Instrues de Utilizao

17-OH-Progesterone ELISA
Imunoensaio enzimtico para a determinao quantitativa, em diagnstico in-vitro, de 17-OH-progesterona em soro e plasma humanos.

RE52071
96
2-8C

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17-OH-Progesterone ELISA (RE52071) 1. APLICAES

PORTUGUS

Imunoensaio enzimtico para a determinao quantitativa, em diagnstico in-vitro, de 17-OH-progesterona em soro e plasma humanos.

2.

SUMRIO E EXPLICAO

A hormona esteride 17-OH-progesterona (17-OHP) produzida no crtex supra-renal e nas gnadas. Os efeitos gestagnicos exercidos pela 17-OHP so apenas pequenos. No obstante, esta hormona tem uma significncia clnica, porque constitui o precursor derradeiro do 11-desoxicortisol (composto S, CpS). O CpS forma-se pela hidroxilao do tomo de carbono C 21. A actividade enzimtica da 21-hidroxilase no crtex supra-renal pode, assim, ser monitorizada ao analisar-se o nvel de 17-OHP no sangue. As deficincias na 21-hidroxilaxe, que se encontram mais frequentemente na hiperplasia adrenal congnita, resultam numa secreo excessiva de 17-OHP e, consequentemente, em nveis sanguneos aumentados. As deficincias na 11-hidroxilase, porm, levam apenas a valores moderadamente aumentados de 17OHP. A anlise desta hormona esteride, portanto, desempenha um papel significativo no diagnstico diferencial da hiperplasia adrenal congnita. Em mulheres adultas no grvidas, os nveis de 17-OHP no sangue dependem da fase do ciclo menstrual. Tal como a progesterona, a 17-OHP secretada pelo folculo maduro e pelo corpo lteo. As concentraes so normalmente mais elevadas depois da ovulao. Alm disso, os nveis de 17-OHP so influenciados pelos ritmos diurnos que se correlacionam com a secreo supra-renal de cortisol. Os nveis mximos encontram-se em amostras recolhidas entre a meianoite e as oito horas da manh. Nos homens adultos, existem poucas indicaes de flutuaes semelhantes dos nveis 17-OHP. Durante a gravidez, grandes quantidades de 17-OHP so produzidas pelo feto, pela placenta e pelo crtex supra-renal. A hormona secretada para a circulao sangunea do feto e da me. Os valores maternos da 17-OHP aumentam fortemente aps a 32 semana de gravidez atingindo nveis 4 vezes mais elevados do que durante a fase ltea do ciclo menstrual. Tambm pode encontrar-se a 17-OHP no cordo umbilical de recm-nascidos.

3.

PRINCPIO DO TESTE

Imunoensaio enzimtico (ELISA) em fase slida baseado no princpio de competio. Uma quantidade indeterminada de antignio presente na amostra e uma quantidade fixa de antignio marcado com enzima competem pelos locais de ligao dos anticorpos que revestem os poos. Depois da incubao, os poos so lavados para parar a reaco de competio. Aps a reaco do substrato, a intensidade da cor desenvolvida inversamente proporcional quantidade de antignio na amostra. Os resultados das amostras podem ser determinados directamente usando a curva padro.

4.

AVISOS E PRECAUES

1. Apenas para diagnstico in vitro. Apenas para utilizao profissional. 2. Antes de iniciar o teste, leia as instrues completa e cuidadosamente. Utilize a verso vlida do folheto informativo fornecido com o kit. Tenha a certeza de ter entendido tudo. 3. Em caso de danos no kit por favor contacte a IBL ou o seu fornecedor por escrito, at uma semana aps ter recebido o kit. No utilize componentes danificados na execuo do teste, mas guarde-os para reclamao. 4. Obedea ao nmero de lote e ao prazo de validade. No misture reagentes de diferentes lotes. No utilize reagentes expirados. 5. Siga as boas prticas de laboratrio e as normas de segurana. Vista bata, luvas de ltex descartveis e culos protectores sempre que necessrio. 6. Reagentes do kit contendo material perigoso podem causar irritao da pele e dos olhos. Veja MATERIAIS FORNECIDOS e os rtulos para mais detalhes. As Fichas de Segurana do produto para este kit esto disponveis na Homepage da IBL ou a pedido directamente IBL: 7. Qumicos e reagentes preparados ou utilizados devem ser tratados como resduos perigosos de acordo com as normas nacionais de segurana e resduos perigosos. 8. Evite o contacto com a soluo de Paragem. Pode causar irritao na pele e queimaduras. 9. Todos os componentes deste kit contendo soro ou plasma humano foram testados e foram considerados no reactivos para HIV I/II, AgHBs e HCV. No entanto, no possvel excluir em absoluto a presena destes ou outros agentes infecciosos e portanto os reagentes devem ser tratados com potencialmente perigosos quer na sua utilizao quer na sua eliminao.
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17-OH-Progesterone ELISA (RE52071) 5. ARMAZENAMENTO E ESTABILIDADE

PORTUGUS

O kit enviado temperatura ambiente e deve ser armazenado de 2-8C. Mantenha-o longe do calor ou da luz solar directa. A estabilidade e armazenamento das amostras e reagentes preparados so referidos nas seces correspondentes. A microplaca estvel at expirar a data de validade do kit, na embalagem aberta mas firmemente fechada, quando armazenada a 2-8C.

6.

RECOLHA E ARMAZENAMENTO DE AMOSTRAS

Soro, Plasma (EDTA) Devem ser observados os cuidados usuais para a puno venosa. importante preservar a integridade qumica da amostra de sangue desde o momento da colheita at ao momento de ser analisada. No utilize amostras muito hemolticas, ictricas ou lipmicas. Amostras que apresentem turvao devero ser centrifugadas antes do teste e devem ser removidas as partculas de matria.
Armazenamento: Estabilidade: 2-8C 7 dias -20C (Alquotas) 3 meses Manter afastado do calor ou luz solar directa. Evitar congelar-descongelar repetidamente.

7.

MATERIAIS FORNECIDOS
Smbolo MTP ENZCONJ Componente Microplaca
Tiras separveis. Revestida com anti-coelho IgG (cabra, policlonal), 17-OH-Progesterona Antisoro.

Quantidade 1 x 12 x 8 1 x 20 mL

Conjugado Enzimtico
Colorido Amarelo. Pronto a usar. Contm: 17-OH-Progesterona, conjugado com HRP, tampo fosfato, estabilizantes.

Padro A-G 1 x 2.0 mL 6 x 1.0 mL CAL A-G

0; 0.15; 0.5; 1.5; 3.0; 7.5; 20 ng/mL 0.45; 1.5; 4.5; 9.1; 22.7; 60.6 nmol/L Pronto a usar. Padro A = Padro Zero (soro sem esterides). Contm: 17-OH-Progesterona, Soro humano, estabilizantes.

Controlo 1+2 2 x 1.0 mL 1 x 50 mL 1 x 12 mL 1 x 12 mL 3x CONTROL 1+2 WASHBUF CONC TMB SUBS TMB STOP FOIL
Pronto a usar. Para concentraes / intervalos aceitveis consultar etiquetas dos frascos.

Tampo de Lavagem Concentrado (20x)

Contm: tampo fosfato, Tween, estabilizantes.

Soluo de Substrato TMB

Pronto a usar. Contm: TMB, Tampo, estabilizantes.

Soluo de Paragem TMB

Pronto a usar. 1 M H 2 SO 4 .

Pelcula Aderente

8.
1. 2. 3. 4. 5.

MATERIAIS NECESSRIOS MAS NO FORNECIDOS

Pipetas (Multipette Eppendorf ou aparelhos semelhantes, < 3% CV). Volumes: 5; 25; 50; 100; 500 L Vortex Pipeta de 8 canais com reservatrio de reagente Recipiente de lavagem, sistema de lavagem de microplacas automtico ou semi-automtico Leitor de microplacas com capacidade de ler absorvncias a 450 nm (comprimento de onda de referncia 600-650 nm) 6. gua bidestilada ou bi-destilada 7. Toalhas de papel, pontas para pipetas e cronmetro

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17-OH-Progesterone ELISA (RE52071) 9. NOTAS SOBRE O PROCEDIMENTO

PORTUGUS

1. O manuseamento incorrecto da amostra ou alteraes no procedimento do teste podem influenciar os resultados. Os volumes de pipetagem indicados bem como os tempos de incubao, a temperatura e os passos de pr-tratamento devem ser realizados estritamente de acordo com as instrues. Utilize apenas pipetas e instrumentos calibrados. 2. Uma vez iniciado o teste, todos os passos devem ser executados sem interrupo. Garanta que os reagentes necessrios, os materiais e dispositivos so preparados e prontos a usar no tempo apropriado. Todos os reagentes e amostras devem estar temperatura ambiente antes de utilizar (18-25C). Agite cuidadosamente todos os frascos de reagentes lquidos e a amostra antes de utilizar. Agite os reagentes sem formar espuma. 3. Evite a contaminao dos reagentes, pipetas e poos/tubos. Utilize pontas novas descartveis para cada reagente, padro ou amostra. No troque as tampas. Feche sempre os frascos no utilizados. No reutilize poos/tubos ou reagentes. 4. Recomenda-se a determinao em duplicado das amostras de maneira a identificar potenciais erros de pipetagem. 5. Utilize um esquema de pipetagem para verificar uma disposio apropriada na placa. 6. O tempo de incubao afecta os resultados. Todos os poos devem ser manuseados pela mesma ordem e na mesma sequncia de tempo. E recomendvel utilizar uma Micropipeta de 8 canais para a pipetagem das solues nos poos. 7. A lavagem da microplaca importante. Poos mal lavados originam resultados errados. recomendvel utilizar uma pipeta multicanal ou um sistema automtico de lavagem de microplacas. No permitia que os poos sequem entre lavagens. No arranhe as paredes dos poos durante a lavagem e aspirao. Encha todos os reagentes com cuidado. Enquanto lava, verifique que todos os poos so cheios com o Tampo de Lavagem e que no h resduos nos poos. 8. A humidade afecta os tubos/poos revestidos. No abra o saco at atingir a temperatura ambiente. Os tubos/poos no utilizados devem ser automaticamente guardados no saco incluindo o dessecante.

10.

INSTRUES PR-TESTE

10.1. Preparao de componentes liofilizados ou concentrados

Diluir / dissolver 15 mL Componente WASHBUF CONC juntar 300 mL Diluente agua bidest. Relao 1:20 Observaes Misturar energicamente. Armazenamento 2-8C Estabilidade 4 sem

10.2. Diluio de Amostras As amostras de que se suspeite conterem concentraes mais elevadas que o maior padro tm que ser diludas com Padro A.

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1. 2. 3. 4. 5.

PORTUGUS

PROCEDIMENTO DO ENSAIO
Pipetar 25 L de cada Padro, Controlo e amostra para os respectivos poos da Microplaca. Pipetar 200 L de Conjugado Enzimtico para cada poo. Tapar a placa com pelcula adesiva. Agitar cuidadosamente a placa. Incubar 60 min TA (18-25C). Retire a folha. Rejeitar a soluo dincubao. Lavar a placa 3 x com 250 L de Tampo de Lavagem diludo. Remova o excesso batendo com a placa numa toalha de papel. Para a adio das Solues de Substrato e de Paragem usar uma pipeta de 8 canais. A pipetagem deve ser executada nos mesmos intervalos de tempo para as Solues de Substrato e de Paragem. Usar a tcnica de positive displacement e evitar a formao de bolhas de ar. Pipetar 100 L de Soluo de Substrato TMB para cada poo. Incubar 30 min TA (18-25C). Parar a reaco de substrato adicionando 100 L de Soluo Stop TMB a cada poo. Misturar rapidamente os contedos agitando cuidadosamente a placa. Medir a densidade ptica com um fotmetro a 450 10 nm (Comprimento de onda de referncia: 600-650 nm) nos 30 min a seguir pipetagem da Soluo Stop.

6. 7. 8. 9.

12.

CONTROLO DE QUALIDADE

Os resultados do teste s so vlidos se o teste for executado de acordo com as instrues. Adicionalmente o utilizador deve cumprir rigorosamente as Boas Prticas de Laboratrio ou outras leis ou regulamentos. Todos os padres devem estar dentro dos intervalos de aceitao definidos nas etiquetas e no Certificado de CQ. Se no cumprirem os critrios a srie no vlida e deve ser repetida. Cada laboratrio deve usar amostras conhecidas como controlos adicionais. recomendvel participar em ensaios de garantia da qualidade apropriados. Em caso de desvios os seguintes aspectos tcnicos devem ser tidos em conta: datas de validade dos reagentes (preparados), condies de armazenamento, pipetas, dispositivos, condies de incubao e mtodos de lavagem.

13.

CLCULO DE RESULTADOS

Constri-se um grfico com a DO dos padres (eixo dos yy, linear) em funo da sua concentrao (eixo dos xx, logartmico), quer em papel grfico semi-logartmico quer usando um mtodo computorizado. Uma boa curva fornecida optando por interpolao cubic spline, ajustamento 4PL (4 parameter logistics) ou modelo logit-log. Para o clculo da curva de calibrao, deve usar cada sinal dos padres (se um dos duplicados apresentar um valor claramente diferente do esperado pode ser omitido e o valor mais razovel pode ser usado). A concentrao das amostras pode ser lida directamente a partir da curva de calibrao. Amostras que apresentem concentraes acima do padro mais elevado, tm que ser diludas como descrito em INSTRUES PR-TESTE e testadas novamente. Converso: 17-OH-Progesterona (ng/mL) x 3.03 = nmol/L Curva de Calibrao Tpica
(Exemplo. No usar para clculos!) Padro 17-OH-Progesterona (ng/mL) A 0.00 B 0.15 C 0.50 D 1.50 E 3.00 F 7.50 G 20.00 DO Mdia 1.487 1.276 1.015 0.691 0.496 0.274 0.152 DO/DO max (%) 100.00 85.80 68.30 46.50 33.30 18.40 10.20
(OD) 1.500 1.250 1.000 0.750 0.500 0.250 0.000 0.01 0.10 1.0 10.0 100.0 (ng/mL)

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17-OH-Progesterone ELISA (RE52071) 14. VALORES ESPERADOS

PORTUGUS

Os resultados por si s no devem ser a nica razo para qualquer aco teraputica e devero ser correlacionados com outras observaes clnicas e testes de diagnstico. Indivduos aparentemente saudveis apresentam os seguintes valores:
17-OH-Progesterona (ng/mL) Fase Fase Folicular Fase Ltea aps estimulao com ACTH Gravidez (3 trimestre) Mdia 0.51 0.96 1.4 9.1 Mulheres Intervalo 0.3 1.0 0.2 - 2.9 <3 1.8 20.0 N 16 16 17 52 Mdia Homens Intervalo N

0.75

0.05 - 1.6

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Recomenda-se que cada laboratrio estabelea o seu prprio intervalo de normalidade.

15.

LIMITAES DO PROCEDIMENTO

Os seguintes componentes sanguneos no tm um efeito significativo (+/-20%) nos resultados do teste se estiverem em concentraes inferiores s indicadas:
Hemoglobina Bilirrubina Triglicridos 8.33 mg/mL 0.33 mg/mL 0.25 mg/mL

16.

DESEMPENHO
Substncia 17-OH-Pregnenolona Progesterona 11-Desoxi-Cortisol Desoxi-Corticosterona Cortisol Pregnenolona 0.03 ng/mL Intervalo (ng/mL) 2.44 11.41 0.26 5.74 Intervalo (ng/mL) 1.56 9.23 Mdia (%) 101 Reaco Cruzada (%) 1.7 1.4 1.3 0.12 0.013 0.012

Especificidade Analtica (Reaco Cruzada)

Reactividade cruzada de outras substncias testadas 0.001 %

Sensibilidade Analtica (Limite de Deteco) Preciso Intra-Ensaio Inter-Ensaio Linearidade Recuperao Comparao Mtodo Usado versus GCMS

Mdia do Sinal (Padro Zero) - 2SD CV (%) 2.8 4.9 5.8 9.2 Diluio em Srie Intervalo at (%) 1:16 80 - 120 Intervalo (%) % Recuperao aps adio de reforo 80 - 121 r = 0.94; n = 22

Teste IBL = 1.31 x GCMS 0.45

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1.

PORTUGUS

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS DO PRODUTO

Sahin Y and Kelestimur F. 17-Hydroxyprogesterone responses to gonadotrophin-releasing hormone agonist buserelin and adrenocorticotrophin in polycystic ovary syndrome: investigation of adrenal and ovarian cytochrome P450c17alpha dysregulation. Hum. Reprod., 12: 910-913 (1997) Liovic M et al. CYP17 gene analysis in hyperandrogenised women with and without exaggerated 17hydroxyprogesterone response to ovarian stimulation. J. Endocrinol. Invest., 20: 189-193 (1997) Oriola J et al. Rapid screening method for detecting mutations in the 21-hydroxylase gene. Clin. Chem., 43: 557-561 (1997) Ibanez L et al. Ovarian 17-hydroxyprogesterone hyperresponsive-ness to gonadotropin-releasing hormone (GnRH) agonist challenge in women with polycystic ovary syndrome is not mediated by luteinizing hormone hypersecretion: evidence from GnRH agonist and human chorionic gonadotropin stimulation testing. J. Clin. Endocrinol. Metab., 81: 4103-4107 (1996) Bernini GP et al. 17-Hydroxyprogesterone response to ACTH in bilateral and monolateral adrenal incidentalomas. J. Endocrinol. Invest., 19: 745-752 (1996) J. Assist. Reprod. Genet., 13: 681-682 (1996) Glock Jl et al. The relationship of corpus luteum volume to relaxin, estradiol, progesterone, 17hydroxyprogesterone and human chorionic gonadotropin levels in early normal pregnancy. Early Pregnancy, 1: 206-211 (1995) Berkow R, Fletcher AJ, Beers MH.Congenital Adrenal Hyperplasia. In The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, pp 2224-2226, Merck & Co., Inc., 16th edition 1992 Chrousos GP, Loriaux DL, Mann DL, Cutler GB. Lateonset 21-Hydroxylase deficiency mimicking idiopathic hirsutism or polycystic ovarian disease. Ann. Int. Med. 96: 143 (1982). Schnakenburg K, Bindlingmaier F, Knorr D. 17-hydroxy-progesterone, androstendione, and testosterone in normal children and in prepubertal patients with congenital adrenal hyperplasia. Eur. J. Pediatr. 133: 259 (1980).

2. 3. 4.

5. 6.

7. 8. 9.

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Symbols / Symbole / Symbles / Smbolos / Smbolos /

REF LOT Cat.-No.: / Kat.-Nr.: / No.- Cat.: / Cat.-No.: / N. Cat.: / N.Cat.: / -.: Lot-No.: / Chargen-Bez.: / No. Lot: / Lot-No.: / Lote N.: / Lotto n.: / -: Use by: / Verwendbar bis: / Utiliser : / Usado por: / Usar at: / Da utilizzare entro: / : No. of Tests: / Kitgre: / Nb. de Tests: / No. de Determ.: / N. de Testes: / Quantit dei tests: / : CONC LYO IVD Concentrate / Konzentrat / Concentr / Concentrar / Concentrado / Concentrato / Lyophilized / Lyophilisat / Lyophilis / Liofilizado / Liofilizado / Liofilizzato / In Vitro Diagnostic Medical Device. / In-vitro-Diagnostikum. / Appareil Mdical pour Diagnostics In Vitro. / Dispositivo Mdico para Diagnstico In Vitro. / Equipamento Mdico de Diagnstico In Vitro. / Dispositivo Medico Diagnostico In vitro. / In-Vitro . Evaluation kit. / Nur fr Leistungsbewertungszwecke. / Kit pour valuation. / Juego de Reactivos para Evaluaci. / Kit de avaliao. / Kit di evaluazione. / . Read instructions before use. / Arbeitsanleitung lesen. / Lire la fiche technique avant emploi. / Lea las instrucciones antes de usar. / Ler as instrues antes de usar. / Leggere le istruzioni prima delluso. / . Keep away from heat or direct sun light. / Vor Hitze und direkter Sonneneinstrahlung schtzen. / Garder labri de la chaleur et de toute exposition lumineuse. / Mantngase alejado del calor o la luz solar directa. / Manter longe do calor ou luz solar directa. / Non esporre ai raggi solari. / . Store at: / Lagern bei: / Stocker : / Almacene a: / Armazenar a: / Conservare a: / : Manufacturer: / Hersteller: / Fabricant: / Productor: / Fabricante: / Fabbricante: / : Caution! / Vorsicht! / Attention! / Precaucin! / Cuidado! / Attenzione! / ! Symbols of the kit components see MATERIALS SUPPLIED. Die Symbole der Komponenten sind im Kapitel KOMPONENTEN DES KITS beschrieben. Voir MATERIEL FOURNI pour les symbles des composants du kit. Smbolos de los componentes del juego de reactivos, vea MATERIALES SUMINISTRADOS. Para smbolos dos componentes do kit ver MATERIAIS FORNECIDOS. Per i simboli dei componenti del kit si veda COMPONENTI DEL KIT. .

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LIABILITY: Complaints will be accepted in each mode written or vocal. Preferred is that the complaint is accompanied with the test performance and results. Any modification of the test procedure or exchange or mixing of components of different lots could negatively affect the results. These cases invalidate any claim for replacement. Regardless, in the event of any claim, the manufacturers liability is not to exceed the value of the test kit. Any damage caused to the kit during transportation is not subject to the liability of the manufacturer

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