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UNIVERSIDAD NACIONAL EXPERIMENTAL ROMULO GALLEGOS AREA DE INGENIERIA AGRONOMICA DIRECCION DE ESTUDIOS COMUNES DEPARTAMENTO DE ASIGNATURAS INSTRUMENTALES CATEDRA

DE BIOQUIMICA

PRACTICA N 1: Identificacin de Aminocidos y Protenas


Introduccin: Las protenas son sustancias qumicas orgnicas de alto peso molecular, constituida por muchos aminocidos, que juegan un papel muy importante en la estructura y dinmica de la materia viva. Solamente 20 aminocidos diferentes se encuentran formando parte de las protenas; sin embargo, no todas las protenas contienen los 20 aminocidos. En esta prctica vamos a realizar reacciones cualitativas de coloracin, que nos permitirn detectar, la presencia de grupos qumicos en aminocidos y protenas. Fundamento de las Reacciones: 1) Reaccin de la ninhidrina: Esta es una reaccin general para cualquier aminocido y es debido a la presencia del grupo amino (NH2), de manera de que todos los alfa aminocidos y por supuesto las protenas dan positiva a esta reaccin. No obstante, cualquier sustancia proteica que contenga un grupo alfa-NH 2 tambin de positiva a esta reaccin, la reaccin se efecta en tres etapas. 1.1 .- Reduccin de la ninhidrina oxidada por la accin del alfa aminocido

1.2 .- Hidrlisis del Aminocido producido para formar un alfa cetocido, el cual se carboxila bajo las condiciones de la reaccin.

1.3 .- Finalmente, el Amoniaco (NH3) reducido reacciona con cantidades equimolares de ninhidrina oxidada y ninhidrina reducida para formar un compuesto de color azul violeta, la intensidad del color es proporcionada a la cantidad de aminocidos presentes.

La ecuacin Global es

Azul Violeta

Esta reaccin se desarrolla mejor a pH neutro. Todos los aminocidos dan color azul violeta, con excepcin de prolina e hidroxiprolina que da color amarillo. 2) Reaccin de Biuret: Esta reaccin es caracterstica para aquellos compuestos que poseen dos o mas enlaces peptdicos. La denominacin Biuret se debe a que el compuesto orgnico Biuret tambin da positiva a esta reaccin. La reaccin de Biuret se basa en las formaciones en medio alcalino, de un complejo de coordinacin de color violeta entre el in cprico (Cu +2) y 4 tomos de nitrgeno, provenientes de las cadenas peptdicas.

3) Reaccin Xantoproteica: Con esta reaccin podemos identificar la presencia de los aminocidos aromticos triptofano). (tirosina,

La reaccin se basa en la nitracin del anillo bencnico con acido ntrico, produciendo derivados del nitrobenceno de color amarillo. Estos derivados amarillos se tornan anaranjados a la alcalinidad de la solucin con NH4OH o NaOH. En las condiciones de la reaccin la fenilalanina es difcil de nitrar por cuanto se requiere la presencia de un catalizador. 3) Reaccin de Milln: Esta reaccin es especfica para el grupo hidroxifenil. Por lo que el aminocido tirosina da positiva a esta reaccin. Se cree que el grupo hidroxifenil primero forma un derivado nitrato con el Acido Nitrico (HNO3), que luego reacciona con el mercurio y forma un complejo de color rojo. 4) Reaccin Sakaguchi: Esta es una reaccin especfica para el grupo Guanidrina. Por lo tanto el aminocido arginina da positiva a esta reaccin.

La Guanadina en Solucin alcalina, da un color rojo en presencia de alfa-naftol e Hipodromito de Sodio. PREGUNTAS DE PRE LABORATORIO: 1.- Defina las siguientes palabras: Aminocido Protena Peptido 2.- Dibuje la estructura general de los aminocidos, identificando cada uno de los grupos funcionales que poseen. 3.- Dibuje a Estructura de los siguientes aminocidos: Tirosina, Leucina, Metionina, Lisina, Triptofano y arginina 4.- Haga la clasificacin de los aminocidos segn su grupo R

PARTE EXPERIMENTAL OBJETIVOS: a) Reconocer los Grupos -aminos de los aminocidos. b) Diferenciar aminocidos libres de compuestos con dos o mas enlaces peptdicos.

c) Identificar aminocidos aromticos. d) Identificar el aminocido arginina. e) Identificar una solucin problema. MATERIALES Y REACTIVOS: Tubos de ensayo. Gradillas Metlicas para tubos de ensayo Beakers de 600 ml. Pipetas Graduadas de 5 ml y de 10 ml Plancha de Calentamiento Frascos goteros. Frascos de vidrio Pinzas de Madera Solucin de ninhidrina al 0,1%. Solucin de Hidrxido de Sodio (NaOH) al 2,5 N. Solucin de Sulfato de Cobre Cu(SO4) al 1%. Acido Ntrico (HNO3) Concentrado. Hidrxido de Amonio (NH4OH) concentrado o Amoniaco ( NH3) Reactivo de Milln (solucin de Mercurio en Acido ntrico Concentrado) Solucin alcohlica de -naftol al 1%. Solucin de Hidrxido de sodio (NaOH) al 5%. Solucin de hipoclorito de Sodio (NaCLO) al 10%. Solucin al 0,1% de: Arginina, Leucina, Metionina, Lisina, Triptofano, Tirosina. Soluciones al 1% de Albmina de Huevo.

PROCEDIMIENTO Experimento N 1: REACCION DE NINHIDRINA. a.- Tome 4 tubos de ensayo limpios b.- Coloque 2,5 ml de cada una de las soluciones de aminocidos o protenas, en diferentes tubos de ensayo, como se muestra en la figura

Tubo N1
Leucina al 0.1%

Tubo N 2
Albumina de huevo al 1%

Tubo N 3
Solucin Problema

Tubo N 4
Agua Destilada (Testigo)

c.- Con una Pipeta graduada limpia, agregue 1 ml de Solucin de Ninhidrina al 0,1% a cada tubo de ensayo. d.- Coloque los tubos de ensayo en un bao de agua hirviente por unos 10 minutos.

e.- Retire los tubos del bao de maria y deje enfriar en la gradilla. f.- Anote sus Observaciones y resultados Tubo N 1: _______________________________________________________________________________ _____________________________ Resultado: _________________________________________ Tubo N 2: ______________________________________________________________________ ____________________________ Resultado: _________________________________________

Tubo N 3: ___________________________________________________________________________________ _________________________Resultado: ___________________________________________ Tubo N 4: ___________________________________________________________________________________ _________________________Resultado: ___________________________________________ Experimento N 2: REACCION DE BIURET. a.- Tome 3 tubos de ensayo limpios b.- Con una pipeta graduada limpia, coloque 2,5 ml de cada una de las soluciones de aminocidos o protenas, en diferentes tubos de ensayo, como se muestra en la figura

Tubo N1
Leucina o Lisina al 0.1%

Tubo N 2

Tubo N 3
Solucin Problema

Albumina de Huevo al 1%

c.- Con una pipeta graduada limpia, agregue 0,5 ml de NaOH 2,5 N a cada tubo de ensayo. d.- Agregue 3 gotas de solucin de sulfato cprico al 1% a cada tubo de ensayo. E.- Agite cada tubo de ensayo e.- Observe si se desarrolla algn Color. f.- Anote sus Observaciones y resultados Tubo N 1: _______________________________________________________________________________ _____________________________ Resultado: _________________________________________ Tubo N 2: ______________________________________________________________________ ____________________________ Resultado: _________________________________________

Tubo N 3: ___________________________________________________________________________________ _________________________Resultado: ___________________________________________

EXPERIMENTO N 3: REACCION XANTOPROTEICA. a.- Tome 4 tubos de ensayo limpios b.- Con una Pipeta Graduada limpia, coloque 1 ml de cada una de las soluciones de aminocidos o protenas, en diferentes tubos de ensayo, como se muestra en la figura

Tubo N1
Triptofano al 0.1%

Tubo N 2
Metionina al 0.1%

Tubo N 3
Albumina de huevo al 1%

Tubo N 4
Solucin Problema

c.-Agregue con una pipeta graduada, 0,5 ml de HNO3 concentrado en cada tubo, en la campana de extraccin. d.- Caliente los tubos en un bao de agua hirviente por 10 minutos. d.-Retire los tubos del bao y djelos enfriar. e.-Agregue lentamente 1 ml de Amoniaco (NH 4OH) concentrado en la campana de extraccin y observe el cambio de color amarillo hacia anaranjado en la interfase. f.- Anote sus observaciones y resultados Tubo N 1: _______________________________________________________________________________ _____________________________ Resultado: _________________________________________ Tubo N 2: ______________________________________________________________________________ ____________________________ Resultado: _________________________________________ Tubo N 3: ___________________________________________________________________________________ _________________________Resultado:___________________________________________ Tubo N 4: ___________________________________________________________________________________ _________________________Resultado: ___________________________________________

EXPERIMENTO N 4: REACCION DE MILLON. a.- Tome 4 tubos de ensayo limpios b.- Con una Pipeta Graduada limpia, coloque 1,5 ml de cada una de las soluciones de aminocidos o protenas, en diferentes tubos de ensayo, como se muestra en la figura

Tubo N1
Tirosina al 0.1%

Tubo N 2
Leucina al 0.1%

Tubo N 3
Albumina de huevo al 1%

Tubo N 4
Solucin Problema

c.- Con una pipeta o con un gotero, agregue 15 gotas del Reactivo de Milln a cada tubo de ensayo. d.- Caliente los tubos en un bao de agua hirviente por unos 10 min. e.- Retire con cuidado los tubos de ensayo del bao de Mara y colquelos en la gradilla f.- Anote sus Observaciones y resultados. Tubo N 1: _______________________________________________________________________________ _____________________________ Resultado: _________________________________________ Tubo N 2: ______________________________________________________________________________ ____________________________ Resultado: _________________________________________ Tubo N 3: ___________________________________________________________________________________ _________________________Resultado:___________________________________________ Tubo N 4: ___________________________________________________________________________________ _________________________Resultado: ___________________________________________ EXPERIMENTO N 5: REACCION DE SAKAGUCHI. a.- Tome 4 tubos de ensayo limpios b.- Con una Pipeta Graduada limpia, coloque 1,5 ml de cada una de las soluciones de aminocidos o protenas, en diferentes tubos de ensayo, como se muestra en la figura

Tubo N1
Arginina al 0.1%

Tubo N 2
Metionina al 0.1%

Tubo N 3
Albumina de huevo al 1%

Tubo N 4
Solucin Problema

c.- Agregue con una pipeta limpia, 0,5 ml de Hidrxido de Sodio (NaOH) al 5% a cada tubo de ensayo. d.- Agregue con un gotero, 2 gotas de alfa-naftol al 1% a cada tubo de ensayo. e.- Agregue 2 con un gotero, 2 gotas de hipoclorito de Sodio al 10% a cada tubo. f.- Anote sus Observaciones y Resultados. Tubo N 1: _______________________________________________________________________________ _____________________________ Resultado: _________________________________________ Tubo N 2: ______________________________________________________________________________ ____________________________ Resultado: _________________________________________ Tubo N 3: ___________________________________________________________________________________ _________________________Resultado:___________________________________________ Tubo N 4: ___________________________________________________________________________________ _________________________Resultado: ___________________________________________

PREGUNTAS DE POST LABORATORIO 1.- Qu grupos funcionales se revelan en la reaccin de ninhidrina? 2.- Es adecuada la reaccin de ninhidrina para distinguir aminocidos de protenas? Expique 3.- Explique el uso y la importancia de la reaccin de Biuret? 4.- Con que reaccin distinguira usted, un aminocido de una protena? 5.- Escriba la formula estructural de la tirosina e identifique el grupo responsable de la reaccin de Milln. 6.- Qu otros aminocidos dan positiva a la reaccin de Milln? 7.- La Lisina podra dar positiva a la reaccin Xantoproteica? 8.- Describa la formula estructural de la Arginina y seale el grupo guanidina. BIBLIOGRAFIA: CONN. EE y STUMPF. Bioqumica Fundamental. Segunda Edicin. Editorial LimusaWiley S.A. 1992.

DANIEL, LJ. And L. NEAL. Laboratory in biochemistry. V. OF CORNELL, New Cork. LITWACK C. bioqumica Experimental. Un manual de Laboratorio. Ediciones Omega. S.A. Barcelona, Espaa, 1990.