

legăturilor C=C şi respectiv C-C este evident că uleiul de cătină obţinut de la producătorul al treilea (Figura I.4) are conţinutul cel mai ridicat de carotenoide .

Clasificarea uleiurilor vegetale folosind spectroscopia FTIR şi analiza PCA Pentru spectrele FTIR a 9 uleiuri de măsline, 10 de floarea-soarelui, 2 de susan şi 4 de sâmbure (2 de prune, 1 de caise, 1 de piersici), regiunea spectrală caracteristică, cu informaţii structurale moleculare utile, a fost identificată în intervalele spectrale 6401840 şi 2770-3070 cm-1. Prin analiza PCA a diferenţelor între profilurile spectrelor s-a obținut gruparea uleiurilor după originea biologică a acestora. Figura I.5 prezintă rezultatele obţinute.

kernel olive sesame

sunflower

Figura I.5. Gruparea uleiurilor de măsline, floarea soarelui, sesam și diferite uleiuri din sâmburi de fructe Figure I.5. Grouping of olive, sunflower, sesame and fruit kernel oils by PCA. . Uleiurile de măsline şi de floarea-soarelui pot fi observate în grupuri total distincte (Figura I.5), permiţând astfel o discriminare excelentă după originea vegetală. Cu toate acestea, una dintre probele de ulei de măsline este în afara grupului caracteristic. Astfel, autenticitatea acestei probe nu poate fi confirmată prin spectroscopie FTIR/analiză PCA.

XV 

O grupare satisfăcătoare a fost obţinută pentru uleiurile din sâmburi (caise, piersici şi două uleiuri din sâmburi de prune). Cele două uleiuri de susan reprezintă un grup distinct.
 

CONCLUZII Spectroscopia FTIR și FT-Raman reprezintă metode viabile, rapide și de analiză nedistructivă pentru evaluarea calității și autenticității uleiurilor vegetale. Au fost investigate 13 tipuri de ulei vegetal provenite de la diferiți producători fară a fi necesară prelucrarea probelor. Astfel, amprentele FTIR ale diferitelor uleiuri vegetale au fost comparate folosind benzile specifice, caracteristice acizilor graşi saturaţi și nesaturați. Profilul acestora a fost folosit ca și marker de autenticitate. Combinând spectroscopia FTIR și analiza statistică PCA, 25 de uleiuri vegetale de floarea soarelui, măsline, susan și sâmburi de fructe au fost grupate cu succes, permițând discriminarea uleiurilor în funcție de originea lor biologică. Amprenta spectrală FT-Raman a uleiurilor prezintă raportul acizilor grași saturați și nesaturați, comparând intensitățile relative ale benzilor marker, cum ar fi banda de vibrație =C-H de la 1302 cm-1, banda de vibrație -CH2 de la 1264 cm-1, precum și vibrația de întindere C=C de la 1657 cm-1. În domeniul numerelor de undă mari, pot fi menționate următoarele benzi marker: banda de la 2851 cm-1, datorată vibrației de întindere -CH2, precum și banda de la 3010 cm-1 atribuită vibrației de întindere =C-H. Așa cum era de așteptat, spectrul Raman al uleiului de palmier, prezintă concentrația cea mai mare în acizi grași saturați. Spectroscopia FT-Raman, a fost aplicată cu succes în evaluarea calității uleiului de cătină, analizând nu doar conținutul în acizi grași, dar și conținutul în carotenoide a uleiului. Astfel, au fost identificate benzi marker ale uleiului de cătină: 1523 cm-1, 1156 cm-1, 1004 cm-1. Utilizând aceste benzi, a fost evaluat conținutul în carotenoide al uleiurilor de cătină provenite de la trei producători diferiți, putând fi observate diferențe de până la 100%.

XVI 

Pe bazat profilului spectral și intensitatea benzilor marker s-a putut identifica etichetarea greșită a unui ulei de soia ca fiind de rapiță.

XVII 

II. EVALUAREA CALITĂȚII SUCURILOR DE FRUCTE FOLOSIND SPECTROSCOPIA FTIR ȘI METODE CHEMOMETRICE
II.1 CUANTIFICAREA GLUCOZEI, FRUCTOZEI ȘI ZAHAROZEI ÎN SUCURI DE MERE UTILIZÂND SPECTROSCOPIA FTIR CUPLATĂ CU METODE CHEMOMETRICE MATERIALE ȘI METODE Probe. Un număr de 11 sucuri de mere au fost achiziționate de la diferite supermarket-uri. Sucuri de mere autentice (100% naturale) au fost obţinute prin stoarcerea unui măr de tip Golden Delicious şi a unui măr de tip Jonagold. Cele 13 probe sunt descrise în Tabelul II.1, conform cu etichetarea acestora. Tabel II.1 Notația și descrierea probelor de sucuri folosite în analiza FTIR Table II.1 Notation and short description of apple juice samples used for FTIR analysis Nr. Nr. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 Probă Sample A1_100% A2_100% A3_100% A4_100% A5_100% A6t_100% A7t_100% A8t_100% A9c_100% A10c_100% A11_50% Golden Jonagold Descriere probă Description suc de mere 100%, măr verde suc de mere 100% suc de mere 100% suc de mere 100% suc de mere 100% suc de mere 100%, tulbure suc de mere 100%, tulbure suc de mere 100%, tulbure suc de mere 100%, din concentrat suc de mere 100%, din concentrat suc de mere 50% suc autentic suc autentic Proveniență Provenience comercial comercial comercial comercial comercial comercial comercial comercial comercial comercial comercial stors din măr Golden Delicious stors din măr Jonagold

Pentru prepararea a 24 amestecuri de glucoză, fructoză și zaharoză (codificate g_f_s) au fost folosite soluţii standard de diferite concentraţii (g/100 ml) de glucoză (g) (1.0, 1.25, 2.0, 2.5, 4.0 şi 5), fructoză (f) (3.25, 3.5, 6.0, 6.5, 7.0, 9.0 şi 13.0) şi zaharoză

XVIII 

(e) (0.75, 1.0, 1.5, 2.0, 3.0, 4.0). Soluțiile standard pregătite au acoperit intervalele minime şi maxime de concentraţie, reprezentative pentru probele naturale şi au fost utilizate pentru dezvoltarea modelului de calibrare. Instrumentația. Spectrele din domeniul mid-IR (MIR) au fost înregistrate folosind o unitate ATR (Attenuated Total Refelectance) la temperatura camerei cu ajutorul unui spectrometru FTIR (Bruker, Germania), echipat cu un detector răcit cu azot lichid de tip cadmiu-telur mercur (MCT). Rezoluţia spectrală a fost de 4 cm-1, iar pentru fiecare spectru au fost acumulate 32 scanări. Analiza cantitativă. Pentru analiza cantitativă a fost folosit programul Unscrambler (Camo, Norvegia). Modelele de calibrare au fost elaborate folosind prima derivată a spectrelor celor 24 soluţii standard de glucoză, fructoză şi zaharoză. Domeniul spectral al carbohidraţilor a fost identificat între 885-1500 cm-1, acesta fiind utilizat pentru procesele de calibrare şi predicţie.

REZULTATE ȘI DISCUȚII Amprenta spectrală ATR-MIR a principalilor carbohidrați Pentru a găsi amprentele spectrale specifice pentru glucoză, fructoză şi zaharoză au fost înregistrate spectrele de absorbţie ATR-MIR, a soluţiilor individuale, la diferite concentraţii, de exemplu, glucoză (5%), fructoza (13%) şi zaharoză (3%), așa cum este prezentat în Figura II.1. Toate spectrele MIR, ale acestor soluţii sunt dominate de o bandă puternică datortă absorbţiei apei, centrată la 1650 cm-1. Cu toate acestea, rămâne disponibilă o fereastră spectrală între 885 şi 1500 cm-1 pentru observarea benzilor caracteristice absorbţiei carbohidraților. În această regiune au fost identificate benzile caracteristice glucozei (maxime specifice la 991, 1034, 1080, 1107, 1151, 1367 şi 1460 cm-1), fructozei (maxime specifice la 966, 1063, 1155, 1254,1346, 1416 și 1456 cm-1) şi zaharozei (maxime specifice la 995, 1055, 1113, 1138, 1338 şi 1464 cm-1).

XIX 

Benzile din regiunea 904-1153 cm-1 sunt atribuite vibrațiilor de întinde C-O şi CC, în timp ce benzile din domeniul 1474-1199 cm-1 sunt datorate vibrațiilor grupărilor OC-H, C-C-H şi C-O-H al carbohidraţilor (Irudayaraj şi Tewari, 2003).

Figura II.1. Spectrele specifice ATR-MIR ale soluțiilor standard de glucoză (5%), fructoză (13%) și zaharoză (3%). Figure II.1. Specific ATR-MIR spectra of standard solutions of glucose (5%), fructose (13%) and sucrose (3%).

Predicții cantitative bazate pe analiza PLS a concentraţiilor de carbohidraților din sucuri comerciale şi autentice Calitativ se pot identifica benzi caracteristice pentru glucoză, fructoză şi zaharoză la 1034, 1063 şi 995 cm-1, în conformitate cu Figura II.1. Prin utilizarea doar aceste benzi marker, o evaluare cantitativă a carbohidraților din sucuri este extrem de dificilă sau chiar speculativă, având în vedere suprapunerea acestor benzi, cu intensităţi diferite de absorbţie.

XX 

Folosind spectrele FTIR ale soluţiilor standard, cu concentrații de glucoză, fructoză și zaharoză cunoscute, a fost elaborat un model pe baza regresiei de tip PLS. Apoi, aplicând acest model elaborat la spectrele cu concentrații necunoscute, a sucurilor de mere comerciale și autentice, programul chemometric a prezis concentrația de glucoză, fructoză şi zaharoză din probele sucurilor comerciale şi autentice, așa cum este prezentat în Figura II.2.

(a)

(b)

(c)

Figura II.2. Valori ale concentrațiilor prezise pentru glucoză (a), fructoză (b) și zaharoză (c) în sucurile de mere comerciale și cele autentice folosind modele de regresie PLS. Figure II.2. Predicted values for glucose (a), fructose (b) and sucrose (c) concentrations in the commercial and genuine apple juices using the PLS regression models.

Valorile maxime pentru glucoză (3.166%) şi fructoză (9.344%) au fost obţinute pentru sucul autentic obținut din măr stors Golden Delicious, sucul de măr stors Jonagold

XXI 

prezentând de asemenea valori similare. Concentraţiile de zaharoză în probele Golden Delicious și Jonagold au fost 1.393% şi respectiv 1.381%. Sucurile A2_100% şi A3_100% etichetate "100% naturale" prezintă concentraţii de carbohidrați comparabile cu cele din sucurile de mere stoarse indicând autenticitatea acestora. Autenticitatea probelor A4_100% şi A5_100% nu a putut fi confirmată prin analiza ATR-MIR. Concentraţiile de glucoză (1.664%) şi fructoză (4.374%) sunt mult mai mici decât a sucurilor etichetate "100% naturale". Proba A1_100% prezintă o deviere standard (SD) relativ mare la determinarea glucozei şi fructozei, dar rezultatele indică în mod clar o concentrare ridicat de zaharoză. De regulă, conţinutul ridicat de zaharoză indică o adaosul acestei substanțe pentru îndulcire, astfel că acest suc nu poate fi catalogat 100%, așa cum este trecut pe etichetă. Sucurile de mere comerciale obţinute din concentrat (A9c_100% şi A10c_100%), precum şi sucurile tulburi A6t_100%, A7t_100% şi A8t_100% prezintă o calitate bună în ceea ce privește conținutul de glucoză, fructoză şi zaharoză, datorită valorilor aproapiate de sucurile autentice. Turbiditatea sucurilor nu a influenţat absorbţia IR, astfel sucurile tulburi au putut fi de asemenea clasificate cu succes. Sucul de mere A11_50% (50% conținut suc de fructe) prezinta glucoză (1.999%) şi fructoză (3.701%) aproximativ 60% din conţinutul unui suc de mere natural autentic, în timp ce concentraţia de zaharoză (3.518%) este aproape de două ori mai mare decât în sucul de mere pur, probabil datorită adaosului de zaharoză suplimentar , necesare pentru a menţine intensitatea gustului dulce.

CONCLUZII Metodele combinate, spectroscopie FTIR şi analiză statistică multivariată (chemometrie), au fost aplicate pentru evaluarea calității și autenticității sucurilor de mere, prin determinarea concentraţiilor de glucoză, fructoză şi zaharoză în 11 de sucuri de mere comerciale şi compararea cu valorile a două 2 sucuri autentice obținute prin stoarcerea merelor.

XXII 

În vederea determinării acurate a concentrațiilor de carbohidrați din sucurile de mere au fost analizate în prealabil un număr de 24 soluții de amestecuri de glucoză, fructoză şi zaharoză (soluții standard), la diferite concentraţii, pentru elaborarea unui model de calibrare. Concentraţiile de glucoză prezise, utilizând regresia PLS, pentru sucurile comerciale, au variat între 1.664 și 3.133% (w/w) faţă de 3.1% pentru sucurile pure, autentice. Concentraţiile de fructoză prezise pentru sucurile comerciale au variat între 3.701 și 6.941 faţă de 9.2% pentru sucurile proaspete, autentice, în timp ce concentraţiile de zaharoză prezise pentru sucurile comerciale au variat între 0.746 la 5.795 faţă de 1.38% pentru sucurile autentice. Majoritatea sucurilor au prezentat un conținut de carbohidrați în conformitate cu valorile din literatură pentru sucuri autentice, cu o medie de 2.8, 6.5 şi 1.5% pentru glucoză, fructoză şi respectiv zaharoză. Cu toate acestea, mai multe probe au prezentat discrepanţe faţă de valorile medii, astfel autenticitatea acestor sucuri nu a putut fi confirmată. De asemenea, concentraţia ridicată de zaharoză indică adulterarea sucului, așa cum s-a observat pentru proba A1_100%, sau adaosul zaharozei la suc pentru menținerea intensității gustului dulce în cazul sucurilor cu conținut parțial de fruct, așa cum s-a observat pentru proba A11_50%. Devierea standard a valorilor prezis prin regresie PLS pentru cele mai multe probe a fost sub 10%. Turbiditatea sucurilor nu au perturbat analiza IR, obținându-se rezultate acurate și pentru aceste probe. Rezultatele noastre demonstrează că metoda FTIR combinată cu tehnici de analiză statistică multivariată oferă analize rapide, acurate, non-distructive şi eficiente în ceea ce privește costurile, pentru monitorizarea de rutină a carbohidraților din sucurile de mere, ca indicatori de calitate și autenticitate.

XXIII 

II.2 CUANTIFICAREA GLUCOZEI, FRUCTOZEI ȘI A ZAHAROZEI ÎN SUCURILE DE FRUCTE UTILIZÂND SPECTROSCOPIA FTIR ȘI ANALIZA STATISTICĂ MULTIVARIATĂ MATERIALE ȘI METODE Probe. Un număr de 28 de sucuri din gama băuturilor răcoritoare au fost achiziționate din supermarket-uri. Un număr de 5 sucuri de fructe autentice (mere, pere, portocale, ananas şi pere) au fost obţinute prin stoarcerea fructelor corespunzătoare obţinute de la supermarket-uri. Un total de 33 de probe de suc cu un conţinut de suc pur (suc de fructe) între 4 şi 100% sunt descrise în Tabelul II.2, în conformitate cu etichetarea. Tabel II.2. Notație și scurtă descriere a probelor de sucuri de fructe Table II.2. Fruit juice samples notation and short description
Nr. Probă Descriere Nr. Sample Description 1 Ap1_100% Suc de mere 100% 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 Ap2_100% Ap3_100% Ap4_100% Ap5_40% Ap_G Ac_50% Ch_15% Or1_100% Or2_100% Or3_100% Or4_100% Or5_100% Or6_100% Or7_100% Or8_100% Or9_4% Suc de mere 100% Suc de mere 100% Suc de mere 100% Suc de mere verzi 40% Suc de mere autentic (măr Jonagold presat) Suc de caise 50% Suc de cireșe 15% Suc de portocale 100% Suc de portocale 100% Suc de portocale 100% Suc de portocale 100% Suc de portocale 100% Suc de portocale 100% Suc de portocale 100% Suc de portocale 100% Suc de portocale 4% Nr. Probă Nr. Sample 18 Or_G 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 Pc1_50% Pc2_50% Pc3_46% Pc4_45% Pc5_10% Pc_G Descriere Description Suc de portocale (portocale presate) Suc de piersici 50% Suc de piersici 50% Suc de piersici 46% Suc de piersici 45% Suc de piersici 10%

autentic

Suc de piersici autentic (piersică presată) Pi1_100% Suc de ananas 100% Pi2_50% Suc de ananas 50% Pi_G Suc de ananas autentic (ananas presat) Pr1_50% Suc de pere 50% Pr2_50% Suc de pere 50% Pr3_50% Suc de pere 50% Pr4_30% Suc de pere 30% Pr_G Suc de pere autentic (pară Packham presată) To_100% Suc de roșii 100%

XXIV 

Pentru calibrare au fost analizate un număr de 13 soluții standard, de diferite concentraţii de glucoză (0.5 - 4.0 g/100ml), fructoză (0.5 - 14.0 g/100ml) şi zaharoză (0.5 - 8.0 g/100ml), ce acoperă concentraţiile relevante pentru probele de sucuri naturale. Astfel, modelul elaborat prin regresia de tip PLS folosind spectrele FTIR ale soluțiilor standard va folosit ulterior pentru predicția concentrațiilor de carbohidrați din sucurile de fructe. Analiza FTIR. Spectre de absorbţie mid-IR (MIR) au fost înregistrate folosind un spectrometru FTIR (IR-Prestige, Shimadzu Europa GmbH, Duisburg, Germania), echipat cu un detector DLATGS. Rezoluţia spectrală a fost de 4 cm-1 iar pentru fiecare spectru sau acumulat 128 înregistrări. Probele au fost analizate folosind un acesoriu ATR cu 10 reflexii consecutive (Pike Technology, Madison, SUA). Între măsurători cristalul ATR a fost curăţat cu apă distilată. Analiza HPLC. Carbohidrații au fost separați şi cuantificați cu ajutorul unui cromatograf Shimadzu, echipat cu un sistem binar de pompe, autosampler și detector PDA. Coloana de separare cromatografică utilizată a fost de tip C18 (250 x 4.6 mm), Amino-Altima modificată. Eluare a fost realizată la 300C, într-un sistem isocratic, acetonitril: apă (80:20, v / v) cu un debit constant de 1,3 ml / min. Carbohidrații determinați au fost identificați prin compararea lor în funcție de timpul de retenţie a standardelor. Monitorizare s-a realizat la 260 nm cu un detector PDA. Determinarea activității antioxidante. Metoda echivalentului Trolox al capacităţii antioxidante (TEAC) se bazează pe capacitatea de neutralizare a radicalului anion ABTS+ de către antioxidanţi. ABTS este oxidat de către radicalii peroxil sau alţi oxidanţi la radicalul său cationic ABTS +, intens colorat (λmax = 734 nm). Capacitatea antioxidantă este exprimată ca şi potenţialul compuşilor testaţi de a decolora radicalul ABTS+ prin reacţie directă cu acesta. Capacitatea antioxidantă a compuşilor testaţi a fost exprimată ca şi echivalenţi Trolox, apoi transformată în activitate relativă prin raportarea la valoarea cea mai mare. Analiza tip Principal Components Analysis (PCA) și regresia tip Partial Least Squares (PLS). Analiza statistică a fost efectuată folosind programul Unscrambler 7.6

XXV 

(CAMO ASA, Oslo, Norway). Cele mai bune rezultate au fost obținute folosind derivata de ordin una a spectrelor FTIR calculate pe baza procedurii Savitzky-Golay.

REZULTATE ȘI DISCUȚII Analiza de tip Principal Component Analysis (PCA) Combinând metodele FTIR și analiza tip PCA, s-a realizat clasificarea sucurilor în funcție de originea biologică. Figura II.3 prezintă discriminarea sucurilor de mere, portocale şi piersici în funcție de componentele principale PC1 și PC2 obţinute în cadrul analizei PCA. Primele două componente principale explica 94% din variaţia spectrelor FTIR.

orange peach apple

Figura II.3. Distribuția scorurilor pentru primele două componente principale, PC1 și PC2, obținute din analiza PCA a sucurilor de mere, portocale și piersici (autentice și comerciale). Figure II.3. Scores plot of the first two principal components, PC1 and PC2, obtained from the PCA of the apple, orange and peach juices (genuine and commercial).

XXVI 

Majoritatea probelor de suc de mere, portocale şi piersici apar în grupuri distincte, bine definite. În Figura II.3 se observă două probe ce nu se încadrează în grupul caracteristic. Acestea sunt sucul de portocale cu 4% conţinut de fruct, ce a fost poziţionat în regiune suc de piersici. Autenticitatea acestuia este infirmată de analiza FTIR/PCA, ceea ce este în conformitate cu etichetarea. De asemenea sucul de piersici autentic apare departe de grupul caracteristic. Aceasta se explică prin faptul că sucurile de piersici analizate prezintă un conținut de fruct sub 50%, comparativ cu cel autentic 100% .

Regresia de tip Partial Least Squares (PLS) Utilizând modelele de regresie elaborate pe baza spectrelor soluțiilor standard, au fost determinate concentrațiile sucurilor de fructe comerciale și autentice. Tabelul II.3 prezintă concentrațiile prezise precum și deviațile pentru glucoză, fructoză și zaharoză. Erorile relative de predicţie pentru glucoză, fructoză şi zaharoză în sucurile de fructe au fost 2.88%, 8.05% şi respectiv 2.86% (s-a calculat suma abaterilor şi s-a împărţit la numărul total de probe).

XXVII 

Tabel II.3 Concentrații (g/100 ml) prezise pentru glucoză, fructoză și zaharoză precum și deviațiile ( ) pentru sucurile comerciale și cele autentice Table II.3 Predicted glucose, fructose and sucrose concentrations (g/100 ml) and deviations ( ) in the commercial and genuine fruit juices
Nr. Nr.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33

Sample Probă
Ap1_100% Ap2_100% Ap3_100% Ap4_100% Ap5_40% Ap_G Ac_50% Ch_15% Or1_100% Or2_100% Or3_100% Or4_100% Or5_100% Or6_100% Or7_100% Or8_100% Or9_4% Or_G Pc1_50% Pc2_50% Pc3_46% Pc4_45% Pc5_10% Pc_G Pi1_100% Pi2_50% Pi_G Pr1_50% Pr2_50% Pr3_50% Pr4_30% Pr_G To_100%

Glucose Glucoză
3.28±0.09 3.99±0.10 3.62±0.10 3.23±0.08 4.91±0.09 2.72±0.06 3.96±0.13 8.30±0.16 2.91±0.07 3.84±0.08 3.18±0.07 3.62±0.09 3.78±0.09 3.65±0.08 3.72±0.10 5.08±0.12 2.35±0.10 2.44±0.07 3.50±0.14 4.48±0.13 2.49±0.11 3.02±0.12 2.88±0.09 0.66±0.08 5.20±0.11 4.93±0.09 2.33±0.07 2.48±0.12 2.71±0.07 2.86±0.12 2.26±0.11 3.19±0.18 1.98±0.09

Fructose Fructoză
6.9±0.3 9.92±0.39 9.33±0.4 7.62±0.29 6.32±0.42 8.4±0.22 3.08±0.49 7.67±0.82 3.03±0.25 3.95±0.35 3.32±0.26 3.84±0.34 3.97±0.36 3.83±0.31 3.87±0.36 5.14±0.53 2.3±0.31 2.49±0.23 3.07±0.5 4±0.56 2.4±0.36 2.64±0.38 2.89±0.3 0.71±0.28 4.6±0.52 4.6±0.44 2.51±0.2 3.85±0.35 4.34±0.27 4.87±0.41 7.95±0.37 9.49±0.58 1.78±0.31

Sucrose Zaharoză
1.15±0.12 1.52±0.14 2.44±0.15 1.28±0.11 1.21±0.12 1.71±0.08 8.88±0.17 2.51±0.23 4.1±0.1 3.83±0.12 3.31±0.1 4.96±0.13 4.49±0.13 3.57±0.12 4.43±0.14 6.05±0.18 8.12±0.12 4.01±0.1 10.28±0.18 9.34±0.18 8.32±0.14 8.28±0.15 7.09±0.11 3.4±0.1 6.61±0.16 3.74±0.13 5.45±0.08 7.71±0.15 4.31±0.11 8.35±0.16 6.52±0.15 1.18±0.25 -0.15±0.13

XXVIII 

Cele cinci sucuri autentice au fost analizate, de asemenea, prin HPLC pentru determinarea continutului de carbohidrati şi validarea valorilor prezise, o cromatogramă reprezentative fiind prezentată în Figura II.4.

Figura II.4. Separarea standardelor de carbohidrați și o cromatogramă reprezentativă a probelor. Figure II.4. Separation of carbohydrate standards and a reprezentative syample chromatogram.

Tabelul II.4 prezintă concentraţiile carbohidraților obţinute prin HPLC, comparativ cu valorile corespunzătoare prezise. Valorile HPLC obţinute experimental au fost comparate cu valorile medii prezise şi abaterile relative au fost de 10% pentru glucoză, de 7% pentru fructoză şi 8% pentru zaharoză, validând astfel modelele dezvoltate prin regresie PLS. Sucurile de mere etichetate suc fruc 100% prezintă valori în conținut de glucoză, fructoză şi zaharoză caracteristice acestora. Pentru un suc de mere autentic, raportul aproximativ dintre fructoză, glucoză și zaharoză este de 3:6:2, în timp ce carbohidrații variază de la 1 la 4 (glucoză), 5-8 (fructoză) şi 0-5 g/100 ml (zaharoză) (Irudayaraj, J., şi Tewari, J. 2003).

XXIX 

Tabel II.4 Valori prezise (pred) și determinate prin HPLC pentru glucoză (g), fructoză (f) și sucroză (s) în cinci sucuri de fructe autentice Table II.4 Predicted (pred) and HPLC determined concentrations of glucose (g), fructose (f) and sucrose (s) in five genuine fruit juices Sample Probă Ap_G Or_G Pc_G Pi_G Pr_G g/pred g/prezis 2.72 2.44 0.66 2.33 3.19 g/HPLC g/HPLC 3.01 2.19 0.75 2.4 2.63 f/pred f/prezis 8.4 2.49 0.71 2.51 9.49 f/HPLC f/HPLC 8.8 2.21 1 2.6 8.82 s/pred s/prezis 1.71 4.01 3.4 5.45 1.18 s/HPLC s/HPLC 2.1 4.47 3.6 5.33 1.44

Un suc autentic de caise ar trebui să conţină mai puţin de 1 g/100 ml de fructoză, în timp ce sucul de cireşe să prezinte un conținut de zaharoză pură sub 1 g/100ml. Probele de suc de caise şi suc de cireşe analizate FTIR/PLS prezintă un conţinut mai mare de fructoză şi zaharoză, ceea ce denotă adăugarea de îndulcitori. Portocale conțin o medie de glucoză, fructoză şi zaharoză de 2.2 - 2.4, 2.5 - 3 şi respectiv 4 la 4.8 g/100ml. Se poate observa că valorile estimate (2.44, 2.49, 4.01 g/100ml) pentru sucul autentic de portocale sunt în concordanţă bună cu intervalele menţionate mai sus. Probele Or8_100% şi Or9_4% prezintă abateri relativ mari de la valorile medii. Aceste abateri pot fi constatate și în analiza PCA, unde proba Or8_100% (poziţionată în Figura II.3 la valori negative PC2) prezintă deviere de la alte eşantioane de suc de portocale. Sucul de portocale etichetat ca fruct 4% (Or9_4%) prezintă o concentrație de zaharoză (7.90 g/100ml) de aproape două ori mai mare comparativ cu alte sucuri de portocale, foarte probabil datorită adaosul de zaharoză suplimentar, necesare pentru menţinerea intensității gustului dulce. Sucul pur de piersici se caracterizează printr-un conţinut ridicat de zaharoză, de aproximativ 5.5 g/100 ml şi un conținut mai mic de glucoză şi e fructoză, de 1.1 şi 1.3 g/100ml, respectiv. Pentru sucul de piersici autentic au fost observate concentrații de glucoză şi fructoză sub valorile menţionate mai sus. Valorile mai mici sunt, probabil, din

XXX 

cauza unei recoltări într-un stadiu mai incipient de coacere ca și recoltarea în cazul sucurilor de fructe prelucrate comerciale. Valorile crescute ale glucozei (2.49-3.50 g/100ml), fructozei (2.4-3.07 g/100ml) şi zaharozei (7.09 - 10.28 g/100ml) prezise pentru sucurile de piersic comerciale denotă adăugarea de îndulcitori. Sucul din pulpă matură de ananas conţine zaharoză aproximativ 7 g/100ml şi 3 g / 100ml din fiecare, glucoză şi fructoză. Conform așteptărilor, pentru sucul de ananas autentic, precum și pentru proba Pi1_100%, s-a obținut un conţinut ridicat de zaharoză, în timp ce sucul de fructe de ananas 50% fruct prezinta doar 3.74 zaharoză g/100ml. Sucul de pere autentic este caracterizat de un conținut mare de fructoză şi conţinut de zaharoză relativ mic. Din probele analizate, sucul de pere autentic prezinta concentraţii de 9.49 şi 1.18 g/100ml pentru fructoză şi respectiv zaharoză. Prin urmare, datorită conţinutului ridicat de zaharoză (4.31 - 8.35 g/100ml) prezis pentru probele comerciale de suc de pere, se poate presupune adăugarea de îndulcitori. În final, de asemenea, a fost analizată o probă de suc de roșii etichetată 100% autentic. Valorile prezise pentru glucoză şi zaharoză sunt în concordanţă cu valorile din literatură (Briandet, R. şi colab., 1996) lipsa de zaharoză în tomate este evidențiată prin valoarea uşor negativă prezisă pentru zaharoză. De asemenea, un conţinut total de carbohidraţi de 3.76 g/100ml, conform valorilor prezise, este in acord cu valoarea de 3,5 g/100ml etichetată.

Evaluarea capacității antioxidante a sucurilor prin FTIR și PLS Capacitatea antioxidantă totală (TAC) a sucurilor a fost determinată experimental, prin utilizarea metodei echivalentului Trolox al capacităţii antioxidante (TEAC). Tabelul II.5 prezintă valorile numerice ale valorilor TAC a sucurilor de fructe măsurate cu metoda de referință TEAC comparativ cu valorile prezise FTIR/PLS şi abaterile standard corespunzătoare.

XXXI 

Tabel II.5 Valori TAC măsurate (TEAC) și prezise (PLS) Table II.5 Measured (TEAC) and predicted (PLS) TAC values
Sample Probe Ap1_100% Ap2_100% Ap3_100% Ap4_100% Ap5_40% Ap_G Ch1_15% Or1_100% Or2_100% Or3_100% Or4_100% Or5_100% Or6_100% Or7_100% Or8_100% Or9_4% Or_G Pc1_50% Pc2_50% Pc3_46% Pc4_45% Pc5_10% Pc_G Pi1_100% Pi2_50% Pi_G Pr1_50% Pr2_50% Pr3_50% Pr4_50% Pr_G To1_100% Measured (%) Măsurate 38.45 73.73 63.46 94.05 50.66 37.78 100 74.4 77.6 82.44 81.39 85.34 82.81 83.85 85.93 2.03 93.97 47.01 37.56 41.8 50.21 15.38 18.5 61.45 52.14 78.71 38.37 35.25 65.24 55.94 18.35 83.92 Predicted (%) Prezise 43.504 65.402 70.39 m 46.045 37.254 m m 79.442 71.981 79.632 77.994 76.613 87.563 94.887 7.81 m 40.511 45.045 38.742 m 11.878 23.06 65.012 54.848 m m 36.454 m 56.976 m 88.101 Pred. STDErr (%) Eroare standard prezisă % 5.986 6.1 6.238 m 6.405 6.186 m m 5.734 5.68 5.757 5.696 5.65 5.768 6.414 6.143 m 6.01 6.026 6.04 m 6.07 6.437 5.871 6.125 m m 5.748 m 6.527 m 6.707

XXXII 

Figura II.5 prezintă grafic valorile TAC prezise, comparativ cu valorile măsurate în cadrul testului TEAC

Figura II.5. Valori TAC măsurate (axa Ox) în sucurile de fructe folosind metoda de referință (TEAC) și valori prezise (axa Oy) prin FTIR și PLS. Figure II.5. Measured TAC values (Ox axis) in fruit juices with the reference method (TEAC) and predicted values (Oy axis) with FTIR and PLS.

Comparând valorile determinate TAC ale sucurilor (Tabelul II.5), cea mai mare capacitate antioxidantă o prezintă sucurile de portocale şi sucul de roşii cu valori în jur de 80%. Proba cu 4% suc pur de portocale apare ca excepţie, cu o valoare scăzută TAC (2.03% măsurată şi 7.81% prezisă), cel mai probabil din cauza conținutului scăzut de suc de fructe pur.

CONCLUZII Spectroscopia FTIR şi statistica multivariată (PCA şi PLS) au permis evaluarea calității și autenticității sucurilor de fructe. Prima derivată a spectrelor FTIR a prezentat cele mai bune capacităţi de predicţie, datorită valorilor scăzute a erorilor RMSEP. Analiza PCA a soluţiilor standard de carbohidraţi a permis o mai bună înţelegere a modului în care acestea se regăsesc în spectrele FTIR, în timp ce analiza PCA a

XXXIII 

spectrelor sucurilor de mere, portocale şi piersici a permis discriminarea între aceste tipuri de sucuri, prin gruparea acestora în funcție de originea biologică. Folosind regresia de tip PLS, erorile relative de predicţie pentru glucoza, fructoza şi zaharoza din probele de suc de fructe au fost de 2.88%, 8.05% şi respectiv 2.86%. A fost găsită o corelare satisfăcătoare (până la 10% deviere) între media prezisă FTIR/PLS a conținutului de carbohidrați şi datele HPLC Adăugarea de îndulcitori în sucurile de fructe poate fi dedusă pe baza discrepanţei față de concentraţiile medii de carbohidraţi din probelor autentice, sau valorile raportate în literatura de specialitate. Spectroscopia FTIR şi regresia PLS au fost folosite cu succes pentru determinarea capacităţii antioxidante a sucurilor de fructe. Valorile prezise FTIR/PLS şi valorile măsurate prin metoda de referință TEAC sunt în bună concordanţă, factorul de corelaţie între acestea fiind 0.958.

XXXIV 

III. DETERMINAREA CAROTENOIDELOR ÎN GRÂU
Autenticitatea a patru varietăți diferite de grâu (Einkorn, Rosadur, Kamut and Toronit), recoltate între anii 2004-2007 a fost verificată prin realizarea amprentei carotenoidice, folosinu-se metoda HPLC
 

MATERIALE ŞI METODE Probe. Patru varietãţi de grâu galben recoltate în 2004, 2005, 2006 şi 2007 au fost luate în studiu în vederea caracterizãrii profilului lor carotenoidic. Speciile de grâu Einkorn (EI-18), Toronit, Kamut şi Rosadur au fost achiziţionate de la Staţia Experimentalã BOKU Vienna. Distribuţia luteinei şi zeaxantinei a fost cuantificatã în diferite fracţiui de mãcinişi (tãrâţe >900 µm, shorts >500 µm, middlings plus >275 µm, middlings >180 µm, şi fãinã < 180 µm) în probele Einkorn, Toronit şi Topdur recoltate în anul 2007. Analiza HPLC. A fost utilizat cromatograful Agilent Technology model 1090 HP, echipat cu pompã binarã, auto sampler şi detector DAD. Separarea cromatograficã a compuşilor a dost realizatã cu ajutorul coloanei C18 (250 x 4.6mm, 5µm) GRACEVydac 201TP54. Eluarea s-a realizat la temperatura cameriei în sistem izocratic utilizând metanol: acetonitril (9:1, v/v) ca fazã mobilă la un debit constant de 0.7 ml/min. Cromatogramele au fost înregistrate la 450 nm.

Purificarea SPE (extracţie în fazã solidã) Purificarea extractului de carotenoide este necesarã, deoarece cantitãţi însemnate de lipide sunt extrase şi concentrate iar prezenţa fracţiunilor lipidice compromit coloana HPLC. Protocolul SPE pentru separarea carotenoidelor din extractul de grâu este schematic prezentat în Figura III.1.

XXXV 

Solid phase extraction

equilibrated with 10 ml 1% ethyl acetate/hexane

Silica SPE column

C. Xanthophylls: 15 ml 30% ethyl acetate / hexane + 5 ml ethyl acetate B. Lipids: 10 ml 10% ethyl acetate / hexane

A. Carotens: 2 ml 1% ethyl acetate / hexane

Figura III.1. Protocolul de separare pe coloana SPE a carotenoidelor, cu fracțiile corespunzătoare carotene, lipide și xantofili. Figure III.1. SPE protocol for separation of wheat extract, with the corresponding fractions carotenes, lipids and xantophylls.

REZULTATE ŞI DISCUŢII Separarea cromatograficã a carotenoidelor prin HPLC din probele de grâu nesaponificate Spre deosebire de fructe şi legume, în probele de grâu nu sunt prezente epoxicarotenoidele de aceea saponificarea se efectueazã doar în vederea îndepãrtãrii lipidelor. Extractele probelor de grâu pot fi analizate cu ajutorul HPLC în sistem izocratic. Separarea cromatograficã a carotenoidelor utilizând standarde de luteinã şi zeaxantinã, α- şi β-caroten este prezentatã în Figura III.2 iar cea a carotenoidelor din proba de grâu Einkorn, este prezentatã în Figura III.3.

XXXVI 

Figura III.2. Cromatograma HPLC a Figura luteină, zeaxantină, α- și β-carotene.

III.3.

Cromatogramă

HPLC

a

amestecului de standarde de carotenoide extractul de grâu Ei-18, recolta 2007.

Figure III.2. HPLC chromatogram of Figure III.3 HPLC chromatogram of Ei-18, lutein, zeaxanthin, α- and β-carotene crop 2007, wheat sample extract. standard mixture.

Analiza cantitativã a carotenoidelor din varietãţile de Einkorn, Rosadur, Kamut şi Toronit nesaponificate În cadrul acestui studiu, au fost analizate varietățile de grâu Einkorn, Rosadur, Kamut și Toronit din recoltele 2004-2007. În acest rezumat vor fi prezentate doar rezultatele obținute în urma analizei probei Einkorn, ca fiind cea mai relevantă. Probele Rosadur, Kamut și Toronit sunt analizate pe larg în capitolul VI al tezei. Analiza probelor Einkorn. Conţinutul în luteinã a variat între 4.55 mg/kg (EI-18, recoltat 2004) şi 6.25 mg/kg substanţã uscatã (s.u) (EI-18, recoltat 2005), cu media de 5.47 mg/kg s.u. Rezultatele obţinute sunt prezentate în Tabelul III.1 și în corelație cu cele raportate de Abdel-Aal şi colab. (Abdel-Aal, E. S. M. şi colab., 2002). Din întraga cantatitate de carotenoide, luneina este cea mai însemnatã cantitativ 84%, urmatã de β-caroten 8.87%. Zeaxantina a fost identificatã în toate probele analizate. Aceste rezultate sunt în contradicţie cu cele raportate de cãtre Hidalgo şi colab. (Hidalgo, A. şi colab., 2006) care menţioneazã absenţa zeaxantinei din varietatea Einkorn. Concentraţia de zeaxantinã identificatã a fost de 0.31 (recoltate în 2004) şi 0.44 mg/kg s.u

XXXVII 

(recoltat în 2006). Concentraţia de α-caroten variazã între 41.31µg/kg şi 80.57 µg/kg, în timp ce pentru β-caroten raportãm cantitãţi între 725.24 şi 434.5 µg/kg s.u. În concluzie varietatea EI-18 recoltatã în 2007 a prezentat cantitãţi mai mari de carotenoide în comparaţie cu EI-18 recoltate în ceilalţi ani. Tabelul III.1 reprezintã concentraţia de carotenoide din probele nesaponificate Ei-18, Rosadur, Kamut şi Toronit. Tabel III. 1 Concentrația (mg/kg) carotenoidelor individuale din extractele probelor de grâu nesaponificate Ei-18, Rosadur, Kamut și Toronit Table III.1 The concentration (mg/kg) of individual carotenoids from unsaponified extract of Ei-18, Rosadur, Kamut and Toronit varieties of wheat
Year An 2004 2005 2006 2007 Ei-18 (mg/kg) L 4.55 6.25 4.95 6.11 Z 0.31 0.35 0.44 0.43 Ei-18 (µg/kg) α 77.19 80.57 65.08 41.31 β 725.19 654.80 434.58 490.89 Rosadur (mg/kg) L 1.08 1.64 1.67 1.87 Z 0.17 0.21 0.29 0.20 Rosadur (µg/kg) α 25.02 29.78 59.68 46.46 β 44.25 47.95 47.95 47.01 Kamut (mg/kg) L 0.92 1.18 1.27 1.29 Z 0.17 0.20 0.22 0.23 Kamut (µg/kg) α 22.25 25.46 25.67 19.33 β 35.60 38.04 36.54 34.61 Toronit (mg/kg) L 2.32 2.67 2.35 Z 0.28 0.39 0.27 Toronit (µg/kg) α 67.24 21.17 20.41 β 31.31 35.16 43.39 -

L- lutein, Z- zeaxanthin, α- α-carotene and β - β-carotene

Separarea cromatograficã a carotenoidelor din grâu, folosind extracția în fază solidă (SPE). În studiile noastre, analiza HPLC a fost utilizatã pentru a compara cantitatea de carotenoide din probele saponificate şi nesaponificate din grâu. Pierderile de carotenoide în urma saponificării în cazul extractelor de grâu au fost de pâna la 40%. Datoritã pierderilor mari, am utilizat ca și metodă alternativă pentru purificarea și îndepărtatrea lipidelor nedorite, metoda extracției în fază solidă (SPE). Tabelul III.3 prezintã conţinutul în luteinã vs. zeaxantinã şi α-caroten vs.β-caroten dupã separarea SPE. Dupã cum se poate deduce comparând Tabelul III.2 şi Tabelul III.3, randamentul de recuperare a luteinei şi zeaxantinei a fost de 82-99% pentru luteinã şi 8293% pentru zeaxantinã. Recuperarea fracţiunilor de α- și-β caroten au fost de 84-99 %.

XXXVIII 

Randamentul de recuperare a pigmenților carotenoidici pentru probele Rosadur, Kamut și Toronit au fost 74-98%, 81-95% şi 75-98%. În acest studiu, am demonstrat cã separarea SPE pentru îndepãrtarea lipidelor este o metodã mai rapidã cu pierderi de 1-25 % în comparaţie cu saponificarea unde pierderile de carotenoide înregistrate sunt mai mari de 40%. Table III.2 prezintã concentraţia de carotenoide în Ei-18, Rosadur, Kamut şi Toronit dupã separarea SPE. Tabel III.2 Concentrația (mg/kg) carotenoidelor individuale după separarea SPE pe coloană deschisă a probele de grâu Ei-18, Rosadur, Kamut și Toronit Table III.2 The concentration (mg/kg) of individual carotenoids after SPE clean-up in Ei-18, Rosadur, Kamut and Toronit varieties of wheat
Year An 2004 2005 2006 2007 Ei-18 (mg/kg) L 4.51 6.19 4.89 5.63 Z 0.26 0.31 0.43 0.42 Ei-18 (µg/kg) α 70.67 72.43 59.28 40.08 β 706.25 554.28 409.63 464.08 Rosadur (mg/kg) L 1.06 1.49 1.52 1.73 Z 0.17 0.20 0.26 0.18 Rosadur (µg/kg) α 22.36 26.10 51.68 39.87 β 40.25 43.50 41.62 37.13 Kamut (mg/kg) L 0.79 1.13 1.16 1.23 Z 0.16 0.16 0.17 0.20 Kamut (µg/kg) α 19.30 20.91 22.43 17.35 β 29.38 28.83 33.00 32.88 Toronit (mg/kg) L 2.29 2.60 2.12 Z 0.26 0.33 0.23 Toronit (µg/kg) α 50.49 19.80 16.13 β 28.32 25.01 36.90 -

L- lutein, Z- zeaxanthin, α- α-carotene and β - β-carotene

Distribuţia carotenoidelor în fracţiunile de grâu Condiţiile de creştere, varietatea şi factorii genetici ai grâului înfluenţeazã conţinutul de carotenoide şi distribuţia în seminţe. Randamentul fracţionãrii pentru fiecare varietate investigată a fost urmãtorul: Ei-18 furnizeazã 16.5, 15.1, 12.2, 5.3 şi 49.9%; Topdur furnizeazã 8.9, 10.9, 24.4, 23.1 şi 31.9%; şi Toronit furnizeazã 14.9, 9.3, 12.1, 12.9 şi 49.8% tãrâţe, shorts, middlings plus, middlings, şi fãinã. Fracţiunea integralã a fost utilizatã în vederea evaluãrii extracţiei şi fracţionãrii. Figura III.4 prezintã conţinutul de luteinã şi zeaxantinã în farcțiunile de măciniș a urmãtoarelor varietãţi de grâu galben: Ei-18 (a, b), Topdur (c, d) și Toronit (e, f).

XXXIX 

a)
8
***

< 180 mm > 180 mm

> 275 mm > 500 mm

> 900 mm whole EI-18

b)
0.4

< 180 mm > 180 mm

> 275 mm > 500 mm
**

> 900 mm whole EI-18

Lutein content (mg/kg)

*

Zeaxanthin content (mg/kg)

ns

6
ns

0.3
ns

ns

ns

4
*** ***

0.2

2

0.1

0

0.0

EI-18 wheat samples

EI-18 wheat samples

c)
5

< 180 mm > 180 mm > 275 mm
* **

> 500 mm > 900 mm whole Topdur

d)
0.4

< 180 mm > 180 mm > 275 mm
***

> 500 mm > 900 mm whole Topdur

Lutein content (mg/kg)

4

Zeaxanthin content (mg/kg)

0.3
***

3

ns

0.2
* ns

2
*** ***

0.1

ns

1

0

0.0

Topdur wheat samples

Topdur wheat samples

e)
4
**

< 180 mm > 180 mm > 275 mm
**

> 500 mm > 900 mm whole Toronit

f)
0.5

< 180 mm > 180 mm > 275 mm
***

> 500 mm > 900 mm whole Toronit

Zeaxanthin content (mg/kg)

0.4

Lutein content (mg/kg)

3
*

***

0.3

***

2
*** ***

0.2

1

0.1
*** ***

0.0

0

Toronit wheat samples

Toronit wheat samples

Figura III.4. Conţinutul de luteină şi zeaxantină a fracţiunilor obtinute din cele trei varietăţi de grâu: EI-18 (a, b), Topdur (c, d) şi Toronit (e, f). Valorile sunt exprimate ca medie ± SD (* semnificativ, ** foarte semnificativ, *** extraem de semnificativ, P < 0.05, ns-nesemnificativ P> 0.05). Figure III.4. Lutein and zeaxanthin content in millstreams of yellow wheat varieties: EI18 (a, b), Topdur (c, d) and Toronit (e, f). Values are mean ± SD (* significant, ** very significant, ***extremely significant, P < 0.05, ns-non significant P> 0.05).

XL 

Conţinutul cel mai mare în carotenoide a fost identificat în fracţiunile de fãinã Ei18 (6.92 pentru luteinã şi 0.24 mg/kg zeaxantinã), urmat de fracţiunile de fãinã Topdur (3.6 luteinã şi 0.09 mg/kg zeaxantinã). În fracţiunile de fãinã de Toronit a fost identificatã cea mai micã cantitate de luteinã 3.08 mg/kg.

CONCLUZII Pentru extracţia luteinei, zeaxantinei, α- şi β-carotenului, mixul eter de petrol: acetat de etil: metanol (1:1:1 v/v/v) a fost gãsit ca fiind cel mai eficient solvent de extracţie. Saponificarea standard produce pierederea carotenoidelor în procent de 40%. Astfel, metoda SPE a fost gãsitã ca fiind cea mai avantajoasã. Recuperarea carotenoidelor dupã procedura SPE a fost între 85-99%, 74-98%, 81-95% şi 75-98% pentru varietãţile Einkorn, Rosadur, Kamut şi Toronit. Metoda de extracţie utilizând SPE a fost identificatã ca fiind o metodã rapidã cu pierderi mici de carotenoide. Diferenţe semnificative privind conţinutul de carotenoide au fost înregistrate între varietãţile analizate. Prin alaliza HPLC, conţinutul în luteinã din grâu a fost identificat ca fiind pigmentul carotenoidic majoritar. Cea mai mare cantitate de luteinã a fost identificatã în proba Einkorn cu o medie a anilor de recoltare( 2004-2007) de 5.47 mg/kg, urmatã de proba Toronit 2.44 mg/kg, Rosadur 1.56 mg/kg şi Kamut 1.16 mg/kg. Einkorn prezintã o concentraţie medie de α- şi β-caroten de 66 µg/kg şi 576 µg/kg, în timp ce în probele de Rosadur, Kamut şi Toronit concentraţia de α-caroten a variat între 20-40 µg/kg iar β-caroten 36-46 µg/kg, valorile exprimate ca medie a anilor 20042007. Concentraţia de zeaxantinã a fost deasemenea identificatã în toate probele analizate cu variaţii minore cuprinse între 0.21-0.38 mg/kg. Conţinutul în carotenoide al cerealelor depinde de condiţiile de cultivare din anul de recoltare. Pe aceeaşi varietate s-au observat variaţii ale conţinutului de carotenoide (cu mai mult de 25%) între probele recoltate între 2004 şi 2007.

XLI 

Probele din diferitele fracţiuni ale mãcinişului de grâu relevã faptul cã existã o distribuţia diferitã de carotenoide în cereale. Pentru varietãţile Einkorn, Topdur şi Toronit, conţinutul cel mai mare în luteinã a fost identifiat în fracţiunea de fãinã descrescând odatã cu mãrimea particulelor fracţiunii. Einkorn prezintã cantitãţi de luteinã între 6.92 mg/kg în fracţiunea de fãinã, la 3.13 mk/kg în fracţiunea de tãrâţe. Topdur prezintã cantitatea de luteinã de 3.6 mg/kg în fãinã şi 0.92 mg/kg în tãrâţe, în timp ce Toronit prezintã 3.08 mg/kg în fãinã şi 1.18 mg/kg în fracţia de tãrâţe. Concentraţia de zeaxantinã variazã între 0.091 şi 0.37 mg/kg în fracţiunea de măciniş, excepţie fãcând de fãina din proba Toronit unde concentraţia a fost sub limita de detecţie.

XLII 

IV. DETERMINAREA CAROTENOIDELOR ŞI ANTOCIANILOR DIN ORZ
MATERIALE ŞI METODE Probe. Probele de orz colorat şi decorticat au fost furnizate de Staţiunea Experimentală BOKU din Viena. Au fost utilizate următoarele 30 de linii de orz, recoltate în perioada 2007-2008: 8 linii de orz negru decorticat (Boku, BVAL358117, BVAL358163,C661, E360, E604, ICARDA, J307), 7 linii de orz purpuriu decorticat (BVAL350010, BVAL350017, Digersano, HB803, Lawina, Washonubet), 8 linii de orz albastru decorticat (C651, E515, E550, E632, GE-040,I 311, N308, N624) şi 7 liniide orz galben decorticat (HOR 2199, HOR 2593, HOR 3727, HOR 4024, HOR 4940, HOR 11402, N 023). Pentru cuantificarea şi determinarea carotenoidelor, au fost analizate toate cele petru genotipuri colorate de orz, cultivate în ani succesivi 2007 și 2008. Numai genotipurile de orz decorticat negru, albastru şi purpuriu descrise au fost selectate pentru a studia diferentele între profilul lor antocianic. Analiza HPLC. Pentru determianrea carotenoidelor analiza HPLC s-a efectuat cu ajutorul unui cromatograf Agilent Technology model 1090 HP, echipat cu un sistem cu pompe binare, injector automat şi detecţie cu diodă (DAD). Separarea cromatografică a compuşilor a fost obţinută cu ajutorul unei coloane C18 (250 x 4.6mm, 5 μm) GRACEVydac 201TP54. Elutia a fost realizată la temperatura camerei isocratic, având ca şi solvent amestecul de metanol:acetonitril, de puritate HPLC (9:1, v/v) la un debit constant de 0.7 ml/min. Carotenoidele au fost identificate cu ajutorul spectrului lor UV-Vis caracteristic şi prin compararea timpilor de retenţie cu cei ai soluţiilor standard cunoscute. Cromatogramele au fost monitorizate la 450 nm cu un detector DAD. Antocianinii au fost separaţi şi cuantificaţi utilizând un cromatograf Agilent seria 1100, echipat cu pompe cuaternare, injector automat, thermostat pentru controlul temperaturii coloanei, degazor şi detector cu fotodiodă (PDA). Pentru separarea compuşilor a fost utilizată o coloană Luna C-18 column (Phenomenex) (250 x 4.6mm, 5 μm). Eluţia a fost relizată la 350C pentru a îmbunătăti separarea. Coloana a fost eluată cu

XLIII 

un faza mobilă în gradient constând în (A) 4.5% acid formic and (B) acetonitrile absolut cu un debit de 0.8 ml/min. Gradientul a fost programat după cum urmează: 0-9 min, 1012% B; 9-16.5 min,12- 13% B; 16.5-30 min, 13-25% B; 30-45 min, 25-90% B; 45-50 min, 90% B; 50-55 min, 90-10% B; şi 55-60 min, menţinut cu 10% B. Antocianii separaţi au fost detectaţi şi măsuraţi la 520 nm, iar antocianii identificaţi au fost la fost în concordanţă cu timpii de retenţie şi spectrul UV-Vis al standardelor autentice pure.

REZULTATE ŞI DISCUŢII Analiza cantitativă a carotenoidelor în genotipurile de orz Distribuţia calitativă şi cantitativă a luteinei şi zeaxantinei în probele de orz a fost determinată prin HPLC cu fază inversată, utilizând o coloană Luna C-18. Această coloană HPLC a fost cu succes întrebuinţată pentru separarea luteinei şi zeaxantinei în condiţii izocratice. Un profil HPLC specifical xantofilelor şi al extractului de orz este prezentat în Figura IV. 1.
Zeaxanthin
14 16

Zeaxanthin

300000

(a)
Lutein

14000

(b)
12000 10000 8000

250000

200000

Area (mAU)

150000

Area (mAU)

6000 4000 2000

100000

50000

0
0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28

-2000 0 2 4 6 8 10 12 18 20 22 24 26 28 30

Time (min)

Figura IV. 1. Profilul HPLC al standardelor de carotenoide, luteină şi zeaxantină (a) şi cromatograma extractului din proba de orz de culoare purpuriu HOR (b). Figure IV. 1. Carotenoid HPLC profile of an standard mixture of lutein and zeaxanthin (a) and the chromatogram of HOR 4024 purple barley extract (b).

XLIV 

Lutein

Time (min)

Analiza carotenoidelor din orz Determinarea autenticității genotipurilor de orz s-a făcut prin realizarea amprentei carotenoidelor folosindu-se metoda HPLC. În acest rezumat am evaluat conținutul în carotenoide doar al genotipului de culoare neagră ca fiind cel mai relevant din punct de vedere al concentrațiilor de luteină. Celelalte genotipuri au fost tratate pe larg in capitolul VII al tezei. Ca o privire generală, Tabelul IV. 1 prezintă conţinutul de luteină şi zeaxantină din patru genotipuri de orz negru, albastru, galben şi purpuriu studiate, cultivate in anii 2007 şi 2008. Tabel IV. 1 Compararea conţinutului de carotenoide mg/kg (luteină şi zeaxantină) în genotipuri de orz de culoare neagră, galbenă, albastră şi purpuriu din probe recoltate în anul 2007 şi 2008. Table IV. 1 Comparation of carotenoid content mg/kg (lutein and zeaxanthin) in black, yellow, blue and purple barley genotype samples harvested in 2007 and 2008.
Black barley [mg/kg] Orz negru [mg/kg] BOKU SNG 04 BVAL 358117 BVAL 358163 C 661 E 360 E 604 ICARDA J 307 Yellow barley [mg/kg] Orz galben [mg/kg] BVAL 350010 BVAL 350017 DIGERSANO HB 803 LAWINA WASHONUBET U 347

Lutein 2007 4.60 9.32 4.97 4.99 1.88 5.15 8.11 2.67

Zeaxanthin 2007 3.47 3.19 3.17 3.51 2.45 3.12 3.43 4.89

Lutein 2008 7.91 3.94 8.38 10.93 3.95 7.71 9.33 12.32

Zeaxanthin 2008 4.34 2.32 4.58 5.75 2.77 4.55 5.65 6.78

3.67 2.84 3.29 3.52 3.15 3.16 4.77

2.87 3.26 3.52 3.05 3.14 2.68 4.16

7.13 3.51 3.01 6.13 4.60 9.39 -

3.84 2.35 1.75 4.91 2.44 4.83 -

XLV 

Blue barley [mg/kg] Orz albastru [mg/kg] C 651 E 515 E 550 E 632 GE 040 I 311 N 308 N 624 Purple barley [mg/kg] Orz purpuriu [mg/kg] HOR 2199 HOR 2593 HOR 3727 HOR 4024 HOR 4940 HOR 11402 N 023

Lutein 2007 3.01 1.86 2.64 2.54 1.34 2.57 1.42 3.88 Lutein 2007 1.81 2.66 2.16 2.24 2.87 4.09 3.42

Zeaxanthin 2007 3.28 2.00 2.66 2.99 2.96 2.82 2.78 3.56 Zeaxanthin 2007 2.24 2.39 2.74 2.21 2.62 3.38 3.35

Lutein 2008 4.60 5.92 8.65 4.04 4.57 5.09 3.13 5.23 Lutein 2008 4.61 3.37 4.11 4.93 4.95 5.26 5.64

Zeaxanthin 2008 4.03 2.76 4.00 1.76 3.02 2.66 2.33 3.07 Zeaxanthin 2008 3.15 2.39 3.32 3.45 2.88 3.70 3.86

Dacă analizăm anul de recoltare 2007, cel mai mare conţinut de luteină a fost determinat în varietatea BVAL 358117 cu o concentraţie de 9.3 mg/kg substanţă uscată (s.u), urmată de probele ICARDA cu un conţinut de luteină de 8.1 mg/kg s.u. Probele BOKU SNG, BVAL 358163, C661 şi E 604 au valori similare pentru conţinutul de luteină: 4.6 mg/kg, 4.9 mg/kg, 4.9 mg/kg şi 5.1 mg/kg. Conţinutul de zeaxantină din probele de orz negru variază între 2.4 mg/kg şi 4.8 mg/kg cu o medie de 3.4 mg/kg. Comparând concentraţia de carotenoide distribuite în toate varietățile de orz, se poate observa ca aproape toate probele prezintă cantităţi similare de zeaxantină, 3.3 mg/kg, cu două excepţii, E 360 şi J 307 unde concentrţia este de 2.4 mg/kg respectiv 4.8mg/kg. În concluzie varietatea de orz negru BVAL 358117 are cea mai mare cantitate de carotenoide (luteină şi zeaxantină) comparând cu celelalte şase varietăţi studiate. Dacă analizăm anul de cultură 2008, cel mai ridicat conţinut de luteină a fost găsit în proba J 307 cu 12.3 mg/kg s.u urmat de C 661 unde conţinutul de luteină a fost de 10.9 mg/kg. Cel mai scăzut conţinut de luteină a fost determinat in probele de orz negru BVAL 358117, acestea având un conţinut de 3.9 mg/kg.

XLVI 

Concentrţiile de zeaxantină din probele de orz negru, cultivat în 2008 variază ca medie între 2.3 mg/kg în proba BVAL 358117 şi 6.8 mg/kg în proba J 307. Concluzionând, au fost găsite diferenţe semnificative în conţinutul de pigmenţi carotenoidici, luteină și zeaxantină între genotipuri şi între anii cultivării. În general, analiza conţinutului de carotenoide din genotipurile de orz negru, galben, albastru şi purpuriu este influenţată de condiţiile climaterice, aşadar extractele din anul 2008 conţin cantintăţi mai mari de pigmenţi carotenoidici comparativ cu anul 2007 de pâna la 30%.

Separarea cromatografică a antocianilor din probele de orz prin metoda HPLC Figura IV.2 reprezintă separarea unui amestec de nouă standarde de antociani puri, cianidin-3-galactozid, cianidin-3-glucozid, delfinidin-3-ramnozid, pelargonidin-3glucozid, delfinidin, peonidin-3-glucozid, malvidin-3-glucozid, cianidin şi respectiv malvidin, în 35 min la 520 nm. Cromatograma LC a extractului de orz purpuriu separată la 35°C este prezentată în Figura IV.3. Cromatograma extractului de orz purpuriu prezintă o bună separare a antocianilor: cianidin-3-glucozid, pelargonidin-3-glucozid, delfinidin, peonidin-3-glucozid și cianidină prezenți în probă, detectați la 520 nm..

XLVII 

Malvidin

250000
Delphinidin rhamnoside Peonidin glucoside Delphinidin

300000

250000
Cyanidin

Cyanidin glucoside

Pelargonidin glucoside

Cyanidin galactoside

200000

Malvidin glucoside

200000

Area (mAU)

150000

Cyanidin glucoside

150000

Area (mAU)

100000

Delphinidin

100000

Pelargonidin glucoside

Peonidin glucoside

50000

50000

0 0 10 20 30

0 0 10 20 30

Time(min)

Time (min)

Figura IV.2. Separarea HPLC a noua standarde de antociani: cianidin-3galactosid, cianidin-3-glucosid, delphinidin-3-ramnosid, pelargonidin-3glucosid, delphinidin, peonidin-3-glucosid, malvidin-3-glucosid, cianidină şi malvidină Figure IV.2. HPLC separation of pure standards of anthocyanins: cyanidin-3galactoside, cyanidin-3-glucoside, delphinidin-3-rhamnoside, pelargonidin-3glucoside, delphinidin, peonidin-3glucoside, malvidin-3-glucoside, cyanidin and malvidin.

Figura IV.3. Cromatogramă relevantă a unui extract de antociani din varietatea de orz de culoare purpuriu: cianidin-3glucosid, pelargonidin-3-glucosid, delfinidin, peonidin-3-glucosid şi cianidin înregistrata la 520 nm. Figure IV.3. A relevant chromatogram of anthocyanins of a purple variety of barley extract: cyanidin-3-glucoside, pelargonidin-3-glucoside, delphinidin, peonidin-3-glucoside and cyanidine at 520 nm.

Analiza cantitativă a antocianilor din probele de orz negru, albastru şi purpuriu Autenticitatea genotipurilor de orz negru, albastru și purpuriu s-a facut folosinduse ca și markeri conținutul în antociani. În studiul nostru, media conţinutului total de antociani din genotipul negru a fost de 45.87 mg/kg (1.17 mg/kg cianidin glucozid, 3.38 mg/kg pelargonidin glucozid, 17.69 mg/kg delfinidin, 1.35 mg/kg peonidin glucozid şi 22.27 mg/kg cianidin), comparativ cu cercetările lui Mi-Jung Kim. Antocianii totali din probele de orz negru variază de la 2.71 mg/kg în ICARDA la 91.87 mg/kg în varietatea C 661. Studiile de literatură raportează că,genotipul de orz purpuriu şi albastru conţin cantităţi mai mari de antociani decât genotipul negru. Această caracteristică este confirmată şi de studiul nostru.

XLVIII 

Cyanidin

Antocianii totali cuantificaţi din varietatea de orz albastru din studiul nostru au fost 86.89 mg/kg (1.01 mg/kg cianidin glucozid, 2.43 mg/kg pelargonidin glucozid, 37.52 mg/kg delfinidin, 3.5 mg/kg peonidin glucozid şi 42.42 mg/kg cianidin). Cel mai scăzut conţinut de antociani totali a fost găsit în proba N 624 (3.94 mg/kg), în timp ce cel mai mare conţinut de a fost calculat pentru proba de orz C 651 cu o medie de 146.79 mg/kg antociani totali. Rezultatele concentraţiilor de antociani din diferite genotipuri de orz purpuriu sunt reprezentate în Tabelul IV. 2. Tabel IV. 2 Concentraţia de antociani (mg/kg) determinată prin metoda HPLC în pobe de orz din genotipul de culoare purpuriu Table IV. 2 Anthocyanins concentrations (mg/kg) detected by HPLC in purple barley genotypes
Probe de orz purpuriu mg/kg Purple barley samples mg/kg HOR 2199 HOR 2593 HOR 3727 HOR 4024 HOR 4940 HOR 11402 N 023 Cianidin glucozid media±SD Cyanidin glucoside mean ±SD 8.13±0.01 9.98±0.96 16.1±1.2 52.9±1.04 13.71±0.66 11.69±0.42 0.69±0.01 Pelargonidin glucozid media±SD Pelargonidin glucoside mean ±SD 2.68±0.03 2.17±0.06 4.27±0.28 11.55±0.27 4.92±0.21 4.3±0.12 0.93±0.05 Delfinidin media±SD Delphinidin mean ±SD 61.97±1.67 162.11±5.52 50.43±2.6 77.65±2.65 190.81±7.7 155.64±3.12 50.08±2.73 Peonidin glucozid media±SD Peonidin glucoside mean ±SD 39.23±0.01 27.41±1.04 113.63±7.35 198.88±5.54 45.18±0.74 42.15±1.79 Cianidin media±SD Cyanidin mean ±SD 28.17±1.96 38.74±1.97 28.65±0.44 92.27±2.18 52.82±2.7 44.4±0.98 19.11±0.36

Media conţinutului de antociani în probele de orz purpuriu studiate a fost de 237.49 mg/kg (16.17 mg/kg cianidin glucozid, 4.4 mg/kg pelargonidin glucozid, 106.8 mg/kg delfinidin, 66.6 mg/kg peonidin glucozid and 43.45 mg/kg cianidin).

XLIX 

Antocianii toatali din probele de orz purpuriu variză de la 70.81 mg/kg în proba N 23 la 433.25 mg/kg în varietatea HOR 4024. Concluzionand, diferenţe semnificative în conţinutul de antociani au fost identificate între genotipuri. Cel mai mare conţinut de antociani a fost găsit în orzul purpuriu, urmat de genotipurile de orz albastru şi negru, fiind în concordanţă cu literatura.

CONCLUZII Conţinutul de carotenoide, luteină și zexantină, depinde de genotip, varietate şi condiţii climatice. Luteina şi zeaxantina au fost analizate din patru genotipuri de orz negru, galben, albastru şi purpuriu din doi ani de cultivare 2007 şi 2008. Genotipul de orz cu cel mai mare conţinut de carotenoide a fost identificat a fi orzl negru cu un conţinut mediu de 8.06 mg/kg pentru luteină şi 4.6 mg/kg pentru zeaxantină. Din varietăţile de orz negru, proba J 307 are o concentrţe de luteină de 12.3 mg/kg şi 6.78 mg/kg pentru zeaxantină. Cea mai scăzută cocnentraţie de carotenoide a fost determinată în genotipurile albastru şi purpuriu cu o medie de 2.5 mg/kg luteină şi 2.7 mg/kg zeaxantină. Probele cultivate în 2008 au cel mai mare conţinut de carotenoide mai mare de 30% dintre tate probele analizate din anul 2007. Continutul de antociani din orz, stabilit în acest studiu este in concordanţă cu alte studii pe alte varietăţi ale aceloraşi genotipuri. În contrast cu cantităţile de carotenoide identificate, orzul negru conţine cea mai mică cantitate de antociani. Cel mai mare conţinut de antociani a fost identificat în orzl purpuriu (237.49 mg/kg), descrescând în următoarea ordine: orz albastru (86.89 mk/kg) şi orz negru (45.87 mg/kg).

Genotipul cu cea mai mare varietate de antociani (cianidin glucozid, pelargonidin glucozid, delfinidin, peonidin glucozid şi cianidin), este orzul purpuriu, în timp ce varietatea cea mai săracă în antociani este orzul negru.

LI 

BIBLIOGRAFIE

1. Abdel-Aal, E. S. M., J. C. Young, P. J. Wood, I. Rabalski, P. Hucl, D. Falk and J. Fregeau-Reid (2002), Einkorn: A potential candidate for developing high lutein wheat, Cereal Chemistry 79:(3) 455-457.

2. Kim, M. J., J. N. Hyun, J. A. Kim, J. C. Park, M. Y. Kim, J. G. Kim, S. J. Lee, S. C. Chun and I. M. Chung (2007), Relationship between phenolic compounds, anthocyanins content and antioxidant activity in colored barley germplasm, Journal of Agricultural and Food Chemistry 55:(12) 4802-4809.

3. Siebenhandl, S., H. Grausgruber, N. Pellegrini, D. Del Rio, V. Fogliano, R. Pernice and E. Berghofer (2007), Phytochemical profile of main antioxidants in different fractions of purple and blue wheat, and black barley, Journal of Agricultural and Food Chemistry 55:(21) 8541-8547.

4. Irudayaraj, J. and J. Tewari (2003), Simultaneous monitoring of organic acids and sugars in fresh and processed apple juice by Fourier transform infrared-attenuated total reflection spectroscopy, Applied Spectroscopy 57:(12) 1599-1604.

5. Esbensen, K. H., D. Guyot, F. Westad and L. P. Houmøller (2002). Multivariate Data Analysis - in practice, Camo Process AS.

LII 

Sign up to vote on this title
UsefulNot useful