République algérienne démocratique et populaire.

Université Djillali Liabes Faculté de Médecine Département de Pharmacie

TP N°02 Dosage des protéines totales plasmatique.
Réalisée par: • GHERMI Mohamed. • TAHRI Mahmoud. • CHAREF KHODJA Meriem. • BETTAYEB Mohamed Amine. 4 ème année pharmacie G05. Année universitaire : 2008 / 2009

TP N° 02

DOSAGE DES PROTEINES TOTALES PALSMATIQUES

I-

Généralités :

Les protéines représentent la plus grande partie des matières solides du plasma. En dehors du fibrinogène, protéine fibreuse, ce sont toutes des protéines globulaires. Seule la sérumalbumine est une holoprotéine, toutes les autres étant des hétéroprotéines pouvant contenir des lipides (lipoprotéines), des métaux (métalloprotéines) et surtout des glucides, la plupart des protéines plasmatiques sont en effet des glycoprotéines. Leurs propriétés sont très variables : transporteurs, anticorps, enzymes, agents de pression oncotique, marqueurs de l'inflammation, marqueurs tumoraux, agents de la coagulation, facteurs de croissance, etc. Mais il faudra différencier les protéines toujours présentes dans le plasma, éléments constitutifs de celui-ci et celles, d'origine cellulaire, n'y apparaissant que transitoirement.

Maintien de la pression oncotique. • Molécules présentent en grande quantité • Molécules ayant des propriétés physico-chimiques particulières. • Représentant principal est la sérum albumine, les globulines et notamment l’αglobulines. Fonction de transport. • Assurée par l’albumine et de nombreuses globulines relativement spécifiques vis-àvis de leur ligand plus ou moins spécifique. • Les globulines sont plus spécifiques dans leur ligand. Rôle inhibiteur de protéases • Permettent de limiter l’action des protéases libérées dans le sang par des cellules. • Inhibent des protéases par des mécanismes diverses. Rôle de cofacteur d’enzyme. • Exemple : α1-glycoproteine acide ou orosomucoïde : Cofacteur de la lipoprotéine lipase.
1 RAFUNIT© - UDL - Pharmacie.

TP N° 02

DOSAGE DES PROTEINES TOTALES PALSMATIQUES

Rôle dans la coagulation. • Exemple : - Le fibrinogène : glycoprotéine asymétrique et de grande taille. - Protéines C, - Protéines S, - … etc. Rôle dans l’immunité. • Les immunoglobulines. • Les fractions protéiques du complément. • Toutes les protéines impliquées dans la transmission de l’information.

II-

Exploration des protéines :
L'exploration des protéines plasmatiques est réalisée par le dosage individuel de telle ou telle protéine, par le regroupement de quelques dosages, sous le terme de profil protéique, par l'électrophorèse qui peut être faite sur des supports différents et enfin par l'étude éventuelle d'une protéinurie. Méthodes colorimétriques Électrophorèse des protéines Dosages immunologiques – Turbidimètriques – Néphélémètriques – Immunoenzymologiques

1. Réaction de Biuret
1. 1. Principe :
En milieu alcalin, les ions cuivriques donnent avec les liaisons peptidiques un complexe de coloration violet-pourpre. L’intensité de la coloration est proportionnelle à la concentration des protéines. Cette coloration est mesurée par spectrophotométrie en lumière visible. C’est une méthode simple, rapide et fiable mais peu sensible.

2. Fractionnement des protéines sériques
2. 1. Méthodes électrophorétiques :
Elles se fondent sur la charge électrique des protéines en solution et sur leur mobilité. Les protéines, substances amphotères, possèdent à la fois des charges positives et négatives et selon le pH de la solution, elles se comportent comme possédant soit plus de charges positives, soit plus de charges
2 RAFUNIT© - UDL - Pharmacie.

TP N° 02

DOSAGE DES PROTEINES TOTALES PALSMATIQUES

négatives. La migration des protéines sous l’influence du champ électrique sera donc fonction du pH.

2. 2. Méthode d’immunodifusion Méthode d’Oudin ou d’immunodiffusion simple
On incorpore l’anticorps à la gélose dans un tube; à la surface on dépose l’antigène, celui-ci diffuse. Le contact antigène-anticorps s’effectue et une ligne de précipitation s’établit. C’est la première méthode immunologique en milieu solide.

Méthode d’Ouchterlony ou de double diffusion
On utilise un bloc de gélose dans lequel on perce trois godets. Dans l’un on place une préparation contenant un antisérum et dans les deux autres on place deux antigènes. Les molécules diffusent dans la gélose en fonction de leur taille et forment des lignes de précipitation pour chaque système antigèneanticorps correspondant à leur zone d’équivalence respective c’est à dire à la formation d’un réseau Ag-Ac.

Méthode d’immunodiffusion radiale ou de Mancini
Elle sert à l’estimation quantitative d’un antigène. Elle fait appel à une immunoprécipitation en gel d’agarose entre l’antigène et un anticorps connu.

2 3. Méthodes d’immunoélectrophorèse Définition
L’immunoélectrophorèse, aussi appelée gammaglobuline électrophorèse ou immunoglobuline électrophorèse est une méthode mettant en jeu une séparation électrophorétique des protéines dans un gel d’agarose suivie d’une double diffusion selon une direction perpendiculaire à l’axe de migration électrophorétique contre un antisérum. Chaque zone d’équivalence correspondant à un précipité Ag-Ac se traduit par un arc de précipitation. On peut utiliser des antisérums globaux reconnaissant toutes les protéines majeures du sérum ou des antisérums spécifiques.

Principe
Les protéines sériques sont fractionnées par électrophorèse en gel d’agarose, puis un antisérum est déposé dans une rigole parallèle à l’axe de migration. Les protéines diffusent dans le gel à partir de leur zone de migration, les anticorps à partir de la rigole. Des lignes de précipitations se forment au niveau des zones d’équivalences. Selon sa migration, sa concentration et sa diffusion dans la gélose, et selon la spécificité de l’antisérum utilisé chaque protéine donne lieu à un arc de précipitation dont la forme et la position sont caractéristique.
3 RAFUNIT© - UDL - Pharmacie.

TP N° 02

DOSAGE DES PROTEINES TOTALES PALSMATIQUES

Intérêt
L’immunoélectrophorèse est une méthode permettant d’étudier toutes les protéines, une catégorie de protéines ou une protéine particulière, si on utilise respectivement un antisérum, un anticorps spécifique d’un mélange de protéines ou d’une protéine. Elle est surtout utilisée pour les immunoglobulines. Elle est utilisée dans le diagnostic des myélomes multiples et dans le diagnostic de beaucoup de maladies du système immunitaire et dans l’évolution des réponses thérapeutiques. Les différentes méthodes utilisées sont : • Méthode de Williams et Grabar C’est une combinaison de l’électrophorèse en gélose ou en agarose, avec une réaction de précipitation spécifique antigèneanticorps: on réalise d’abord une électrophorèse en milieu gélifié à pH 8,2 sur une plaque recouverte d’un gel d’agarose, puis on dépose dans une gouttière centrale un immuno sérum antiprotéine humaine et on laisse diffuser. On observe alors des arcs de précipitations, très nets, correspondant chacun à une fraction protéique particulière. La migration électrophorétique sépare particulièrement les protéines. Le sérum de cheval antiprotéique humain mis dans la gouttière contient des anticorps spécifiques; ceux ci mis au contact du même antigène ayant migré par électrophorèse dans le gel, donnent après diffusion un arc local.

4

RAFUNIT© - UDL - Pharmacie.

TP N° 02

DOSAGE DES PROTEINES TOTALES PALSMATIQUES

Méthode de Laurel On dépose différentes dilutions de protéines antigéniques dans des puits creusés dans un gel d’acrylamide agarose contenant l’antisérum. Le courant électrique est appliqué perpendiculairement à la ligne des godets. Les précipités triangulaires sont proportionnels à la quantité d’antigène.

3. Autres méthodes : • Méthode au BCA (acide bicinchonique) 1970 :
Technique ayant une très bonne limite de détectabilité et facile à mettre en oeuvre. •

Mesure directe de l’absorbance (λ = 280 nm):
Aminoacides aromatiques ou λ = 210 nm : liaisons peptidiques) très bonne limite de détectabilité (0,1 gL-1) mais utilisable uniquement sur des solutions parfaitement limpides.

Méthodes utilisant la fixation de colorants sur les protéines
avec modification de la couleur : Technique au méthylorange (hélianthine). Technique au vert de bromocrésol. Technique de Bradford (1976) : Bleu de Coomassie :
Le bleu de Coomassie se lie à l'arginine (Arg, R), la tyrosine (Tyr, Y), le tryptophane (Trp, W), l'histidine (His, H) et la phénylalanine (Phe, F) (surtout à R; huit fois plus qu'aux autres en fait). En solution, il a une forme cationique rouge qui absorbe à 470nm. Lié aux protéines, il a une forme anionique bleue qui absorbe à 595nm. La méthode de Bradford est encore plus sensible que celle de Lowry (0,2 — 20 µg de protéines).

5

RAFUNIT© - UDL - Pharmacie.

TP N° 02

DOSAGE DES PROTEINES TOTALES PALSMATIQUES

Méthode de Lowry (1951) :
Limite de détection 100 fois plus faible que celle de biuret mais dont la précision n’est que de l’ordre de 5 à 10 % (la loi de Beer Lambert ne semble pas tout à fait respectée et la spécificité est diminuée par l’interférence de nombreux dérivés ; réducteurs en particuliers).

III- Application TP « ECH N°56 » :
La méthode utilisée est celle de Biuret. 1- Rappel : En milieu alcalin (NaOH), à froid, les ions cuivriques (Cu2+) forment avec les liaisons peptidiques un complexe de coordination coloré en rose, qui ajouté à la teinte bleue du réactif donne finalement une coloration pourpre (bleu-violet). Cette réaction est positive dès que la molécule possède 3 à 4 liaisons peptidique,s elle est donc utilisable pour les protéines et les polypeptides. La mesure de l’absorbance se fait à 540 nm après avoir laissé la coloration se développer 30 min. La technique tire son nom de la molécule le biuret NH2–CO–NH–CO–NH2 (obtenu par condensation de 2 molécules d’urée NH2–CO–NH2) qui donne une la coloration violette. La technique a été développée par Gornall (1949) qui a laissé son nom au réactif utilisé pour la colorimétrie.

2- Préparation des réactifs :
• R1 :
Tartrate de Na+, K+, 4H20 (160mmol/l): MM = 282,23 g/mol V= 200 ml. M = X. n= 160 * 200/1000 = 32 mmol ; X= 32. 10-3 * 282,23 = 9,03136 g.

Sulfate de Cu, 5H20 (20mmol/l) : MM = 249,69 g/mol V= 200ml. M= Y. n= 20 * 200/1000 = 4 mmol ; Y= 4.10-3 * 249,69 = 0,99876 g Iodure de K+ (30mmol/l): PM= 166g/mol V= 200ml M= Z. Z= 30.10-3*0,2*166 = 0,996 g.
6 RAFUNIT© - UDL - Pharmacie.

TP N° 02

DOSAGE DES PROTEINES TOTALES PALSMATIQUES

NaOH (0,2N) : PM= 40g/mol V=200ml M= W W= 0,2*0,2*40 = 1,6 g.

• R2 :
Iodure de K+ (30mmol/l) qsp 200ml : M= 0,996g. NaOH(0,2N) qsp 200ml : M= 1,6g. La solution de travail correspond au mélange des deux réactifs dans les proportions suivantes : 1 volume R1 + 4 volumes R2 (30ml R1 + 120ml R2)

3- Mode opératoire :
Le tableau suivant résume les étapes procédées lors de ce TP : Blanc 100 µl Etalon 100 µl 5 ml 5 ml 100 µl 5 ml Echantillon

Eau distillée (ED) Etalon Echantillon Solution de W

Après avoir ajouté la solution de travail : • Bien mélanger ; • Laisser à température ambiante pendant 30mn ; • Lecture au spectrophotomètre à λ = 546 nm. Remarque : La concentration de l’étalon [Etalon] = 80 g/l ; L’échantillon utilisé est le N° 56.

4- Résultats & valeurs normales:
a- Résultats :
Les résultats obtenus sont présentés sur ce tableau :

Etalon Absorbance (D0) 0,213

Echantillon 0,162

7

RAFUNIT© - UDL - Pharmacie.

TP N° 02

DOSAGE DES PROTEINES TOTALES PALSMATIQUES

[ech] = [ech] =
, ,

* [Etalon]. * 80.

[ech] = 60, 845 g/l. b- Valeurs normales :
• Sang :

• LCR (Protéinorachie): 0,28 < N < 0,52. • Urine (Protéinurie) : 50 < N < 150 mg/24H. • Liquide d’épanchement : - Transsudat : de 10 à 20 g/l ; - Exsudat : > 25 g/l.

c- Interprétation des résultats :
Les résultats obtenus lors de ce TP concernant le dosage de la protéinémie du sujet (N°56) peuvent être interprétés de la manière suivante : Si le sujet N°56 est un enfant, la valeur obtenue de la protidémie (≈ 61g/l) est dans les normes usuelles ; Si le sujet est un adulte, il serait en dessous de la limite inférieur des normes usuelles (Hypo-protidémie), il faudra interpréter selon le contexte clinique et faire éventuellement des examens complémentaires tels que :
8 RAFUNIT© - UDL - Pharmacie.

TP N° 02

DOSAGE DES PROTEINES TOTALES PALSMATIQUES

- Electrophorèse sur gel ; - immuno-électrophorèse ; - dosage spécifique des protéines plasmatique ; - dosage de la protéinurie ; -… Les principales causes d’une hypo-protidémie (jusqu’à 15g/l) sont les suivantes : à une carence d'apport en protéines, à une malabsorption intestinale des protéines (insuffisance pancréatique) ; à un défaut de synthèse lors d'une insuffisance hépatique sévère (pathologies hépatiques, alcoolisme et hépatite chronique) ou d'un déficit en immunité humorale ; à un catabolisme accéléré (dénutrition sévère, néoplasie) ; à une fuite anormale des protéines en cas de pertes extériorisées (hémorragies aiguës), cutanées (brûlures), intestinales (entéropathies exsudatives, hémorragies digestives) ou rénales (syndromes néphrotiques, glomérulonéphrites). L'apparition d'une protéinurie rénale massive accompagne l'hypoprotidémie en cas de pertes rénales ; à une modification du volume de distribution. Dans les syndromes inflammatoires généralisés secondaires à un état de choc, sepsis ou traumatisme, l'augmentation de la perméabilité capillaire s'accompagne d'une fuite des protéines vers l'espace interstitiel. Un excès d'apport hydrique peut faire chuter rapidement la concentration des protéines surtout chez les prématurés et N.N. Certains traitements tels que la dialyse péritonéale peuvent également induire une baisse de la concentration des protéines lorsqu'ils sont utilisés de manière prolongée. Cependant les hyper-protidémie peuvent être dues à : le plus souvent à une diminution du volume plasmatique (déshydratation extracellulaire) observée en cas de pertes liquidiennes, diabète insipide et hypertension artérielle ; à une augmentation de la synthèse des gammaglobulines polyclonales observées dans certaines pathologies auto-immunes et syndromes inflammatoires chroniques (le lupus érythémateux disséminé, les maladies du collagène, le rhumatisme articulaire aigu). Certaines hyperprotidémies peuvent dépasser 120 g/l en cas de synthèse de gammaglobulines monoclonales observées dans les contextes de gammapathies monoclonales (myélomes).
9 RAFUNIT© - UDL - Pharmacie.

Sign up to vote on this title
UsefulNot useful