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INVESTIGACION DEL GRUPO SANGUNEO ABO 1.

OBJETIVO Determinar el grupo sanguneo, con relacin al sistema ABH, mediante la identificacin de los aglutingenos y las aglutininas principales que se encuentran en una muestra de sangre y suero, utilizando antisueros y glbulos rojos conocidos segn lo indicado en cada caso. 2. PRE-LABORATORIO Las pruebas utilizadas para establecer la hemoclasificacin sangunea relacionada con los diversos grupos sanguneos, aprovechan las caractersticas inmunolgicas que expresa cada individuo, de acuerdo a su particular codificacin gentica. En dichas pruebas se evidencian los antgenos y/o anticuerpos del grupo sanguneo, de acuerdo a su comportamiento in-vitro. En cuanto se refiere al sistema ABH se investigan tanto los antgenos o aglutingenos como los anticuerpos o isoaglutininas naturales. Los glbulos rojos utilizados en estos procedimientos poseen en la membrana los antgenos que al unirse (in vitro) con los anticuerpos especficos producen reacciones que son fcilmente visibles, actuando como si fuesen los indicadores del punto final de la hemoaglutinacin. La hemoaglutinacin se considera la reaccin de Ag-Ac de mayor utilidad en el laboratorio de Inmunohematologa, por lo cual se hace indispensable recordar las caractersticas y las condiciones que modifican dicha reaccin, para poder determinar con claridad los requerimientos ptimos que permitan obtener la mayor constante de equilibrio en cada prueba especfica, y en esta forma se asegure la confiabilidad y contribucin exitosa de los procedimientos empleados en el estudio de los grupos sanguneos. Tambin es necesario conocer las caractersticas especficas de comportamiento de los aglutingenos y aglutininas del sistema ABH. Para la revisin de los aspectos mencionados tenga en cuenta los siguientes parmetros: 1. Analice las fases o etapas de la reaccin de hemoaglutinacin. 2. Efecte la representacin esquemtica de la reaccin de hemoaglutinacin ejemplarizada con lo que ocurre en las pruebas de tipificacin ABH. (Tenga en cuenta que el anticuerpo que interviene es una molcula pentamrica y que la hemoaglutinacin se hace evidente cuando se unen muchos eritrocitos. 3. Seleccione las caractersticas especficas de los aglutingenos y las isoaglutininas ABH, que intervienen en la reaccin de hemoaglutinacin y/o hemlisis, que deben tenerse en cuenta para la realizacin de cada prueba. 4. Para la tipificacin sangunea ABH, prueba globular se utilizan, reactivos que contienen anticuerpos policlonales o anticuerpos monoclonales. Describa en forma sinttica y de manera comparativa las propiedades de los anteriores reactivos teniendo en cuenta: mtodos de obtencin y usos. 5. Realice la revisin por medio de un mapa conceptual que incluya los principales trminos usados en las pruebas de hemoaglutinacin como son: afinidad, avidez, sensibilidad, especificidad. 6. Revise en el Manual de Normas Tcnicas, Administrativas y de Procedimientos para Bancos de Sangre el control de calidad que se debe realizar en inmunohematologa que incluye: aspecto, reactividad, especificidad, potencia y avidez. 7. Elabore una tabla comparativa, de las reacciones esperadas para cada uno de los diferentes fenotipos del sistema ABO, teniendo en cuenta antgenos y anticuerpos expresados y antisueros y clulas reactivas usadas. 8. Investigue la expresin genotpica y fenotpica, para cada uno de los principales grupos sanguneos del Sistema ABO. 3. PRACTICA N 1

IDENTIFICACION DE AGLUTINOGENOS. PRUEBA GLOBULAR, DIRECTA O DE BETH- VINCENT A. Mtodo en tubo 3.1 MATERIALES Y REACTIVOS Lminas porta-objeto. Tubos de 10 o 12 x 75 m y tubos de 13 x 10 mm. provistos de tapones de caucho o en su defecto plstico adherente. Pipetas Pasteur (plsticas), palillos, Tubos de sistema al vaco, para recoleccin de las muestras, tapa roja y tapa lila, con sus respectivas agujas y guas, o sistemas de jeringa hipodrmica, lupa para lectura, fuente de luz blanca. Solucin salina isotnica GUA PRACTICA DE BANCO DE SANGRE

Sueros anti-A, anti-B, anti-A, B. Dibujos elaborados por Andrea Vallejo.

3.2 MUESTRAS Obtener una muestra de sangre del paciente, anticoagulada (EDTA, CPDA-1). 3.3. METODO EN TUBO 1. Marcar cuatro tubos de ensayo de vidrio de 12 x 75 mm (con marcador de vidrio) con el No. de la muestra y el nombre del antisuero correspondiente al antgeno que se va a investigar y un tubo para el control con S.S al 0.85 %. 2. Tomar 2 a 3 gotas de los glbulos rojos en estudio y lavarlos una vez con solucin salina fisiolgica (SSF); centrifugando a 3.400 r.p.m. x 1 minuto. 3. Decantar completamente para eliminar el sobrenadante y preparar una suspensin del 3-al 5% en SSF de los hemates previamente lavados. 4. Seleccionar 4 tubos de, 12 x 75 mm e identificarlos con marcador como A, B, AB, Control, respectivamente. Nota: Leer y seguir las instrucciones del fabricante. Continuar como sigue:
Anti-A 5. Antisuero correspondiente 1 gota (50ul) 1 gota (50ul) Anti-B 1 gota (50ul) 1 gota (50ul) Anti A,B 1 gota (50ul) 1 gota (50ul) S.S 0.85 % 1 gota (50ul) 1 gota (50ul)

6. G.R del paciente lavados y suspendidos del 2 al 5 % 7. Mezclar suavemente 8. Centrifugar a 3.400 r.p.m. x 15 o a 1.000 r.p.m. x 1 minuto. 9. Desprender el botn de clulas del fondo del tubo agitndolo suavemente; inclinarlo hasta la posicin horizontal para apreciar completamente la aglutinacin y cuantificar las cruces. Se debe usar siempre ayuda visual. 10. Anotar inmediatamente, tubo en mano, los resultados obtenidos de la aglutinacin o hemlisis.

3.4 INTERPRETACIN GUA PRACTICA DE BANCO DE SANGRE

POSITIVO: Aglutinados de Glbulos rojos (GR) de diferentes grados de reaccin segn tabla. NEGATIVO: Presencia de una suspensin uniforme de los Glbulos rojos. TABLA 1. GRADOS DE REACCIONES EN HEMAGLUTINACIN Y SCORE. (Marsh) La siguiente tabla debe tenerse en cuenta para graduar todas las reacciones de hemoaglutinacin de pruebas realizadas por el mtodo en tubo. 4+ ++ + 3+ ++ 2+ + 1+ Wo db il 0 H Un agregado slido compacto. No se detectan glbulos rojos libres. Varios agregados grandes Agregados grandes en un mar de grumos ms pequeos, sin glbulos rojos libres. Agregados pequeos, sobrenadante rojizo por glbulos rojos libres. Granularidad dbil en la suspensin de glbulos rojos. Pocos aglutinados macroscpicos pero muchos microscpicos. Suspensin de glbulos rojos uniforme. No se detectan aglutinados. Negativo. Sobrenadante rojo brillante. Hemlisis

SCORE Es la puntuacin que corresponde segn el grado de aglutinacin. Es de gran importancia en pruebas de titulacin de anticuerpos.
4 ++++ 3 +++ 2 ++ 1+ W o dbil 0 H 12 10 8 5 2 0 Hemolisis

3.5 Mtodo en portaobjetos. REACTIVOS 1- Anti-A mono o policlonal 2- Anti-B mono o policlonal 3- Anti-A,B (opcional) Nota: Todos los reactivos deben utilizarse de acuerdo a las instrucciones del fabricante. 4- Solucin Salina Fisiolgica (0.85 %) 3.6 MUESTRAS Antes de realizar pruebas en lmina portaobjetos, es preciso consultar las instrucciones del fabricante de los reactivos, algunos recomiendan efectuarlas con sangre entera y otros con suspensiones de glbulos rojos poco concentradas, preparadas en solucin salina, suero o plasma. 3.7 PROCEDIMIENTO
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1. 2. 3.

Marcar apropiadamente la lmina con A, B, AB y control. Agregar una gota de anti-A, anti-B, anti-AB y solucin salina en el sitio correspondiente. Colocar las cuatro gotas de sangre con la pipeta de transferencia o Pasteur y mezclar con un palillo limpio y diferente para cada antisuero, extendiendo la mezcla en un rea de aproximadamente dos centmetros por cuatro centmetros. 4. Inclinar el portaobjetos con suavidad por 2 minutos. No colocar en superficie caliente. Rotar constantemente y observar por aglutinacin. 5. Leer e interpretar frente a una buena fuente de luz blanca antes de dos minutos, (lmpara lectora) 6. Anotar los resultados de acuerdo al siguiente formato. 3.8 INTERPRETACION POSITIVO: Aglutinados de GR mximo despus de 2 minutos de la mezcla. NEGATIVO: Presencia de una suspensin uniforme de los Glbulos rojos. TABLA DE REGISTRO DE RESULTADOS Nombre Paciente:_______________________No. Identificacin Muestra: _____________
Prueba Directa en Lmina Recheque Ant Ant Anti Contr i-A i-B A,B ol

Nombre Paciente: _________________________________________


Prueba Directa en Tubo AntiA AntiB AntiA,B Contr ol Gr A1 Prueba Inversa Gr A2 Gr B Gr O Interpretaci n Grupo ABO

Grupo: _____________ Fecha: ____________________ Firma: ________________ Lote de Reactivos. Fecha de Expiracin: Anti-A:___________ Anti-B:____________ Anti-A,B:____________ ___________ ___________ ____________

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Tomado de Dia-Med PRACTICA N 2 IDENTIFICACION DE AGLUTININAS. PRUEBA SERICA, INVERSA O DE SIMONIN-MICHON 3.1. REACTIVOS Para esta prueba se debe disponer de hemates A 1, A2, B y O, preferiblemente Rh o D negativo suspendidos en una solucin del 3-5% en solucin salina fisiolgico (las pruebas con hemates A2 pueden ser opcionales). 3.2. MUESTRAS 1. Tomar una muestra de sangre total en tubo seco. 2. Esperar 10 minutos para que se retraiga el coagulo, centrifugar 7 minutos a 1.500 r.p.m. 3. Separar el suero en tubo perfectamente marcado. 3.3. PROCEDIMIENTO 1. Identificar apropiadamente cuatro tubos de vidrio de 12 x75 mm, por ejemplo: A 1, A2, B y O. Continuar como sigue:
GR A 2. Suero en estudio
1

GR A2 2 gotas

GR B 2 gotas

GR O 2 gotas

2 gotas

3. Hemates grupo sanguneo especfico 1 gota 1 gota 1 gota 1 gota 4. Mezclar, agitando el tubo. Si desea potenciar la aglutinacin los tubos pueden ser incubados durante 5 minutos a temperatura ambiente. 5. Centrifugar a 3.400 r.p.m. x 15 o a 1.000 r.p.m. x 1 minuto 6. Observar el sobrenadante contra un fondo blanco bien iluminado para detectar hemlisis. 7. Desprender el botn de clulas del fondo del tubo agitndolo suavemente; inclinarlo hasta la posicin horizontal y leerlo contra un fondo bien iluminado para apreciar completamente los aglutinados dispersos. Emplear siempre ayuda visual. 8. Anotar inmediatamente tubo en mano los resultados de la aglutinacin.

3.4. INTERPRETACION POSITIVA: Aglutinados de GR en grado variable. Graduarla de acuerdo a la Tabla # 1. NEGATIVA: Suspensin homognea de G.R. 4. ANALISIS DE RESULTADOS Despus de observar aguzadamente como se evidencia la reaccin de hemoaglutinacin positiva y diferenciarla de la reaccin negativa, efecte la interpretacin de las lecturas obtenidas en cada tubo o lmina teniendo en cuenta que usted investiga los aglutingenos presentes en los glbulos rojos y las aglutininas presentes en el suero. Haga el anlisis correlacionado de lo efectuado en el laboratorio.
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Resultado: El grupo sanguneo ABO corresponder al resultado tanto de la prueba directa o de deteccin de antgenos como a la de deteccin de aglutininas o anticuerpos. Ser el producto del anlisis comparativo y correlacionado de las dos pruebas y el cual definir el fenotipo ABO del paciente. En caso de existir alguna discrepancia tendr que resolverse antes de informar el grupo del paciente.

Tomado Imgenes internet 5. POST LABORATORIO Analice las dificultades en determinacin de la tipificacin sangunea ABH debidas a discrepancias que se pueden presentar en las pruebas efectuadas realizando un cuadro sinptico. Cmo complementa las pruebas anteriores para la deteccin de los subgrupos sanguneos?. Elabore una tabla. Explique los mtodos que se pueden utilizar para detectar antgenos A, B, H, y los antgenos Lewis en secreciones y tejidos. Investigue la frecuencia en porcentaje de cada uno de los diferentes fenotipos de los hemates en el sistema A, B, O en Colombia consgnelo en un cuadro comparativo o en grficos con la frecuencia en dos pases de diferentes continentes. Investigue fundamento, procedimiento y lectura de las tcnicas en microplaca y en Gel para determinacin del Sistema ABO.

Tomado de Internet. Grupos sanguneos Baha blanca Argentina. 6. INFORME Consigne los resultados por cada uno de los estudiantes que conforman el grupo de trabajo en el laboratorio y /o el de las muestras asignadas por el docente para estudio. ANTICUERPOS ABH OBJETIVOS Determinar el comportamiento serolgico de los anticuerpos relacionados al sistema ABH, efectuando pruebas para detectar anticuerpos naturales y anticuerpos inmunes y diferenciar
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macroscpicamente con ayuda de la lupa, las variaciones cuantitativas de la reaccin de la hemoaglutinacin calificando los diversos grados de reaccin de acuerdo a la escala de valores estandarizadas internacionalmente 2. PRE-LABORATORIO La clasificacin de los anticuerpos de grupo sanguneo por su comportamiento serolgico se basa en los patrones de reaccin Ag-Ac frecuentemente observada con los anticuerpos ABH, mediante la reaccin de la hemoaglutinacin. Los anticuerpos hemolticos, en presencia de complemento, por lo general aglutinan o sensibilizan las clulas. La cantidad del complemento del suero fresco de un donante o paciente, suele ser suficiente para que se produzca una hemlisis visible, se puede aadir complemento exgeno (suero humano AB) para aumentar la sensibilidad. Las cantidades relativas de antgeno, anticuerpo y complemento son crticas para producir un nivel adecuado de hemlisis. Existe cierta correlacin entre las propiedades fsico-qumicas y la actividad serolgica de la mayora de anticuerpos de grupo sanguneo; por lo tanto es indispensable para analizar la variedad de reacciones tener en cuenta las caractersticas de los anticuerpos y en este caso especficamente los relacionados con el sistema ABH, por tanto se deben revisar los siguientes aspectos: 1. Condiciones de reaccin de acuerdo a las propiedades fsico-qumicas de los anticuerpos del sistema ABH 2. Condiciones de las muestras utilizadas para investigar y cuantificar anticuerpos ABH 3. Determine los elementos indispensables para que ocurra el mecanismo de lisis de glbulos rojos mediado por anticuerpos de grupo sanguneo 4. PRACTICA N 2 DETECCION SEMICUANTITATIVA DE ANTICUERPOS AGLUTINANTES. TITULACION DE ISOAGLUTININAS NATURALES 3.1 MATERIALES Tubos de 12 x 75 mm (12), provistos de tapones de caucho o en su defecto de papel adherente. Suero problema fresco (grupo sanguneo A, B u O), GR A 1 y B. Pipeta Pasteur (plsticas). Pipetas automticas con sus respectivas puntas. Suero AB y/o albmina bovina. Solucin salina fisiolgica. 3.2 PROCEDIMIENTO Colocar en la gradilla 10 tubos de 12 x 75 mm (para cada titulacin). Realizar nueve diluciones en base dos a partir de hasta 1/512. 1. De izquierda a derecha colocar: Suero fresco del paciente a titular: 0.1 ml en el primer y segundo tubo. 2. Solucin salina 0.85 % 0.1 ml desde el segundo tubo hasta el tubo 12; mezclar bien el segundo tubo (que corresponde a dilucin ) y pasar 0.1 ml de la mezcla al tercero (cambiar la punta y mezclar), y continuar as sucesivamente hasta el ltimo tubo (cambiando siempre la punta despus de dispensar la dilucin anterior al siguiente tubo y antes de hacer la mezcla de la dilucin). Retirar 0.1 ml de la mezcla del ltimo tubo (en otro tubo aparte debidamente marcado) para posibles diluciones posteriores Cada tubo debe contener 0.1 ml de diluciones dobles de suero, desde suero concentrado hasta dilucin 1/512. Nota: Si se va a titular un suero grupo O para anti A y anti-B, las diluciones deben realizarse al doble, para separar 0.1 ml en un tubo adicional debidamente marcado de cada una de las diluciones para su anlisis.

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Dibujo Elaborado por Andrea vallejo. 2006

3. 4. 5. 6. 7. 8.

Agregar GR en suspensin al 5% 0.1 ml (2 gotas) a cada tubo (glbulos rojos A, si se estn titulando anticuerpos anti-A, glbulos rojos B, si se est titulando anticuerpos anti-B). Incubar 60' a 22 C. Centrifugar todos los tubos a 3.400 r.p.m. x 15. Observe los sobrenadantes para detectar hemlisis. Desprenda los botones de clulas del fondo de los tubos, e incline los tubos en posicin horizontal para observar sobre un fondo bien iluminado, la aglutinacin. Anote los resultados de cada reaccin tubo en mano. NOTA: Observe con detenimiento las variaciones en la calidad de la aglutinacin empezando por las diluciones ms dbiles (mayor ttulo) y terminando con las ms concentradas (ttulo ms bajo). Califique la calidad de la reaccin de acuerdo a la Tabla #1. (Grados de reacciones de hemoaglutinacin). 4. ANALISIS DE RESULTADOS - Despus de calificar las reacciones obtenidas en los tubos establezca el titulo de la isoaglutinina natural A y/o B e informe el resultado de su prueba. - Causas de error: El uso de material sucio o inadecuado induce a error. - Enumere las causas de error inherentes a la muestra, reactivos y procedimientos. 7. POST LABORATORIO Determine la utilidad de la investigacin y cuantificacin de las aglutininas naturales y los anticuerpos inmunes Cul es la contribucin de estas prueba en la determinacin de donantes peligrosos? Cmo se define el ttulo de un anticuerpo? PRACTICA N 3 USO DE LECTINAS PARA DETERMINACIN DE SUBGRUPOS Los extractos salinos de semillas reaccionan con carbohidratos especficos de las membranas celulares y los convierten en reactivos muy tiles para tipificacin especialmente para los subgrupos del Sistema ABO. Es muy usada la lectina extrada del Dolichos biflorus, ya que aglutina los glbulos rojos A1 pero no los A2. La Lectina Dolichus biflorus debe aglutinar los G.R A1 y A1B, pero no debe aglutinar las A2, A2B, B y O. El extracto del Ulex europaeus reacciona con el determinante H; lo aglutina en forma proporcional a la cantidad de H presente (glbulos rojos O> A2> B > A2B> A1> A1B) Leer instrucciones del fabricante.

1. 2. 3.

3.1 MATERIALES Y REACTIVOS 10 Tubos de 12 x 75 mm. Gradilla Pipetas Pasteur o de transferencia

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4. 5. 6.

Solucin Salina 0.85 % Lectina Anti-A1 Lectina Anti-H 3.2 PROCEDIMIENTO

1.

Marcar un tubo por cada muestra de glbulos rojos que se deseen probar, con el # de identificacin y la Lectina a realizar. 2. Lavar los glbulos rojos a analizar durante 3 veces con S.S.F y suspender del 2 al 5 % en S.S.F Continuar con el siguiente procedimiento:
Muestra Control Positivo Control Negativ o ___

3. GR lavados y suspendidos del 2 al 5 % del paciente. 4. GR positivos para la Lectina a evaluar. 5. GR negativos para la Lectina a evaluar 6. Lectina correspondiente 7. Centrifugar a 3.400 r.p.m x 15 segundas.

1 gota ___ ___ 1gota

___ 1 gota ___ 1 gota

1 gota 1 gota

8. Leer y registrar con la lupa la presencia de aglutinacin en la fuente de luz y registrar los resultados tubo en mano.

La lectina Dolichus biflorus debe aglutinar los glbulos rojos A1 y A1 B, no debe aglutinar los A2, A2 B, B y O. La Lectina Ullex europaeus , debe aglutinar los glbulos rojos de acuerdo al siguiente diagrama (Glbulos rojos O > A2 > B > A2B > A 1> A1B). CONTROL DE CALIDAD DE LOS REACTIVOS CELULARES 1. Aspecto: Realizar una inspeccin visual a los reactivos celulares en busca de hemlisis o turbidez. Frecuencia: Diaria. 2. Reactividad y Especificidad: Reacciones netas con los antisueros seleccionados frente a hemates conocidos. Frecuencia: Con cada lote el primer y ltimo da del periodo de caducidad. PEOCEDIMIENTO Marcar nuevos tubos: tres marcados como clulas A, tres como clulas B y otros tres como clulas O. Adicionar:
Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Clulas A Anti- A Anti-B Anti- A, B Clulas B Anti-A Anti-B Anti, A,B Clulas O Anti- A Anti- B Anti, A,B

Mezclar cada tubo y centrifugar en serfuga por 15-30 segundos. Re suspender los botones celulares y observar aglutinacin. POSITIVO: Aglutinacin y/o hemlisis NEGATIVO: Una suspensin uniforme de glbulos rojos.
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Interpretacin: Cada antisuero debe reaccionar especficamente solamente con las clulas que poseen el antgeno correspondiente y no deben reaccionar con clulas que posean antgenos diferentes. CONTROL DE CALIDAD DE LOS ANTISUEROS
Clulas D Positivo Anti-D Antisuero Control Rh Clulas D Negativo

CONTROL DE CALIDAD DE LOS ANTISUEROS ABO Y Rh 1. Aspecto: Ausencia de hemlisis, precipitado, partculas o formacin de Gel a la inspeccin visual. Frecuencia: Diaria 2. Reactividad y Especificidad: Descrito en el segundo punto del control de calidad de reactivos celulares. 3. Potencia: El antisuero no diluido debe dar una reaccin de tres a cuatro cruces en tubo utilizando una suspensin salina de hemates a temperatura ambiente. Frecuencia: Cada nuevo lote. PROCEDIMIENTO 1. Marcar Diez tubos as: 1. (1/1) 2. (1/2) 3. (1/4) 5. (1/8) 6. (1/32) 7. (1/164) 8. (1/128) 9. (1/256) 10. (1/512) 2. Agregar en todos los tubos excepto en el primero, 50 microlitros de solucin salina al 0,85 a 0,9 %. 3. Adicionar al primero y segundo tubo 50 microlitros de antisuero al que se le va a determinar la potencia (anti-A, anti, B, anti-D), cambiar la punta y mezclar el segundo tubo. Transferir 50 microlitros del segundo tubo al tercero y as sucesivamente (cambiando la punta de la pipeta antes de mezclar cada dilucin) hasta el ltimo tubo el N10 4. Adicionar clulas que contengan el antgeno correspondiente al antisuero que se va a titular (Clulas A1, A2, B, Clulas D positivas) 5. Mezclar cada tubo y centrifugar por 15-30 segundos en serfuga. 6. Al terminar la centrifugacin observar el sobrenadante para detectar la presencia de hemlisis. 7. Resuspender los botones celulares y observar aglutinacin. 8. Observar hasta la dilucin en que se observe aglutinacin. POSITIVO: aglutinacin y/o hemlisis NEGATIVO: Una suspensin uniforme de glbulos rojos. Interpretacin: Los ttulos obtenidos a partir de diluciones seriadas de los antisueros deben ser de : 1/128 para anti-A, anti-B y anti A,B usando clulas A1 y B y de 64 con clulas A2 y A2B. Para los antisueros Rh: El suero no diluido debe dar una reaccin de 3+ a 4+, en la prueba designada para cada suero y un ttulo de 1/16 para anti-D, anti-C, anti-E, anti- CD, anti- DE y anti-CDE 4. Avidez: Aglutinacin macroscpica con una suspensin de Hemates al 50% en una prueba en portaobjetos, en un tiempo de 5 segundos para anti- A, anti-B y anti-A,B con clulas A1 y B Para Rh: Usar suspensin al 40% en suero homlogo en portalmina a 40C, la aglutinacin macroscpica debe aparecer a los 30 segundos frente a hemates del fenotipo adecuado Frecuencia: Cada nuevo lote CONTROL DE CALIDAD DE LOS ANTISUEROS DEL SISTEMA ABO
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REQUISITOS MINIMOS PARA EL ANALISIS Tipificaci n ABO Tipificaci n inversa ABO Tipificaci n Rh (D) Uso de clulas A y B

MUESTRAS DE CONTROL O, A, A1B, B y A2 B

FRECUENCIAS

CONTROL EJECUTAD O POR

Tipificacin por duplicado utilizando dos sueros diferentes de anti-D, utilizacin de la AGH para confirmacin del D dbil en los donantes Si se utilizan dos anti- D monoclonales debe comprobarse que el sistema reconozca las variantes del D. Tipificacin por duplicado utilizando dos antisueros por cada factor Rh

Una muestra Rh ( D ) positiva, y una muestra Rh(D) negativa

Cada serie de pruebas o al menos una vez al da siempre que se usen los mismos reactivos

Fenotipo Rh

Para un fenotipo Rh completo: una muestra de cada uno de los tipos

Reactividad y Especificidad:
Reactivo Anti- A Anti-B Anti-D Clulas A Lote F. Exp. Clulas B Lote F. Exp. Clulas O Lote F. Exp.

Potencia:
1/ 1 Anti- A Clulas A1 Clulas A2 Anti- B Clulas B Anti- D Clulas D 1/ 2 1/ 4 1/ 8 1/1 6 1/3 2 1/6 4 1/12 8 1/25 6 1/51 2

Anti-A, Lote: Anti-B, Lote: Anti-D, Lote: Avidez:


Anti suero Anti- A Anti- B Anti- A1B Anti- A2B Anti-D

F exp: F exp: F exp:


Clulas A1 B A1 B A2 B D Tiempo de reaccin

CONTROL DE CALIDAD EN LA DETECCIN DE ANTICUERPOS ERITROCITARIOS


TIPO DE PRUEBA REQUISITOS MINIMOS DE LAS MUESTRAS DE CONTROL FRECUENCIAS CONTROL EJECUTAD

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a) Pruebas para anti-B y anti-B inmunes (en donantes)

PRUEBAS Uso de hemates A y B

O POR Muestras de suero con una cantidad de anti-A y anti-B inmunes, respectivamente superior e inferior al ttulo de aglutinacin directa en salina para anti A y anti B Muestras de suero con aloanticuerpos eritrocitarios conocidos Cada serie pruebas de

b) Pruebas para anticuerpos irregulares en donantes

Uso de la prueba mediante la cual se detectan los anticuerpos con importancia clnica y que reaccionan fuertemente Uso por lo menos de: * Una prueba salina a 37C. * Un test enzimtico. * La prueba AGH indirecta *O una prueba manual o automatizada con sensibilidad equivalente Uso por lo menos de: * Una prueba salina a 37C *La prueba antiglobulina indirecta * O una prueba manual o automatizada con sensibilidad equivalente

c) Pruebas de anticuerpos irregulares (en pacientes)

Lo mismo para (b)

que

Ocasional por parte del supervisor del laboratorio y participacin en ejercicios externos de comprobacin Lo mismo que para (b)

d) Pruebas de compatibilidad

Lo mismo que (c)

Lo mismo (c)

que

PRACTICA N 4 TIPIFICACION SANGUINEA Rh 1. OBJETIVO Determinar la clasificacin sangunea, en relacin al sistema Rh, segundo Sistema sanguneo en importancia despus del ABO, efectuando pruebas que identifiquen los principales antgenos del sistema que se encuentran presentes en una muestra de sangre dada. La prctica incluye la Determinacin del Antgeno D presente en los Glbulos rojos por diferentes mtodos, la investigacin de los cinco principales antgenos del Sistema exceptuando el D, como son: C, c, E, e. Reconocer el inters e importancia clnica de su determinacin. Identificar las caractersticas de los antgenos del sistema y los diferentes reactivos y mtodos existentes para la determinacin de los fenotipos relacionados. Identificar los Genotipos ms probables de acuerdo a los resultados de la fenotipificacin realizada. Analizar las opciones de transfusin para los diferentes componentes sanguneos de acuerdo al Rh de los receptores. 2. INTRODUCCIN El sistema del grupo sanguneo Rhesus es de gran importancia en biologa humana. Es el ms importante despus del Sistema ABO. Su conocimiento permiti lograr transfusiones exitosas despus de la segunda guerra mundial. Su descubrimiento permiti comprender el mecanismo de la enfermedad hemoltica del recin nacido por inmunizacin feto - materna. Dado que la
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mayor parte de la poblacin es Rh positivo, es indispensable que en el laboratorio de Inmunohematologa se utilicen los procedimientos adecuados para establecer la correcta clasificacin para el antgeno D, incluyendo las variantes dbiles y el fenotipo Rh, para lograr disminuir la sensibilizacin eritrocitaria por transfusin o embarazo asociada con este sistema. Los antgenos Rhesus fueron identificados por anticuerpos descubiertos en el suero de sujetos transfundidos o mujeres embarazadas. Estos anticuerpos en su mayora anticuerpos inmunes, que pertenecen a la IgG y son incapaces de aglutinar in-vitro los hemates portadores del antgeno correspondiente, se les denomin anticuerpos bloqueadores o incompletos. Por esta razn se utilizan corrientemente tcnicas de aglutinacin in vitro para comprobar la fijacin del anticuerpo al antgeno especfico mediante modificacin del medio de suspensin de los hemates mediante macromolculas o altas concentraciones de protenas (albmina bovina) o utilizacin de hemates tratados con enzimas; bromelina, papaina, ficina. El antgeno D es el ms importante en transfusin e incompatibilidad feto-materna, dada su gran inmunogenicidad, los restantes antgenos del Sistema pueden tambin ser causa de inmunizacin. La rutina en el laboratorio de Inmunohematologa incluye la determinacin del antgeno D y la deteccin del antgeno D dbil, confirmacin del antgeno D negativo en todos aquellos individuos susceptibles de recibir transfusiones repetidas o en posibles futuras embarazadas a quienes tambin deben identificrseles los 5 antgenos principales del sistema Rhesus. Para la determinacin del antgeno D se utilizan variedades de antisueros cada una de ellas tiene modificaciones o indicaciones especficas para sus uso, para lo pertinente se revisarn algunos aspectos de comportamiento y actividad de dichos antisueros y la utilidad prctica de cada uno de ellos. 3. PRE- LABORATORIO Teniendo en cuenta las variedades de antisueros anti-D que existen comercialmente; explique comparativamente las diferencias existentes y sus diversas aplicaciones. En relacin a la variante dbil del D analice el comportamiento variable frente a los anticuerpos anti-D (Rh). Destaque las condiciones de reaccin indispensables para detectar antgenos Rh. Explique porque se deben emplear en las pruebas de tipificacin Rh controles con sueros inertes. Qu tipo de antisuero debe de usarse en la determinacin del antgeno D en caso de pruebas en tubo con resultado positivo en el control de prueba. Revise y analice a fondo las expresiones D dbil y D parcial y explique en un cuadro las diferencias. Investigue los diferentes tipos de suero de de Coombs existente y los mtodos de obtencin. Revise el fundamento de las pruebas de Coombs, su aplicacin para la deteccin de antgenos dbiles y la aplicacin en la determinacin de la variante D dbil. Explique el fundamento de la prueba. LABORATORIO DETERMINACION DEL FACTOR Rh(D) a. Mtodo en Lmina MATERIALES Y REACTIVOS Lminas portaobjetos, palillos, sangre total, suero anti-D y reactivo control Rh, lmpara con visor de aglutinacin, lupa, pipetas Pasteur. 4.2. PROCEDIMIENTO Leer siempre las instrucciones del fabricante sobre el uso de los reactivos para pruebas en tubo o lmina Colocar sobre una lmina de vidrio previamente calentada a 4C, una gota de suero anti-D, en otra lmina una gota de control Rh o en su defecto albmina bovina al 22%, agregar a cada lmina una gota de sangre una suspensin de hemates en su propio suero al 50%. Mezclar

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 4. 4.1.

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circularmente y extender sobre una superficie de 22 mm x 40 mm utilizando un palillo de madera, dentro de los 2 minutos siguientes oscilando la lmina observar presencia o ausencia de aglutinacin Nota: Siempre debe usarse un control con el fin de que GR sensibilizados con anticuerpos de tipo IgG(incompletos) o procedentes de pacientes cuyo suero posea globulinas sericas anormales, anticuerpos autoinmunes, aglutininas fras o protenas que causen rouleaux, y que pueden agregarse espontneamente sean detectados. 4.3 INTERPRETACION POSITIVO: Aglutinacin de los glbulos rojos. NEGATIVO: Suspensin uniforme de glbulos rojos. Observaciones: Si la preparacin de glbulos rojos en el tubo control presenta aglutinacin; la prueba no se logra interpretar (Esto puede suceder con antisueros de alta concentracin proteica caso en el cual se usa un antisuero salino) Se debe tener cuidado en no leer pasado el tiempo indicado ya que la desecacin en los bordes de la preparacin se puede confundir con aglutinacin. b. Mtodo En Tubo 4.1 MATERIALES Tubos de 12 x 75 mm, suspensin de glbulos rojos 3 - 5%, bao serolgico, anti-D, reactivo control Rh, Pipetas Pasteur. 4.2 PROCEDIMIENTO 1. Lavar los glbulos rojos del paciente con solucin salina fisiolgica (SSF) 0.85 % y preparar una suspensin de glbulos rojos a examinar al 3 - 5 % en SSF. 2. Identificar apropiadamente dos tubos de 12 x 75 mm (para la prueba y su control) y el nmero de identificacin de la muestra. Continuar con el siguiente procedimiento:
Anti-D 3. Dispensar 1 gota o 50 ul Control-Rh ____

4. Agregar ____ 1 gota o 50 ul 5. GR en estudio lavados y 1 gota o 50 ul 1 gota o 50 ul suspendidos del 2 al 5 % 6. Mezclar y Centrifugar a 3.400 r.p.m. (serfuga) por 15, o a 1.000 r.p.m. por 1 minuto. 7 .Resuspender suavemente el botn de las clulas del fondo del tubo y leer la aglutinacin en cruces 8. Si no se observa aglutinacin incubar 15 a 30 minutos a 37C. 9 .Centrifugar, leer y registrar.

4.3 INTERPRETACION POSITIVO: Aglutinacin superior a 2+ antes o despus de incubacin. NEGATIVO: Suspensin uniforme de GR o aglutinacin dbil o dudosa. En este caso continuar con procedimiento para variante dbil. PRACTICA N 5 DETERMINACIN DEL FENOTIPO Rh 3.1 MATERIALES Y REACTIVOS -6 Tubos de 12 x 75 mm, Bao de Mara, Serfuga, Lmpara, Lupa. -Antisueros: Anti- C, anti E, Anti- c, Anti- e. -Solucin salina 0.85 %. 3.2 PROCEDIMIENTO 1. Lavar los glbulos rojos 3 o 4 veces y suspender del 2 al 5 %. 2. Marcar un tubo por cada antgeno a determinar, con la letra correspondiente al antgeno y el # de identificacin de la muestra. 4. INTERPRETACIN
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POSITIVO: Se observa aglutinacin en grado variable. NEGATIVO: Suspensin homognea de los glbulos rojos 5. POS LABORATORIO 1. Para la tipificacin Rh se pueden emplear antisueros monovalentes y polivalentes, especficamente determine la importancia de utilizar sueros anti-CD, y anti-CDE. 2. Considera usted que en un paciente D negativo que va a recibir una transfusin sangunea es importante realizar el fenotipo Rh y porque? 3. Por qu se debe determinar el fenotipo del sistema Rh en todas las personas Rh D: Negativo? 4. Revise las principales nomenclaturas internacionales para identificar los diferentes fenotipos del sistema Rh PRACTICA N 6 DETERMINACION DE LA EXPRESIN DBIL DEL ANTIGENO D 3.1. MATERIALES Y REACTIVOS Tubos de 12 x 75 mm, Antisuero anti-D (Rh), suero de Coombs, Albmina bovina al 30% control de Coombs. 3.2. PROCEDIMIENTO 1. Lavar los glbulos rojos del paciente con SSF al 0.85 % y preparar una suspensin de glbulos rojos a examinar al 3-5 % en SSF. 2. Identificar apropiadamente dos tubos de 12 x 75 mm (para la prueba y su control) y el nmero de identificacin de la muestra. Continuar con el siguiente procedimiento:
3. Dispensar 4. Agregar 5. GR en estudio lavados y suspendidos del 2 al 5 % 6. Incubar a 37C por 30 minutos Anti-D 1 gota ____ 1 gota Control-Rh ____ 1 gota 1 gota

7. Centrifugar y leer. Si el resultado es positivo no continuar. Si es Negativo o dudoso continuar con el siguiente paso. 8. Lavar 3 4 veces en solucin salina 6. Agregar suero de Coombs poliespecfico 7. Centrifugar a 3.400 r.p.m. x 15 8. Leer por aglutinacin 9. Si es negativa la prueba aadir solo una gota de control de Coombs. Mezclar, centrifugar, leer por aglutinacin. 1 a 2 gotas 1 a 2 gotas

3. 1.

INTERPRETACIN DEL RESULTADO La presencia de aglutinacin en el tubo con anti- D, pero no en el de Control, constituye un resultado positivo. La sangre debe clasificarse como D positivo ya que tiene una expresin Dbil del Antgeno D. 2. La ausencia de aglutinacin en el tubo con anti- D constituye un resultado negativo e indica que las clulas no expresan D y deben clasificarse como D negativo.

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4. ANALISIS DE RESULTADOS 7. POST LABORATORIO Cmo se rotulan las bolsas de sangre obtenidas de donantes con prueba de expresin Dbil del Ag D: positiva? Revisar los criterios de transfusin en donantes y receptores que presentan una expresin dbil del Ag D Positiva. Analice la importancia de determinar la presencia de un antigeno D dbil en una materna y explique?. PRACTICA N 7 DETERMINACIN DE FENOTIPO EXTENDIDO 1. OBJETIVOS Determinar la presencia de los antgenos eritrocitarios ms importantes de los Sistemas de Grupos sanguneos principales. 2. PRE LABORATORIO 1. Defina fenotipo eritrocitario. 2. Investigue tipo de muestra que se emplea para determinacin del fenotipo eritrocitario y condiciones de las mismas. 3. Revise la frecuencia de los fenotipos en raza blanca y raza negra para los siguientes Sistemas: Kell ( K+ k-), (K-k+), (K+k+), (K-k-). Duffy (Fya + Fyb-), (Fya Fyb+), (Fya + Fyb+), (Fya- Fyb-). Kidd (Fya + Fyb-), (Fya Fyb+), (Fya + Fyb+), (Fya- Fyb-). MNSsU: Principales combinaciones Lewis (Lea+Leb-), (Lea-Leb+), (Lea+Leb+), (Lea-Leb-). Lutheran (Lua+Lub-), (Lua-Leb+), (Lua+Lub+), (Lua-Lub-). 4. Revisar el fundamento de la prueba de antiglobulina indirecta aplicada a la determinacin de antgenos eritrocitarios. 3. LABORATORIO

3.1 MATERIALES Y REACTIVOS Tubos de 12 x 75 mm de fondo redondo. Suero de Coombs poliespecfico (Anti- IgG y anti- complemento) Solucin salina. Muestra de sangre anticoagulada del paciente. 3.2 PROCEDIMIENTO PARA DETECCIN DE FENOTIPOS EN FASE DE ANTIGLOBULINA
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Casa comercial Sanquin .Reactivo para raros grupos sanguneos. Mtodo AGT (k, Kpa, Kpb, Fya, Fyb, Lua. Lub, s, Wra)
Muestra 1. Agregar reactivo policlonal correspondiente. Leer instrucciones del fabricante. 2. Preparar una suspensin de G.R del paciente del 3 al 5 % previamente lavados en SSF al 0.85 % Mezclar suavemente Incubar de 15 a 20 minutos a 37o C 3. Lavar las clulas en solucin salina tres o cuatro veces. Centrifugar y decantar muy bien despus de cada lavada. Eliminar completamente el sobrenadante final. 4. Suero de Coombs (una o dos gotas, segn recomendacin del fabricante). 5. Mezclar. Centrifugar (30" en serfuga a 3.400 r.p.m) 6. Leer por aglutinacin y registrar. 7. Si no se observa aglutinacin en los tubos aadir control de Coombs. 1 gota 1 gota Segn fabricante ________ 1 gota Controles 1 gota

1 gota

1 gota

8. Centrifugar. Examinar por aglutinacin, si la prueba fue realizada correctamente debe dar 2+ a 3+ de aglutinacin.*

4. INTERPRETACION POSITIVA: Aglutinacin. Indica la presencia del antgeno correspondiente.( Se debe reportar la afinidad de la reaccin. (Escala de Cruces) NEGATIVA: Suspensiones homogneas. Indica la ausencia del antgeno correspondiente. Nota: Probar siempre los resultados negativos con clulas control de Coombs Para validar la prueba debe existir aglutinacin al agregar las clulas, centrifugar y leer, 5. LIMITACIONES DE LA PRUEBA Resultados positivos inesperados a causa de: poliaglutinacin, autoaglutinacin, reaccin de aglutinacin mixta. Resultados negativos o dbiles a causa de antgenos dbiles, reaccin de aglutinacin mixta, actividad reducida del reactivo. Clulas rojas con PAD Positiva producen un resultado Falso positivo. 3.3 PROCEDIMIENTO PARA DETECCIN DE FENOTIPOS POR AGLUTINACIN EN PRUEBA DIRECTA Casa comercial Sanquin (M, N) IgG y (S, P 1, Lea, Leb) IgM monoclonales
Muestra 1. Agregar el reactivo monoclonal (IgM) correspondiente. Leer instrucciones del fabricante. 2. Preparar una suspensin de G.R del paciente del 2 al 5 % previamente lavados en S.S al 0.85 % 1 gota Controles 1 gota

1 gota

1 gota

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Mezclar suavemente Incubar de 5 a 15 a temperatura ambiente( 18 a 25 oC)

3. Centrifugar (30" en serfuga a 3.400 r.p.m) 4. Leer por aglutinacin y registrar.

4. INTERPRETACION POSITIVA: Aglutinacin. Indica la presencia del antgeno correspondiente.( Se debe reportar la afinidad de la reaccin. (Escala deCruces) NEGATIVA: Suspensiones homogneas. Indica la ausencia del antgeno correspondiente. 5. LIMITACIONES DE LA PRUEBA Resultados positivos inesperados a causa de: pseduiaglutinacin, autoaglutinacin, reaccin de aglutinacin mixta, presencia de gelatina de Wharton en las clulas de cordn umbilical. Resultados negativos o dbiles a causa de antgenos dbiles, reaccin de aglutinacin mixta, actividad reducida del reactivo. Clulas rojas con PAD Positiva pueden producir un resultado Falso positivo. Para estos casos se recomienda usar un control monoclonal inerte. 3.4 DETERMINACIN DE FENOTIPOS JKa y JKb (IgM) con antisuero Monoclonal. Casa comercial Sanquin
Muestra 1. Agregar el reactivo monoclonal (IgM) correspondiente. Leer instrucciones del fabricante. 2. Preparar una suspensin de G.R del paciente del 3 al 5 % previamente lavados en S.S al 0.85 % Mezclar suavemente Incubar de 5 a 15 minutos a temperatura ambiente( 37 oC) 3. Centrifugar (30" en serfuga a 3.400 r.p.m) 4. Leer por aglutinacin y registrar. 1 gota Controles 1 gota

50 ul

50 ul

4. INTERPRETACION POSITIVA: Aglutinacin. Indica la presencia del antgeno correspondiente.( Se debe reportar la afinidad de la reaccin. (Escala de Cruces) NEGATIVA: Suspensiones homogneas. Indica la ausencia del antgeno correspondiente. 5. LIMITACIONES DE LA PRUEBA Resultados positivos inesperados a causa de: pseudoaglutinacin, autoaglutinacin, reaccin de aglutinacin mixta, presencia de gelatina de Wharton en las clulas de cordn umbilical. Resultados negativos o dbiles a causa de antgenos dbiles, reaccin de aglutinacin mixta, actividad reducida del reactivo. Clulas rojas con PAD Positiva pueden producir un resultado Falso positivo. Para estos casos se recomienda usar un control monoclonal inerte.
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3.5 PROCEDIMIENTO PARA DETERMINACIN DE FENOTIPOS Cw, Jka, Jkb, M y anti N. Casa Comercial Diagast ( Reactivos con anticuerpos monoclonales de tipo IgM obtenidos a partir de sobrenadantes de cultivos in vitro de hibridomas de origen humano)
Muestra 1. Agregar el reactivo monoclonal (IgM) correspondiente. Leer instrucciones del fabricante. 2. En tubo plstico preparar una suspensin al 5 % en S.S isotonica de los G.R sin lavar del paciente. Mezclar suavemente 3. Centrifugar (30" en serfuga a 3.400 r.p.m) 4. Leer por aglutinacin y registrar. 1 gota Controles 1 gota

50 ul

50 ul

4. INTERPRETACION POSITIVA: Aglutinacin. Indica la presencia del antgeno correspondiente. NEGATIVA: Suspensiones homogneas, indican la ausencia del antgeno correspondiente. 3.6 PROCEDIMIENTO PARA LA DETERMINACIN DE FENOTIPO Lea Diagast
Muestra 1. Agregar el reactivo monoclonal (IgM) correspondiente. Leer instrucciones del fabricante. 2. En tubo plstico preparar una suspensin al 5 % en S.S isotonica de los G.R sin lavar del paciente. 3. Agregar PALERM( PAPAINA) 1 gota Controles 1 gota

50 ul

50 ul

1 gota

1 gota

Incubar los tubos 5 minutos entre 18 y 25 oC 4. Mezclar por agitacin suave y centrifugar (30" en serfuga a 3400 r.p.m) 4. Leer por aglutinacin inmediatamente y registrar.

4. INTERPRETACION POSITIVA: Aglutinacin. Indica la presencia del antgeno correspondiente. NEGATIVA: Suspensiones homogneas, indican la ausencia del antgeno correspondiente. 3.7 ROCEDIMIENTO PARA LA DETERMINACIN DE FENOTIPO Leb Diagast
Muestra 1. Agregar el reactivo monoclonal (IgM) correspondiente. Leer instrucciones del fabricante. 2. En tubo plstico preparar una suspensin al 5 % en S.S isotonica de los G.R sin lavar del paciente. 1 gota Controles 1 gota

50 ul

50 ul

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3. incubar los tubos 15 minutos entre 18 y 25 oC 4. Mezclar por agitacin suave y centrifugar (30" en serfuga a 3400 r.p.m) 5. Leer por aglutinacin inmediatamente y registrar.

4. INTERPRETACION POSITIVA: Aglutinacin. Indica la presencia del antgeno correspondiente. NEGATIVA: Suspensiones homogneas, indican la ausencia del antgeno correspondiente. 3.6. ROCEDIMIENTO PARA LA DETERMINACIN DE FENOTIPO P1. Diagast
Muestra 1. Agregar el reactivo monoclonal correspondiente. Leer instrucciones del fabricante. 2. En tubo plstico preparar una suspensin al 5 % en S.S isotonica de los G.R sin lavar del paciente. 1 gota Controles 1 gota

50 ul

50 ul

3. Mezclar por agitacin suave y centrifugar (30" en serfuga a 3.400 r.p.m). 4. Leer por aglutinacin inmediatamente y registrar. 5. Si no se observa aglutinacin, incubar los tubos de 2 a 8 C por 30. 6. Mezclar por agitacin suave y centrifugar (30" en serfuga a 1.500 r.p.m).

4. INTERPRETACION POSITIVA: Aglutinacin. Indica la presencia del antgeno correspondiente. NEGATIVA: Suspensiones homogneas, indican la ausencia del antgeno correspondiente. 8. POST LABORATORIO 1. Cules son las aplicaciones en la clnica del fenotipaje extendido. 2. De acuerdo a los resultados obtenidos, compare su fenotipo con los conocidos para cada una de las razas. 3. Determine cuales son los principales antgenos teniendo en cuenta su naturaleza qumica y su capacidad para que los anticuerpos correspondientes se encuentren involucrados en E.H.R.N y R.T inmunes. PRACTICA N 8 PRUEBA DE COOMBS DIRECTA (D.A.T.) 1. OBJETIVOS Demostrar glbulos rojos sensibilizados in-vivo al poner en evidencia globulinas anticuerpos que se han adherido a los eritrocitos in-vivo mediante el empleo de la antiglobulina humana. Es til en anemias hemolticas autoinmunes, enfermedad hemoltica del recin nacido, hemlisis inducida por drogas, reacciones aloinmunes contra eritrocitos recientemente transfundidos. 1. PRE LABORATORIO 1. Defina un GR sensibilizado 2. Analice los diferentes grados de sensibilizacin de un GR y las concentraciones o proporciones de anticuerpos que pueden evidenciarse con el suero Coombs.
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3. Referente al suero de Coombs; detalle el procedimiento de obtencin y preparacin del suero de Coombs. 4. Describa las variedades del suero de Coombs y establezca las diferencias entre dichas variedades. 5. Analice las aplicaciones y utilidad del suero de Coombs 6. Determine las variedades y condiciones de las muestras que se emplean. 7. Fundamentos de la prueba de Coombs directo. 8. Funcin del suero de Coombs y la reaccin de hemoaglutinacin. 3. LABORATORIO 3.1 MATERIALES Y REACTIVOS Tubos de 12 x 75 mm Suero de Coombs poliespecfico (Anti- IgG y anti- complemento) Solucin salina. Muestra de sangre anticoagulada del paciente. Albmina bovina al 6 % en suspensin que se prepara diluyendo albmina bovina al 22 % o 30 % en solucin salina. 3.2 PROCEDIMIENTO
Muestra 1. Suspensin de G.R del paciente del 2 al 5 % 1 gota Control 1 gota

2. Lavar las clulas en solucin salina tres o cuatro veces. Centrifugar y decantar muy bien despus de cada lavada. Eliminar completamente el sobrenadante final. 3. Albmina bovina al 6 % 4.. Suero de Coombs (una o dos gotas, segn recomendacin del fabricante). Segn fabricante 2 gotas ________

5. Mezclar. Centrifugar (30" en serfuga en centrifuga a 1.500 r.p.m. por 1-2 minutos) 6. Leer por aglutinacin o hemlisis y registrar. 7. Si no se observa aglutinacin en el tubo Muestra aadir control de Coombs. 1 gota

8. Centrifugar. Examinar por aglutinacin, si la prueba fue realizada correctamente debe dar 2+ a 3+ de aglutinacin.*

* Si el Coombs es poliespecifico o C3d incubar 5 minutos a T ambiente, centrifugar y leer. 4. INTERPRETACION PAD POSITIVA: Aglutinacin. Se debe reportar el grado de aglutinacin (Escala de Cruces) PAD NEGATIVA: Suspensiones homogneas Probar siempre los resultados negativos con clulas control de Coombs Para validar la prueba debe existir aglutinacin al agregar las clulas, centrifugar y leer, 5. ANALISIS Y RESULTADOS Analice detalladamente el papel de control de Coombs que se utiliz en la prueba. Describa otras formas de controlar las pruebas. Identifique las causas de error 8. POST LABORATORIO 4. Determine las causas de una prueba antiglobulina Directa Positiva. 5. Cul es el resultado de las pruebas De Coombs Directo en las E.H.R.N por ABO y en la E.H.R.N por Rh.
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6.

En qu consiste la prueba de Coombs Fraccionado? y explique cual es su valor diagnstico. 7. Explique si es posible encontrar PAD Negativo en pacientes con AHAI y porqu? PRACTICA N 9 PRUEBA DE COOMBS INDIRECTO (I.A.T. o PAI o RAI) 1. OBJETIVOS Detectar en el suero del paciente la presencia de Anticuerpos incompletos de diversos grupos sanguneos diferentes a los del Sistema ABO, incapaces de aglutinar directamente los hemates pero capaces de adherirse (sensibilizar) a los GR in- vivo o in-vitro, y posteriormente demostrarse con la adicin del suero de Coombs. Est prueba tiene gran utilidad en la deteccin e identificacin de anticuerpos irregulares, agrupacin de la sangre y pruebas de compatibilidad. 2. PRE LABORATORIO SENSIBILIZACION IN-VITRO En un primer tiempo se ponen los hemates lavados que poseen el antgeno correspondiente a los anticuerpos a investigar con el suero del paciente, Si el suero contiene anticuerpos irregulares estos se fijaran sobre los hemates que poseen el antgeno correspondiente. Los hemates sensibilizados al adicionar el suero de Coombs se evidenciarn mediante aglutinacin. Revise: 1. Clases de anticuerpos que se detectan con la prueba del Coombs Indirecto. 2. En qu casos se debe utilizar la prueba de Coombs a diferentes temperaturas? 3. Cul es el valor diagnstico de la prueba I.A.T 3. LABORATORIO 3.1 MATERIALES Y REACTIVOS - Tubos de 12 x 75 mm. - Suero de Coombs de amplio espectro. - Solucin salina fisiolgica. - Suero del paciente fresco. - Glbulos rojos reactivos o Glbulos rojos O Positivo - Albmina bovina al 6% o Solucin de baja fuerza inica. - Pipetas de transferencia 3.2 PROCEDIMIENTO Se emplean glbulos rojos comerciales, existen en diferentes presentaciones, tres clulas, dos clulas o una clula. La presentacin en varias clulas permite tener mayor nmero de clulas con antgenos de expresin homocigota lo cual facilita la deteccin de anticuerpos. Las clulas deben ser del grupo 0 y expresar los antgenos de grupos sanguneos principales como son: D, C, E, c, e, f, Cw, K, k, Fya, Fyb, Jka, Jkb, Xg, Lea, Le, S, s, M, N, P, Lua. Estos dos grupos de glbulos rojos son provenientes de dos donantes con los siguientes fenotipos de Rh: Rh1 (Dce) y Rh2 (DcE) y vienen suspendidos al 3% en una solucin de Alsevers modificada. nicamente en caso de investigacin de anticuerpos Rho D se pueden utilizar en lugar de glbulos rojos comerciales; glbulos rojos O Rho D positivos lavados tres veces y suspendidos del 2 al 5 % en S.S. fisiolgica. El suero del paciente a investigar debe ser fresco, noms de 24 horas despus de la recoleccin. Debe estar libre de hemlisis y separado prontamente despus de recolectado. Hasta el momento del anlisis congelar para preservar el complemento. En toda investigacin de anticuerpos irregulares es importante la Historia del paciente como:
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1. 2. 1-

Historia de embarazos y abortos. Transfusiones anteriores. Marcar el nmero de tubos de acuerdo a las clulas a usar. Se debe emplear un tubo por clula y un autocontrol. Continuar el procedimiento de acuerdo al cuadro que sigue:
2. Suero del paciente 3. G.R reactivos del 2 al 5 % I 2 gotas 1 gota -------II 2 gotas 1 gota ------Autocontrol 2 gotas --------

4. G.R del paciente lavados y 1 gota suspendidos del 2 al 5 % 5. Centrifugar, leer y registrar. 6. albmina bovina o solucin de 2 2 2 gotas baja fuerza inica gotas gotas 7. Incubar a 37C por 30 en el caso de usar albmina y 10 a 15 minutos para solucin de baja fuerza inica.). 8. Centrifugar de 15 a 45 segundos. 9. Leer* 10. Lavar tres a cuatro veces con solucin salina fisiolgica. 11.Decantar perfectamente los tubos. 12. Suero poliespecfico de Coombs 2 2 gotas gotas 13. Centrifugar a 3.400 r.p.m. x 15 o a 1.000 r.p.m. x 1 minuto 2 gotas

14. Leer desprendiendo el botn de clulas del fondo del tubo aglutinacin por cruces y registrarlo.

observando

la

Nota: A los tubos con resultado negativo agregar 1 gota de Control de Coombs, centrifugar y leer. Debe producirse una aglutinacin de 2 + a 3+ para validar la prueba,

* Observar la presencia de hemlisis en el sobrenadante, resuspender sobre la lmpara y usando la lupa para observar la aglutinacin. Registrar los resultados. Si hay aglutinacin graduarla segn escala. 6. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES - Siempre que tengamos un resultado positivo se debe identificar el anticuerpo. - El suero debe ser congelado para investigaciones posteriores. - En caso de que el paciente sea una mujer embarazada se debe realizar la cuantificacin del anticuerpo. 7. POST LABORATORIO Identifique los resultados falsos positivos y falsos negativos de las pruebas de Coombs. Cul es el valor Crtico de las pruebas de Coombs indirecto cuantitativo en la Enfermedad Hemoltica del Recin Nacido? En que se diferencia una prueba de Coombs Indirecto y un Rastreo de Anticuerpos Irregulares (RAI) PRACTICA N 10 IDENTIFICACION DE ANTICUERPOS 1. OBJETIVO Determinar la especificidad y el significado clnico de los anticuerpos irregulares presentes en una muestra de suero. 2. PRE- LABORATORIO La identificacin de anticuerpos se realiza utilizando un panel de clulas obtenidas de 11 donantes envasadas individualmente y organizadas de tal forma que la combinacin de
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reacciones positivas o negativas puedan dar perfectamente clara la identificacin del anticuerpo problema. Cada uno de estos donantes ha sido fenotipado para los principales antgenos de los ms importantes grupos sanguneos menores y su fenotipo viene especificado en la tabla anexa al reactivo. El principio de esta prueba, es el de hacer reaccionar el suero del paciente a investigar, con cada una de las clulas a T ambiente, a 37C y Coombs, esto dar mayor seguridad de identificacin. Est identificacin tiene gran valor en pacientes que van a ser transfundidos y tienen un rastreo de anticuerpos positivo, maternas con rastreo de anticuerpo positivo y pacientes con enfermedad hemoltica autoinmune. 3. LABORATORIO 3.1. MATERIALES 12 tubos de 10 x 75 mm, pipetas de Pasteur, serfuga, calentador seco o bao Mara, albmina bovina o solucin de baja fuerza inica, solucin salina, control de Coombs, suero del paciente en congelacin, panel de clulas,. 3.2 TCNICAS Y PROCEDIMIENTOS Marcar los tubos de 1 a 12 el ltimo es auto control Colocar dos gotas de suero para investigar en cada uno Colocar en cada uno una gota de la clula correspondiente, el auto control (tubo No. 12) lleva clulas del propio paciente, lavadas y suspendidas al 3% Dejar los tubos a T ambiente 10', antes de centrifugar Centrifugar siguiendo las instrucciones dadas en las investigaciones de anticuerpos Observar microscpicamente por aglutinacin o hemlisis. Anotar los resultados en hojas especiales que vienen con el panel (Solucin Salina a T ambiente) Agregar dos gotas de albmina bovina o LISS en cada tubo. Centrifugar, leer y anotar Incubar todos los tubos a 37C x 15 a 30' si se usa albmina o 10 a 15 si se usa LISS. Centrifugar a 3.400 r.p.m. (serfuga) 30", leer y anotar resultados. 10. Lavar tres o cuatro veces. Agregar 1-2 gotas (depende del fabricante) de suero de Coombs a todos los tubos. 11. Centrifugar, leer y anotar. Determinar mediante la exclusin de posibilidades, el anticuerpo presente. 12. Confirmar mediante tipificacin para el antgeno correspondiente, que el paciente es negativo para el antgeno. NOTA: En algunos casos, no pueden encontrarse la especificidad del anticuerpo usando este panel, pero las casas comerciales estn en capacidad de suministrar otro panel (panel raro) para la identificacin de estos anticuerpos menos comunes Existe adems, la posibilidad de encontrar mltiples anticuerpos en un solo paciente, cuando esto se presenta, hay necesidad a veces de utilizar clulas adicionales. 7. POST LABORATORIO Defina: Anticuerpo clnicamente significativo. Qu valor tiene esta prueba de identificacin de Acs irregulares en estudio prenatales? Explique la importancia de identificar el anticuerpo irregular presente en el suero de un paciente que va a ser transfundido. Despus de realizar la Identificacin del o los anticuerpos irregulares por medio del panel de clulas como podra corroborar su especificidad. PRACTICA N 11 TITULACIN DE ANTICUERPOS PARA LA DETECCIN PRECOZ DE LA E.H.R.N 1. INTRODUCCIN

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9.

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La titulacin es un mtodo semicuantitativo para la determinacin de la concentracin de anticuerpos. Se preparan diluciones seriadas de suero y se evala la actividad de los anticuerpos. El ttulo es la inversa de la dilucin ms alta de plasma o suero que exhibe una reaccin de 1 +.Ej: Dilucin de 1 en 128, ttulo = 128. Durante el embarazo, la titulacin de anticuerpos se realiza para identificar las mujeres con niveles significativos de anticuerpos que podran llevar a enfermedad hemoltica del recin nacido (E.H.R.N) y, en el caso de los anticuerpos en ttulos bajos, establecer un valor basal para compararlos con los de titulaciones posteriores. 2. OBJETIVO Determinar la concentracin de anticuerpos de importancia clnica en muestras de suero con el fin de que sirvan para el pronstico clnico de la posible E.H.R.N, siendo de gran ayuda para el seguimiento y manejo de la misma desde la etapa gestacional. 3. PRE LABORATORIO Los anticuerpos presentes en una muestra de suero fresca, se encuentran en concentraciones desconocidas, por lo cual se requiere de la realizacin de tcnicas que incluyen la dilucin del suero y posterior unin con los G. R reactivos y posterior uso de la antiglobulina humana, para encontrar el ttulo mximo en que es capaz de aglutinarlos. De igual manera es importante conocer la potencia (score) del anticuerpo para lo cual est prueba es de gran valor. Responda las siguientes preguntas: 1. Cuales serian los criterios para seleccionar las clulas que se deben usar para la cuantificacin de anticuerpos irregulares? 2. Qu tipo de anticuerpos presentes en una madre gestante tendran importancia clnica para ser cuantificados? 4. LABORATORIO 4.1 REACTIVOS 1. Anti- inmunoglobulina humana. 2 Albmina bovina diluida (al 6 % p/v); opcional albmina bovina al 22 %(p / v), 1 ml; solucin salina isotnica, 3 ml. 3 Pipetas: de 0,1- 0,5 ml, con extremos descartables. 4 Glbulos rojos (GR): GR reactivos del grupo O, con doble dosis de los antgenos pertinentes (para titulacin de anti- D, usar GR R2R2); lavar tres veces y suspender al 2 % en solucin salina isotnica. 5. Solucin salina. (Nota: si se desea las diluciones pueden realizarse con albmina.) 4.2 MUESTRAS Suero para titulacin (con potenciales anticuerpos irregulares significativos, contra antgenos eritrocitarios), 1ml. Si es posible, analizar la muestra actual en paralelo con el suero previo ms reciente del embarazo en curso( el cual debe mantenerse en congelacin -30C). 4.3. CONTROL DE CALIDAD 1. Evaluar una muestra previa en paralelo con la actual. 2. Preparar las diluciones utilizando una pipeta separada para cada tubo. En caso contrario, podran registrarse ttulos altos falsos. 3. Confirmar las reacciones negativas con GR recubiertos con IgG (vase el paso 9). 4. PROCEDIMIENTO 1. Colocar en la gradilla 12 tubos de 12 x 75 mm. (para cada titulacin). Realizar nueve diluciones en base dos a partir de hasta 1/2048. 2. De izquierda a derecha colocar: Suero: 0.1 ml en el primer y segundo tubo. El primer tubo corresponde a una dilucin 1/1 o suero sin diluir; la dilucin significa un volumen de suero en un volumen final de dos o una solucin al 50% de suero en el diluyente. 3. S.S.F* al 0.85% 0.1 ml desde el segundo tubo hasta el tubo 12; mezclar bien el segundo tubo (que corresponde a dilucin ) y pasar 0.1 ml de la mezcla al tercero (cambiar
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la punta y mezclar), continuar as sucesivamente hasta el ltimo tubo (cambiando siempre la punta despus de dispensar la dilucin anterior al siguiente tubo y antes de hacer la mezcla de la dilucin). Retirar 0.1 ml de la mezcla del tubo (en otro tubo) para posibles diluciones posteriores Cada tubo debe contener 0.1 ml de diluciones dobles de suero, desde suero concentrado hasta dilucin 1/2048. Tomar 0.1 ml de la ultima dilucin a un tubo limpio marcado y reservarla. 4. Agregar 0.1 ml de GR de expresin homocigota para el antgeno correspondiente al anticuerpo a titular en suspensin del 2 al 5 %. Agitar suavemente. 5. Incubar 1 hora a 37C. Lavar cuatro veces con S.S.F. Decantar completamente el sobrenadante. Agregar suero de Coombs de acuerdo a recomendaciones del fabricante. Centrifugar a 3.400 r.p.m x 15 . Leer y registrar las reacciones. La lectura debe iniciarse por el tubo con el suero ms diluido y continuar con los ms concentrados. A los tubos negativos agregarles control de Coombs para evidenciar la actividad del suero de Coombs. Nota: Cuando los G.R recubiertos con IgG son negativos; se deben repetir las pruebas. * Se pueden realizar las diluciones en albmina al 6 % 5. INTERPRETACIN 1. Observar la dilucin ms alta que produce aglutinacin macroscpica de 1+. 2. El ttulo es la inversa de la dilucin y se informa como, por ejemplo, 32 y no 1 en 32 ni 1:32 3. Se considera que los ttulos > o = a 16 son significativos y podran sealar la necesidad de monitorear la EHRN por cordocentesis, ecografa o espectofotometra del lquido amnitico para identificar la presencia de bilirrubina. 4. Cuando el ttulo es < de 16 y la especificidad de los anticuerpos se asocia con EHRN, es aconsejable repetir la titulacin cada 2 a 4 semanas, a partir de la semana 18 de gestacin; conservar una alcuota de suero ( congelada a -20 C o menos ) para realizar estudios comparativos con la prxima muestra. 5. Si se advierte aglutinacin en el tubo con el suero ms diluido, no se alcanzo el punto final y se debe continuar con diluciones adicionales a partir del tubo de dilucin que se haba reservado. 6. Se debe obtener el Score o puntaje a la afinidad de las reacciones. Nota: Est prueba es semicuantitativa y muchos factores intervienen en sus resultados. 6. POS LABORATORIO Cul es el valor clnico de los estudios de titulacin de anticuerpos en mujeres embarazadas? Cules son las variables que afectan los resultados en las pruebas de Titulacin de anticuerpos? Cules son los ttulos que podran considerarse con significado clnico y podran sealar la necesidad de monitorear la E.H.R.N? PRACTICA No. 12 PRUEBAS CRUZADAS OBJETIVO Establecer la compatibilidad entre el donador y el receptor, mediante la utilizacin de procedimientos que permitan detectar los anticuerpos presentes en el receptor, que puedan lesionar GR del donador en el momento de ser transfundidos; y detectar los anticuerpos que se encuentren en el donador y puedan ser perjudiciales al receptor. PRE LABORATORIO Explique en que consiste la prueba cruzada mayor Explique en que consiste la prueba cruzada menor Determine la importancia y la utilidad de estas pruebas

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Precise las limitaciones de las pruebas para detectar todos los errores relacionados a la clasificacin sangunea 5. Relacione los requerimientos de los diferentes anticuerpos con la ejecucin de las pruebas en diferentes condiciones de reaccin 3. LABORATORIO 3.1 MATERIALES Y REACTIVOS Tubo de 12 x 75 mm, gradilla, pipetas, solucin salina, albmina bovina al 30%, suero de Coombs, sangre del donador con anticoagulante y coagulada, sangre del receptor anticoagulante y coagulada. 3.2 PROCEDIMIENTO
Mayor Menor Suero del receptor 2 gotas ____ Suero del donador ____ 2 gotas GR del donador lavados y suspendidos de 2 al 5 % 1 gota ____ GR del receptor lavados y suspendidos del 2 al 5 % ____ 1 gota Mezclar. Centrifugar a 3.400 r.p.m x 15 * Leer. Registrar. Si no observa aglutinacin agregar: Albmina bovina al 22 % 0 30 % o LISS 1 gota 1 gota Incubar 10 a 15 en caso de usarse LISS y 15 a 30 si se usa albmina. Centrifugar 30 a 3.400 r.p.m y leer. Registrar. Si no hay aglutinacin lavar tres veces con S.S. al 0.85 %. Suero de Coombs 2 gotas 2 gotas Centrifugar, leer y registrar. Si no observa aglutinacin adicione una gota de clulas control de Coombs al tubo muestra y valide la prueba.

* Si se observa aglutinacin en este paso se demuestra incompatibilidad ABO por centrifugacin inmediata o presencia de anticuerpos irregulares contra los antgenos eritrocitarios. 4. ANLISIS DE RESULTADOS Despus de determinar la lectura de las pruebas, determine los resultados que indiquen compatibilidad y los que indiquen incompatibilidad 5. AUTO EVALUACION. Describa las debilidades y fortalezas que encontr en la prctica Qu aport usted para el desarrollo de la prctica 6. POST LABORATORIO 1. Aplique un mtodo de SELECCIN EFECTIVA de las PRUEBAS MINIMAS que deben efectuarse en el laboratorio de Inmunohematologa justificando la necesidad de efectuar dichas pruebas. (Tenga en cuenta que pueden existir reacciones dependiendo del componente que se transfunde) 2. Realice un cuadro que defina los criterios de transfusin teniendo en cuenta los resultados obtenidos en la prueba cruzada entre donante y receptor y el rastreo de anticuerpos de los receptores, en cada caso en particular. 3. Realice los algoritmos correspondientes a las pruebas de compatibilidad obligatorias a realizar en caso de: a. Emergencia. b. Urgencia c. Reserva de sangre PROCEDIMIENTOS EN GEL CENTRIFUGACIN Dia-med Los procedimientos en Gel Centrifugacin de la casa comercial Dia-Med utilizan dos diluyentes el Diluyente 1 que es Bromelina y el Diluyente 2 Liss. Segn el procedimiento a realizar se utilizan el diluyente 1 o el 2. Clasificacin ABO y D Prueba directa Se realiza una dilucin como sigue: 500 micolitros de Diluyente 2 5 microlitros de GR 1. Se agregan 10 microlitros de la dilucin anterior a cada columna segn corresponda. 2. Centrifugar
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Leer Registrar Prueba inversa 1. Se agregan 50 microlitros de las clulas A1 y B al pozo correspondiente. 2. 50 microlitros del suero del paciente o donante. 3. Centrifugar 4. Leer 5. Registrar Prueba Cruzada Se realiza dilucin de las clulas del donante: 1000 micolitros de diluyente 2 10 Microlitros de paquete globular Dispensar en una columna de reaccin 1. 50 microlitros de la dilucin de los G.R del donante 2. 25 microlitros de suero del receptor 3. Incubar 15min a 37oC 4. Centrifugar 5. Leer 6. Registrar D Confirmatorio Realizar la siguiente dilucin de la muestra a confirmar 1. 500 microlitros Diluyente 1 Bromelina 2. 25 micolitros paquete globular 3. Incubar 10 minutos a Temperatura ambiente. Dispensar en una columna de reaccin 4. 10 microlitros en la tarjeta correspondiente 5. Centrifugar 10 minutos 6. Leer 7. Registrar Rastreo de anticuerpos Dispensar en una columna de reaccin 1. 50 microlitros de clulas pantalla. 2. 25 micro de suero 3. 25 microlitros de bromelina. Diluyente 1 4. Incubar 15 minutos a 37 oC 5. Centrifugar 6. Leer 7. Registrar 8. Analizar con el inserto correspondiente. Identificacin de anticuerpos 1. Dispensar 50 microlitros de las clulas pantalla en una columna de reaccin. 2. Agregar 25 microlitros del suero del paciente o donante. 3. Incubar 15 minutos a 37C 4. Centrifugar 5. Leer 6. Registrar 7. Analizar de acuerdo al inserto de las clulas del lote correspondiente. ANEXO N 1 PREPARACIN DE LA SOLUCIN SALINA 0.85 % REACTIVOS 1. Cloruro de Sodio (NaCl)
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Agua destilada PREPARACIN La Solucin salina se prepara P/V en agua destilada de acuerdo a la concentracin y volumen requeridos. Para preparar 1000 ml de solucin salina al 0.85 %: se pesan 8.5 gr de cloruro de sodio Y se disuelven en 1000 ml de agua destilada. ANEXO N 2 PREPARACIN DE LOS GLBULOS ROJOS LAVADOS DEL 2 5 % REACTIVOS 1. Solucin salina 0.85 %. 2. Glbulos rojos tomados con E.D.T.A PREPARACIN 1. Dispensar 2 a 3 gotas de glbulos rojos en un tubo de 12 x 75 mm. 2. Agregar solucin salina hasta mximo tres cuartas parte del mismo. 3. Colocar los tubos en la serfuga y equilibrarlos con un tubo correspondiente. 4. Tapar perfectamente la serfuga. 5. Centrifugar durante 45 o 1 a 3.200 r.p.m. 6. Esperar que se detenga completamente la serfuga. 7. Sacar los tubos. 8. Decantar completamente la solucin salina. 9. Agitar suavemente los tubos para resuspender el contenido. 10. Agregar nuevamente salina como en el paso 2 y continuar de acuerdo al nmero de lavados que se deseen. 11. Tomar 1 gota (50 ul) de hemates lavados y concentrados + 1ml (1000 ul) de S.S al 0.85 %.La suspensin de G.R obtenida, ser color rojo salmn. %. ANEXO N 3 PREPARACION DEL CONTROL DE COOMBS El control de Coombs se obtiene tomando clulas del grupo "O" Rho D positivo y aadindole antisuero anti-D con el fin de recubrirlas de Inmunoglobulina para que puedan reaccionar a su vez con la Inmunoglobulina presente en el suero de Coombs y de esta manera servir de control de calidad de las pruebas de Coombs con resultado negativo. REACTIVOS 1. Anti- D 2. Solucin salina 0.85 % 3. Glbulos rojos O positivos lavados y concentrados. PREPARACIOn Las cantidades pueden doblarse de acuerdo a las necesidades del banco de sangre. La siguiente frmula produce aproximadamente 10 ml de control de Coombs. 1. Colocar en un tubo de 12 x 75 mm o 13 x 75 mm 2 gotas de anti-D 2. 4 gotas de solucin salina 3. 4 gotas de clulas de grupo "O" Rh D positivos. 4. Mezclar. Incubar por 30' a 37 C. 5. Lavar 4-5 veces en solucin salina. 6. Hacer dilucin al 5% ANEXO N 4 PREPARACIN DE LA ALBMINA BOVINA AL 6 % REACTIVOS 1. Albmina bovina al 22 % 2. Solucin salina 0.85 % PREPARACIN
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1. De acuerdo al volumen de albmina al 6 % requerido, realizar los clculos correspondientes, empleando la siguiente frmula V 1x C1 = V2 x C2. Para preparar 2 c.c de albmina al 6 % a partir de albmina al 30 %, tomar 0,4 c.c de albmina al 30 % y diluir con 1,6 c.c de solucin salina al 0,85 %

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