Actividades Prcticas 2011

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MDULO PRCTICO: INTRODUCCIN A LAS TCNICAS INMUNOQUMICAS Objetivo general del prctico.
El objetivo general del prctico es introducir al estudiante los fundamentos tericoprcticos de dos tcnicas inmunolgicas ampliamente utilizadas, ELISA y WB. Se espera que mediante la realizacin de ambas tcnicas, conjuntamente con el marco terico que acompaa el mdulo prctico, el estudiante adquiera los conceptos bsicos que subyacen a los inmunoensayos as como su potencialidad en Medicina, Clnica, y Biologa, tanto prctica como bsica. Como marco de referencia para la introduccin a este prctico sobre herramientas inmunoenzimticas, usamos la infeccin por VIH-SIDA. La eleccin de esta enfermedad como ejemplo para el prctico se basa en i) la relevancia mdica de esta epidemia a nivel mundial y en nuestro Pas (segn el Ministerio de Salud Pblica al final de 2007 existan 7,168 casos acumulados, y un total de 10,324 individuos seropositivos); y ii) el enorme impacto de las tcnicas inmunoqumicas en el diagnstico de la infeccin, lo cual resulta fundamental tanto para la prevencin como para el monitoreo de pacientes infectados que estn recibiendo tratamiento. Por tanto, en una primera parte se resumen las caractersticas salientes del virus VIH y las metodologas y criterios usados para el diagnstico de la infeccin. En una segunda parte se presenta el trabajo prctico a realizar, el cual estar basado en las metodologas inmunoqumicas aplicadas para el diagnstico de VHI-SIDA. De esta manera, se pretende que el estudiante de Medicina se acerque por primera vez al potencial de los inmunoenzayos en el contexto de una enfermedad actual, sin cura, y para la cual las herramientas que se vern en la actividad prctica son las mismas que se aplican en la prctica mdica.

Introduccin:
Los anticuerpos en el rea biomdica. El sistema inmune de los organismos vertebrados, tiene la notable capacidad de producir anticuerpos capaces de reconocer en forma especfica cualquier compuesto extrao con el cual sea desafiado. As, ante una infeccin (viral, bacteriana, o incluso la entrada de

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cualquier sustancia extraa), el sistema inmune responde produciendo anticuerpos capaz de unirse a la sustancia invasora, neutralizndola y facilitando su eliminacin y destruccin. Los mecanismos por los cuales el sistema inmune logra generar anticuerpos especficos ya fueron discutidos en el terico. La capacidad de generar anticuerpos especficos, de alta afinidad, contra cualquier molcula la cual el sistema inmune nunca se ha encontrado, se ha usado experimentalmente para producir anticuerpos en animales. Tpicamente se usan ratones y conejos para la produccin de anticuerpos monoclonales y antisueros, e incluso caballos para la produccin de suero antiofdico. Las propiedades de los anticuerpos (especificidad, afinidad) los convierte en reactivos moleculares muy valiosos, con una gigantesca variedad de aplicaciones en ciencia bsica y medicina. En medicina, el desarrollo de anticuerpos altamente especficos contra un antgeno dado, tiene un impacto enorme en el rea diagnstica en particular, mientras que a nivel clnico su relevancia como agentes teraputicos aumenta rpidamente.

Un modelo de alto impacto social para la introduccin a las tcnicas inmunoqumicas: VIH-SIDA. Un ejemplo del impacto de los anticuerpos en medicina, entre muchos otros, es el inmunodiagnstico de la infeccin con el virus de la inmunodeficiencia humana, (VIH). El VIH es un virus perteneciente a la familia Retroviridae, subfamilia Lentivirinae. Se han identificado dos formas geneticamente diferentes: VIH-1 y VIH-2, pero compartiendo algunos antgenos que son diferenciados por tcnicas especficas. Desde el punto de vista morfolgico es un virin esfrico de 100 200 nm de dimetro (fig. 1), con una nucleocpside electrondensa en forma de cono, rodeada de una bicapa lipdica que proviene de la membrana de la clula husped, donde se insertan protenas virales constituidas por molculas de glicoprotena 120 (gp 120) unida no covalentemente a una protena que integra la membrana, la glicoprotena 41 (gp 41). La nucleocpside encierra dos copias de ARN y tres enzimas virales (proteasa, transcriptasa reversa e integrasa) fundamentales para el ciclo biolgico del virus. Este ARN est constitudo por 3 genes estructurales (gag, pol y env) y por otros genes (tat, rev, vif, nef, vpr y vpu) encargados de la regulacin de la sntesis y replicacin viral. Los genes gag, pol y env codifican protenas precursoras que sern divididas por la accin de la proteasa formando protenas estructurales. Sobre esta proteasa actan frmacos

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muy efectivos, que inhiben la accin de esta enzima impidiendo formar las protenas estructurales virales (inhibidores de proteasa). La infeccin se inicia cuando una partcula viral completa toma contacto con una clula con receptor CD4, uniendose fuertemente a ste a travs de la gp 120. Actualmente se sabe que es necesaria la presencia de otros correceptores, receptores para quemoquinas (CXCR-4, CCR-5), para mediar la fusin del virus a las clulas. Dentro de los nuevos frmacos antiretrovirales, se encuentran los inhibidores de fusin y los inhibidores de unin a los receptores de quemoquinas. Durante el ciclo viral, en el citoplasma celular, la enzima transcriptasa reversa convierte el ARN viral en ADN copia para que luego se pueda integrar al genoma de la clula husped. Tambin sobre esta enzima actan varios frmacos inhibiendo la funcin de retrotranscripcin (inhibidores de la trancriptasa reversa). La accin de esta enzima impidiendo formar las protenas estructurales virales (inhibidores de proteasa). La infeccin se inicia cuando una partcula viral completa toma contacto con una clula con receptor CD4, uniendose fuertemente a ste a travs de la gp 120. Actualmente se sabe que es necesaria la presencia de otros correceptores, receptores para quemoquinas (CXCR-4, CCR-5), para mediar la fusin del virus a las clulas. Dentro de los nuevos frmacos antiretrovirales, se encuentran los inhibidores de fusin y los inhibidores de unin a los receptores de quemoquinas. Durante el ciclo viral, en el citoplasma celular, la enzima transcriptasa reversa convierte el ARN viral en ADN copia para que luego se pueda integrar al genoma de la clula husped. Tambin sobre esta enzima actan varios frmacos inhibiendo la funcin de

retrotranscripcin (inhibidores de la trancriptasa reversa).

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La infeccin por VIH tiene un fuerte impacto social, que mancomuna la accin del Ministerio de Salud Pblica (MSP), la Administracin de Servicios del Estado (ASSE), Instituciones de Asistencia Mdica Colectiva, y la UdelaR (particulamente la Facultad de Medicina). Segn informe del MSP, nuestro Pas ha logrado la meta de 100% del tratamiento con anti-retrovirales a pacientes afectados con VIH-SIDA, lo cual constituye un mrito de reconocimiento internacional. Esto se debe en gran medida a la incorporacin de metodologas rpidas de alta especificidad, que permiten realizar un diagnstico preciso en etapas tempranas de la infeccin. En particular, es destacable la accin de equipos de salud destinados a identificar protocolos de diagnstico/terapia adecuados al conjunto de pacientes con distintas situaciones clnicas, como ser mujeres embarazadas y con resistencia a frmacos de inicio. La aprobacin de estos protocolos as como el subsecuente control de su aplicacin corresponde a la esfera del MSP a travs del Programa Prioritario de ITS/SIDA. En 2005, el MSP design un equipo de Trabajo cuyo objetivo era la elaboracin de Guas de Consenso de utilidad en la prctica clnica, dirigidas a la atencin integral de pacientes afectados por VIH-SIDA. Especficamente, el equipo fue responsable de la integracin y optimizacin de metodologas y criterios diagnsticos, teraputicos, y de prevencin orientados al control de la infeccin. Los protocolos de diagnsticos son realizados actualmente sobre la base de directivas internacionales,

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actualizadas en funcin de la experiencia clnica a nivel nacional y de pases de la regin. A pesar de los avances realizados desde el descubrimiento de la enfermedad, a nivel bsico, diagnstico y medidas teraputicas implementadas, la infeccin por VIH-HIV an contina siendo un grave problema de salud, que ocasiona importantes prdidas humanas con un alto impacto econmico. Si bien actualmente se dispone de frmacos antivirales eficaces y se est lejos de la situacin al inicio de la epidemia, an nos encontramos en un contexto de ausencia de una cura definitiva para la enfermedad. Se han notificado al Programa Nacional de SIDA, desde 1983 al 31 de marzo del 2004, un total acumulado de 7.396 personas positivas, 5.084 personas portadoras (VIH+) y 2.312 enfermos de SIDA en todo el Uruguay. La seroprevalencia del VIH en poblacin general es de 0.36% (MSP-PNS, 2004). El VIH/SIDA en nuestro pas es una epidemia concentrada en poblaciones vulnerables, con una prevalencia, en stas igual o mayor del 5% y menor al 1% en poblacin general (MSP-PNS,2001). Segn diversos estudios la Prevalencia estimada en poblaciones especficas sera de: 6%en reclusos (1993), 21% en travestis (2002), 9.5% en usuarios de cocana no inyectable (2003) y 18.5% en usuarios de drogas inyectables (2004) (Osimani, 2004). Los estudios centinelas (*ver al final de este tem) que se realizan en nuestro pas anualmente desde 1991, mostraron desde 1996, un enlentecimiento del crecimiento anual de la epidemia, un aumento de la participacin de las mujeres y una disminucin de la edad de las personas (MSP, 2001). La informacin registrada en el mbito oficial, da cuenta desde 1983 al 31 de marzo del 2004 de 5.318 de VIH positivos (MSP-PNS, 2004 a). Para junio del 2003, el informe epidemiolgico del PNS-MSP describe a la infeccin de VIH de la siguiente manera:
Edades se registran casos en todos los grupos etarios. Pico de mxima incidencia entre 15y 34 aos. Sexo masculinos 3.343 (68.9%) femeninos 1.512 (31.1%) Distribucin geogrfica Montevideo 3.719 (76.6%), Interior 1.031 (21.2%), No precisada 105 (2.2%) Mecanismos de transmisin Transmisin sexual 3.379 (69.6%) - Homosexuales 528 (15.6%) - Trabajadores sexuales 196 (5.8%) - Bisexuales 488 (14.5%) - Heterosexuales 2.032 (60.1%) - Trabajadoras sexuales 135 (4.0%) Transmisin sangunea 1.027 (21.1%) - Usuarios de drogas inyectables 1.015 (98.8) - Hemoflicos 5 (0.5%) - Transfundidos 6 (0.6%) - Accidentes en personal de salud 1 (0.1%) Transmisin perinatal 78 (1.6%)

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Transmisin no precisada 371 (7.7%) Donantes de sangre Se captaron 571 infectados VIH, desde el inicio del tamizaje (junio/88) hasta la fecha (2004), en un total de 1.032.739 tests de Elisa realizados a los mismos (0.05%)
Fuente: Programa Nacional de SIDA. MSP

En la infeccin VIH en Uruguay (31 marzo del 2004), predomina la transmisin sexual (69.4%), sobre la sangunea (20.4%), seguida por la transmisn perinatal (1.7%). La transmisin sexuales predominantemente heterosexual (65.2%), seguida por la categora de exposicin homosexual (20.4%) y luego la bisexual (14.1%). Es de destacar que el compromiso conjunto de homo/bisexual llega al 34.5% de los infectados por la va sexual. Respecto al sexo, el 68.4% son hombres y el 31.6% mujeres, siendo stas ltimas casi un tercio del total de los VIH+ acumulados en el pas y en permanente aumento. La franja etaria ms afectada est entre los 15-44 aos, con una mxima incidencia entre los 15-34 aos de edad. El 30% de los VIH+ adultos del pas se halla en la franja etaria de 15 a 24 aos de edad (MSP-PNS a, 2004). Por tanto la epidema del VIH-SIDA en Uruguay se ha definido como heterosexual, joven, y cada vez ms femenina.

En nuestro Pas, al igual que a nivel internacional, es considerado un tema prioritario en los Programas de Salud Pblica. Por este motivo, los equipos de salud deben abordar el control de esta enfermedad apuntando a la reduccin del costo humano y econmico, estrategia que tiene dos ejes principales, PREVENCIN y TERAPUTICA. La primera apunta a informar a la poblacin sobre los mecanismos de transmisin del virus, y la manera de evitar la infeccin. La segunda implica la incorporacin/aplicacin de esquemas teraputicos de mxima eficacia, mnimos efectos secundarios, y que aseguren la continuidad del tratamiento. Esto requiere adems la concientizacin social, que permita la adherencia del paciente al plan (aceptacin) para que ste no fracase ni favorezca el surgimiento de cepas resistentes. El xito de los planes teraputicos se relaciona principalmente con su capacidad de disminuir la carga viral a niveles indetectables el mayor tiempo posible. La disminucin sub-ptima de la carga, ya sea por un plan ineficaz o la falta de adherencia de paciente (por negligencia o incapacidad para tolerar la medicacin) aumenta drsticamente la aparicin de variantes virales resistentes a frmacos.

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El diagnstico de VIH es entonces una herramienta crucial tanto para la PREVENCIN (la deteccin temprana de la infeccin aumenta enormemente la posibilidad de xito del esquema teraputico) como para la TERAPUTICA (permitiendo el monitoreo clnico-evolutivo de la carga viral, y la evaluacin del impacto de la terapia antirretroviral). El diagnstico de laboratorio de la infeccin por VIH en adultos, adolescentes y nios mayores a 18 meses, se realiza por mtodos basados en la deteccin de anticuerpos anti-VIH (VIH-1 y VIH-2) en el suero de las personas infectadas. Se han desarrollado varias generaciones de tcnicas (1, 2, 3, y 4), de creciente sensibilidad y especificidad, lo cual conlleva a una marcada disminucin del denominado perodo ventana serolgico, el cual depende directamente de la sensibilidad de la metodologa de deteccin. Actualmente, en Uruguay se dispone de mtodos de 3 y 4 generacin. El diagnstico de la infeccin por HIV en los adultos se realiza por mtodos basados en la deteccin de anticuerpos anti-HIV. Cuando se cuenta con laboratorios de calidad, OPS-OMS sugiere el uso de pruebas de convencionales. El organismo frente a una infeccin va generando dichos anticuerpos de forma paulatina, de manera que existe un tiempo entre el contacto inicial y la produccin de una cantidad medible de anticuerpos especficos antivirales. Durante dicho perodo, conocido como ventana serolgica, las pruebas pueden resultar no reactivas pero las personas infectadas igualmente pueden trasmitir el VIH a otros. Por ello es necesario evaluar frente a un resultado negativo, cuando el contacto fue reciente, la necesidad de un segundo estudio y no olvidar recomendar la aplicacin de estrategias de disminucin de riesgos. Los mtodos de diagnstico de HIV que se utilizan con ms frecuencia en nuestro pas es el ELISA (enzimo inmunoanlisis). En la actualidad pertenecen a la 3era y 4ta generacin. Los de 3era generacin, procedimientos que permiten medir respuestas de IgG, IgM e IgA tienen una ventana serolgica de 25 das de promedio (9 a 41 das con 95% de confianza). Las tcnicas de tamizaje de 4ta generacin, con las que se investiga la presencia de antgeno p24 y anticuerpos anti-VIH en forma simultnea, han reducido esta ventana serolgica en una semana como promedio (entre 5 y 15 das). Los

llamados tests rpidos, tambin disponibles en nuestro pas, son procedimientos que permiten obtener resultados en en 15 a 20 minutos con una tecnologa muy simple en su realizacin.

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Los tests rpidos tienen indicacin de ser usados en las siguientes situaciones: En perodo de preparto, parto y puerperio en mujeres sin antecedentes de control adecuado anterior, o con conductas de riesgo de transmisin de VIH. Para evaluar rpidamente la fuente de infeccin en los accidentes laborales, as como al personal accidentado. Para facilitar la expansin de los servicios de asistencia sanitaria a nivel de atencin primaria y mejorar las estrategias de prevencin de la transmisin del VIH.

Para cualquiera de las tres eventualidades planteadas, los tests rpidos sern realizados por personal de salud debidamente capacitado y bajo control por un laboratorio de anlisis clnico debidamente registrado en el Ministerio de Salud Pblica. El objetivo principal del uso de esta tecnologa es evitar las prdidas de captacin de pacientes y consecuentemente iniciar las acciones profilcticas correspondientes a cada caso. Frente a un resultado REACTIVO o REACTIVO DEBIL, obtenido por los mencionados test rpidos, se deber estudiar nuevamente otra muestra de sangre del paciente en el laboratorio diagnstico de la institucin, sin perjuicio de que se inicien las acciones profilcticas que correspondan a cada caso. Es oportuno aclarar que estas tcnicas no sustituyen a las tcnicas convencionales inmunoenzimticas y es esencial preestablecer un adecuado programa de control de calidad aplicado a los procedimientos rpidos para asegurarnos de alcanzar los beneficios de su aplicacin. Si bien los reactivos para diagnstico han aumentado notablemente su sensibilidad acorde con los desarrollos tcnicos de los ltimos aos, se sigue observando con ellos un nivel de especificidad que no llega a 100% especialmente en poblaciones de baja prevalencia de infeccin por VIH. Por consiguiente todos los resultados reactivos por serologa de tamizaje deben ser confirmados por un procedimiento de alta especificidad, como es la tcnica de Western Blot o los inmuno-ensayos en lnea. Estos procedimientos tienen una sensibilidad menor que los tests de tamizaje y por lo tanto el perodo de ventana serolgica para ellos es ms prolongado. La reactividad comienza a observarse a partir de los 30 das post infeccin. Las tcnicas moleculares cualitativas (PCR de ADN proviral) tienen indicaciones precisas para su aplicacin en el diagnstico de infeccin en este grupo etario de pacientes, las que son referidas a continuacin:

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En aquellos pacientes con resultados de tcnicas confirmatorias reiteradamente INDETERMINADOS en = 2 muestras de sangre obtenidas con un intervalo de 25-30 das. Diferenciar la infeccin por VIH 1 de la infeccin por VIH 2, conjuntamente con la investigacin especfica de anticuerpos anti VIH 2. No est indicado realizar PCR (PCR-DNA/VIH) para el diagnstico precoz de la infeccin por VIH no vinculada a la transmisin vertical. El tiempo en obtener los resultados a partir de las tcnicas de laboratorio empleadas para la investigacin de ADN proviral (intracelular) del VIH es similar al logrado con la investigacin del antgeno p24, incluido en las tcnicas de 4. generacin existentes en nuestro pas. Por lo tanto los resultados de PCR no aportan informacin confiable en plazos menores que la serologa.

Es importante tambin recordar que: un solo estudio por PCR no es suficiente para hacer el diagnstico de infeccin, lo que retarda el diagnstico definitivo por esta tecnologa y a nivel mundial se sigue considerando a la serologa como el estndar de oro de la confirmacin diagnstica de la infeccin por VIH post natal, salvo situaciones muy excepcionales registradas en la literatura mundial. Si bien la investigacin de ARN viral (PCR-RNA/VIH) permite reducir an ms la ventana diagnstica, llevndola a 11 das como promedio, los procedimientos para investigar el ARN viral no estn validados a nivel internacional con finalidad diagnstica

Es importante destacar tambin los siguientes grupos de pacientes en relacin con el diagnstico de VIH-SIDA:

-Diagnstico de laboratorio de la infeccin por VIH en mujeres embarazadas. Tienen valor todas las consideraciones e indicaciones referidas en el Diagnstico de laboratorio de la infeccin por VIH en adultos, adolescentes y nios mayores de 18 meses Recomendacin y mensaje recordatorio: CONTROL DURANTE EL EMBARAZO Aclaracin sobre el diagnstico con tcnicas rpidas:

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Sern realizados por personal de salud debidamente capacitado y bajo control por un laboratorio de anlisis clnico debidamente registrado en el Ministerio de Salud Pblica. Frente a un resultado REACTIVO o REACTIVO DEBIL, obtenido por los mencionados test rpidos, se deber estudiar nuevamente otra muestra de sangre del paciente en el laboratorio diagnstico de la institucin, sin perjuicio de que se inicien las acciones profilcticas que correspondan a cada caso.

-Diagnstico de laboratorio de la infeccin por VIH en nios nacidos de madres VIH positivas. Consideraciones generales Existen diferentes situaciones en el diagnstico de la infeccin VIH en pediatra, segn la va de transmisin y la edad en el momento del diagnstico de infeccin: a) transmisin vertical en nios menores de 18 meses I. con tratamiento antiretroviral materno II. sin tratamiento antiretroviral materno b) transmisin vertical detectada en nios mayores de 18 meses c) transmisin horizontal de la infeccin. El diagnstico de infeccin por VIH en las situaciones b y c, se basa en la demostracin de la respuesta inmune humoral, mediante tcnicas serolgicas de tamizaje y confirmacin comentadas en Diagnstico de laboratorio de la infeccin por VIH en adultos, adolescentes y nios mayores de 18 meses. Por lo tanto a partir de los 18 meses de vida, las tcnicas mencionadas (tamizaje y confirmatoria) son suficientes para el diagnstico de infeccin por VIH, excepto que se considere como indicacin especial la utilizacin de tcnicas moleculares cualitativas de acuerdo a lo aconsejado: En aquellos pacientes con resultados reiteradamente INDETERMINADOS a partir de tcnicas confirmatorias en por lo menos 2 muestras de sangre obtenidas con 25- 30 das de diferencia. Diferenciar la infeccin por VIH1 de la infeccin por VIH 2, conjuntamente con la investigacin especfica de anticuerpos anti VIH-2. En el nio menor de 18 meses (a), por la persistencia de anticuerpos maternos IgG que atraviesan la barrera placentaria, el diagnstico debe realizarse con mtodos

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directos que detectan al virus o algunos de sus componentes. La presencia de tales anticuerpos en el suero del nio en los primeros meses de vida limita el valor de los estudios serolgicos en estos pacientes y por consiguiente el diagnstico precoz de la infeccin del recin nacido por transmisin materno requiere de estudios que investiguen la presencia de virus circulante en la sangre del nio o algunos de sus componentes (Ag p24, PCR ADN proviral, cultivo del virus). La tcnica de eleccin para este diagnstico es la investigacin de ADN proviral en linfocitos de sangre perifrica. Sin embargo es de buena prctica confirmar siempre la asociacin del binomio madrehijo (para evitar errores de identificacin), con una determinacin para VIH por test serolgico de tamizaje en el nio recin nacido. Asimismo es conveniente realizar un estudio serolgico entre los 18 y 24 meses de edad para establecer junto con los datos de PCR el diagnstico final. En el diagnstico de la infeccin perinatal por VIH por PCR deben tenerse en cuenta los problemas tcnicos de contaminacin de la muestra, que producen resultados falsos positivos, as como la existenciade falsos negativos estos ltimos asociados a baja concentracin de los linfocitos circulantes, bajo nmero de copias de ADN proviral o presencia de variantes genotpicas. Por consiguiente se deber tener 3 exmenes por PCR, positivos o negativos de muestras obtenidas en diferentes momentos para poder establecer si el nio est infectado o no y uno de estos estudios deber haber sido realizado despus del 6 mes de vida. Se sugiere como cronograma de estudio: la toma de la primera muestra en la primera semana de vida, la segunda entre los meses 1 y el 3 y la tercera muestra luego del 6 mes de vida. La investigacin de ARN viral (carga viral) no est validada por los laboratorios de referencia internacionales para el diagnstico de infeccin perinatal, aunque puede constituir una prueba de gran valor para evaluar resultados de PCR con ADN proviral en estos pacientes.

En nuestro medio, en un primer nivel de diagnstico (laboratorios asistenciales, de medicina transfusional y del primer nivel de atencin) se realiza un primer estudio que puede resultar reactivo o no reactivo. Si no es reactivo, se informa como tal y se aplican las estrategias de consejera post-test. Cuando su resultado es reactivo (y esto es vlido tambin para los tests rpidos) se realiza una segunda extraccin (personalizada) para repetir con sta, la tcnica de tamizaje utilizada en el primer nivel de diagnstico. Con ello se corroborar la identidad de

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la muestra y la reactividad de la misma. La confirmacin serolgica siempre es necesaria mediante una tcnica de alta especificidad (por ej.: Western Blot) que se efecta en un segundo nivel de diagnstico (Laboratorio Nacional de Referencia). Nunca se debe comunicar un resultado primario reactivo hasta obtener el diagnstico final que surge de la confirmacin serolgica realizada por el laboratorio de referencia, asegurndose que la muestra corresponda al usuario. De manera que frente a un resultado serolgico reactivo en el primer nivel de diagnstico se enva al Laboratorio de Referencia la muestra de sangre del paciente que ser estudiada con una tcnica de alta especificidad (por ejemplo Western Blot). De este nivel surgirn los posibles resultados: positivo, indeterminado o negativo. Es posible, pero muy poco frecuente, que exista una discordanciaentre el ELISA (4ta Generacin) y el examen confirmatorio debido a que el contacto haya sido muy reciente (menos de 30 das). En estos casos se deber repetir el estudio luego de un mes. Por ello, para fines prcticos, considerando a las variadas situaciones tomar como perodo de ventana serolgica promedio de 30 das.

Interpretacin de Western Blot 1) Criterio de Positividad El diagnstico de positivo se realiza cuando se detectan los siguientes anticuerpos en el Western Blot: Anticuerpo anti p24 (siempre presente) y Anticuerpo anti gp160/120 y/o Anticuerpo anti gp41 2) Criterio de Negatividad Ausencia de anticuerpos 3) Criterio de Indeterminado Presencia de algn anticuerpo aislado Los INDETERMINADOS pueden correlacionarse con diferentes situaciones, entre alguna de ellas se citan: Durante la primoinfeccin, cuando an no hay respuesta inmunolgica totalmente detectable durante el perodo llamado de ventana serolgica. Durante la etapa clnica final del sndrome, conjuntamente con la depleccin linfocitaria profunda, se pierden tambin algunos anticuerpos, razn por la cual son detectados solo algunos de ellos.

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En los casos de hipogamaglobulinemia, tambin pueden ocasionar resultados indeterminados. Estar o haber cursado alguna infeccin reciente, como gripe por ejemplo, puede ocasionar tambin la aparicin de reacciones inespecficas en los resultados serolgicos. Estas situaciones en principio pueden resolverse al realizar un seguimiento serolgico de las personas con serologa INDETERMINADA y la consejera correspondiente.

Cuando el estudio confirmatorio es positivo se deber realizar la notificacina Vigilancia Epidemiolgica del MSP (vigilanciaepi@msp.gub.uy)

Una vez que se notifique al paciente se deber coordinar la atencin con el tcnico de referencia en ITS/VIH del Servicio, o con el Centro de Referencia (Servicio de Enfermedades Infecto-contagiosas-S.E.I.C, Centro Nacional Obsttrico Peditrico VIH/SIDA, C.H.P.R, Instituciones de Asistencia Mdica Colectiva, I.A.M.C, etc.). Es importante facilitar la derivacin proporcionndole al usuario la mayor

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cantidad de informacin, brindando con la mayor claridad la direccin, horario y dems aspectos relacionados con su prxima consulta. Se trata de evitar as que se pierda su captacin por el Sistema de Salud. Este es un momento crucial en lo referente a la continuidad de la atencin y continencia dentro del Sistema de Salud. Tambin se aplicarn estrategias especficas de consejera frente a estos resultados. La realizacin de la consejera est directamente relacionada a la calidadde atencin brindada por los servicios de salud. Es una estrategia para la atencin integral, permitiendo la promocin de salud y prevencin de las ITS/SIDA. La consejera es un instrumento que contribuye desde el punto de vista epidemiolgico a romper la cadena de transmisin de las ITS/VIH, ya que favorece la reflexin de la persona o personas, si es grupal sobre sus riesgos de infeccin, permite evaluar la percepcin de los mismos, desarrollar acciones preventivas y promover estilos de vida saludables as como de gestin de los riesgos a los que est o estn expuestos. Promueve la adherencia al tratamiento por lo que mejora la calidad de vida de las personas, disminuye las internaciones hospitalarias y la mortalidad por sida.

La informacin de los resultados al paciente forma parte de la consejera post-test. Esta consejera siempre debe llevarse a cabo atendiendo a la situacin personal y en forma individual. Es la informacin y el proceso educativo que se brinda una vez que la persona se ha realizado las pruebas diagnsticas y se tiene los resultados del examen. Existen tres modalidades de resultados post test: resultado negativo o no reactivo, resultado positivo o reactivo y resultado indeterminado. Frente al resultado negativo: - Informar que un resultado es negativo significa que la persona no ha estado en contacto con el virus, no ha sido infectada con el VIH. - Tambin puede significar que se encuentre en el perodo ventana, por lo tanto puede estar infectada recientemente y todava no ha producido los anticuerpos necesarios para que se detecten en el test. Si existe la sospecha de que esto ocurra, deber repetirse el examen a los 30das. - No significa que sea inmune al virus. El proporcionar un resultado negativo es importantsimo, ya que es el momento de reforzar las prcticas seguras ya adoptadas como los beneficios del uso correcto

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del preservativo/condn y del uso exclusivo de equipamientos para consumo de drogas. Tambin es la oportunidad para invitar a realizar preguntas, reiterar la informacin y explorar estrategias de un plan individualizado de gestin de riesgos en especial con las mujeres en su relacin con su pareja y las posibilidades de negociar el uso correcto del condn. Frente a un resultado indeterminado: Recordar que un resultado indeterminado significa que se debe realizar una nueva extraccin de sangre, dejando pasar unos 30 das luego de esa primera extraccin. Recordar la adopcin de prcticas seguras para reducir los riesgos de infeccin por VIH y otras ITS. Brindar durante este perodo de espera de un nuevo resultado un apoyo emocional que permita contener al usuario/a. Frente al resultado positivo: Informar sobre un resultado positivo significa: - La persona tiene anticuerpos contra el VIH, adquiri el virus - Aunque no tenga sntomas s puede transmitir el virus - No significa que tenga sida
Los estudios centinelas del VIH, forman parte de la vigilancia epidemiolgica activa, en grupos seleccionados (poblacin laboral) que permite conocer la prevalencia de la infeccin, por sexo y edad, la tendencia de su evolucin, y tambin estimar el numero total de personas infectadas por VIH en el pas.

Tomando como ejemplo el diagnstico de HIV: una muestra de protenas procedente de un lisado de clulas en cultivo infectadas con el virus sirve como fuente de antgenos virales (este lisado se encuentra estandarizado y constituye un reactivo primario de laboratorio). Este conjunto de protenas puede separarse por SDS-PAGE y transferirse a una membrana de nitrocelulosa, sobre la cual se deposita el suero del paciente. De encontrarse ste infectado, presentar anticuerpos especficos contra las protenas virales a las cuales se unirn. Finalmente se agrega un Ac secundario conjugado y un sustrato cromognico que desarrolla un precipitado coloreado en el lugar donde se uni, revelando as la presencia y localizacin de las protenas reactivas. inmunoreactividad (nmero, El perfil de protenas que muestran tipo de protenas) permite el

intensidad,y

establecimiento de un diagnstico positivo o negativo de infeccin en base a criterios pre-establecidos.

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Pruebas diagnsticas La medicina es una ciencia que depende, entre otras variables, de las probabilidades y el manejo de la incertidumbre. Esta ltima, se extiende desde las actividades preventivas, pronsticas y teraputicas, hasta las pruebas diagnsticas. En toda prueba diagnstica de laboratorio, existe un margen de error (incertidumbre) debido a una variedad de parmetros, que van desde las caractersticas de la tcnica hasta los errores humanos. Por tanto, se corre siempre el riesgo de no detectar la infeccin en individuos enfermos (falsos negativos) as como de diagnosticar la infeccin en individuos sanos (falso positivos). Resulta obvio que una prueba diagnstica ptima deber dar reaccin positiva

nicamente en la totalidad de individuos infectados, y reaccin negativa nicamente en la totalidad de individuos sanos. En la prctica no es posible que esto ocurra ya que toda prueba est sujeta a error, y es prcticamente imposible desarrollar una tcnica 100% efectiva. Por tanto, debemos conocer la magnitud del error de cada prueba diagnstica, para lo cual existen una serie de criterios que permite estimar su eficacia y debilidad. As, un test diagnstico debe poseer: Validez, una medida de la frecuencia con la que el resultado de un test es confirmado por metodologas diagnsticas complementarias, usualmente ms complejas y rigurosas. La sesibilidad y la especificidad de un test son una medida de su validez. Reproductividad, es la capacidad de un test de proporcionar un mismo resultados en sucesivas aplicaciones en idnticas condiciones.

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Seguridad, es determinada por el valor predictivo de un resultado positivo o negativo, que ltimamente proporcionan informacin sobre cul es la probabilidad de diagnosticar adecuadamente la presencia/ausencia de infeccin.

Adems, cabe destacar que adems de la sensibilidad y especificidad de los mtodos diagnsticos, debe considerarse asimismo su costo, disponibilidad, complejidad tcnica, tipo y tamao de la muestra requerida, tiempo de ensayo, etc. De lo expuesto anteriormente, se destacan tres parmetros de relevancia crucial para evaluar la potencia y debilidades de la misma: SENSIBILIDAD, ESPECIFICIDAD, y VALOR PREDICTIVO.

La sensibilidad se correlaciona con la capacidad de determinar la proporcin de individuos infectados, que tienen reaccin positiva con la

metodologa diagnstica utilizada. Es la probabilidad de clasificar correctamente a un individuo enfermo. De esto se desprende que una prueba diagnstica tendr una mayor sensibilidad cuanto mayor sea el nmero de personas infectadas. Sensibilidad = 100 X (No reactivos positivos)/(No reactivos positivos + falsos negativos)

La especificidad se correlaciona con la proporcin de individuos no infectados que que tienen reaccin negativa con la metodologa diagnstica

utilizada. Es la probabilidad de diagnosticar correctamente a un individuo sano. As, una mayor especificidad permite discriminar mejor aquellas personas que reaccionan positivamente pero que no se encuentran infectados. Sensibilidad = 100 X (No reactivos)/(No reactivos positivos + falsos positivos)

Los conceptos de sensibilidad y especificidad proporcionan informacin respecto a la probabilidad de obtener un resultado determinado en funcin del estado real del paciente. Del punto de vista clnico, el Mdico carece de informacin a priori de la verdadera condicin del paciente, por lo que el inters apunta entonces a, dado un resultado positivo o negativo en un test diagnstico, cul es la probabilidad de que el paciente est realmente infectado o sano,

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respectivamente? El valor predictivo proporciona la probabilidad de tener la enfermedad en funcin del resultado del test diagnstico. El valor predictivo positivo es la probabilidad de s estar infectado si el resultado es positivo VPP = 100 X (No reactivos positivos)/(No reactivos positivos + falsos positivos)

El valor predictivo negativo es la probabilidad de no estar infectado cuando el resultado del test diagnstico es negativo. VPP = 100 X (No reactivos negativos)/(No reactivos + falsos negativos)

A la hora de definir un criterio clnico y/oestablecer un diagnstico ante el resultado de una prueba, el valor predictivo no aporta per se toda la informacin necesaria. Esto se debe a que el valor predictivo depende de la frecuencia de la enfermedad en una poblacin para poder ser aplicado en un criterio diagnstico. En este sentido, resulta importante el concepto de Prevalencia, la cual cuantifica la proporcin de individuos infectados en un momento o perodo temporal determinado: (Prevalencia = No positivos reales en el tiempo T/poblacin total en el tiempo T). As, cuando la prevalencia de la enfermedad es baja, un resultado negativo es ms probable que sea acertado, lo que resulta en un valor predictivo negativo mayor. Si la prevalencia es alta, un resultado positivo, no permite confirmar el diagnstico con igual certidumbre, resultando en un bajo valor predictivo positivo.

A continuacin se muestran a modo ilustrativo resultados de la aplicacin del test de VIH-HIV en una poblacin de baja prevalente (tabla superior) y alta prevalencia (tabla inferior):

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