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INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL CENTRO DE INVESTIGACION EN BIOTECNOLOGIA APLICADA

CROMATOGRAFA LQUIDA
Clase: Qumica Instrumental Aplicada a la Biotecnologa

I.A. Gisela Clara Hernndez


Agosto 2013

Antecedentes
Cromatografa en columna:

Fase estacionaria: slido poroso Fase mvil: lquido

Columnas de vidrio de dimetro 1-5 cm y longitudes de 50 500 cm. Partculas slidas: 150 a 200 mm Tasa de flujo bajas -- horas

Aos 60s : Empaques de tamao de partculas pequeos: 3- 10 mm. Instrumentos complejos para trabajar a altas presiones.

Cromatografa de lquidos de alta resolucin HPLC


Cromatografa lquida

Campo de aplicacin
Ampliamente utilizada Sensibilidad Automatizacin Capacidad para separar especies no voltiles o termolbiles. Amplia aplicabilidad a sustancias importantes en la industria: aas, protenas, ac. Nucleicos, hidrocarburos , carbohidratos, frmacos, plaguicidas antibiticos, especies organometlicas

Cromatografa lquida

Instrumentos
Presiones de bombeo de cientos de atmosferas. Equipos complejos.

Cromatografa lquida

Recipientes para la fase mvil sistema de tratamiento de solvente


40:60 metanol 8% por min

+ de un recipiente + Un de disolvente 500 ml de solvente o mezcla de composicin constante: Sistema de purga: arrastrar elucin isocrtica de la con 2gases o masdisueltos sistemasfuera disolventes solucin . polaridad distinta: Filtrar solventes y eliminar elucin con gradiente. Lapolvo. relacin se varia de manera programada Evita ensanchamiento de banda, malfuncionamiento .

Mezcla de clorobencenos.

Metanol-agua 50:50 (v/v)

Cromatografa lquida

Sistema de bombeo

Generacin de presiones de 6000 psi (lib-in2) o 414 Cmara en la que el disolvente es impulsado por el bares. pistn. Salida librecontrolan de pulsos. Vlvulas el flujo. de Desventaja: , ruido enreproducibilidad la lnea base. Tasa flujo de flujo 0.1 pulsado a 10 mL/ min Ventajas: pequeo volumen interno , altas presiones del flujo 0.5% relativo de salida, adaptacin a la elucin con gradiente, Componentes resistentes a la corrosin. independientes de la viscosidad del disolvente.

Cromatografa lquida

SISTEMA DE INYECCION

Rizos de muestreo: Intercambiable permiten la eleccin de muestra de 1 a 100 ml o ms.


Cromatografas actuales autoinyetores , medios controlados por temperatura. Programacin de inyectores automaticos

Cromatografa lquida

Columnas para HPLC


Columnas para HPLC Tubos de acero inoxidable Longitud: 5-25 cm Dimetro interno: 3-5 mm Partculas para empaquetamiento de la columna: 3 a 5 mm Microcolumnas Longitud: 3-7.5cm Dimetro interno: 1-4.6 mm Partculas para empaquetamiento dela columna: 3 a 5 mm

Ventaja: Velocidad y mnimo consumo de fase mvil.

Cromatografa lquida

Pre-columna o guarda columna


Son usadas para aumentar la vida til de la columna analtica. Eliminan materias en suspensin, contaminantes y componentes de la muestra que se unen irreversiblemente a la fase estacionaria. Su composicin de relleno deber ser semejante al de la columna analtica. Tamao de partcula mayor. Se reemplaza cuando se contamina

Cromatografa lquida

Tipos de rellenos de la columna


PELICULAR Cuentas vidrio o de polmero, no porosas y esfricas dimetros caractersticos de 30 a 40 m. En la superficie de estas bolas se deposita una capa delgada y porosa de slice, almina o de una resina de intercambio inico.

PARTCULA POROSA Partculas de 3 y 10 m y con la menor dispersin posible para un tamao determinado. slice, almina o resinas de intercambio inico,

Cromatografa lquida

Detectores
Propiedad del soluto responden a una propiedad fsica o fsico-qumica del soluto. selectivos y muy sensibles. Propiedad de la disolucin comparan el cambio global de alguna propiedad fsica de la fase mvil con y sin soluto eluido. poco sensibles

Cromatografa lquida

Los detectores de absorbancia ultravioleta


254 nm de una lmpara de mercurio. dos terceras partes de los solutos orgnicos analizados por HPLC presentan absorcin a esa longitud de onda, compuestos aromticos.

Detectores de fluorescencia
Propiedades fluorescentes absorber radiacin electromagntica de una determinada longitud de onda y emitir radiacin fluorescente a longitud de onda ms larga . Comunicar fluorescencia a determinados analtos mediante el uso de reactivos apropiados. Esta derivatizacin puede realizarse en la muestra antes de la columna.
Cromatografa lquida

Detectores electroqumicos

En este sentido, cualquier especie capaz de ser oxidada o reducida sobre un electrodo es susceptible de deteccin por via electroqumica en una variedad de matrices, como medioambientales, farmacuticas y qumicas. fenoles, aminas, perxidos y mercaptanos pueden detectarse por oxidacin, mientras que hidrocarburos no saturados, cetonas, aldehidos y nitrocompuestos aromticos pueden ponerse de manifiesto mediante procesos de reduccin.

Cromatografa lquida

Detectores de ndice de refraccin

el ndice de refraccin (IR) de la fase mvil deber modificarse por la presencia de cualquier soluto que tenga un ndice de refraccin diferente de ella.

la comparacin del IR de la fase mvil pura con el de los efluentes que salen de la columna cromatogrfica, indicar la presencia de cualquier soluto eluido.
El principal inconveniente de este tipo de detectores es que son muy sensibles a los cambios de temperatura, la cual debe ser controlada con fluctuaciones de 0.0001 C.

Cromatografa lquida

Cromatografia de reparto

Tcnica mas ampliamente utilizada. La fase estacionaria es un lquido inmiscible con la fase mvil lquida.

Cromatografa con fases unidas qumicamente (enlazadas): la fase estacionaria se une qumicamente a la superficie del soporte.

los soportes se preparan con slice rgida formados por partculas mecnicamente resistentes, porosas y uniformes, con dimetros de 3, 5 o 10 m.

Revestimientos de fase unida : siloxanos

Superficie de silice hidrolizada constituida por grupos silanol reactivos

organoclorosilano
Cromatografa lquida

En relacin con las polaridades relativas de las fases mvil y estacionaria, se distinguen dos tipos de cromatografia de reparto. En la cromatografa en fase inversa (o reversa), la fase estacionaria es no polar, con frecuencia se trata de un hidrocarburo, y la fase mvil es relativamente polar (como el agua, el metanol o el acetonitrilo). En cromatografia en fase normal, el componente menos polar se eluye primero, debido a que relativamente es el ms soluble en la fase mvil y un aumento de la polaridad de la fase mvil provoca una disminucin del tiempo de elucin. Por contraste, en los mtodos en fase inversa, los componentes ms polares aparecen primero, y un aumento de la polaridad de la fase mvil aumenta el tiempo de elucin

Cromatografa lquida

Cromatografa de adsorcin o solido -liquido

La fase estacionaria es un solido adsorbente de gran area superficial (silice, alumina). Tiempo de retencin mas largas si la polaridad del analito aumenta. Centros activos interaccionan con gpos. Funcionales polares de los compuestos a separar. la separacion se produce como consecuencia de la intesidad de esas interacciones para los diferentes compuestos.

Cromatografa lquida

Se basa en el equilibrio de los iones de soluto entre el solvente y los sitios cargados en la fase estacionaria. La fase estacionaria de una matriz (R) con gpos. Funcionales cargados (A) y contraiones de carga opuesta (M) , susceptibles de intercambiarse con especies de la misma carga contenidas en la fase movil.

Cromatografa lquida

De exclusin por tamao o de gel


Cromatografa lquida

Especie de elevada masa molecular . Rellenos: pequeas particulas de silice o de polimeros que contienen una red de poros uniformes . Las moleculas que son mas grandes que el tamao medio de los poros del relleno son excluidas . Las q tienen diametros menores que los poros pueden penetrar atrves de ellos . Se evita una interaccion quimica entre los analitos y la fase estacionaria.