UNIVERSITATEA DE ŞTIINŢE AGRICOLE ŞI MEDICINĂ VETERINARĂ CLUJNAPOCA ŞCOALA DOCTORALĂ FACULTATEA DE HORTICULTURĂ

Ing. Raica Paul-Andrei

Investigarea variabilităţii genetice la unele specii de Gentiana din flora spontană a României cu ajutorul marcherilor moleculari

(REZUMAT AL TEZEI DE DOCTORAT)

Conducător ştiinţific: Prof. univ. dr. Doru Pamfil

Cluj-Napoca 2010

Cuprins rezumat Cuprinsul tezei............................................................................. III Capitolul 1 Introducere.................................................................................. 1 Capitolul 2 Descrierea generală a familiei Gentianaceae şi stadiul actual al cunoaşterii................................................................................... 3 2.1 Taxonomia familiei Gentianaceae ...................................... 3 2.2 Implicaţii farmacologice ale Gentianaceae-lor................... 3 Capitolul 3 Marcherii moleculari bazaţi pe reacţia PCR ............................... 4 3.1 Marcherii RAPD ................................................................. 5 3.2 Marcherii SSR..................................................................... 6 Capitolul 4 Obiectivele cercetării, Material şi metodă .................................. 7 4.1 Obiectivele cercetării .......................................................... 7 4.2 Material biologic ................................................................. 7 4.2.1 G. asclepiadea .......................................................... 7 4.2.2 G. clusi ...................................................................... 8 4.2.3 G. cruciata ................................................................ 9 4.2.4 G. phlogifolia ............................................................ 9 4.2.5 G. orbicularis.......................................................... 10 4.2.6 G. lutea ................................................................... 10 4.2.7 G. nivalis................................................................. 11 4.2.8 Gentianopsis ciliata ................................................ 11 4.3 Izolarea ADN .................................................................... 12 4.4 MARCAREA RAPD ........................................................ 12 4.5 MARCAREA SSR............................................................ 13 4.6 Migrarea electroforetică .................................................... 14 4.6.1 Migrarea electroforetică în gel de agaroză.............. 14 4.6.2 Migrarea electroforetică în gel de poliacrilamidă ... 14 4.6.3 Colorarea gelurilor electroforetice şi achiziţia de imagini............................................................................ 14 4.7 Analiza şi interpretarea datelor ......................................... 14 4.7.1 Metode statistice generale....................................... 14 4.7.2 Analiza statistică a datelor rezultate din marcarea RAPD ............................................................................. 15 I

4.7.3 Generarea arborilor prin metoda UPGMA. ............ 16 4.7.4 Generarea arborilor prin metoda Neighbor-Joining 17 4.7.5 Estimarea diversităţii genetice pe baza indicelui de diversitate genetică ......................................................... 17 4.8 Analiza statistică a datelor rezultate din marcarea SSR.... 18 4.9 Aplicaţii software utilizate în analizele statistice.............. 18 Capitolul 5 Rezultate şi discuţii................................................................... 19 5.1 Rezultate privind marcarea RAPD.................................... 19 5.2 Rezultate privind marcarea SSR ....................................... 20 5.3 Analiza şi interpretarea datelor ......................................... 22 5.3.1 Analiza relaţiilor taxonomice.................................. 22 5.4 Analiza variabilităţii genetice intra- şi interpopulaţionale la specia G. asclepiadea .............................................................. 26 5.5 Analiza variabilităţii genetice intra- şi interpopulaţionale la specia G. nivalis ...................................................................... 30 5.6 Analiza variabilităţii genetice intra- şi interpopulaţionale la specia G. cruciata.................................................................... 31 5.6.1 Analiza statistică a datelor rezultate din marcarea RAPD ............................................................................. 31 5.6.2 Analiza statistică a datelor rezultate din marcarea SSR 32 5.7 Analiza variabilităţii genetice intrapopulaţionale la specia G. phlogifolia .......................................................................... 34 5.8 Analiza variabilităţii genetice intrapopulaţionale la specia G. lutea .................................................................................... 34 5.9 Analiza variabilităţii genetice intrapopulaţionale la speciile G. Orbicularis, G. clusi şi Gentianopsis ciliata ...................... 35 Capitolul 6 Concluzii şi recomandări .......................................................... 36

II

Cuprinsul Tezei Capitolul 1 Introducere............................................................................. 1 Capitolul 2 Descrierea generală a familiei Gentianaceae şi stadiul actual al cunoaşterii................................................. ......................... 6 2.1 Taxonomia familiei Gentianaceae ............................. 6 2.2 Compoziţia chimică şi chemotaxonomia familiei Gentianaceae ............................................................. 9 2.2.1 Concluzii fitochimice..................................... 11 2.3 Implicaţii farmacologice ale Gentianaceae-lor ........ 12 Capitolul 3 Biodiversitatea şi conservarea biodiversităţii ...................... 15 3.1 Definiţia biodiversităţii............................................. 15 3.2 Tipuri de biodiversitate ............................................ 17 3.3 Conceptul de biodiversitate ...................................... 17 3.4 Protecţia şi obiectul conservării biodiversităţii ........ 18 3.5 Strategia conservării biodiversităţii.......................... 19 3.6 Conservarea in situ ................................................... 20 Capitolul 4 Descrierea condiţiilor bioclimatice generale a regiunilor de deal şi de munte ................................................................... 21 4.1 Dealurile şi podişurile .............................................. 21 4.2 Pădurile de munte..................................................... 22 4.3 Golul alpin................................................................ 23 4.4 Endemismele din România....................................... 25 Capitolul 5 Marcherii moleculari bazaţi pe reacţia PCR................... 27 5.1 Principiul reacţiei PCR............................................. 27 5.2 Marcherii RAPD ...................................................... 30 5.3 Marcherii SSR .......................................................... 33 5.4 Aspecte practice privind alegerea tipului de marcare moleculară................................................................ 34 Capitolul 6 Consideraţii generale privind determinarea variabilităţii genetice cu ajutorul marcherilor RAPD .............................. 36 Capitolul 7 Obiectivele cercetării, Material şi metodă ........................... 42 III

7.1 Obiectivele cercetării................................................ 42 7.2 Descrierea arealelor, speciilor şi populaţiilor luate în studiu........................................................................ 43 7.2.1 Parcul Naţional Munţii Rodnei ...................... 43 7.2.2 Parcul Naţional Ceahlău ................................ 46 7.2.3 G. asclepiadea (lumânărica pământului, ghinţură).................................................................. 48 7.2.4 G. clusii.......................................................... 51 7.2.5 G. cruciata...................................................... 53 7.2.6 G. phlogifolia ................................................. 55 7.2.7 G. orbicularis ................................................. 57 7.2.8 G. lutea........................................................... 59 7.2.9 G. nivalis........................................................ 61 7.2.10 Gentianopsis ciliata...................................... 62 7.3 Conservarea şi transportul probelor biologice.......... 64 7.4 Izolarea ADN ........................................................... 65 7.4.1 Prepararea soluţiilor stoc: .............................. 65 7.4.2 Protocol de lucru............................................ 66 7.5 Evaluarea cantităţii şi calităţii ADN-ului extras....... 68 7.6 Marcarea RAPD ....................................................... 69 7.7 Marcarea SSR........................................................... 71 7.8 Migrarea electroforetică ........................................... 73 7.8.1 Migrarea electroforetică în gel de agaroză..... 73 7.8.2 Migrarea electroforetică în gel de poliacrilamidă ......................................................... 74 7.8.3 Colorarea gelurilor electroforetice şi achiziţia de imagini ............................................................... 74 7.9 Analiza imaginilor şi obţinerea matricelor binare .... 75 7.10 Analiza şi interpretarea datelor............................... 75 7.10.1 Metode statistice generale............................ 75 7.10.2 Analiza statistică a datelor rezultate din marcarea RAPD ...................................................... 77 7.10.3 Generarea arborilor prin metoda UPGMA. . 78 7.10.4 Generarea arborilor prin metoda NeighborJoining..................................................................... 81 7.10.5 Estimarea diversităţii genetice pe baza indicelui de diversitate genetică.............................. 85

IV

.........7 Aplicaţii software utilizate în analizele statistice ............................ cruciata ............9 Analiza variabilităţii genetice intra.......................... 115 8.................1 Rezultate privind izolarea ADN ............... 110 8................................10..... 142 V ............................................ 86 Capitolul 8 Rezultate şi discuţii....................................6 Analiza statistică a datelor rezultate din marcarea SSR........... 129 Bibliografie..9.... nivalis .1 Analiza statistică a datelor rezultate din marcarea RAPD .........8 Analiza variabilităţii genetice intrapopulaţionale la specia G.......12 Analiza variabilităţii genetice intrapopulaţionale la specia G.............. 117 8..................................1 Analiza relaţiilor taxonomice.13 Discuţii privind biogeografia genului Gentiana în România.......... 88 8......................................... orbicularis...2 Analiza statistică a datelor rezultate din marcarea SSR............3 Rezultate privind marcarea SSR..7 Analiza variabilităţii genetice intrapopulaţionale la specia G................ 115 8................. phlogifolia ..........4...10............... asclepiadea..................................... 126 8.......... 89 8............. clusi ................................................................. ...... 105 8...................6 Analiza variabilităţii genetice intra....................... 88 8......................şi interpopulaţionale la specia G.................... 127 Capitolul 9 Concluzii şi recomandări ................... 115 8....... 115 8........................... 97 8...............7....... 86 7........................4 Analiza şi interpretarea datelor....10 Analiza variabilităţii genetice intrapopulaţionale la specia G........................................ 126 8.....................şi interpopulaţionale la specia G..... 124 8....... 97 8...............şi interpopulaţionale la specia G.......................... 93 8.....................9.................................................5 Analiza variabilităţii genetice intra...... 134 Anexa 1: Index de abrevieri şi acronime............................. lutea ...2 Rezultate privind marcarea RAPD ......11 Analiza variabilităţii genetice intrapopulaţionale la specia Gentianopsis ciliata .................

.................................... 144 Anexa 3: Harta rezervaţiei Scăriţa-Belioara................................................... 146 Anexa 5: Harta parcului naţional Munţii Rodnei ..................................................................................... 152 Anexa 7: Concentraţiile şi purităţile ADN-ului izolat la indivizii analizaţi................................................................................................... 148 Anexa 6: Harta distribuţiei populaţiilor analizate din parcul Naţional Ceahlău... şi distribuţia populaţiilor analizate ....................... ......... cruciata...... 157 VI ....................... 153 Anexa 8: Distanţele genetice calculate între toţi indivizii analizaţi.................... utilizând coeficientul de distanţă Nei-Li/Dice...... pe baza marcherilor RAPD................................Anexa 2: Codificarea indivizilor.... 145 Anexa 4: Distribuţia indivizilor populaţiei din Sălicea aparţinând speciei G............................................................

în esenţă. în timp ce altele pentru valoarea lor decorativă. datorită naturii codominant a lor. studierea variabilităţii genetice. Marcarea moleculară SSR. marcheri biochimici (proteine sau izoenzime). ele bucurând ochii iubitorilor de munte atunci când le întâlnesc pe culmile stâncoase ale munţilor. Aceste specii sunt valoroase nu doar pentru importanţa lor practică.CAPITOLUL 1 INTRODUCERE Conservarea şi utilizarea resurselor de diversitate genetică la plante depinde în mare măsură de disponibilitatea informaţiilor. marcheri moleculari sau alte studii capabile să releve variabilitatea genetică. vor îmbunătăţii managementul operaţiunilor de conservare şi va permite celor interesaţi să identifice materialul biologic care să deţină caracteristicile de interes. economică. şi prin 1 . Unele specii ale genului Gentiana sunt cultivate datorită importanţei lor din punct de vedere farmacologic. simplitatea şi eficienţa lor. Familia Gentianaceae cuprinde o serie de specii medicinale care au fost utilizate din cele mai vechi timpuri. 1993). nelimitaţi ca număr şi sunt de obicei foarte polimorfici. Informaţiile pot fi obţinute pe baza unor studii morfologice sau de fiziologie. Dezvoltarea tehnicilor de marcare moleculară ADN a facilitat prin rapiditatea. Aceste informaţii vor permite luarea unor decizi optime în privinţa a ceea ce trebuie conservat. ci şi pentru valoare lor peisagistică în mediul lor natural. în ceea ce priveşte distribuţia acestei diversităţi genetice în cadrul speciei de interes. prezintă o serie de avantaje privind nivelul de informare care rezultă în urma utilizării lor. Se cunosc foarte puţine despre secvenţele acestor tipuri de markeri. dar se bănuieşte că ei aparţin unor regiuni necodificatoare sau unor gene nestructurale (Williams. Datorită avantajelor pe care le oferă acest tip de markeri sunt des utilizaţi în studiile care vizează determinarea variabilităţii genetice la nivel populaţional şi în studiile taxonomice. Ele intră în compoziţia unor reţete de bitter sau a diferite reţete culinare. Marcherii RAPD sunt.

polimorfismul ridicat. faţă de conducerea căreia îmi exprim recunoştinţa pentru că m-a onorat cu încredere şi înţelegere. Lucrarea de faţă prezintă şi un grad de interdisciplinaritate prin aceea că combină tehnicile de specifice geneticii moleculare cu metodele de analiză caracteristice pentru genetica populaţiilor. Un alt dezavantaj al acestui tip de marcheri este rezultat din transferabilitatea redusă la nivel interspecific şi aproape absentă la nivel intergeneric. Doru Pamfil. Acest studiu reprezintă primul de acest gen din România. pentru îndrumarea competentă şi formarea mea profesională. Toate cercetările efectuate în prezentul studiu au fost efectuate în cadrul departamentului de Biotehnologii al Universităţii de Ştiinţe Agricole şi Medicină Veterinară din ClujNapoca. dar prezintă şi unele dezavantaje care rezidă din costurile ridicate pe care le generează dezvoltarea seturilor de amorse specifice acestor marcheri. 2 . Pentru toate acestea. şeful Disciplinei de Biotehnologii. dar şi observaţiile biogeografice. Realizarea acestei teze de doctorat nu ar fi fost posibilă fără sprijinul conducătorului de doctorat Prof. din cadrul Facultăţii de Horticultură şi Rectorul Universităţii de Ştiinţe Agricole şi Medicină Veterinară Cluj-Napoca. importanţa lui fiind dată de necesitatea caracterizării moleculare a speciilor autohtone în vederea luării unor decizii de management adecvate pentru conservarea in situ a biodiversităţii. Dr. Aceste caracteristici îi recomandă pentru studiile de genetică populaţioală. îmi exprim înalta preţuire şi îi aduc respectuoase mulţumiri. Căruia îi rămân profund recunoscător pentru tot sprijinul pe care mi l-a acordat pe parcursul perioadei de doctorantură. în încercarea de a identifica cauzele care au condus la actuala dinamică a variabilităţii genetice a speciilor studiate.

cu excepţia Africii. Stil scurt sau lung. Asteridae. de regulă bisexuale. Magnoliophita (Angiospermatophita). Subtrib Gentianinae. Frunze opuse sau alterne. Gentianaceae. pe toate continentele. Plantele din acest gen sunt anuale. adesea sesile. lipsite de stipele. Corolă albastră. uneori vaginate. Capsulă sesilă sau pedicelată. bivalvată. Caliciu tubulos. grupate în 87 de genuri. cu tulpini erecte sau cespitoase. Gentianales. campanulată sau rotată. Srg. bianuale sau perene. netede sau acoperite cu solzi. Bitterul a fost folosit în mod tradiţional ca un remediu împotriva scăderii apetitului şi a 3 . violacee. Fam. Seminţe adesea aripate. cu stigmat întreg sau bilobat. Gen Gentiana Familia Gentianaceae cuprinde aproximativ 800 de specii grupate în 70 de genuri. solitare sau în inflorescenţe umbeliforme. Scl. 2. multispermă. galbenă sau murdar roşiatică. Inc. Genul Gentiana cuprinde 300-400 de specii răspândite mai ales în zona montană şi subalpină. Cls. Trib Gentianae. Stamine 4 5. sesile sa u scurt pedicelate. cu 4 5 diviziuni egale sau 8-10 diviziuni alternativ inegale. infundibuliformă. În clasificările mai noi apar un număr de aproximativ 1650 de specii în această familie.CAPITOLUL 2 DESCRIEREA GENERALĂ A FAMILIEI GENTIANACEAE ŞI STADIUL ACTUAL AL CUNOAŞTERII 2. precum amarogentina (cea mai amară dintre ele). datorat conţinutului crescut în iridoide. Flori radiare. Cormobionta. cu 5 (rareori 4 10) diviziuni. mari. Asteridae. Ord.2 Implicaţii farmacologice ale Gentianaceaelor Plantele aparţinând Gentianaceae-lor sunt cunoscute pentru gustul lor amar. rar albă.1 Taxonomia familiei Gentianaceae Speciile aparţinând genului Gentiana sunt încadrate taxonomic după cum urmează: Rg Vegetalia (Plantae). Speciile acestei familii sunt răspândite pe tot globul fiind mai des întâlnite în etajul alpin şi subalpin.

1982). atât prin inhibarea degranulării CAPITOLUL 3 MARCHERII MOLECULARI BAZAŢI PE REACŢIA PCR În anul 1985 a fost pusă la punct o noua tehnică. Anumite iridoide provenind de la Gentianaceae s-au dovedit a avea anumite proprietăţi. efect ce poate fi explicat prin activitatea inhibitorie la nivelul mono-amin-oxidazei. Erythraea chilensis în Chile şi Peru. Acesta inhibă şi edemul inflamator. Schultesia guianensis în America Centrală şi Centaurium australe în Australia (Hegnauer.. recoltată în perioada înfloririi) şi Ghinţura galbenă – Gentiana lutea (rizomul şi rădăcina uscate. şi efect antiinflamator. Frasera caroliniensis în SUA. care a revoluţionat genetica moleculară. Numeroase plante aparţinând Gentianaceae-lor sunt prezente în farmacopei: ţintaurul (florile uscate ale ţintaurului comun – Centaurium erythraea dar şi alte specii de Centaurium). Coutoubea spicata în Brazilia. Tehnica permite amplificarea in vitro a unei 4 . cum ar fi: swertiamarin -ul are proprietăţi anticolinergice (Yamahara şi colab. 1991). Swerosidele şi gentiopicrosidele sunt hepatoprotectoare.febrei. al căilor ciclooxigenazei şi lipooxigenazei. o xantonă provenind de la Tripterospermum. fiind folosite ca şi medicamente antihepatitice (Kondo şi colab. de asemenea. dar slab. Studiul efectuat de Wang şi colab. 2002). Norathyriolul. Enicostema littorale în India. Jensen şi colab. 1994). parţial fermentate). Numeroase alte specii din familie au fost utilizate în diferite regiuni ale globului în scop terapeutic: Chironia baccifera în Africa de Sud. Acestea au. în 1994 sugerează că norathyriolul ar putea fi un blocant dublu. Această tehnică poartă numele de Polimerase Chain Reaction – PCR (reacţia în lanţ a polimerazei). are efect antiinflamator şi analgezic.. Swertia chirata (planta uscată. 1966. fiind încă inclus în multe reţete „tonice” (Martindale. Xantonele (mai ales mangiferina) par să determine stimularea sistemului nervos central.. Bellidifolina şi swerchirina au un puternic efect hipoglicemiant (Jensen şi colab. 2002).

fragmentul dintre cele două amorse va fi amplificat. 3.. Produşii de amplificare vor fi migraţi electroforetic. Reacţia are loc pe fondul unui ciclu termic care va permite denaturarea ADN. 5 . AP-PCR. Aceste tehnici utilizează amorse specifice.1 Marcherii RAPD Tehnica RAPD a fost concepută de Williams şi colaboratorii (Williams şi colab. nu este necesară cunoaşterea prealabilă a secvenţelor de ADN care vor fi amplificate (Vila şi colab.). într-un număr foarte mare de copii. Datorită faptului că secvenţa amorselor este generată arbitrar. Pentru a putea amplifica o secvenţă ADN dorită. rezultând în general un număr de 5 – 20 de benzi pentru fiecare amorsă (Grant.) sau alese aleatoriu (RAPD. care au la bază amplificarea PCR cu amorse alese aleatoriu (DAF.. etc. Amorsele se vor hibridiza cu molecula de ADN matriţă în mai multe locuri în mod aleatoriu. fixarea amorselor şi polimerizarea (extensia) secvenţei de ADN cuprinse între cele două amorse PCR specifice (Vila şi colab. Totodată pentru a realiza o amplificare este necesară o ADN polimerază termostabilă. 1996). 1996. Dacă distanţa dintre două amorse este suficient de mică şi dacă sunt orientaţi corespunzător unul faţă de celălalt. 2001). complementare capetelor secvenţei pe care dorim să o amplificăm (amorse).trifosfat – DNTP) cât şi de un tampon de amplificare potrivit. 1990) şi este cea mai simplă şi mai utilizată dintre tehnicile de marcare moleculară. Pe baza reacţiei PCR s-au dezvoltat o serie de tehnici de obţinere a unor amprente genetice şi de detectare a polimorfismelor la nivel de ADN. nucleotide (sub formă de deoxinucleotid . AP-PCR) (Vila şi colab. utilizând amorse scurte (de obicei decameri). DAF. sunt necesare două oligonucleotide monocatenare. 1996) Marcherii RAPD (Random Amplified Plymorphic DNA) sunt obţinuţi pe baza tehnicii PCR.secvenţe dorite de ADN.

EtBr. găsindu-se în proporţie mai mare la nivelul centromerului şi telomerelor (ADN non-informaţional) (Gupta şi colab. Polimorfismul este manifestat prin variaţia în număr a repetiţiilor în tandem în urma amplificării PCR cu amorse complementare secvenţelor ce flanchează ADN-ul microsatelit (secvenţe conservate în cadrul speciei. studii de filogenie şi de evoluţionism. − polimorfism ridicat. de obicei 2-3 pb) de nucleotide ce se repetă în tandem.2 Marcherii SSR Microsateliţii (ADN înalt repetitiv) reprezintă secvenţe scurte (1-10 pb. − reproductibilitate mare. Produşii de amplificare (benzi de 200-300 pb. − codominanţă. amprentarea genetică.3. a diversităţii genetice. evaluarea germoplasmei. Produşii ce diferă între ei ca mărime prin mai puţin de 10 pb. − posibilitatea de automatizare a analizelor. în general. uneori şi a genului). − interpretarea simplă a rezultatelor. − Transferabilitatea interspecifică redusă Marcherii SSR îşi găsesc aplicabilitate în genotipizarea indivizilor. ce diferă între ele ca mărime prin cel puţin 10-20 pb) sunt migraţi în gel de agaroză şi vizualizaţi prin marcare cu substanţe de intercalare specifice (ex. 1996). Avantajele utilizării marcherilor SSR: − distribuţia lor uniformă în genom. 6 . cartarea genomului. sunt migraţi în gel de poliacrilamidă şi vizualizaţi prin impregnare cu azotat de argint sau cu ajutorul izotopilor radioactivi sau pot fi supuşi electroforezei capilare pentru o analiză foarte clară a rezultatelor. Dezavantaje: − costul elaborării amorselor − necesitatea cunoaşterii secvenţei de ADN de interes. SYBR Safe).

1 G. V.CAPITOLUL 4 OBIECTIVELE CERCETĂRII. iar patru în Carpaţii Orientali 7 . dar multe specii rare sau extincte în restul Europei. V. Boului. pe baza marcherilor moleculari − Analiza variabilităţii genetice intrainterpopulaţionale pe baza marcherilor moleculari − Identificarea unor factori care influenţează evoluţia variabilităţii genetice intrapopulaţionale la populaţiile analizate 4. MATERIAL ŞI METODĂ 4. Vf. Roşia Montana – Munţii Metaliferi).1 Obiectivele cercetării Ţara noastră este considerată un important centru de biodiversitate pe harta Europei. dintre care cinci au fost situate în Carpaţii Occidentali (Valea Drăganului –masivul Vlădeasa. au fost identificate în teren zece populaţii. Scăriţa – Masivul Gilău-Muntele Mare. Principalele obiective urmărite în cadrul studiului nostru au fost: − Identificarea în teren a unor populaţii ale speciilor din genul Gentiana − Descrierea şi caracterizarea arealelor respective − Recoltarea materialului biologic necesar analizelor la nivel molecular fără afectarea diversităţii genetice a populaţiei − Analiza relaţiilor taxonomice dintre speciile identificate. numărând în flora şi fauna naţională o serie de specii endemice.2 şi Material biologic 4. asclepiadea În cadrul acestei specii. Pociovaliştei.2. Cu toate acestea studiile privitoare la diversitatea genetică a populaţiilor din cadrele naturale sunt foarte puţine.

20 de indivizi din populaţiile din Suhardu Mic. Suprafeţele ocupate de populaţiile speciei G. Masivul Ceahlău în etajul pădurilor montane – alt. cca.(Masivul Ceahlău în zona alpină – alt. el fiind de ordinul sutelor de indivizi în fiecare populaţie. Suhardul Mic – Munţii Hăşmaş şi Obcinele Bucovinei) şi una în Carpaţii Meridionali – Munţii Făgăraş. În vederea izolării ADN-ului necesar analizelor moleculare au fost recoltate câte două frunze de la câte 31 indivizi din populaţia de pe valea Boului. asclepiadea sunt şi ele mari fiind în unele cazuri de câteva zeci de hectare. clusi A fost identificată o singură populaţie aparţinând acestei specii de talie mică. distanţa dintre pâlcuri fiind de 50 . Suprafaţa arealului ocupat de populaţia din Scăriţa Belioara este de câteva hectare. pe teritoriul rezervaţiei naturale Scăriţa – Belioara (Anexa 3). Se poate spune astfel. Vf. Au fost recoltate frunze de la 21 indivizi aflaţi în faza de fructificare. asclepiadea este specia cu cea mai mare răspândire pe teritoriul ţării noastre. se poate spune că este mare. astfel ca frunzele au avut o calitate redusă. că specia G. fiecare pâlc fiind alcătuit din cca. mai ales dacă îl comparăm cu celelalte specii ale genului. 1400 m. 4. Ceahlău platou .2 G. 30 – 40 de indivizi. şi cinci indivizi din populaţia din Roşia Montană. 8 . aflate în zona alpină. Câte zece indivizi din populaţiile din Făgăraş şi Straja. Scăriţa -Belioara. Ceahlău pădure. În ceea ce priveşte numărul indivizilor din care sunt alcătuite populaţiile acestei specii. 1750 m. Plantele aparţinând acestei specii preferă coastele însorite ale stâncilor calcaroase. valea Pociovaliştei şi Valea Drăganului. Indivizii au fost selectaţi aleatoriu. cca.2.100 m. astfel încât să acopere cea mai mare parte a arealului ocupat al populaţiei respective. indivizii speciei crescând în pâlcuri întinse pe suprafeţe mici de câteva zeci de m2. dintre speciile genului Gentiana.

1998).4 G.3 G. În această listă este clasificată ca o subspecie a speciei G. Walter şi colab. şi se găseşte lista roşie a plantelor ameninţate publicată în 1997 de WCMC (centrul de mondial de monitorizarea conservării) al UNEP (United Nations Environment Programme) (UNEP). A doua situaţie este întâlnită în cazul populaţiei din Sălicea. în zonele nepăşunate aceasta creste la cca.. O primă situaţie este cea a populaţiei situate pe arealul rezervaţiei Scăriţa Belioara. Au fost recoltate frunze de la 20 de indivizi din populaţia situată pe platoul şi peretele stâncos al vf-ului Suhardul Mic. 9 . Totuşi. 4. phlogifolia Această specie este endemică în România (Săvulescu 1956. 5 indivizi la 100 m2 (500 indivizi/ha).4. formate dintr-un număr mic de indivizi.2. Astfel. pe întreaga suprafaţă a păşunilor aflate în nordul satului Sălicea se găsesc cu o frecvenţă foarte redusă şi la distanţe mari unul de altul exemplare din specia G. neexploatate pentru păşunat. iar una în zona de deal (Păşunea satului Sălicea). Dacă în ariile păşunate frecvenţa indivizilor este de până la 10 indivizi la hectar. Au fost recoltate frunze de la 31 indivizi din populaţia din Scăriţa-Belioara şi de la 20 de indivizi din populaţia din Sălicea. unde indivizii cresc în pâlcuri cu suprafeţe reduse. Această repartiţie neuniformă este datorată cel mai probabil păşunatului. în câteva arii cu dimensiuni reduse. Distanţa geografică dintre cele două populaţii fiind de 26 km.. crucita (Walter şi colab. cruciata. cruciata. În ceea ce priveşte suprafeţele ocupate de populaţiile acestor specii am întâlnit în teren două situaţii diferite. Totuşi în interiorul ariei protejate densitatea indivizilor este mult mai mare decât în zonele învecinate. Una dintre acestea fiind situate în etajul subalpin (Rezervaţia Scăriţa – Belioara). unde populaţia ocupă suprafeţe însemnate atât în interiorul ariei protejate cât şi în afara acesteia respectiv pe platoul situat la vest de rezervaţie.2. numărul acestora creşte semnificativ (Anexa 4). cruciata Au fost localizate două populaţii ale speciei G. 1998).

terminale. Specia este importantă datorită proprietăţilor sale medicinale fiind totodată specie protejată. cu tub cilindric. lung de 1.-ul Corongiş în Munţii Rodnei. orbicularis Gentiana orbicularis este una din speciile cu talie mică ale genului Gentiana (Anexa 5). aproape sesile. cu tulpină scurtă sau aproape lipsă. 4. acute sau obtuze. Seminţe elipsoidale. Plantă stoloniferă. lutea este specia cu cea mai mare importanţă din punct de vedere economic. Au fost recoltate frunze de la 16 indivizi. cu margine papiloasă. rozulare. el este foarte mic. Suprafaţa ocupată de această populaţie se întinde pe aproximativ 200 m2. albastră. fin reticulate. întunecat cafenii. Flori solitare. întunecat verzi. lucioase. situată sub Vf. În ceea ce priveşte numărul de indivizi din care este formată această populaţie. într-o zonă protejată de vânturile puternice din creastă de câteva stânci formând o mică căldare. lungi de cea 1 mm. La baza peretelui a fost identificată o populaţie formată în cea mai mare parte din hibrizi G. fapt care o face relativ uşor de reperat în teren. Înflorire VII—IX. Totodată nivelul umidităţii solului în această căldare este mai ridicat decât în zonele expuse la vânt. lungi de cea 3 cm. Ovar aproape sesil. înaltă de 3-6 (8) cm.5 G.Această populaţie este compusă din câteva sute de indivizi. ascuţiţi. gâtul nud şi lacinii acutiuscule. 4. lutea Dintre toate speciile identificate în teren G. cruciata × G. Caliciu tubulos. indivizii ei având înălţimi de 80-120 cm. lungi de 1 cm. Această specie este una din speciile cu talie înaltă. glabră. phlogifolia. Corolă hipocrateriformă.6 G. cu stil scurt. cu dinţi triunghiular lanceolaţi. rotunde sau ± subrotunde.5-2 cm.2. profund bifidat şi stigmat de regulă papilos. lung de l-2 cm. Reprezentanţii acestei specii preferă coastele 10 . cât jumătatea tubului sau mai lungi. crenulate. Frunze conforme. A fost identificată în teren numai o populaţie aparţinând acestei specii.2. Capsulă lungă de cea 2 cm. îndesuite. de ord inul câtorva zeci. aproape sesile.

4.7 G. Au fost recoltate frunze de la 15 indivizi din populaţia situată pe platoul în Munţii Rodnei şi 20 de indivizi din Ceahlău. O situaţie contrastantă cu cea prezentată anterior. unde păşunatul este interzis. Populaţia identificată de noi în Munţii Rodnei pe Vf. Cea mai mare parte a arealelor favorabile creşterii speciei G. 110. poate fi găsită pe platoul masivului Ceahlău (Anexa 6). excisa. dintre care doar 5 au fost accesibili în lipsa echipamentului de escaladă. este dificil de localizat în teren. Distanţa geografică între cele două populaţii este de cca.6 Km.-ul Corongiş. Astfel.Vf. similar speciei G. nivalis este exploatată în prezent prin păşunatul oilor. cilliata este reprezentată în actualul studiu printr o populaţie situată în Cheile Baciului. dar este reprezentată printr-un număr foarte mic de indivizi (am localizat 11 indivizi).-ul Corongiş. Populaţia ocupă un areal 11 . zonă declarată parc naţional. (Anexa 5) se întinde pe o suprafaţă de câteva hectare.înierbate cu pantă accentuată şi expunere sudica. sud-estică sau sud-vestică. Rodnei. nivalis se întinde pe întreaga suprafaţă a platoului. în special în condiţii meteorologice nefavorabile.-ul Corongiş. nivalis Două populaţii reprezentante ale speciei G. face foarte dificilă sau chiar imposibilă în unele cazuri colectarea probelor biologice de la indivizii acestei specii. trei areale pedoclimatice favorabile creşterii acestei specii. Datorită înclinaţiei mari a pantelor pe care această specie creşte. separată de restul suprafeţei prin praguri stâncoase abrupte. nivalis au fost identificate. ambele situate în Carpaţii Orientali. iar cea de a doua în munţii Bistriţei pe platoul Masivului Ceahlău. nivalis este prezentă doar într-o mică parte a arealului de pe Vf.2. 4. Specia G.8 Gentianopsis ciliata Specia G. dar specia a fost prezentă numai într-o mică parte a unuia dintre aceste areale (Anexa 5).2. În M-ţii. Specia este de talie redusă şi. o primă populaţie a fost identificată în Munţii Rodnei . şi unde populaţia de G.

Gielly. datorită proprietăţilor sale tensioactive. Reacţiile de amplificare au fost rulate în termociclere Corbet Palmcicler. MgCl2 3mM. Separarea proteinelor se realizează prin precipitarea acestora cu cloroformului în amestec (24:1) cu alcool izoamilic. provocând astfel destabilizarea şi dezintegrarea acestora. 4.5 µM şi ADN 1ng/µl.2 mM. iar ulterior în genul nou creat. Dintre cele 20 de amorse testate. Amestecul de reacţie a fost compus din: GoTaq Green Buffer 1x (Promega). Amplificările PCR au fost efectuate în volum de 20µl în tuburi Eppendorf de 200µl în cazul reacţiilor de testare şi optimizare şi în plăci PCR cu 96 de godeuri pentru analizele finale. 4. Astfel şase dintre cele zece amorse utilizate au prezentat polimorfism la nivel itraspecific iar patru amorse au prezentat polimorfism accentuat doar la nivel interspecific. care. Gentianopsis (Löve şi Löve.5 U. această specie apare încadrată în genul Gentiana. 1975.destul de extins atât în interiorul rezervaţiei complexe cât şi pe păşunile din amonte. acţionează asupra fosfolipidelor din membranele celulare bistratificate. Testele iniţiale au fost efectuate la nivelul ac câte patru indivizi aparţinând fiecărei specii. 1996).3 Izolarea ADN Pentru extracţia ADN am utilizat un protocol de extracţie publicat de Lohdi şi colab (1994) şi modificat de Pop Rodica şi colab (2003). amestec dNTP 0. Taq (Promega) 0. 1956). un detergent cationic. Pentru precipitarea ADN-ului se utilizează alcoolul etilic în prezenţa NaCl. Deşi în lucrarea „Flora RPR” (Săvulescu. au fost selectate zece amorse care au prezentat diferite nivele de polimorfism. în clasificări ulterioare a fost încadrată în genul Gentianella. Amorsă 0. Programul de amplificare a fost constituit din 12 . Protocolul are la bază liza celulară cu ajutorul CTAB.4 MARCAREA RAPD În vederea utilizării marcherilor RAPD au fost testate un număr de 20 de amorse decameri.

phlogifolia)... 50 sec. 13 .. a fost supus amplificării cu fiecare dintre cele zece perechi de amorse. 8 min. Datorită rezultatelor testelor preliminare. 40 sec.. 4.. Astfel ADN izolat de la câte doi indivizi din fiecare specie prezent în studiu. TA+0. 45sec.. 40 sec. 40 sec. ataşarea primerilor 1 minut la 34°C şi elongrea 1 minute la 72°C. două cicluri 94°C. cruciata şi G. produşii de amplificare au fost migraţi electroforetic în gel de poliacrilamidă. care au relevat un nivel mediu şi ridicat de polimorfism astfel încât datele rezultate în urma marcării moleculare să poată fi folosite la toate nivelurile taxonomice urmărite de noi (intrapopulaţional.5°C. TA+1. şi un pas de elongare finală la 72°C timp de 10 min. urmat de un număr de 45 de cicluri cu câte trei etape per ciclu: denaturarea 1 minut la 93°C. două cicluri 94°C. şi extensia finală 72°C. 50 sec. TA°C... 72°C.. (2007). 40 sec. 45sec. Din cele 20 de amorse testate iniţial pe un număr redus de indivizi au fost selectate 10 amorse.un pas de denaturare iniţială la 95°C . constituit din următorii paşi: denaturare iniţială la 94°C 4 min. două cicluri 94°C. TA+2°C. phlogifolia. cruciata şi zece indivizi din specia G. Produşii de amplificare au fost migraţi electroforetic în gel de agaroză. 72°C.5 MARCAREA SSR În vederea testării transferabilităţii interspecifice a marcherilor SSR în cadrul genului Gentiana a fost utilizat un set de zece perechi de amorse specifice publicate de Li şi colab. 72°C.. Astfel au fost incluşi în studiu câte zece indivizi din fiecare populaţie aparţinând speciei G. 72°C. au fost incluse în studiul final doar două specii (G. 50 sec. 35 cicluri 94°C. Un alt criteriu de selecţie a fost reprezentat de repetabilitatea rezultatelor. au fost obţinute rezultate similare. Programul de amplificare utilizat în cazul marcherilor SSR a fost unul de tip Touchdown PCR. interpopulaţional şi interspecific).3 min. TA+1°C. 50 sec. 45sec. În acest sens... Toate analizele au fost efectuate la nivel individual. 50 sec.. au fost reţinute pentru analizele ulterioare doar amorsele cu care în urma a trei amplificări diferite. urmată de două cicluri 94°C. 45sec. 72°C. 45sec.5°C. 40 sec..

5 ore la 500 V. au fost imersate timp de cinci minute într-o soluţie de 0. Vizualizarea produşilor de amplificare s-a realizat în lumină UV. Aceloraşi condiţii de migrare electroforetică au fost supuşi şi produşii de amplificare obţinuţi în urma amplificărilor PCR cu amorse decamere.5×. 4.6. cu ajutorul unor teste de semnificaţie de permutare. în tampon de migrare TAE 1×. de obicei o matrice de distanţe genetică şi o matrice de distanţe geografice.7 Analiza şi interpretarea datelor 4.3 Colorarea gelurilor electroforetice şi achiziţia de imagini După migrarea electroforetică gelurile de poliacrilamidă. au fost migraţi electroforetic în gel denaturant de poliacrilamidă 6%.2 Migrarea electroforetică poliacrilamidă în gel de Produşii de amplificare obţinuţi prin amplificarea PCR cu amorse specifice în cazul marcherilor SSR.4%.1 Migrarea electroforetică Migrarea electroforetică în gel de agaroză În vederea determinării calităţii ADN-ului izolat câte 5 µl din fiecare probă a fost supusă migrării electroforetice în gel de agaroză de 1. în tampon TBE 0.1 Metode statistice generale Testul Mantel este un test de estimare a corelaţiei dintre două matrice de distanta.4. produs de UVP.6. la o tensiune de 5V/cm. În vederea vizualizării ADN -ului în lumină UV în gel a fost adăugată bromură de etidiu în concentraţie de 0.5 h. timp de 1. 4. 4. timp de 1.5µg/µl %.6 4.7.5µg/µl de bromură de etidiu. imaginea gelurilor fiind achiziţionată cu ajutorul aparatul BioSpectrum AC Imaging Sistem.6. Atunci când populaţiile au o structură spaţială şi genetică bine definită şi se întinde pe întreaga zonă 14 .

pentru care se obţin indicii Φ. Huff şi colab. Peakall şi colab.(1993). SSR. Testarea robusteţii arborilor întocmiţi a fost efectuată prin metoda Bootstrap. Atunci când aceeaşi populaţie este analizată prin mai multe metode de marcare moleculare este de preferat utilizarea indicilor Φ. abordată tot mai des în studiile de genetică populaţională. sau valorile omoloage (Φ. R). indicii R. FST). Astfel pot fi analizate datele obţinute cu marcheri dominanţi precum RAPD sau AFLP. poate fi detectată prin acest test. CAPS. analiza varianţei şi stabilirea semnificaţiilor prin teste de permutaţie aleatorie. descrisă de Excoffier şi colab. şi estimarea semnificaţiei diferitelor valori ale indicilor F (FIS. (1995) şi Michalakis şi colab. Metoda permite partiţionarea ierarhică a varianţei genetice. interpoplaţional. sunt de obicei utilizaţi indicii F. regional. Pentru marcherii codominanţi (RFLP. Acest dezavantaj este însă compensat prin 15 . sau pentru cei codominanţi polialelici (SSR). fiecare nod al arborelui original este analizat în sensul determinării procentului de arbori Bootstrap în care taxonii acelui grup au fost grupaţi împreună. AMOVA sau analiza varianţei moleculare este o metodă statistică.geografică. astfel că datele obţinute pot fi comparate cu uşurinţă.7. etc). Această metodă presupune generarea unui set de arbori pe baza unor matrice modificate în sensul eliminării aleatoare a câte unui locus şi înlocuirea lui cu un alt locus. FIT. la diferite niveluri de organizare a populaţiilor (intrapopulaţional. relativ recentă. care pot fi calculaţi şi pentru marcheri codominanţi. SCAR). Ulterior. obţinute se generează un set de arbori. (1992).2 Analiza statistică a datelor rezultate din marcarea RAPD Analizarea variabilităţii genetice cu ajutorul marcherilor dominanţi prezintă dezavantajul unui nivel scăzut al informaţiei obţinute comparativ cu cea obţinută prin utilizarea marcherilor de tip codominant. (1996). Pe baza matricelor. AMOVA permite analiza datelor obţinute prin diferite metode de marcare moleculară. 4. corelaţia pozitivă semnificativă.

în cazul marcherilor dominanţi acest lucru nu poate fi făcut în mod direct. necesare întocmirii dendrogramelor pot fi utilizaţi diferiţi coeficienţi de distanţă sau de similaritate (D=1-S). În vederea calculării distanţelor genetice dintre indivizi. aşteptate în cazul respectării echilibrului Hardy-Weinberg. Metoda utilizează un algoritm secvenţial care începe cu obţinerea unui taxon compozit din perechea de taxoni care au cel mai mare indice de similaritate (cea mai mică distanţă). Cu toate acestea analiza matematică a rezultatelor este mai dificilă şi se bazează pe o serie de prezumţii. dar care poate fi utilizată şi pentru generarea de arbori filogenetici. Pentru analiza diversităţii genetice cu ajutorul marcherilor dominanţi se pot utiliza două metode de analiză. O altă abordare este reprezentată de estimarea variabilităţii cu ajutorul indicelui de diversitate Nei genetică (H).7. Datele obţinute prin marcarea moleculară cu marcheri dominanţi sunt cel mai adesea analizate prin întocmirea de dendrograme prin metodele UPGMA sau Neighbor Joining.numărul mare de loci analizaţi atât în cazul utilizării marcherilor AFLP cât şi în cazul marcherilor RAPD. atunci când rata evoluţiei este egală pentru toate liniile analizate. Metoda UPGMA (Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean) este cea mai simplă metodă pentru construirea unei dendrograme. Utilizând în continuare acest taxon compozit se trece mai departe la obţinerea unei noi matrice de distante (prin calcularea mediilor aritmetice) în care intră taxonul compozit şi restul taxonilor 16 . Astfel o primă metodă este cea care implică calcularea unor distanţe genetice între taxonii analizaţi pe baza cărora se întocmesc mai apoi arbori phenetici. dezvoltată iniţial pentru construcţia fenogramelor. În timp ce analiza diversităţii cu ajutorul marcherilor codominanţi se bazează în principal pe compararea frecvenţelor alelelor şi a genotipurilor observate cu cele teoretice. arbori care pot oferi indicaţii asupra modului de grupare a taxonilor în funcţie de asemănările sau diferenţele dintre ei. 4.3 Generarea arborilor prin metoda UPGMA.

Construcţia începe prin gruparea celor mai apropiate două noduri şi adăugarea la arbore a nodului ancestral comun lor. Pe baza acestei noi matrice de distanţe se caută următorul taxon compozit.rămaşi.5 Estimarea diversităţii genetice pe baza indicelui de diversitate genetică Estimarea diversităţii genetice la un locus dialelic dominant are la bază calcularea frecvenţelor alelelor dominante (p) şi recesive (q) şi compararea lor cu situaţia ideală teoretica întâlnită în cazul echilibrului Hardy-Weinberg. Datele brute sunt de asemenea reprezentate de o matrice binară. Procesul se încheie atunci când în analiza rămân doar doua noduri separate printr-o singură ramură. într-un arbore cu dimensiuni mai mici. Algoritmul permite apariţia ramurilor cu valoare negativa. După aceasta nodurile terminale sunt înlăturate din analiza. 17 . astfel că distanta totala dintre cele două noduri adiacente rămâne neschimbată. după care se calculează o a doua matrice modificată. distantele dintre noduri şi nu cele dintre taxoni sau grupuri de taxoni. în care distanţa dintre fiecare doua noduri este ajustată în funcţie de distanta medie faţă de toate celelalte noduri. 1987) este o metodă de grupare care nu cere ca datele sa fie ultrametrice şi deci nu presupune că taxonii au o rată egală a evoluţiei. În cazul acestei metode se porneşte de la un arbore de tip stea. valoarea ei fiind adăugată la valoarea ramurii adiacente.4 Generarea arborilor prin metoda NeighborJoining Neighbor-joining (Saitou and Nei. 4. urmărindu-se. şi aşa mai departe până în momentul în care rămân doar doi taxoni 4. spre deosebire de metoda precedenta. Daca acest fenomen apare atunci lungimea ramurii respective se setează la zero.7.7. şi topologia generală nu este afectată. Practic în fiecare pas al analizei două noduri terminale sunt înlocuite cu unul terminal nou. astfel nodul ancestral devine nod terminal.

şi generarea arborilor UPGMA şi Neighbor-Joining. Datorită faptului că diversitatea genetică estimată la nivelul mai multor loci este obţinută prin efectuarea mediei aritmetice a valorilor calculate pentru fiecare locus.50.6 (Felsenstein.. În vederea 18 .8 Analiza statistică a datelor rezultate din marcarea SSR În vederea analizării datelor obţinute prin utilizarea marcherilor SSR au fost utilizate metodele statistice descrise de Wright (1965). pentru dendrogramele circulare.1.9 Aplicaţii software utilizate în analizele statistice Pentru analiza statistică a datelor obţinute în urma utilizării celor două metode de marcare moleculară au fost utilizate mai multe aplicaţii software. Astfel pentru gestionarea matricelor binare şi matricelor de distanţe. Pentru calcularea distanţelor genetice pe baza coeficientului Nei-Li/Dice. şi deci eroarea totală va fi mult redusă (Kremer şi colab. (Hampl şi colab. Astfel valorile H supraestimate la nivelul unor loci vor fi compensate de valorile subestimate calculate pentru alţi loci.9. 1989).6. Pentru afişarea sub formă grafică a arborilor au fost utilizate după caz programul TreeView 1. 4. Aceste erori sunt însă foarte mult diminuate atunci când în analiză este introdus un număr mare de loci. Pachetul Phylip a mai fost utilizat şi pentru generarea arborilor consensus pe baza arborilor generaţi prin metoda bootstrap cu programul FreeTree. 1908) a fost utilizat pachetul MS Office Excel. 2005). precum şi pentru efectuarea analizelor privind indicii de diversitate genetică Nei (H). 4. eroarea este supusă distribuţiei valorilor Q ale diferiţilor loci. a fost utilizat programul FreeTree 0. şi pentru efectuarea testelor Student (t) (Gosset. precum şi pentru testarea acestora prin metoda Bootstrap.. dependente de valorile frecvenţei genotipurilor recesive (Q).În cazul analizării unui singur locus această metodă produce rezultate supuse unor erori mari. 1996) sau pachetul de programe Phylip 3. 2001).6 (pentru dendrogramele rectangulare) (Page.

testele privind echilibrul genetic. nivalis 108 86 80 G.1. Marcarea RAPD a pus în evidenţă a pus în evidenţă la şapte din cele opt specii. orbicularis 85 53 62.63 G.27 G. total Nr benzi % benzi benzi polimorfe polimorfe 119 90 75. Tabel 1: Numărul total de benzi şi numărul de benzi polimorfe rezultate în urma marcării RAPD Specia Nr.75 75 43 57. clusi 85 61 72. cilliata 103 76 74. indiferent de specie au pus în evidentă un număr total de 169 de benzi. a fost utilizat programul GenAlEx 6.1999).28 G. lutea Cel mai mare număr de benzi la nivel individual au fost obţinute cu amorsa OPF20 (26) iar cel mai mic număr a fost obţinut cu amorsa OPC15 (12). cruciata G. analiza varianţei moleculare (AMOVA).30 (Langella O.19 65 33 51. (PEAKALL şi SMOUSE. polimorfe în procent de 100%. 19 . analiza coordonatelor principale (PCA). şi statistica F.55 G. benzi specifice pentru câte o anumită specie.1 Rezultate privind marcarea RAPD Amplificările efectuate cu cele zece amorse decamere la nivel individual. 2006). Numărul total de benzi precum şi cel de benzi polimorfe per specie este prezentat în tabelul 1.78 G. Pentru generarea dendrogramei pe baza marcherilor SSR modelul diploid a fost utilizat programul Population 1. asclepiadea G.2. CAPITOLUL 5 REZULTATE ŞI DISCUŢII 5.efectuării analizelor privind testul Mantel. phlogifolia 96 38 52. Pentru afişarea grafică a rezultatelor analizei coordonatelor principale cu trei axe a fost utilizată aplicaţia NTSYSpc 2.

Astfel cu perechile de amorse Gcr023 şi Gcr138 nu au fost obţinuţi produşi de amplificare. cilliata G. cruciata. Dintre rezultatele obţinute prin marcarea SSR prezentăm rezultatele amplificărilor efectuate cu perechea de amorse CRS-003 CRS-006 CRS-008 CRS-009 CRS-010 CRS-011 CRS-012 CRS-013 CRS-015 CRS-016 CRF-032 CRF-033 CRF-034 CRF-035 CRF-036 CRF-037 CRF-038 CRF-040 CRF-041 CRF-042 PHL-121 PHL-122 PHL-123 PHL-124 PHL-125 PHL-126 PHL-127 PHL-128 PHL-129 PHL-130 L L L L 252 212 175 158 152 140 pb pb pb pb pb pb Figura 1: Produşii de amplificare rezultaţi în urma amplificării PCR cu perechea de amorse GCR128. Datorită naturii tetraploide a speciei G. au fost obţinute. lutea 5. phlogifolia G. cruciata + G.Tabelul 2: Benzile specifice rezultate în urma marcării RAPD Specia G. clusi G. cruciata G. 348 713 Rezultate privind marcarea SSR Dintre cele zece perechi de amorse testate doar opt au generat produşi de amplificare. În coloanele notate cu L a fost încărcat ladderul 20bp (Fermentas) 20 . asclepiadea G.2 Amorsa OPA03 OPH02 OPA01 OPA03 OPF20 OPC15 OPA03 OPA03 OPF20 Dimensiunea benzii specifice (pb) 1040 1069 534 1358 121 904 1112 622. cu unele perechi de amorse până la patru alele per individ. orbicularis G.

care. au pus în evidenţă două categorii de produşi de amplificare (Figura 1). cruciata este o specie autotetraploidă. au fost identificate între două şi patru alele per individ. Analiza pe baza marcherilor SSR ne poate conduce la concluzia că specia G. 2008). cinci au prezentat câte două alele per individ. Alela cu dimensiunea de 140 pb este prezentă la toţi indivizii în timp ce alela cu dimensiunea de 152 pb este prezentă la toţi indivizii care au prezentat şi alela cu dimensiunea de 212 pb dar şi la un individ care nu prezintă această alelă. În caz ul acestor fragmente. Alela 158 este prezentă numai la indivizii care prezintă şi alela cu dimensiunea de 252 pb. dar care aparent se supun modelului tetrasomic. (2007). Astfel o primă categorie de produşi de amplificare este reprezentată de două alele cu dimensiunile de 212 respectiv 252 de perechi de baze. Dintre cei şapte loci la care au fost identificate cel puţin două alele. Aceste alele putem spune că se supun modelului disomic de transmitere ereditară. care au dimensiuni similare celor de la alte specii (Yong şi colab. Astfel alelele 212 şi 252. 158 şi 175 de perechi de baze. În cazul locusului Gcr197. prin acea că cele două categorii de alele identificate se supun unor modele diferite.Gcr128. şi alela cu dimensiunea de 175 pb este regăsită la indivizii purtători ai alelelor de 158 pb respectiv 252 pb. 2008). situaţie caracteristică modelului de transmitere ereditară disomic întâlnit la speciile autotetraploide (Marc şi colab. situaţie caracteristică modelului tetrasomic întâlnit la speciile alotetraploide (Marc şi colab. au fost identificate între două şi patru alele per individ. Aceste două alele având dimensiuni similare celor raportate de către Yong şi colab. sunt probabil forme ancestrale ale alelelor acestui locus.. Existenţa celor două categorii de ampliconi poate fi explicată prin duplicarea locilor urmată de evoluţia independentă a lor (Avner şi colab. apărând alele noi. 2008). iar modelul tretrasomic întâlnit în cazul celor doi loci este rezultatul 21 . dimensiuni mai mici decât cele raportate iniţial de către Yong şi colab. O a doua categorie de produşi de amplificare este reprezentată de patru fragmente cu dimensiunile de 140. Locusul Gcr128 prezintă o situaţie mai complexă... 2007). copiile au evoluat independent.. Cu excepţia unui singur individ. 152. În urma duplicării secvenţelor acetui locus la nivelul genomului. (2007).

În cazul speciilor G.140 14.001 ΦPR 0.193 <0.277 1. 5. care nu mai formează întotdeauna cromozomi tetravalenţi. au fost utilizate rezultatele obţinute în urma amplificărilor cu cele zece amorse.689 <0.087 61% Interpopulaţională 11 223. În ceea ce priveşte variabilitatea genetică intrapopulaţională este în ansamblu una foarte semnificativă. Totodată izolarea populaţiilor este una foarte semnificativă.616 22. şi astfel conduc la segregarea independentă a alelelor. la toţi cei 146 indivizi analizaţi.908 100% AMOVA Valoare p 0.1 Analiza relaţiilor taxonomice În vederea analizei relaţiilor taxonomice la nivel interspecific. prezentată în figura 2.001 ΦPT În dendrograma obţinută prin metoda UPGMA. cruciata pot fi distinse câte două subclustere corespunzătoare populaţiilor analizate.200 7. aparţinând celor opt specii introduse în studiu. prezentată în tabelul 3. nivalis şi G.702 7% Intrapopulaţională 127 904. reprezentând 31% din varianţa totală.3. se poate observa delimitarea clară a opt clustere corespunzătoare celor opt specii analizate. Analiza varianţei moleculare (AMOVA). indică o diferenţiere foarte semnificativă între speciile analizate. Tabel 3: Analiza varianţei moleculare la nivel interspecific Sursa varianţei GL SPA s2 % Interspecifică 7 1548. ducând la apariţia cromozomilor parţial omologi.3 Analiza şi interpretarea datelor 5.615 <0.evoluţiei divergente a unor tetrade cromozomale. 22 .001 ΦRT 0.120 31% Total 145 2675.

respectiv genul (Gentianopsis) 23 . Deşi morfologic cele două specii diferă semnificativ. gruparea nu este surprinzătoare. lutea din secţiunea Gentiana. Figura 2: Dendrograma întocmită prin metoda UPGMA. această grupare fiind pusă în evidenţă şi de alte studii efectuate la nivel molecular în care G. iar pe cel exterior sunt marcate după caz secţiunile genului. Putem spune astfel că rezultatele noastre sunt în concordanţă cu cele din literatura de specialitate.(1998).Din analiza dendrogramelor UPGMA şi Consensus se poate observa că G. asclepiadea în secţiunea Pneumonanthe este greşită. asclepiadea a fost grupată împreună cu specii din secţiunea Gentiana şi nu cu împreună cu speciile din secţiunea Pneumonanthe. conducând la concluzia că încadrarea speciei G. asclepiadea aparţinând secţiunii Pneumonanthe este grupată împreună cu G. De altfel Yuan şi colab. Pe cercul interior sunt marcate cele opt grupuri corespunzătoare speciilor analizate.

Lungimile braţelor corespund valorilor bootstrap.recomandă încadrarea acestei specii într -o secţiune separată. clusi din secţiunea Ciminalis este grupată alăturat celor anterior menţionate grupare asigurată cu o valoare bootstrap de 49%. cu un singur reprezentant. Pe cercul interior sunt marcate cele opt grupuri corespunzătoare speciilor analizate. phlogifolia din secţiunea Cruciata al cărui poziţie este asigurată statistic de o valoare bootstrap de 46%. apropiată genetic de secţiunea Gentiana. respectiv genul (Gentianopsis) 24 . cruciata şi G. G. notate şi ca valori numerice pe braţele importante. Acest rezultat este similar Figura 3: Dendrograma întocmită prin metoda consensus pe baza a 250 de arbori generaţi prin analiza Bootstrap. iar pe cel exterior sunt marcate după caz secţiunile genului. Un alt grup este constituit de speciile G.

dar nu şi pe axele x şi y. cruciata valoarea bootstrap este de 81%. este separat de grupul speciei G. un al doilea grup bine delimitat pe toate axele este format din indivizii speciilor G. sunt mai reduse comparativ cu cele care susţin grupările altor specii (în toate cazurile fiind de 100%). Datorită incertitudinilor în ceea ce priveşte relaţiile ierarhice dintre diferitele secţiuni ale genului Gentiana. nivalis. al şaselea este format din 25 . phlogifolia ca fiind o subspecie a speciei G. cruciata.937. cruciata. format din indivizii speciei G. clusi. Deşi aceste valori susţin o oarecare separare. (1996). separarea fiind evidentă şi susţinută statistic de o valoare bootstrap de 100%. Un prim astfel de grup este reprezentat de indivizii aparţinând speciei G. Astfel în cazul speciei G. Încadrarea taxonului G. o metodă mai potrivită pentru analizarea distanţelor genetice dintre speciile analizate este constituită de analiza principalelor coordonate (PCA). phlogifolia ca subspecie a speciei G. valorile bootstrap care susţin gruparea indivizilor aparţinând celor două specii din această secţiune.. GL=27) faţă de distanţele interspecifice medii calculate pentru toate perechile de specii analizate. cruciata şi G.(2009) respectiv Gielly şi colab. orbicularis pe axa z. ea nu este suficient de mare pentru a considera cei doi taxoni ca fiind specii diferite ci mai degrabă putem considera taxonul G. Astfel Metoda PCA în trei axe (figura 4). Valori similare au fost regăsite şi în celelalte studii efectuate la nivel molecular în cadrul genului Gentiana. pune în evidenţă şapte grupuri principale (nori de puncte). Cel de al treilea grup. Valorile reduse obţinute prin metoda bootstrap între diferitele secţiuni ale genului indică o incertitudine a clasificării ierarhice a relaţiilor dintre secţiuni. Specia Gentianopsis ciliata formează un grup separat de celelalte specii analizate. phlogifolia. care este foarte semnificativ mai mică (t=-3. Cel de-al cincilea grup este reprezentat de specia G. iar pentru specia G.celor obţinute de către Mishiba şi colab. phlogifolia avem o valoare de 87%. este susţinută şi de distanţa medie calculată intre indivizii celor doi taxoni. asclepiadea bine individualizat pe toate cele trei axe. Aşa cum se poate observa în figura 3.

309 26 .4 Analiza variabilităţii genetice intra.şi interpopulaţionale la specia G. grupuri separate de celelalte grupuri pe toate axele. Figura 4: Reprezentarea grafică a rezultatelor analizei principalelor coordonate pe trei axe. se constată astfel că şi prin intermediul metodei PCA. 5. în sistematica clasică bazată doar pe caracterele morfologice. Putem astfel concluziona că rezultatele obţinute în prezentul studiu sunt în concordanţă cu cele regăsite în cele mai noi studii din literatura de specialitate.indivizii speciei G. studii care atrag atenţia supra unor încadrări defectuoase a unor specii aparţinând genului Gentiana. speciile aparţinând aceleaşi secţiuni au fost grupate împreună pe cel puţin două axe. ciliata. lutea iar al şaptelea din cei aparţinând speciei G. Relaţiile de distanţă dintre diferitele secţiuni sunt descrise fără prezumţia existenţei unei structuri ierarhice. asclepiadea Distanţele genetice medii calculate prin coeficientul Nei-Li (Dice) între indivizi în interiorul populaţiilor au variat între 0.

populaţiile din ţara noastră fiind situate la limita estică a arealului de distribuţie. Acest fapt este pus în evidenţă atât de analiza coordonatelor principale (PCA). fără însă a fi o diferenţă semnificativă. Astfel arborele nu pune în evidenţă grupuri corespunzătoare populaţiilor indivizii fiind dispersaţi în toată structura arborelui fără a se ţine cont de populaţia de origine (figura 6).159). grupurile se suprapun în cea nai mare parte.183 pun în evidenţă o separare foarte semnificativă (p<0. ea reprezentând 82% din variabilitatea totală din interiorul speciei. Datorită numărului mare de indivizi care compun toate cele zece populaţii analizate. Deşi coeficienţii de distanţă genetică calculaţi doar pe baza locilor prezenţi la această specie. Valorile calculate ale indicilor FST (FST=0. variabilitatea genetică intrapopulaţională este ridicată.210 pentru populaţia din Roşia Montana.pentru populaţia din Suhardu Mic şi 0. indică o variabilitate genetică mai scăzută decât media distanţelor genetice intrapopulaţionale pentru toate speciile. relevă o variabilitate genetică ridicată. Astfel aşa cum se poate observa în figura 5. prin analiza principalelor coordonate. cât şi de arborele UPGMA generate pe baza distanţelor genetice calculate pe baza coeficientului de similaritate NeiLi/Dice. deşi există o tendinţă de grupare a indivizilor în funcţie de populaţia de provenienţă.001) între populaţii. ceea ce conduce 27 . cei calculaţi ţinându-se cont de toţi locii analizaţi la toate speciile introduse în studiu (0. având în vedere distribuţia acestei specii pe continentul european. Situaţia este redată similar şi de analiza arborelui UPGMA generat.225) şi ΦPT = 0. Totuşi la nici una din populaţiile analizate nu au fost puse în evidenţă benzi specifice populaţiei. Astfel că diferenţele puse în evidenţă între populaţii sunt datorate mai degrabă frecvenţelor diferite ale alelelor în fiecare populaţi e decât prezenţei vreunor alele specifice pentru câte o populaţie. rezultând astfel un singur nor de puncte cuprinzând toţi indivizii speciei. Această variabilitate scăzută relevată la populaţii compuse dintrun număr mare de indivizi poate fi pusă pe seama efectului de fondator (Templeton. 1980).

la ideea că la originea populaţiilor din Carpaţi a fost un număr mic de indivizi migraţi cel mai probabil din Europa centrală. Analiza Principalelor Coordonate AVB ASM AC1 Coord. asclepiadea. 28 . 2 AC2 ASB AVP AVD AFA AST Coord. pe baza marcherilor RAPD la specia G. 1 ARM Figura 5: Reprezentarea grafică a analizei principalelor coordonate.

aslepiadea. 29 .AVB-59 AVP-280 AVP-277 AVP-282 AC2-206 AVB-58 ASM-143 ASB-265 ASB-267 ASB-268 AVP-279 AC1-187 AVB-62 AC1-188 AC2-204 AVD-306 AVD-302 AVD-308 AFA-323 AVD-303 AVD-309 ARM-298 ARM-299 ARM-300 ARM-301 AC2-203 AVB-56 AC1-190 AC1-189 AC2-202 AFA-324 AFA-329 AFA-326 AFA-325 AFA-328 AFA-322 AVD-305 AVD-307 AC2-209 AVP-281 ASB-262 AC1-184 AC1-182 AC1-185 AVP-283 AVP-284 AC1-183 ASM-147 AC2-207 AFA-327 ASM-191 ASM-151 AST-339 AST-338 AVP-276 AST-332 AST-333 AST-337 AST-334 AST-335 ASB-261 ASM-149 ASB-264 ASB-266 ASB-263 AVB-60 AC2-208 AST-336 ASM-146 ASM-148 AC2-205 ASM-142 AVB-61 AVB-55 ARM-297 AVD-304 AVB-57 out Figura 6: Dendrograma întocmită prin metoda UPGMA cuprinzând cei 77 de indivizi analizaţi din specia G.

la specia G.506 31% 0.506 0. precum şi indicele ΦST=0. nivalis În cazul speciei G. Valoarea mare a distanţei medii regăsite între indivizii care aparţin la populaţii diferite şi faptul ca acestea diferă foarte semnificativ (p=5. iar în cazul analizei principalelor coordonate pot fi observaţi doi nori de puncte bine individualizaţi reprezentând cele două populaţii. Diferenţele accentuate dintre variabilităţile genetice ale celor două populaţii pot fi explicate prin demografia diferită a celor două populaţii.307 0. Astfel în cazul dendrogramei obţinute prin metoda UPGMA. Astfel. Distribuţia indivizilor în clustere corespunde distribuţiei în populaţiile analizate. nivalis dendrograma generată pe baza matricei de distanţe a pus în evidenţă două clustere bine delimitate.33×10-7) de cele calculate între toţi indivizii specie. 30 .307 sugerează izolarea reproductivă a celor două populaţii. pot fi distinse două grupuri evidente corespunzând celor două populaţii analizate.001 intrapopulaţional 14 1.5 Analiza variabilităţii genetice intra. Tabel 4: Analiza varianţei moleculare efectuată pe baza distanţelor genetice calculate prin coeficientul Nei-Li/Dice. Proporţia Sursa variaţiei s2 varianţei ΦPT p GL SPA Estimata (%) < interpopulaţional 1 0.şi interpopulaţionale la specia G. O posibilă cauză a acestei demografii diferite poate fi găsită în condiţiile ecologice ale arealelor celor două populaţii. nivalis.064 100% Diferenţierea celor două populaţii este pusă în evidenţă şi de cele două metode de analiză grafică a datelor. iar populaţia de pe platoul alpin al Masivului Ceahlău este constituită din mai multe sute de indivizi răspândiţi pe întreg platoul alpin.5. utilizând rezultatele marcării RAPD.111 69% Total 15 2. populaţia de lângă Vf-ul Corongiş este constituită din doar câteva zeci de indivizi răspândiţi pe o arie restrânsă.558 0. respectiv practicile diferite de exploatare prin păşunare a acestor areale.

NIC-167 NIC-169 NIC-165 NIC-170 NIC-166 NIC-168 NIC-164 NIC-163 NIR-111 NIR-116 NIR-108 NIR-113 NIR-110 NIR-112 NIR-106 NIR-115 OUT 0. 5.1 Figura 7: Dendrograma întocmită prin metoda UPGMA. nivalis.12×10-8) faţă de cel calculat pentru toţi indivizii analizaţi ai acestei specii. a fost foarte semnificativ mai mic (p=1.şi interpopulaţionale la specia G. Astfel în cazul populaţiei situată în arealul protejat al rezervaţiei ScăriţaBelioara. cruciata 5.6. cruciata au prezentat un grad de polimorfism diferit. 31 . pentru cele două populaţii analizate din specia G.6 Analiza variabilităţii genetice intra.1 Analiza statistică a datelor rezultate din marcarea RAPD Cele două populaţii analizate aparţinând speciei G. media coeficientului de distanţă Dice doar pe baza locilor polimorfi la nivelul speciei.

O altă cauză posibilă rezidă din adaptabilitatea diferită a heterozigoţilor.5. populaţie cu un număr mic de indivizi poate fi explicată. Distanţa medie dintre indivizii populaţiei din Sălicea are o valoare de 0. au fost analizaţi câte zece indivizi din fiecare populaţie. ceea ce conduce la proporţii diferite ale indivizilor analizaţi din totalul populaţiei. respectiv de scăderea numărului de indivizi din populaţie în perioada 2005-2009.411. deşi populaţiile au diferit foarte mult în ceea ce priveşte numărul de indivizi. Tot odată în această perioadă nu a fost observată apariţia de noi indivizi astfel că populaţia este formată în majoritate din indivizi maturi.439.2 Analiza statistică a datelor rezultate din marcarea SSR Pentru populaţia situată în rezervaţia Scăriţa-Belioara a fost regăsită o distanţă medie de 0. Lipsa descendenţei se datorează probabil păşunatului tot mai intens al acestor păşuni. ceea ce conduce la imposibilitatea plantelor de a mai produce seminţe datorită distrugerii plantelor înainte de maturarea fructelor prin călcare de către animale. populaţiile sunt în echilibru genetic. pe de altă parte prin adaptabilitatea mai mare a indivizilor heterozigoţi. semnificativ mai mică (p=0. Astfel.024) faţă de distanţa medie regăsită la nivelul întregii specii. faţă de cea din Sălicea. Se poate constata astfel că rezultatele obţinute pe baza marcherilor SSR coincid cu cele obţinute cu ajutorul marcherilor RAPD. indicând o diversitate mai scăzută în cadrul populaţiei din rezervaţia Scăriţa-Belioara. Analiza echilibrului genetic al populaţiilor arată că cu toate că ambele populaţii analizate au prezentat un exces de heterozigoţi la nivelul majorităţii locilor analizaţi. Variabilitatea genetică mare observată în cadrul populaţiei situată în Sălicea. 32 . diferind nesemnificativ faţă de distanţa medie a speciei.6. Supraestimarea variabilităţii genetice în cazul populaţiei din Sălicea este susţinută şi de evoluţia demografiei populaţiei. pe de o parte prin numărul mare de indivizi care au fost analizaţi raportat la numărul total de indivizi din populaţie.

precum şi al celor SSR tetraploid. Aşa cum se poate observa din dendrograme conform analizei RAPD dar şi SSR diploid (figurile 8 A şi C). pentru marcherii SSR diploid.Pe baza distanţelor genetice calculate prin coeficientul Dice în cazul marcherilor RAPD. au fost generate trei dendrograme prezentate în figura 8. consideraţi dominanţi (C). 33 . CRS-009 CRS-012 CRS-008 CRS-003 CRS-006 CRS-011 CRS-010 CRS-013 CRF-034 CRF-038 CRF-036 CRF-035 CRF-040 CRF-032 CRF-033 CRF-037 CRS-012 CRS-008 CRF-034 CRS-010 CRS-011 CRS-015 CRS-016 CRS-013 CRF-042 CRS-003 CRS-006 CRF-041 CRF-038 CRS-009 CRF-033 CRF-037 CRF-040 CRF-032 CRF-035 CRF-036 CRS-015 CRS-016 CRS-012 CRS-008 CRS-010 CRS-011 CRS-013 CRS-009 CRS-003 CRS-006 CRF-033 CRF-042 CRF-034 CRF-041 CRF-038 CRF-032 CRF-035 CRF-036 CRF-037 CRF-040 A B C Figura 8: Dendrogramele întocmite prin metoda UPGMA pe baza markerilor RAPD (A). SSR (B) şi SSR. cruciata. la specia G. şi pe baza coeficientului de distanţă genetică standard Nei. totuşi unii indivizi sunt grupaţi împreună cu indivizi din altă populaţie (figura 8 B). deşi există o tendinţă destul de evidentă de grupare a indivizilor conform populaţiei de origine. pusă de altfel în evidenţă şi de analiza frecvenţei genelor. Această grupare este datorată cel mai probabil migraţiei. În cazul analizei SSR tetraploid. indivizii fiind grupaţi conform populaţiei de origine. cele două populaţii sunt bine delimitate.

Din datele prezentate putem spune că populaţia analizată.165) a fost şi ea situată sub media calculată pentru toate populaţiile analizate.7 Analiza variabilităţii genetice intrapopulaţionale la specia G. Totodată distanţa medie dintre indivizi diferă nesemnificativ de media distanţelor genetice intrapopulaţionale regăsite în toate populaţiile analizate.16) indică o diversitate genetică mai scăzută comparativ cu cei regăsiţi în cadrul celor două populaţii de G. datele obţinute prin cele două metode de marcare moleculară nu sunt în deplin acord. phlogifolia nu prezintă probleme nici în ceea ce priveşte demografia şi nici în ceea ce priveşte variabilitatea intrapopulaţională.8 Analiza variabilităţii genetice intrapopulaţionale la specia G. lutea Dintre toate populaţiile analizate aparţinând celor opt specii studiate.138). Având în vedere 34 . cruciata. lutea manifestă cel mai redus polimorfism relevat prin metoda de marcare moleculară RAPD. foarte apropiat de media distanţelor intrapopulaţionale ale celor două populaţii ale speciei G.5. şi calcularea distanţelor genetice. cruciata dar mai scăzută decât media celor două populaţii. calculaţi pe baza marcherilor RAPD (HHW=0. considerând modelul disomic de transmitere ereditară. Astfel indicii de diversitate genetică Nei ( H).17. indiferent de specie. HPH=0. aparţinând taxonului G. arată că distanţa medie dintre indivizi (0. aparţinând speciei G. Distanţa genetică medie dintre indivizii analizaţi (0. analizate prin întocmirea matricei binare.419) este mai mare decât ce calculată pentru populaţia din Scăriţa-Belioara a speciei G. în cadrul acestei specii situate pe lista roşie speciilor ameninţate.28% din produşii de amplificare au manifestat polimorfism. populaţia din munţii Rodnei. astfel că această populaţie poate fi considerată un centru important de conservare in situ a biodiversităţii.139. Datele obţinute cu ajutorul marcherilor SSR. în timp ce distanţa medie dintre indivizii populaţiei (coeficientul Dice) este de 0. 5. phlogifolia În ceea ce priveşte structura genetică a acestei populaţii. cruciata (0. Astfel doar 51.

Putem spune astfel că variabilitatea genetică din cadrul populaţiei este una medie. clusi şi Gentianopsis ciliata 62.75 % din benzile obţinute în urma amplificărilor RAPD la specia G. aparţinând speciei G. Putem spune astfel că deşi populaţia este compusă dintr -un număr relativ scăzut de indivizi aceasta nu prezintă probleme în ceea ce priveşte diversitatea genetică.dimensiunile foarte reduse ale populaţiei din zona vf -ului Corongiş. distanţă care diferă nesemnificativ faţă de distanţa medie regăsită în cadrul celorlalte populaţii analizate indiferent de specie (0. G.. De altfel un studiu efectuat de către Kery şi colab. puţin peste media distanţelor genetice intrapopulaţionale. 5. clusi. 35 . Orbicularis.187. a pus în evidenţă faptul că în populaţiile compuse dintr-un număr mai mic de 500 de indivizi.172). 2000) şi deci eminamente alogamă.8%). specia G. ca efect a reducerii numărului de seminţe per plantă.9 Analiza variabilităţii genetice intrapopulaţionale la speciile G. iar distanţa genetică medie între indivizii populaţiei a fost de 0. Putem spune astfel că deşi zona vârfului Corongiş este declarată rezervaţie cu protecţie strictă. un număr mic de indivizi în populaţie conduce inevitabil la pierderea variabilităţii genetice. variabilitatea intrapopulaţională redusă este uşor de înţeles.8%) a fost mai redus decât media populaţiilor indiferent de specie (65. lutea (specie protejată) aflată în această zonă este pe cale de dispariţie în acest areal. orbicularis au fost polimorfe. distanţa genetică medie dintre indivizi a fost de 0. Datorită faptului ca această specie este autoincompatibilă (Kery şi colab. (2000). reducându-se şi mai mult şansele de supravieţuire ale unor astfel de populaţii.188. urmate de luarea unor decizii de management care sa conducă la remedierea situaţiei. În cadrul populaţiei situată în rezervaţia Scăriţa-Belioara. Se impune astfel efectuarea unor studii suplimentare prin care să se identifice cauzele care au condus la scăderea numărului de indivizi din această populaţie. performanţele reproductive ale indivizilor scad. Cu toate acestea polimorfismul regăsit î n cadrul acestei populaţii (57.

2%). phlogifolia. rezultatele izolărilor ADN-ului genomic total nu au fost influenţate semnificativ. care să releve diferite niveluri de polimorfism. la speciile G. cruciata G. Concluzii referitoare la analiza relaţiilor taxonomice: − Alegerea atentă a unor amorse. şi rapidă în vederea analizării atât la nivel intraspecific şi intrapopulaţional dar şi la nivel interspecific. utilizate în cadrul marcării RAPD. fie au fost obţinuţi produşi nespecifici. cilliata.crasicaulis în cadrul genului Gentiana este limitată la speciile aparţinând aceleiaşi secţiuni (secţiunea Cruciata). CAPITOLUL 6 CONCLUZII ŞI RECOMANDĂRI Concluzii referitoare la metodele de transport a probelor şi izolarea ADN − Indiferent de metoda de transport utilizată. în cadrul populaţiei din Cheile Baciului aparţinând speciei G. − Studiul de faţă (împreună cu alte studii din literatură) pune în evidenţă faptul că încadrarea speciei G. a fost regăsită cea mai mare distanţă genetică medie intrapopulaţională (0. Din cele zece perechi de amorse testate doar opt au generat produşi de amplificare. Valorile mari ale indicatorilor variabilităţii genetice sunt unele aşteptate în cazul populaţiilor formate dintr-un număr mare de indivizi aşa cum este cazul populaţiei studiate de noi. este una şi 36 . poate face din acest tip de analiză o unealtă uşor accesibilă.271) şi una dintre cele mai mari valori ale polimorfismului. asclepiadea în secţiunea Pneumonanthe. Concluzii referitoare la marcarea moleculară SSR − Transferabilitatea interspecifică a marcherilor SSR dezvoltaţi pentru specia G . La restul speciilor analizate fie nu s-au obţinut produşi de amplificare.Dintre toate populaţiile analizate. (74.

nici una dintre metodele de analiză grafică (dendrograme sau PCA).interpopulaţionale şi la specia G. − Datorită lipsei unor benzi specifice pentru fiecare populaţie. în sistematica clasică bazată doar pe caracterele morfologice. Concluzii referitoare la analiza variabilităţii şi relaţiilor intra. cruciata. studii care atrag atenţia supra unor încadrări defectuoase a unor specii aparţinând genului Gentiana.interpopulaţionale şi la specia G. variabilitatea genetică intrapopulaţională este una redusă. nivalis: − Dendrogramele întocmite pe baza marcherilor RAPD au pus în evidenţă două grupuri de indivizi. corespunzătoare celor două populaţii analizate. Concluzii referitoare la analiza variabilităţii şi relaţiilor intra. fapt care poate fi pus pe de o parte pe seama izolării reproductive a acestora. iar. − Datorită numărului mare de indivizi care compun aceste populaţii. − Distanţele genetice interpopulaţionale sunt semnificativ corelate cu distanţele geografice care le despart. nu a putut pune în evidenţă grupuri de indivizi corespunzătoare populaţiilor. asclepiadea: − Deşi populaţiile speciei G.discutabilă. având în vedere apropierea genetică a acestei specii de speciile din secţiunea Gentiana. − Taxonul G. cruciata astfel că recomandăm încadrarea acestui taxon ca subspecie a speciei G. phlogifolia încadrat în literatura de specialitate din ţara noastră ca specie. pe de alta parte pe seama unor fenomene evolutive cum ar fi efectul fondator. asclepiadea sunt compuse dintr-un număr mare de indivizi. diferă la nivel genetic foarte puţin faţă de specia G. nu au putut fi determinate corelaţii între numărul de indivizi ce compun populaţiile şi variabilitatea genetică intrapopulaţională. 37 . − Rezultatele obţinute în prezentul studiu sunt în concordanţă cu cele regăsite în cele mai noi studii din literatură.

interpopulaţionale şi la specia G. fapt datorat existenţei unor populaţii interpuse. − Variabilitatea genetică regăsită în cadrul populaţiei din arealul protejat al rezervaţiei Scăriţa-Belioara este mai redusă comparativ cu cea regăsită în cadrul populaţiei situată în păşunile satului Sălicea. − Datorită valorii nutritive scăzute ale pajiştilor alpine din comunitatea Festuca supina (pajiştile de păruşcă). cruciata au generat rezultate similare. Nivalis. Recomandăm astfel revizuirea practicilor de management ale acestei regiuni alpine. − Variabilitatea genetică în cazul populaţiei din M-ţii Rodnei este influenţată negativ de practicarea păşunatului excesiv (din iunie până în septembrie). − Analiza pe baza marcherilor SSR ne poate conduce la concluzia că specia G. ducând la 38 − . sugerează o puternică izolare reproductivă a celor două populaţii. cruciata este o specie autotetraploidă. − Deşi cele două populaţii sunt semnificativ izolate reproductiv. preferate de G. numărul de migranţi per generaţie calculat este destul de mare. − Variabilitatea genetică regăsită în cadrul populaţiei din M-ţii Rodnei este distinct semnificativ mai mică faţă de cea regăsită în cazul populaţiei din masivul Ceahlău.Analiza varianţei moleculare precum şi distanţa medie calculată între indivizii aparţinând la populaţii diferite. păsunatul lor este nejustificat din punct de vedere economic. Concluzii referitoare la analiza variabilităţii şi relaţiilor intra. − Variabilitatea genetică ridicată relevată în cadrul populaţiei din păşunile satului Sălicea este cel mai probabil supraestimată. cruciata: − Ambele metode de marcare moleculară utilizate în analiza variabilităţii genetice la cele două populaţii ale speciei G. iar modelul tretrasomic întâlnit în cazul celor doi loci este rezultatul evoluţiei divergente a unor tetrade cromozomale.

urmate de luarea unor decizii de management care sa conducă la remedierea situaţiei. orbicularis. putem spune că nici una din populaţiile speciilor aparţinând genului Gentiana nu a 39 . − Deşi zona vârfului Corongiş este declarată rezervaţie cu protecţie strictă. şi astfel conduc la segregarea independentă a alelelor. Concluzii referitoare la analiza variabilităţii intrapopulaţionale la speciile G. lutea şi G. clusi variabilitatea genetică din cadrul populaţiei este una medie. că populaţia analizată. − În cazul speciei G. G. Se impune astfel efectuarea unor studii suplimentare prin care să se identifice cauzele care au condus la scăderea numărului de indivizi din această populaţie. phlogifolia nu prezintă probleme nici în ceea ce priveşte demografia şi nici în ceea ce priveşte variabilitatea intrapopulaţională. Concluzii generale − Ambele metode de marcare utilizate de noi au avut rezultate similare în ceea ce priveşte capacitatea de analiză a variabilităţii genetice la nivel intra. în cadrul acestei specii situate pe lista roşie speciilor ameninţate. arată. Concluzii referitoare la analiza variabilităţii intrapopulaţionale la specia G. care nu mai formează întotdeauna cromozomi tetravalenţi.apariţia cromozomilor parţial omologi. lutea (specie protejată) aflată în această zonă este pe cale de dispariţie în acest areal. nu prezintă probleme în ceea ce priveşte diversitatea genetică. phlogifolia: − Analizele şi observaţiile efectuate. G. orbicularis este compusă dintr-un număr relativ scăzut de indivizi. specia G. clusi. aparţinând taxonului G. cilliata: − Deşi populaţia din M-ţii Rodnei aparţinând speciei G. − În ceea ce priveşte variabilitatea genetică intrapopulaţională.şi interpopulaţional. astfel că această populaţie poate fi considerată un centru important de conservare in situ a biodiversităţii.

să fie coroborate cu observaţiile efectuate în teren. situate în munţii Rodnei recomandăm introducerea unor accesiuni din aceste populaţii în banca de germoplasm din cadrul USAMV-Cluj. fără aplicarea unor practici corecte de management ale arealelor naturale există riscul diminuări sau chiar al pierderii biodiversităţii prin extincţia unor populaţii sau chiar specii. G. orbicularis.− − − diferit semnificativ faţă de medie. Pentru o înţelegere cât mai cuprinzătoare a fenomenelor evolutive de la nivelul populaţiilor este necesar ca datele obţinute în urma aplicării tehnicilor de marcare moleculară. lutea. şi G. Având în vedere situaţia populaţiilor aparţinând speciilor G. nivalis. Deşi ţara noastră este considerată un important centru de biodiversitate pe harta Europei. 40 . dar în cazul populaţiei speciei Gentianopsis cilliata a fost regăsită o variabilitate genetică semnificativ mai mare.

41 .

dr.UNIVERSITY OF AGRICULTURAL SCIENCES AND VETERINARY MEDICINE CLUJ-NAPOCA DOCTORAL SCHOOL FACULTY OF HORTICULTURE Eng. THESIS SUMMARY) Scientific coordinator: Prof. Doru Pamfil Cluj-Napoca 2010 42 .D. univ. Raica Paul-Andrei Genetic variability assement in some Gentiana species found in Romanian wild flora by molecular markers (Ph.

....................................... 12 Chapter 3 Biodiversity and biodiversity conservation ...................4 Practical aspects of molecular marker type choice................................... 17 3............4 Endemic species in Romania...2 Mountain forests............. 15 3...................... 21 4..................................................................................3 SSR markers... 21 4....................2.. 27 5.................. 6 2............................................. 17 3...........................................2 RAPD markers .......3 Pharmacological implications of Gentianaceae Family .........................................................TABLE OF CONTENS Chapter 1 Introduction ...... 22 4.......................................................... 6 2......2 Types of biodiversity........................................................................................... 11 2.................. 9 2........................ 1 Chapter 2 General Descripion of Gentianaceae family and current state of knowledge .............................................................1 Principiul reacţiei PCR......1 Definition of biodiversity ..................... 25 Chapter 5 PCR-based molecular markers . 20 Chapter 4 Description of general bioclimatic conditions of hilly and mountainous regions.....................4 Protection and conservation of biodiversity ..................1 Hills and plateaus ....................... 23 4.5 Biodiversity conservation strategy ................................................... 30 5.............................2 Chemical Composition and chemotaxonomy of Gentianaceae family.................1 Taxonomy of the Gentianaceae family.......... 27 5................... 33 5............ 34 Chapter 6 General considerations on the genetic variability determination using RAPD markers...........................3 Alpine regions ........................................ 15 3......................... 18 3............. 36 43 ... 19 3..............................1 Phytochemical Conclusions ...........3 The concept of biodiversity.....6 In situ conservation ....................

................................ 77 7... 65 7. 85 7...... 59 7.9 Image analysis and binary matrices construction......................................................................... lutea ..2.............................. 72 7.......................1 Agarose gel electrophoresis .. 61 7.. 72 7... 57 7.. 74 7..............7 Softwares used in statistical analysis .. 65 7................10.... 48 7.10 Gentianopsis ciliata ........... asclepiadea (Willow Gentian) .................2..............2.....3 Costructing trees by UPGMA method........ 62 7........8 G. clusii ............2...7 SSR markers.......4.....2............3 Preservation and transportation of biological samples.....4 G...........................1 Stock solutions preparation.......................... 51 7...10............................. nivalis . 74 7........2........................ 46 7.................. 85 Chapter 8 Results and discussion ........................ 71 7......6 Statistical analysis of SSR markers data......8.....6 RAPD markers .3 Staining electrophoresis gels and image acquisition ...............2 Description of studied species and populations areas43 7............64 7.............4.8.......... 55 7..............................8.............. phlogifolia ....................................4 DNA Isolation ................ 66 7......................... 87 44 ...........3 G.............10....10............2 Polyacrylamide gel electrophoresis ............. 74 7.....4 Costructing trees by Neighbor-Joining method80 7...........1 Rodnei Mountains National Park.......6 G................... 42 7..................9 G...................................... 76 7....2......................... 73 7... 69 7................1 General Statistical Methods . Materials and methods ....2.10........10 Data analysis and interpretation ...................... 53 7........ cruciata ....................... 43 7...2 Statistical analysis of RAPD markers data ............... orbicularis.......5 Estimate genetic diversity based on genetic diversity index .........5 Evaluation of quantity and quality of extracted DNA68 7....................................................2.. 73 7....... 84 7...........8 Electrophoresis ..10..........................Chapter 7 Research objectives...................... 42 7........................1 Research objectives .2.......................2 Ceahlau National Park ..5 G...10...........2 Working protocol.....7 G.

.................8 Analysis of within population genetic variability in G................. 142 Annex 3: Scăriţa-Belioara protected area map...................12 Analysis of within population genetic variability in G............... 123 8. 96 8................................................ 126 Chapter 9 Conclusions and recommendations . cruciata species.......................... phlogifolia species .................................. 125 8..............3 SSR markers results ...........1 DNA isolation results ..................9................................ 144 45 ........................................................... 125 8..........13 Discussions on Gentiana genus biogeography in Romania................. 109 8............... clusi species ............................... orbicularis species ..... 88 8......2 RAPD markers results .. asclepiadea species .. lutea species ......................................... 116 8.............2 Statistical analysis of SSR data ........... nivalis species...............................................................................1 Statistical analysis of RAPD data........6 Analysis of within and betwin populations genetic variability in G..8................... cruciata species ............10 Analysis of within population genetic variability in G..... 128 Bibliography.... 140 Annex 2: Individuals codification ............... 132 Annex 1: Index of abbreviations and acronyms ..................4.... 114 8.11 Analysis of within population genetic variability in Gentianopsis cilliata species .............................. 143 Annex 4: Individuals distribution in the Sălicea population of the G....... 114 8............................. 92 8. 114 8. 114 8.................... 87 8..................... 96 8............................. .................9.....4 Data analysis and interpretation ..........................7 Analysis of within population genetic variability in G....5 Analysis of within and betwin populations genetic variability in G.........1 Analysis of taxonomic relationships...............9 Analysis of within and betwin populations genetic variability in G........................................................... 104 8............................................... and distribution of analyzed populations ....

................... 151 Annex 8: Genetic distances calculated among all analyzed individuals based on RAPD markers using Nei-Li/Dice distance coefficient ................. 146 Annex 6: Distribution map of analyzed populations from Ceahlau National Park............................................................... 150 Annex 7: Concentrations and purity of DNA isolated from analyzed individuals................Annex 5: Rodnie Mountains National Park Map .......... ........................... 155 46 ........................................................................... ....................

Gentianaceae family includes a number of medicinal plants that have been used since ancient times. They enter into the composition of different recipes or recipes bitter. Development of DNA molecular marker techniques has facilitated the speed. simplicity and efficiency. the study of genetic variability. counting many species rare or extinct elsewhere in Europe but found in Romanian flora and fauna including some endemic species. biochemical markers (proteins or isoenzymes). to identify the biological material that has the characteristics of interest. or other molecular markers able to reveal genetic variability studies. but also for their value in their natural landscape. This information will allow making the best decision on what should be preserved for conservation. The main objectives in our study were: − Field identification of populations belonging to species of the Gentiana genus − The description and characterization of the concerned areas − The collection of biological material required for analysis at the molecular level without affecting the population genetic diversity 47 . Information may be obtained on the basis of morphological or physiological studies. while others for their ornamental value. Our country is considered an important center of biodiversity on the map of Europe. These species are valuable not only for their practical and economic importance. However there are very few studies of genetic diversity in natural populations. will improve operations management and will enable those concerned. Some species of the Gentiana genus are grown because of their importance in terms of pharmacological uses.INTRODUCTION Conservation and utilization of genetic diversity in plants depends largely on the availability of information regarding the distribution of genetic diversity within species of interest.

orbicularis. lutea species is 48 − . G. but that of the G. G. The collected samples were analysed by the means of RAPD and SSR markers. clusi. phlogifolia species could better be classified as a subspecies of G. cruciata species. asclepiadea. two populations of the G. Thus in this study were analyzed ten populations of the species G. lutea species. and the result were analysed. using a variety of statistical methods including genetic distance calculation. Regarding the taxonomy of the genus. two populations of G. mantel correlation test. dendrogram constrution and others. phlogifolia species. phlogifolia. Write’s F statistics. showed that classification of G.Analysis of taxonomic relationships between identified species based on molecular markers − Analysis of among and within population genetic variability by molecular markers − Identify factors that influenced the evolution of genetic variability in analyzed populations. nivalis. Our results showed also that G. cruciata species. asclepiadea species in Pneumonanthe section of the Gentiana genus is inappropriate. genetic diversity index. So this study recommends a change in the management practice of these pastures. A similar situation is found in population situated on the pastures in north of Sălicea village belonging to G. our results (in concordance with others). We found that the genetic diversity of the populations belonging to the G. due to the wrong management of the pastures in Rodnei Mountains. G. analysis of molecular variance. The biological material consisted of samples taken from a total of 19 populations belonging to eight species. and one population form each of. clusi and G. genetic variability of this population is dreadfully reduced compared with that of the population situated in Ceahlău mountains. G. cilliata and G. G. have a normal level. cruciata species. nivalis populations. orbicularis. principal coordinate analysis. Analysis of the among and within population genetic variability of the two G. revealed that.

and G. orbicularis. Considering our result we also concluded that: − Interspecific transferability of the SSR markers developed for G. the biodiversity could be lost in case of bad management (especially in the alpine pastures) − Taking in account the our results regarding G. lutea. phlogifolia. found in Rodnei mountains. the results of molecular markers have to be correlated with field observations. crasicaulis. in the germplast collection of USAMV cluj − Due to the genetic equilibrium found in the population of G. we recomand the ex situ conservation of these population variability. − Although our country is considered an important center of biodiversity.very low (due to the reduced number of individuals). we also recommend the in situ conservation of this endemic taxon 49 . is limited to species in the same section (Cruciata) − For a better understanding of the evolution of genetic variability in populations. The within population variability of Gentianopsis ciliata species is fount to be significantly above the average. G. nivalis.