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UNIVERSIDAD NACIONAL DE MAR DEL PLATA FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS BIOQUIMICA I

TRABAJO PRACTICO: Actividad enzimática: invertasa de levadura.
Introducción Las enzimas catalizan las reacciones disminuyendo la energía libre de activación necesaria para que las mismas ocurran. La molécula sobre la cual la enzima actúa se denomina sustrato, esta molécula se transforma

obteniéndose el producto. La molécula de enzima no se modifica al término de la reacción y puede continuar catalizando la misma repetidas veces. Las enzimas son proteínas globulares*1. Su conformación espacial presenta un área, denominada sitio activo, el cual es fundamental para su actividad catalítica. La naturaleza y el arreglo espacial de los aminoácidos en este sitio activo hacen que éste sea específico para un único tipo de sustrato. Aún cuando existan distintas moléculas que podrían ser sustrato, sólo aquella cuya forma sea complementaria con el sitio activo será capaz de unirse al mismo. Cuando el sustrato apropiado se une a la enzima, se producen cambios en el sitio activo. Esta modificación, denominada ajuste inducido, incrementa la catálisis. La liberación de los productos restablece la enzima a su forma original, pudiendo la misma repetir el proceso sucesivas veces, mientras haya sustrato presente. La conformación de una enzima es mantenida por las interacciones que se establecen entre las regiones específicas de los aminoácidos que componen la cadena polipeptídica. Debido a ello la misma es susceptible ante cambios en el ambiente en el cual se encuentra, siendo dos de los factores más

*1

Existen algunos tipos de ARN que pueden actuar como enzimas, catalizando el clivaje y formación de uniones fosfodiéster. Estos ARN con actividad catalítica se denominan ribozimas y son menos comunes que las enzimas proteicas

La catálisis usualmente requiere que tanto la enzima como el sustrato presenten grupos químicos específicos en su forma ionizada o deionizada para reaccionar. por lo cual la tasa de la reacción decaerá. lo cual lleva a que la enzima no pueda catalizar la reacción. Cuando estos varían de forma tal que la conformación de la proteína es alterada.se altera la conformación espacial de la proteína globular. incluido su sitio activo. ante un exceso de H+ o de OH. Las reacciones químicas incrementan su velocidad con la temperatura. es un disacárido compuesto por α-D-glucosa y β-D-fructosa unidos mediante enlace glicosídico α-1. la enzima pierde su actividad. Por ejemplo. mientras que la lipasa. La sacarosa puede ser hidrolizada en presencia de una enzima comúnmente denominada invertasa o sacarasa: Sacarasa Sacarosa + H2O --------------------------. lo hace a pH básico.Glucosa + Fructosa . por ello la catálisis también puede incrementarse con la temperatura. la actividad catalítica puede requerir que un grupo amino de la enzima esté en su forma protonada (-NH3+). presente en el intestino delgado. presenta máxima actividad catalítica en un ambiente fuertemente ácido.2. en el rango óptimo de pH para la actividad de la enzima el sitio activo presenta la conformación apropiada para la unión del sustrato. presente en el estómago. En cambio. cada enzima presenta un rango de temperatura óptima. se genera una mezcla equimolar de glucosa y fructosa. Cuando este enlace es roto en la reacción de hidrólisis. Por otra parte. Por ejemplo la pepsina.importantes la temperatura y el pH. a pH alcalino este grupo estará deprotonado. Invertasa de levadura La sacarosa. comúnmente conocida como azúcar de mesa. Por encima de éste la velocidad de reacción disminuye. La concentración de H+ afecta la velocidad de reacción debido a su efecto tanto a nivel de la ionización del sitio activo como de la estructura espacial de la enzima. Cada enzima funciona mejor en un determinado rango de pH. Sin embargo. hasta que la proteína pierde su configuración funcional. lo cual se denomina desnaturalización.

debido a que la reacción catalizada por esta enzima es la hidrólisis del residuo terminal β-fructofuranósico.5.5 a 5. Por ejemplo. se prefiere a la fructosa sobre la sacarosa. posteriormente. por ejemplo los iones Ag1+ atacan a la histidina de la cadena peptídica inactivándola. la cual es determinante de la funcionalidad de la enzima. El plomo. se verificará su acción sobre una solución de . por lo tanto. En cuanto a la temperatura. el máximo de actividad se registra alrededor de los 55° C. el plomo puede reaccionar fácilmente con los grupos sulfhidrilos (-SH) de las proteínas: proteína-SH + Pb++ + HS-proteina proteina-S-Pb-S-proteina + 2H+ Los puentes disulfuro son vitales en la estabilización de la estructura tridimensional de la proteína.La denominación sistemática de la invertasa es β-fructofuranosidasa. El valor de la cons tante de Michaelis-Menten varía según las diferentes isoformas entre 2 mM y 5 mM. La invertasa es una enzima muy utilizada en la industria alimenticia ya que debido a su sabor más dulce y a que no cristaliza tan fácilmente. Un amplio rango de microorganismos sintetizan invertasa pudiendo. A diferencia de otras enzimas. mercurio y otros metales pesados son extremadamente tóxicos dado que actúan como inhibidores de enzimas. escindiendo la unidad terminal de la glucosa. que también cataliza esta reacción.5) con el óptimo en pH= 4. A escala comercial es biosintetizada por las cepas de levadura Saccharomyces cerevisiae y Saccharomyces carsbergensis. emplear la sacarosa como nutriente. Existe otra enzima. El sulfato de cobre en concentraciones elevadas también presenta un efecto inhibidor. la α-D-glucosidasa. Objetivo: En el presente trabajo práctico se realizará la extracción de la invertasa de levadura y. la invertasa presenta actividad relativamente elevada en un rango amplio de pH (desde 3. La sacarosa también puede ser hidrolizada de manera no enzimática en medio ácido. La actividad de la invertasa es inhibida en presencia de metales pesados.

Trasvasar a un tubo de centrífuga y centrifugar durante 10' a 3000 rpm.1M (buffer de extracción).5 1 1 1 1 1 1 1 EE* EEH** (1) La inulina es un polímero de fructosa que se utiliza como posible sustrato alternativo. Tomar una alícuota de 2 ml del EE y hervirla a BM durante 10 minutos.Proceso enzimático Realizar una batería de tubos de ensayo siguiendo las indicaciones de la siguiente tabla: Sacarosa Inulina (1) Tubo 0. el cual contiene la enzima.25 1 0.02M (0.25 %) mL 1 2 3 4 5 6 7 8 9 2 2 2 2 2 2 2 2 2 0.25 1 0. Mezclar y dejar en contacto durante 20' agitando periódicamente. este será el extracto enzimático hervido (EEH**).5 g de levadura de cerveza (Saccharomyces cerevisiae) en un mortero y agregar 15 ml de solución de bicarbonato de sodio 0. Recuperar el sobrenadante. y será el extracto enzimático (EE*) a utilizar. Protocolo de trabajo: A.Obtención de la enzima Colocar 7. Dejar reaccionar durante 15' a temperatura ambiente. . el cual permite detectar la presencia de los productos de la hidrólisis de este disacárido (glucosa y fructosa).5%) Na OH (0.sacarosa. B. La misma se comprobará mediante el test de Fehling.5%) SO4Cu (0.

Es el sustrato sobre el que actúa la enzima. INc. London.C. 2. Actividades complementarias 1.Bloquea el sitio activo de la enzima. Martinko and J.M. Wiley-liss.¿Cuál es el objeto de realizar el primer tubo de la serie -el cual contiene sólo sacarosa-? .Resultados Los productos de la hidrólisis de la sacarosa -fructosa y glucosa. c. Columbia. lo cual es indicado por la aparición de un precipitado rojo ladrillo. Compare los resultados obtenidos en los distintos tubos -aparición o no del precipitado y cantidad del mismo. 1992. Lucas Brothers Publishers.D.Acelera la reacción entre la enzima y el sustrato. retirarlos y dejarlos enfriar en la gradilla.dan resultado positivo para el test de Fehling. T.En el potocolo experimental realizado. EUA. of Missouri.T..y trate de explicarlos en base a los reactivos agregados en cada uno.Desnaturaliza la enzima por alterar su sitio activo. Laboratory Manual for 210 Biochemistry-Dept of Agricultural Chemistry. Univ. d. J. D. Prentice-Hall International (UK) Limited.Brock.Devlin. .D.Detección de los productos de la catálisis Agregar a cada tubo 2 ml del reactivo A de Fehling y 2 ml del reactivo B de Fehling. Textbook of Biochemistry. Biology of microorganisms. b. 1994. Bibliografía . Third edition. Madigan. M. M. Colocar los tubos en baño de agua a 100° C durante 10'. cuál es el rol del Na OH agregado a algunos de los tubos? a. Seventh edition. Parker.1973-1974.

en el intervalo entre 0 y 10 segundos? N° de moles de producto Tiempo (segundos) Gráfico 1: 4. 0-30 segundos b. a través del tiempo. ¿cuál es la tasa de reacción. Este último es el método empleado en el Gráfico 1. En base al mismo.Las actividades planteadas a continuación están basadas en el siguiente gráfico de catálisis enzimática: Gráfico 2: N° de moles de producto Tiempo (segundos) A).¿En cuál de los siguientes intervalos de tiempo se alcanza la máxima velocidad de reacción? a.La tasa de reacción puede medirse.3. en moles.segundo-1.60-120 segundos . por desaparición de sustrato o por aparición de producto.

durante todo el periodo considerado. C) ¿Cuál de los siguientes gráficos representa la tasa de reacción mostrada en el gráfico 2? Nota: en el eje y se representa la evolución del número de moléculas de sustrato.seg-1 Tiempo (segundos) Número de moléculas . d. c. cuál de los siguientes pasos debería realizarse? a.Remover el producto acumulado.seg-1 Número de moléculas .seg-1 Tiempo (segundos) .120-180 segundos d.seg-1 Tiempo (segundos) Tiempo (segundos) Número de moléculas .agregar más sustrato.c.incrementar la temperatura gradualmente después de los 60 segundos. B) Con el objeto de mantener una tasa constante durante todo el período considerado. Número de moléculas .agregar más enzima b.