Jurnal Farmasi Indonesia Vol. 4 No.

3 Januari 2009: 104 -115

MEKANISME PENEKANAN EKSPRESI N-RAS EKSTRAK KULIT JERUK KEPROK (Citrus reticulata) SEBAGAI AGEN KEMOPREVENTIF
Perdana Adhi N., Andita Pra D., Diah Ayu P.K.W., Sugeng Riyanto, Edy Meiyanto Cancer Chemoprevention Research Center, Fakultas Farmasi Universitas Gadjah Mada, Yogyakarta e-mail edy_meiyanto@gmail.com

ABSTRACT
One targeting point of cancer treatment, especially liver cancer is the suppression of NRas expression, inhibition of c-Src activity and CYP1A2 in the liver cells. The aim of the research in to explore the anticarcinogenesis effect of the ethanolic extract of C. reticulata peel through suppression of N-ras expression and the binding afinity and interaction of polimetoksiflavon compound found in the peel of Citrus Reticulata, namely tangeretin and nobiletin to the target protein using molecular docking. Geometry structure optimization tangeretin and nobiletin were done with the software Molecular Operating Environment (MOE) for Windows. The optimum structure conformation of tangeretin and nobiletin were approached using semiempirik AMBER99 method. The process of docking of the test compound to the bindingsite c-Src (PDB ID: 1FMK) and CYP1A2 (PDB ID: 1AE4) were done using the software Molecular Operating Environment (MOE) for Windows in the conditions without water. From the docking process found that the lowest scoring value is tangeretin in conditions without water. Docking Results of tangeretin compared with the experimental ligan in the target CYP1A2, shows the interaction of tangeretin stronger than the interaction of ligan an α-naphtoflavon. Meanwhile, the target protein, c-Src, interaction endogenous ligan (ATP) is much stronger than the interaction with the test compound and ligan comparison Imatinib. Therefore, it is estimated that the mechanism of liver cancer hepar inhibition in molecular docking is through CYP1A2 inhibition. Keywords : tangeretin, nobiletin, docking, c-Src (1FMK), CYP1A2 (1AE4)

ABSTRAK
Salah satu titik tangkap pengobatan kanker khususnya kanker hepar adalah penekanan ekspresi N-Ras, penghambatan protein c-Src dan aktivitas CYP1A2 di hepar. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui afinitas dan interaksi senyawa berkerangka polimetoksiflavon pada kulit jeruk keprok (Citrus reticulata) yaitu tangeretin dan nobiletin terhadap protein target tersebut menggunakan molecular docking. Optimasi geometri struktur tangeretin dan nobiletin dilakukan dengan piranti lunak Molecular Operating Environment for Windows. Konformasi optimum tangeretin dan nobiletin dihasilkan menggunakan metode semiempirik AMBER99. Kemudian dilakukan proses docking senyawa uji dengan bindingsite c-Src (PDB ID : 1FMK) dan CYP1A2 (PDB ID : 1AE4) menggunakan piranti lunak Molecular Operating Environment for Windows dalam kondisi tanpa air. Dari hasil yang diperoleh dapat diperkirakan bahwa mekanisme penghambatan kanker hepar secara docking molekuler adalah melalui penghambatan CYP1A2 Kata kunci: tangeretin, nobiletin, docking, c-Src (1FMK), CYP1A2 (1AE4)

104

reticulata berfungsi sebagai antiproliferatif melalui mekanisme inhibisi CYP1A2. Oleh karena itu. Senyawa flavonoid terutama metoksi flavon yang terkandung dalam ekstrak etanolik kulit C. reticulata sangat potensial sebagai agen kemopreventif dan alternatif pengobatan kanker hepar.W. senyawa flavonoid diperkirakan dapat menghambat overekspresi pada N-Ras. Hasil dari pendockingan dapat dijadikan acuan untuk memperkirakan mekanisme aksi molekuler dari Tangeretin dan Nobiletin. terlihat bahwa senyawa metoksi flavon (tangeretin dan nobiletin) memiliki kemampuan dalam menginhibisi protein kinase yaitu cdk2. dan Edy Meiyanto) PENDAHULUAN Proses karsinogenesis hepar dipengaruhi oleh banyak protein onkogen. Salah satu flavonoid dominan yang terdapat pada ekstrak kulit jeruk adalah tangeretin yang merupakan suatu senyawa metoksi flavon (4). Aktivasi melalui enzim tersebut dapat dihambat oleh senyawasenyawa flavonoid seperti flavones. Andita Pra D. Penelitian lain menyebutkan pada tahap promosi kanker. metoksi flavon memiliki potensi jauh lebih besar dalam menghambat proliferasi sel kanker dibandingkan flavon yang tidak termetilasi (5). reticulata mempunyai berbagai macam senyawa flavonoid yang berpotensi sebagai agen kemopreventif. Tangeretin yang terdapat pada kulit buah jeruk dapat meningkatkan ikatan antar sel dan menghambat proliferasi pada sel kanker payudara MCF-7/6 secara in vitro. reticulata yang dapat berfungsi optimum sebagai inhibitor c-Src dan CYP1A2 sehingga dapat mengurangi terbentuknya intermediet reaktif pemicu karsinogenesis dengan indikator penurunan ekspresi dan N-Ras. Flavonoid mempunyai kemampuan untuk memodulasi metabolisme xenobiotic (3). Berdasarkan data-data tersebut. reticulata diperkirakan dapat menghambat protein kinase lainnya yang berperan penting dalam signal transduksi sel seperti c-Src yang berfungsi dalam aktivasi expresi NRas. Tangeretin dan nobiletin terbukti menginduksi G1 cell cycle arrest pada kanker kolon dan payudara dengan cara inhibisi pada target cdk4 dan cdk2 (6).Mekanisme Penekanan Ekspresi N-Ras Ekstrak Kulit Jeruk Keprok Sebagai Agen Kemopreventif (Perdana Adhi N. Oleh karena itu senyawaan metoksi flavon yang terkandung dalam ekstrak etanolik kulit C. Overekspresi onkogen oleh senyawa karsinogen merupakan abnormalitas genetik yang sering terjadi pada kanker (1). 105 . Sugeng Riyanto. Jenis flavonoid seperti hidroksi flavon dan metoksi flavon memiliki potensi dan selektifitas yang tinggi dalam menghambat kerja dari protein CYP1A2 (3). Potensi tangeretin dan nobiletin sebagai inhibitor c-Src dan CYP1A2 dapat ditelusuri menggunakan metode komputasi Arguslab melalui proses docking. Berdasarkan data-data tersebut.K. Diah Ayu P. Kulit C. Data-data yang diperoleh dari hasil docking akan memberikan informasi ilmiah mengenai senyawa metoksi flavon (tangeretin dan nobiletin) yang terkandung dalam ekstrak etanolik kulit C. CYP1A2 di hepar telah diketahui dapat mengaktivasi senyawa prokarsinogen (benzo(a)pyrene) menjadi intermediet reaktif yang berinteraksi dengan nukleofil selular dan akhirnya memicu karsinogenesis dengan ditandai terjadinya overekspresi N-Ras (2). hidroxyflavone dan galangin (3). dapat diperkirakan bahwa ekstrak kulit jeruk C.

Jurnal Farmasi Indonesia Vol.rscb. Struktur dengan nilai Hf dan energi terendah digunakan untuk didockingkan pada protenprotein target c-Src dan CYP1A2 yang diperoleh dari database PDB di download dari situs http/www/pdbbeta. Cara kerja Molecular Docking: Simulasi docking dilakukan pada dua protein target yakni CYPA2 dan c-Src terhadap 2 senyawa uji dalam ekstrak kulit jeruk keprok. Fraksi etanol yang diperoleh kemudian dipekatkan dengan rotary vaccum evaporator untuk mendapatkan ekstrak kental. diserbuk dengan blender hingga didapat serbuk kering. Dari 1 kg serbuk kulit jeruk keprok dimaserasi dengan etanol 70% selama 5 hari. Ligan eksperimental yang digunakan adalah Imatinib dan Alfanaftaflavon yang merupakan inhibitor proteintarget c-Src dan CYP1A2. reticulata) secara in vivo sebagai agen kemopreventif melalui penekanan ekspresi protein N-Ras yang mengatur transduksi sinyal proliferasi dan protein-protein yang berkaitan dengan karsinogenesis kanker hepar METODOLOGI PENELITIAN Bahan Kulit Jeruk Keprok yang didapatkan dari daerah Kali Soro Tawangmangu. Ligan eksperimental adalah ligan yang digunakan untuk membandingkan kekuatan ikatan ligan senyawa uji. Uji Karsinogenesis Penekanan Ekspresi N-Ras: Hewan uji dibagi menjadi 5 kelompok. Universitas Gadjah Mada dan diadaptasikan di kandang percobaan selama 3 hari sebelum diberikan perlakuan. Scoring function yang digunakan adalah Score. ligan senyawa uji di-docking-kan pada ligan binding site. menggunakan software Molecular Operating Environment (MOE). Output yang diperoleh menyatakan kekuatan interaksi ligan-reseptor berupa ΔG (energi Gibs). Tikus (Rattus norvegicus) betina galur Sprague-Dawley yang berumur 35 hari dengan berat badan 80-90 gram yang diperoleh dari Unit Pengembangan Hewan Percobaan. masing-masing . Setelah menentukan boks ligan binding site. tangeretin dan nobiletin. Jawa Tengah dan telah dideterminasi di Laboratorium Farmakognosi Bagian Biologi Farmasi Fakultas Farmasi UGM. Lakukan scoring terhadap hasil docking tersebut. Selanjutnya dilakukan scoring dengan memilih score current config pada calculation type. 3 Januari 2009: 104 -115 Penelitian ini bertujuan untuk menelusuri mekanisme dari ekstrak etanolik kulit jeruk keprok (C. Docking dilakukan dengan menggunakan area binding site minimum (calculating site). Sudut torsi dioptimasi menggunakan metode mekanika kuantum dan dioptimasi geometri menggunakan metode semiempirik AMBER99.org/pdb. Kulit Jeruk Keprok dikeringkan dibawah Sinar Matahari dengan ditutupi kain hitam. Ligan binding site yang digunakan merupakan binding site ligan eksperimental. Senyawa uji dibuat struktur 3 dimensi (3D) menggunakan software 106 MOE. Program yang digunakan untuk docking senyawa flavonoid pada protein kinase c-Src dan CYP1A2 serta mengkalkulasi energi bebasnya adalah Molecular Operating Environment. 4 No. Standard ligan dan ligan copy yang akan digunakan dalam validasi pada protein-protein kinase adalah CYP1A2 dan c-Src.

Preparasi organ dilakukan dengan memfiksasi organ hepar dengan buffer formalin 4%. Kelompok V adalah kelompok perlakuan ekstrak (1500 mg/kgBB). Setelah pemberian DMBA yang terakhir (minggu ke-11). Dosis. Diah Ayu P. reticulata setiap hari selama 10 hari selama inisiasi (minggu ke 3 setelah perlakuan DMBA).K. Kelompok IV yaitu kelompok kontrol pelarut (tidak diberi perlakuan) yaitu kelompok tikus yang diberikan pelarut ekstrak berupa CMC-Na 0. Yogyakarta. Kelompok II-III adalah kelompok DMBA+ekstrak kulit jeruk keprok dengan dosis berturut-turut 750 dan 1500 mg/kgBB. Microscope Digital Camera System) di Laboratorium Parasitologi Fakultas Kedokteran UGM. diberi ekstrak etanolik kulit buah C. diinduksi DMBA dosis 20 mg/kgBB dalam corn oil peroral 2 kali tiap minggu selama 5 minggu. HASIL DAN PEMBAHASAN Molecular Docking Senyawa uji yaitu senyawaan polimetoksiflavon yang banyak terdapat dalam kulit C. Kuat lemahnya ikatan ini akan menentukan besarnya aktivitas biologis Software yang digunakan adalah MOE.W. dan Edy Meiyanto) terdiri dari 6 ekor tikus. Program ini dapat menggambarkan semua interaksi yang terjadi antara gugus-gugus dalam senyawa uji dengan residuresidu asam amino yang terdapat pada protein target serta dapat menggambarkan interaksinya baik secara 3 dimensi ataupun secara 2 dimensi. semua tikus dikorbankan dan dilakukan pemeriksaan makroskopis dengan melihat adanya nodul tumor pada organ hepar. Andita Pra D.Mekanisme Penekanan Ekspresi N-Ras Ekstrak Kulit Jeruk Keprok Sebagai Agen Kemopreventif (Perdana Adhi N. cara dan frekuensi pemberian DMBA sama dengan kelompok perlakuan DMBA.1788 kkal/mol yang nilainya lebih besar daripada Alfanaphtoflavon-CYP1A2 -11.reticulata dianalisis dengan metode docking untuk menggambarkan interaksi antara senyawa uji dengan protein target yaitu c-Src dan CYP1A2.5%. Preparat IHC digunakan untuk mengamati jumlah sel hepar yang mengekspresikan protein N-Ras pada semua kelompok perlakuan hewan uji.8. Analisis Data Evaluasi hasil uji meliputi pengamatan ekspresi protein N-Ras dari hasil pengecatan imunohistokimia (IHC). Selanjutnya dibuat preparat organ dalam slide kaca untuk diamati secara mikroskopis kajian histopatologisnya menggunakan metode Imunohistokimia untuk mengamati ekspresi gen N-Ras pada hepar tikus. Sementara itu skor docking untuk Tangeretin dengan CYP1A2 yaitu -12. Kelompok I yaitu kelompok perlakuan DMBA.9962 kkal/mol lebih rendah daripada ikatan tangeretin dan ligan asli alfanaphtoflavon.. Hasil docking antara Nobiletin dengan CYP1A2 (Tabel 1) menghasilkan skor . Pemeriksaan ini dibawah mikroskop binokuler (Nikon. Dengan docking ini akan didapatkan score yang menggambarkan ikatan yang terjadi antara ligan dengan protein target. Hal ini menunjukkan bahwa ikatan antara tangeretin dengan CYP1A2 lebih stabil sehingga diprediksikan 107 . Preparat IHC juga diamati secara deskriptif kualitatif dengan cara melihat sel yang mengekspresikan protein N-Ras akan berwarna coklat.6794 kkal/mol. Kelompok V tidak diberi DMBA dan diberi perlakuan ekstrak dengan cara dan frekuensi yang sama dengan kelompok DMBA+ekstrak. Sugeng Riyanto.

memberikan gambaran bahwa tangeretin mempunyai nilai scoring yang lebih rendah (-12. Atom yang berikatan hidrogen dengan residu asam amino tersebut adalah atom O dari substituen gugus metoksi (–OCH3) pada posisi 5 dan 4’ dari kerangka dasar flavonoid. Pemodelan 2 dimensi hasil docking pada pocket protein target CYP1A2 dengan nobiletin (a). Interaksi yang terjadi lebih sedikit dibandingkan interaksi antara tangeretin ini memungkinkan aktivitas . Nobiletin dengan gugus metoksi yang lebih banyak dibandingkan dengan Tangeretin memberikan surface area yang lebih besar untuk berikatan dengan residu asam amino yang berada di pocket reseptor CYP1A2. Tabel 1 Skor hasil docking ligan uji. 4 No.1788 Ligan Pembanding Alfanaphtoflavon Score -11. Data yang diperoleh pada protein target CYP1A2.9962 kkal/mol) dibandingkan dengan nobiletin dan bahkan dengan ligan aslinya Α-naphtoflavon (-11. Tangeretin berikatan hidrogen sebagai akseptor hidrogen pada residu asam amino 321 Threonin dan 386 Isoleusin yang berada pada pocket reseptor CYP1A2.6794 a b c Gambar 1. 3 Januari 2009: 104 -115 menyebabkan aktivitas inhibitor terhadap CYP1A2 lebih tinggi.6794 kkal/mol). dan ligan endogen dengan CYP1A2 Ligan uji Tangeretin Nobiletin Score -12. Sementara pada α-naphtoflavon yang memiliki struktur cincin yang rigid hanya dapat memberikan surface area yang planar pada pocket reseptor CYP1A2 Nobiletin pada atom O dari gugus metoksi 8 berinteraksi hidrogen pada pocket reseptor CYP1A2 pada residu asam amino 321 Threonin sebagai akseptor transfer hidrogen.9962 -8. ligan pembanding. Tangeretin (b).Jurnal Farmasi Indonesia Vol. dan ligan pembanding αnaphtoflavon (c). yang merupakan suatu isoenzim Cytochrom P450. Nobiletin 108 hanya berinteraksi 1 ikatan hidrogen dengan pocket reseptor CYP1A2. Hal ini dibuktikan dengan jumlah ikatan hidrogen pada tangeretin yang lebih banyak dibanding alfanaphtoflavon dan nobiletin.

Mekanisme Penekanan Ekspresi N-Ras Ekstrak Kulit Jeruk Keprok Sebagai Agen Kemopreventif (Perdana Adhi N.6616 yang nilainya lebih besar daripada imatinib-c-Src -16. karena muatan positif dari –NH+ dapat berinteraksi dengan gugus karboksilat dari residu Asam Aspartat 117. Namun dari penelitian ini didapat bahwa nilai score Tangeretin lebih rendah dibandingkan ligan pembanding alfanaphtoflavon yang berarti ikatan tangeretin dengan CYP1A2 lebih stabil dan cocok dibandingkan dengan ligan pembanding Alfanaphtoflavon.6733. Hal ini ditunjukan dengan nilai skor docking yang lebih rendah dibanding tangeretin yaitu -8. sedangkan ikatan hidrogen lainnya terjadi antara residu Asp 117 dengan gugus –NH+. α-naphtoflavon.1788 kkal/mol. Ini menunjukkan bahwa ikatan antara imatinib dengan c-Src lebih stabil sehingga menyebabkan aktivitas inhibitor terhadap c-Src lebih tinggi. dan ligan endogen dengan c-Src Hasil docking antara c-Src dengan tangeretin menghasilkan score 11.6794 kkal/mol.K. flavon ini mampu membentuk konformasi inhibitor CYP1A2 yang khas dan cukup kuat ikatannya. Selain itu. Ikatan hidrogen ini lebih kuat karena adanya muatan positif yang meningkatkan keasaman sehingga lebih mudah terjadinya donor proton. namun dikarenakan struktur rigid dan planar dari α-naphtoflavon.4267 lebih besar daripada imatinib-c-Src. Alfanaphtoflavon merupakan ligan asli yang telah dikenal luas sebagai inhibitor CYP1A2 dan CYP1A1 dengan mekanisme inhibisi nonkompetitif (3). Oleh karenanya diprediksikan skor docking senyawa tersebut dengan CYP1A2 memiliki energi yang rendah. Diah Ayu P. Tabel 2 Score hasil docking ligan uji. Hal ini semakin didukung dengan tingginya afinitas ikatan antara imatinib dengan c-Src. ligan eksperimental asli yang ada pada protein CYP1A2 memberikan nilai skor yang lebih besar dibandingkan Tangeretin yaitu -11.W. Interaksi kimia ini secara empiris bersifat lemah. Interaksi yang lain adalah interaksi transfer muatan antara cincin benzen dari benzamin dengan residu asam amino Lys 315 yang merupakan 109 . ligan pembanding. gugus naftalen alfanaphtoflavon ini berinteraksi hidrofobik dengan pocket reseptor CYP1A2. Begitu pula score docking nobiletin dengan c-Src yaitu -10. ikatan ini dapat dikatakan sebagai ikatan hidrogen yang diperkuat. dan Edy Meiyanto) penghambatan CYP1A2 oleh Tangeretin lebih besar daripada nobiletin. Andita Pra D. Sugeng Riyanto. Terdapat ikatan hidrogen antara gugus –N-H dari imatinib sebagai donor Hidrogen dengan residu Gln 253. Hal ini dibuktikan dengan ikatan hidrogen yang terjadi pada Alfanaphtoflavon hanyalah berupa ikatan hidrogen tidak langsung antara gugus keton pada posisi 4 dengan molekul air yang berinteraksi dengan residu asam amino Glysin 316.

Imatinib dengan konformasi 3 dimensi yang meruah memanjang dan khas memberikan surface area yang memanjang dan memberikan kemungkinan lebih besar dalam berinteraksi dengan pocket protein target c-Src Skor yang diperoleh antara ATP-cSrc didapat nilai yang lebih rendah dibandingkan dengan tangeretin dan nobiletin yaitu -15. 3 Januari 2009: 104 -115 residu asam amino polar bermuatan positif. Ikatan elektrostatik mempunyai afinitas yang 110 . Gugus ini berikatan pula dengan solven yang ada di sekitar pocket protein target c-Src. Oleh karenanya dimungkinkan aktivitas penghambatan c-Src oleh tangeretin lebih besar daripada nobiletin. Gugus fosfat pada ATP merupakan gugus utama yang berinteraksi dengan c-Src. Sedangkan interaksi antara tangeretin dengan c-Src yaitu ikatan hidrogen antara atom O dari gugus metoksi O-CH3 dari tangeretin pada posisi 8 dan 4’ dengan residu Gln 253 dan Lys 401 yang kontak dengan solven. Pemodelan 3 dimensi hasil docking pada pocket protein target cSrc dengan nobiletin (a). Tangeretin (b). 4 No. Ini berarti bahwa ikatan antara ATP dan c-Src lebih stabil dibandingkan dengan ikatan c-Src tangeretin ataupun c-Src Nobiletin.3059 kkal/mol. Pada nobiletin interaksi yang terjadi hanyalah berupa ikatan hidrogen dari solven dengan seluruh substituen gugus metoksi dari kerangka flavonoid Nobiletin. Ikatan pada tangeretin ini jauh lebih banyak dibandingkan dengan nobiletin yang hanya membentuk ikatan hidrogen dengan solven di sekeliling pocket reseptor dan tidak berikatan secara langsung dengan residu asam amino pada pocket reseptor c-Src. Afinitas ATP terhadap c-Src lebih besar ikatan hal ini dikarenakan karena ATP merupakan senyawa endogen yang memang mempunyai binding site dengan protein kinase. Akibatnya skor yang didapatkan lebih besar dibandingkan Tangeretin karena Interaksi yang terjadi ini adalah lemah dan lebih sedikit dibandingkan interaksi antara tangeretin dan c-Src. a b c d Gambar 2. Total ikatan kimia yang terjadi pada kompleks Imatinib – c-Src inilah yang membuat skor dari imatinib menjadi sangat rendah yang berarti afinitas ikatan terhadap protein target c-Src menjadi sangat besar. Ikatan ini bersifat lemah karena senyawa uji tidak berinteraksi langsung dengan residu asam amino dari pocket reseptor. ligan endogen ATP (c) dan ligan pembanding Imatinib (d).Jurnal Farmasi Indonesia Vol. Adanya muatan negatif pada gugus fosfat dapat membentuk ikatan elektrostatik dengan residu asam amino Arg 160 dan Lys 321.

inti sel normokromatis. reticulata.Mekanisme Penekanan Ekspresi N-Ras Ekstrak Kulit Jeruk Keprok Sebagai Agen Kemopreventif (Perdana Adhi N. tidak dapat dipastikan tidak terjadi perubahan pada ekspresi gen111 . Tidak tampak adanya infiltrasi sel radang maupun kongesti pada semua preparat yang diamati. Sedangkan senyawa polimetoksiflavon ternyata memiliki score yang lebih tinggi dibandingkan ligan endogen ATP maupun ligan pembanding Imatinib. Ini berarti bahwa Imatinib yang dikenal sebagai obat kanker memiliki potensi tertinggi untuk menghambat ATP binding site dari protein kinase C-SRC yang dapat ditunjukkan dengan jumlah dan jenis interaksi dari keduanya. Walaupun tidak tampak adanya perubahan signifikan (hanya terjadi hiperproliferasi) secara mikroskopis pada sel hepar pada kelompok hewan uji terinduksi DMBA yang mengarah pada pembentukan tumor.K. Susunan hepatosit teratur. Pengaruh pemberian DMBA dan Ekstrak Etanolik Jeruk Keprok terhadap gambaran mikroskopik hepar hewan uji Pada minggu ke 11 setelah pemberian ekstrak etanolik C. Sementara pada preparat perlakuan pelarut CMC-Na (Gambar 3b)terlihat susunan hepatosit yang masih teratur.W. Inti selsel hepar kelompok perlakuan pelarut tampak normokromatis tercat ungu dengan hematoksilin dan eosin (H&E). Selain itu juga terbentuk ikatan hidrogen antara –OH dan fosfat dari gugus adenin pada ATP dengan Ser 248 dan Lys 401 yang kontak dengan gugus O pada adenin. Diah Ayu P. Analisis histopatologi yang dilakukan terhadap hepar tikus yang telah diinduksi DMBA (Gambar 3a) menunjukkan terjadinya perubahan pada sel-sel hepar akibat induksi DMBA yang bertendensi ke arah terjadinya kanker. Nilai score pada c-Src yang rendah ini tidak menutup kemungkinan mekanisme inhibisi dari senyawaan polimetoksiflavon adalah melalui penghambatan fosforilasi peotein kinase c-Src. Gambaran histologis yang tampak normal juga terlihat pada kelompok perlakuan DMBA-ekstrak dosis 750 mg/kgBB serta DMBA-ekstrak 1500 mg/kgBB pada tikus betina (Gambar 3d dan 3e). Tidak tampak adanya perubahan berupa kongesti maupun infiltrasi sel radang. terlihat susunan sel-sel hepar tidak lagi radier dan normokromatis yang menunjukan terjadinya hiperproliferasi. dilakukan nekropsi hewan uji. Begitu pula pada gambaran histologis kelompok perlakuan ekstrak (Gambar 3c). Sugeng Riyanto. Analisis mikroskopis dilakukan dengan pengamatan hasil pengecatan hematoxylin-eosin dan pengecatan immunohistokimia pada organ hepar hewan uji. Hal ini dikarenakan belum semua proses docking dilakukan pada berbagai protein kinase yang berperan dalam karsinogenesis kanker hepar. Oleh karenanya diprediksikan mekanisme yang memungkinkan dari aktivitas polimetoksiflavon dalam menghambat karsinogenesis adalah melalui penghambatan aktivitas enzim CYP1A2 dan bukan melalui penghambatan ATP binding site pada c-Src yang merupakan upstream dari ekspresi gen N-Ras. Andita Pra D. Oleh karenanya perlu penelitian lebih lanjut mengenai aktivitas inhibisi protein kinase dari senyawaan polimetoksiflavon. Nilai score ATP-c-Src masih lebih tinggi dibandingkan dengan interaksi Imatinib – c-Src. dan Edy Meiyanto) tinggi dibandingkan ikatan hidrogen dan ikatan hidrofobik. bentuk sel tampak sama (isositosis) dan tidak terdapat kelainan pada sitoplasma. Apalagi perubahan spesifik pada sel hepar yang mengarah pada pembentukan tumor. isositosis dan tidak terdapat kelainan pada sitoplasma.

Tidak tampak perbedaan gambaran histologi antar kelompok. Sel yang mengekspresikan N-Ras akan tampak paling coklat pada daerah membran sel di dekat inti karena yang aktif terlokalisasi pada daerah tersebut (tanda panah putih) sedangkan sel yang normal (tidak mengekspresian N-Ras akan berwarna biru pada membran disekitar inti selnya (tanda panah hitam). kontrol pelarut CMC-Na (b). Gambaran histologi pengecatan Hematoxylin-Eosin organ hepar hewan uji.3-Diaminobenzidin) yang akan berwarna coklat dibawah mikroskop. DMBA-ekstrak dosis 1500 mg/kgBB (e).Jurnal Farmasi Indonesia Vol. 3 Januari 2009: 104 -115 gen regulator bertanggung pertumbuhan yang jawab terhadap pembentukan tumor. tingkat ekspresi NRas dinyatakan dengan jumlah sel yang mengekspresikan N-Ras. 4 No. Gambar dilihat dengan perbesaran 400x Pengecatan dengan HE tidak mampu memberikan informasi perubahan ekspresi protein onkogen secara eksplisit. Secara deskriptif terlihat bahwa perlakuan ekstrak memiliki gambaran yang mirip dengan kelompok perlakuan pelarut sedangkan kelompok perlakuan DMBA-ekstrak dosis 1500 mg/kg BB menunjukkan kecenderungan lebih menurunkan jumlah sel hepar yang mengekspresikan dibandingkan perlakuan DMBA-ekstrak dosis 750 mg/kgBB (Gambar 4c). kelompok perlakuan: DMBA (a). DMBA-ekstrak dosis 750 mg/kgBB (d) . dan kontrol ekstrak dosis 1500 mg/kgBB (c). Pengamatan preparat imunohistokimia pada kelompok perlakuan DMBA menunjukkan jumlah sel hepar yang mengekspresikan lebih banyak dibandingkan kelompok lainnya (Gambar 4a). Hasil reaksi antigen-antibodi ini akan divisualisasi dengan kromogen DAB (3. 112 . sehingga diperlukan suatu metode Imunohistokimia yang dapat memberikan informasi ekspresi protein N-Ras secara spesifik berdasarkan reaksi antigen-antibodi. Pada semua preparat tampak susunan hepatosit yang masih teratur dan tampak sama dengan inti sel tercat ungu biru. Gambar 3. Dengan metode secara Imunohistokimia.

karena proses karsinogenesisnya masih dalam tahap promosi. Andita Pra D. Gambar di atas menunjukkan ekspresi N-Ras (panah merah) pada hepatosit tikus betina kelompok perlakuan: DMBA dosis 20 mg/kgBB (a). Proses ini belum mengarah pada terbentuknya kanker hepar. Hal ini diperkuat oleh pengamatan mikroskopik pada kelompok dosis perlakuan bahwa tidak ada yang mengalami perubahan 113 . pemodelan kanker dengan pemberian perlakuan ekstrak secara post-inisiasi secara empiris mampu menggambarkan efektifitas pemberian ekstrak etanolik C. (7) menunjukkan bahwa ekspresi H-ras pada ginjal tikus dapat meningkat dua kali lipat akibat aplikasi dosis tunggal DMBA. DMBA+ekstrak dosis 1500 mg/kgBB (e). Walaupun demikian dosis tersebut belum merupakan dosis efektif ekstrak yang dapat menurunkan ekspresi . Namun pada pengamatan hepar secara mikroskopik terlihat hepatosit pada perlakuan kontrol DMBA mengalami hiperproliferasi. Hasil penelitian yang dilakukan oleh Ember et al. Hal ini dikarenakan. Diah Ayu P. Sugeng Riyanto. kontrol ekstrak dosis 1500 mg/kgBB (c) DMBA+ekstrak dosis 750 (d). Oleh karenanya pada penelitian selanjutnya perlu dilakukan optimalisasi dosis efektif ekstrak dengan cara peningkatan dan penyempitan kisaran dosis yang dapat berefek optimal terhadap penurunan ekspresi.5% (b).W. sebab penurunan yang terjadi belum mencapai level yang mendekati level ekspresi normal seperti level ekspresi pada perlakuan pelarut. Pemaparan DMBA mampu menyebabkan munculnya nodul pada jaringan tikus namun hanya memberikan profil hiperproliferasi di hepar. reticulata dalam menurunkan insidensi nodul dan tumor pada tikus galur Sprague Dawley. dapat diketahui dosis ekstrak yang mampu menurunkan ekspresi pada kelompok hewan uji tercapai pada dosis 500 mg/kgBB.K. Dari data yang ada dapat dipastikan bahwa pemaparan DMBA tidak menyebabkan perubahan yang nyata secara makroskopik pada hepar. Berdasar pengamatan kualitatif secara mikroskopik maupun makroskopik dan didukung data komputasi in silico. dan Edy Meiyanto) a b c d e Gambar 4. Berdasarkan data diatas pula. kontrol pelarut CMC-Na 0. dapat diketahui semakin tinggi dosis ekstrak yang digunakan semakin kuat efektifitasnya dalam menurunkan insidensi nodul dan tumor pada tikus.Mekanisme Penekanan Ekspresi N-Ras Ekstrak Kulit Jeruk Keprok Sebagai Agen Kemopreventif (Perdana Adhi N. Dari data tersebut dapat dipastikan bahwa pemaparan DMBA mampu menyebabkan perubahan yang nyata pada ekspresi sel hepar tikus. dengan perbesaran 1000x lensa objektif. Dosis ekstrak tersebut dapat menekan jumlah sel hepar yang mengekspresikan sehingga dapat menghambat inisiasi karsinogenesis pada hepar. pemberian DMBA lebih dominan sebagai penginduksi kanker pada jaringan mamae tikus dibandingkan pada sel hepar. Berdasarkan data diatas pula.

UCAPAN TERIMA KASIH Terima kasih kami ucapkan kepada DP2M DIKTI yang telah membiayai penelitian ini. 3 Januari 2009: 104 -115 signifikan pada susunan hepatosit tikus. Hal ini dibuktikan dengan afinitas dan kekuatan ikatan yang cukup stabil pada Tangeretin terhadap residu asam amino pada protein target CYP1A2. 4 No. Senyawa di dalam ekstrak etanolik kulit jeruk C. kemampuan ekstrak dalam mengurangi insidensi nodul dan kanker sel hepar dapat dimungkinkan melalui penghambatan aktivasi DMBA dalam bentuk ultimate carcinogen tersebut. Enzim sitokrom P450 (CYP) dikenal sebagai enzim pemacu aktivasi senyawa prokarsinogen menjadi karsinogen. Inhibisi ini dapat menghambat terbentuknya radikal bebas yang dapat memicu inisiasi karsinogenesis pada hepar. Apigenin telah diketahui dapat menurunkan ekspresi sitokrom P450 pada hepar tikus terinduksi Benzo(a)piren. 4’pentamethoxyflavone) dapat berinteraksi lebih kuat dibandingkan α-naphtoflavon yang merupakan inhibitor pembanding pada CYP1A2 Aktivitas isoenzim P450 tertentu seperti CYP1A1 dan CYP1A2 dapat dihambat oleh flavonoid. reticulata yang diduga mempunyai efek tersebut adalah senyawa golongan flavonoid terutama golongan polimetoksiflavon (5). KESIMPULAN Berdasar pengamatan kualitatif secara mikroskopik dan didukung data komputasi in silico. Keluarga enzim sitokrom P450 yang terlibat dalam aktivasi DMBA adalah CYP1A1 dan CYP1B1 (8). Sehingga penghambatan ekspresi dan aktivitas sitokrom P450 dapat menghambat aktivasi DMBA. Mekanisme penurunan insidensi nodul pada sel hepar akibat akibat pemberian ekstrak kemungkinan disebabkan oleh suatu senyawa aktif yang terkandung di dalam ekstrak. Oleh karena itu senyawaan polimetoksiflavon dalam ekstrak kulit jeruk keprok melalui penelitian ini disimpulkan dapat mengurangi insidensi kanker pada sel hepar. dengan berikatan pada AhR (Arylhydrocarbon Receptor) yang merupakan faktor transkripsi (10). Flavonol kaempferol dan kuersetin secara signifikan dapat menghambat CYP1A1 secara in vitro pada kultur hepatosit tikus (9).6. 114 . Pada enzim pemetabolisme fase I. mekanisme kemopreventif ekstrak kulit jeruk keprok melalui penghambatan ekspresi onkogen N-Ras adalah melalui inhibisi CYP1A2. Dosis ekstrak tersebut dapat menekan aktivitas isoenzim Cytochrom P-450 di hepar yaitu CYP1A2 yang mampu mengaktivasi senyawaan prokarsinogen benzo(a)pyrene yang dimodelkan dengan pemberian DMBA. Oleh karenanya pada penelitian selanjutnya perlu dilakukan optimalisasi dosis efektif ekstrak dengan cara peningkatan dan penyempitan kisaran dosis yang dapat berefek optimal terhadap penurunan insidensi kanker pada sel hepar. Hal ini diperkuat dengan data komputasi kimia bahwa Tangeretin (5.8. Target aksi yang efektif pada penghambatan tersebut adalah enzim-enzim pemetabolisme baik fase I dan II.7.Jurnal Farmasi Indonesia Vol.

and Lin JK. Pan MH. The American Society for Pharmacology and Experimental Therapeutics 1998. Anticanc Res 1998. Tangeretin Induces Cell-Cycle Through Inhibiting CyclinDependent Kinase 2 & 4 Activities As Well As Elevating Cdk Inhibitor p21 in Human Colorectal Carcinoma Cells. and Hayashi S. Lin-Shiau S. Watanabe J. Seminars in Cancer Biology 2007. 23: 1677-1684. and Pusztai Z. 9. 1998. Carcinogenesis. 17. Imai K. Crit Rev Oncol Hematol 1993. 4. Ember I. King RJB. Effect of DMBA on Oncogene Action in vivo: a short term experiment. The CYP1A1 gene and cancer susceptibility. and Sultana S. Walle T. J Pharm Pharmacol 2006. Zhai S.K. Nakachi K.W. Kawajiri K. Zhejiang Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban 2006. Ho CH. Carcin 2002. Chen WJ. 989-992. New York. Kiss I. 18 (1A): 445-447. 58(12): 16551660s. Diah Ayu P. Introductions to rd Biochemical Toxicology 3 ed. Prasad L. 354–362. 10. nd 7. Mitchell W. Zhu HJ . Seattle: Private publication. 8. Jahangir T. Plant Medicine. In: Hodgson E and Smart R (eds).Shen XY. John Wiley & Sons In. 14:77–87. 35(1): 18-22.Mekanisme Penekanan Ekspresi N-Ras Ekstrak Kulit Jeruk Keprok Sebagai Agen Kemopreventif (Perdana Adhi N. 5. Effects of Kaempferol and Quercetin on Cytochrome 450 Activities in Primarily Cultured Rat Hepatocytes. 2000. Zheng YF. Smart RC & Akunda JK. Zhang FF. and Vestal RE. Friedman FK. Comparative inhibition of human Cytochromes P4501A1 and 1A2 by flavonoids. 2001. Khan TH. a superior cancer chemopreventive flavonoid subclass. 10. dan Edy Meiyanto) DAFTAR PUSTAKA 1. 2 ed. London: Pearson Eduation Limited. and Zhu XQ. Cancer Biology. 6. Andita Pra D. 2. Dai R.. 115 . Methoxylated flavones. Sugeng Riyanto. Inhibitory Effect of Apigenin on Benzo(a)pyrenemediated Genotoxicity in Swiss Albino Mice. 3.