LA HABANA, CUBA 2011

PhD Claudio Rodrguez Martnez, Centro Nacional de Biopreparados claudio@biocen.cu

SELECTIVIDAD

SELECTIVIDAD
Definicin: la supresin del crecimiento de un microorganismo que se espera sea inhibido en el medio de cultivo
La selectividad se evala en medios de cultivo selectivos y/o diferenciales

Ej.: En un medio de cultivo lquido selectivo: Caldo EC se evala el desarrollo de las cepas no objeto Cepas no objeto: Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 + otra (s) seleccionada (s) por el laboratorio Mtodo de ensayo: cualitativo Criterio de aceptacin: no crecimiento

Norma ISO/TS 11133-2:2000

PhD Claudio Rodrguez Martnez

SELECTIVIDAD DE MEDIOS SLIDOS

SELECTIVIDAD
Elementos que se evalan
Crecimiento de las cepas objeto Crecimiento de las cepas no objeto Se emplea una suspensin de 104 a 106 ufc/ml

El factor de Selectividad (SF), se calcula: SF= DO - DS DO y DS = Log10 dilucin

Debe estar parcial o completamente inhibido DO: corresponde a la ms alta dilucin que mostr al menos 10 colonias en el medio de referencia DS: corresponde a la ms alta dilucin que mostr resultados comparable con el crecimiento logrado en el medio en evaluacin
Para pruebas cuantitativas para m.o. no objeto en medio selectivo debe ser 2
Norma ISO/TS 11133-2:2000 PhD Claudio Rodrguez Martnez

EJEMPLOS DE RANGOS DE TRABAJO

Inculo mximo de partida 106 Placa Inundacin de superficie Miles y Misra vertida 1000000 (1 ml/placa), (0,2 ml/placa), (10 l/sector), ufc/placa ufc/ml ufc/placa ufc/placa

Log10 dilucin

Dilucin 10-1 100000 Dilucin 10-2 10000 Dilucin 10-3 Dilucin 10-4 Dilucin 10-5 1000 100 10

100000 10000 1000 100 10

20000 2000 200 20 2

1000 100 10 1 -

1 2 3 4 5

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EJEMPLO DE EJECUCIN (m.o. no objeto Gram + en un medio selectivo inhibidor de m.o. Gram +)
Mximo inculo de partida segn la norma ISO 1133-2 (106 ufc) Inundacin de superficie (0,2 ml/placa) Recuento en medio referencia no selectivo (ufc/placa) Receunto en medio ensayo selectivo (ufc/placa) Diluciones seleccionadas

ufc/ml

Log10 ufc

Dilucin 10-1 (105 ufc) Dilucin 10-2 (104 ufc) Dilucin 10-3 (103 ufc) Dilucin 10-4 (102 ufc)

100000 10000 1000 100

20000 2000 200 20

Incontable Incontable 190 18

8 No creci No creci No creci

Ds

1 2 3

D0

D0 - Ds = 4 1 = 3 > 2

ACEPTAR EL LOTE
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PARA MEDIOS SLIDOS (segn ASM)

Siembra en medios selectivos Siembra por inundacin de la superficie en medios no selectivos Siembra por estra en medios no selectivos

Se emplea una suspensin de 107 a 108 ufc/ml

Se emplea una suspensin de 250 a 2500 ufc/placa

Se emplea una suspensin de 104 a 105 ufc/placa

Guidelines for Assuring Quality of Food and Water Microbiological Culture Media. Culture Media Special Interest Group. Australian Society for Microbiology .August 2004

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SELECTIVIDAD POR MTODO SEMI-CUANTITATIVO

Mtodo ecomtrico Inculo de 103 104 ufc del m.o. no objeto

Interpretacin: Para un m.o. no objeto el G1 debe ser parcial- o totalmente inhibido

Norma ISO/TS 11133-2:2000

Selectividad (Mtodo de Mossel)

Cada estra tiene un valor de 0.2 y la estra central de 1.0

Selectividad: score 2 para m.o. no objeto

MOSSEL, D.A. and oth. Quality assurance of selective culture media for bacteria, moulds and yeasts: an attempt at standardization at the international level. Journal Applied Bacteriology, 1983, 54(3), 313-27.

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Pruebas cualitativas
Mtodo de estriado por agotamiento o inundacin de la superficie El inculo de trabajo: 103 104 ufc
Utilizando un asa de 1 l, se realizan estriados en lneas sobre la superficie del medio (preferiblemente lneas paralelas) o por inundacin y dispercin (con esptula de Drigalski) Se pueden inocular ms de 1 m.o.

Interpretacin: Se llevar a cabo visualmente asignando un score (puntuacin) de crecimiento: 0 no hubo crecimiento 1 crecimiento dbil 2 buen crecimiento
Los m.o. no objeto deben ser parcialmente o completamente inhibidos (score 0 1)

Norma ISO/TS 11133-2:2000

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SELECTIVIDAD EN MEDIOS LQUIDOS

SELECTIVIDAD. MTODO CUANTITATIVO

Siembra en medios lquidos selectivos
Se emplea mezcla de m.o. objeto de 10 a 102 ufc m.o. no objeto > 103

Siembra en medios lquidos selectivos

Se emplea una suspensin de m.o. no objeto > 103

Incubacin segn normas y subcultivo (10 l) en medio de propsito general para comprobar crecimiento

SF= DO - DS

DO y DS = Log conc. m.o.

Para pruebas cuantitativas para m.o. no objeto en medio selectivo debe ser 2
Norma ISO/TS 11133-2:2000

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SELECTIVIDAD. MTODO SEMI-CUANTITATIVO

Siembra en medios lquidos selectivos
Se emplea mezcla de m.o. objeto de 10 a 102 ufc m.o. no objeto > 103

Siembra en medios lquidos selectivos

Se emplea una suspensin de m.o. no objeto > 103

Incubacin segn normas y subcultivo (10 l) en medio de propsito general para comprobar crecimiento
Para pruebas semi-cuantitativas los m.o. no objeto en medio selectivo no deben crecer o deben crecer < 10 ufc/placa

Norma ISO/TS 11133-2:2000

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SELECTIVIDAD. MTODO SEMI-CUANTITATIVO

Siembra en medios lquidos selectivos
Se emplea una suspensin de m.o. no objeto > 103

Incubacin segn normas y subcultivo (10 l) en medio de propsito general para comprobar crecimiento (diferentes tcnicas, ejemplo Mossel)
En algunos casos se siembra cada dilucin en 3 tubos

ACCREDITATION SCHEME FOR LABORATORIES. A Guide on Measurement Uncertainty in Chemical & Microbiological Analysis. Technical Guide 2, Second Edition, March 2008. The SAC Accreditation Programme. SPRING. Singapore Weenk GH. Microbiological assessment of culture media: comparison and statistical evaluation of methods. Nutricia Research, Microbiological Research Laboratory, Zoetermeer, The Netherlands. Available online 10 December 2002.

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SELECTIVIDAD. MTODO CUALITATIVO

Mtodo de tubo simple Los resultados son slo indicativos

El m.o. no objeto se inocula directamente utilizando un asa microbiolgica de 1 L

Interpretacin: Se llevar a cabo visualmente asignando un score de crecimiento: 0 no tiene turbiedad 1 turbiedad dbil 2 turbiedad fuerte El score debe ser 0 1. Otras caractersticas pueden ser evaluadas: ausencia de precipitados, de agregacin celular, de gas, de hidrlisis, etc.
Norma ISO/TS 11133-2:2000 PhD Claudio Rodrguez Martnez

ESPECIFICIDAD EN MEDIOS SLIDOS

Especificidad Apreciar la apariencia, tamao y morfologa de las colonias de m.o. objeto y no objeto
Medio cromognico CromoCen AGN, para bacterias Gram identificacin por color, halos, fluorescencia

ACCREDITATION SCHEME FOR LABORATORIES. A Guide on Measurement Uncertainty in Chemical & Microbiological Analysis. Technical Guide 2, Second Edition, March 2008. The SAC Accreditation Programme. SPRING. Singapore

Norma ISO/TS 11133-2:2000

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ANLISIS DE VARIANZA (ANOVA) PARA CONTROL DE LOS MEDIOS

Transformar a Log

ANOVA para nmeros iguales de muestras, para nmeros de muestras diferentes, para diferentes diluciones

ISO 9998:1991 (E) Water quality Practices for evaluating and controlling colony count media used in water quality tests

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CONTROL DE LA CONTAMINACIN MICROBIANA DE LOS MLPU

Cantidad apropiada de muestras Lmites de aceptacin establecidos (%) Incubacin en condiciones apropiadas
(18 h a 37 C o segn se especifique por el fabricante, o en una norma especfica de uso del medio)

Norma ISO/TS 11133-2:2000

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PLAN DE MUESTREO
Menos de 100 unidades
Norma ISO/TS 11133-2:2000

1 % al inicio y 1 % al final del lote LPU

ACEPTACIN: Si al inicio o al final del lote MLPU se detecta 1 unidad contaminada se rechaza el lote Doble muestreo si n > 100 u

Norma AS1199-1:2003

Se rechaza el primer muestreo si el n de Pr est entre Segundo muestreo

Se debe consultar otro esquema en la norma ISO 2859-1:1999

Ac y Re

Si n1 + n2 Re del segundo muestreo se acepta

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CONDICIONES SUGERIDAS PARA LOS ESTUDIOS DE ESTERILIDAD DE LOS MLPU Temperaturas de incubacin para el ensayo 4 8 C 20 25 C 35 37 C Perodo mnimo de incubacin para el ensayo 10 14 das 2 5 das 48 72 h

SEGN ESQUEMA SIMPLIFCADO DE LA OMS:

3 5 % de las placas x lote Incubar a 35 C por 48 h Rechazar el lote si se observan > 2 colonias x placa

Basic Laboratory Procedures in Clinical Bacteriology ISBN 92 4 154425 2. WHO, Geneva, Switzerland, 1991.

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CONTROL DE LA ESTERILIDAD DE MEDIOS PARA ANLISIS DE AGUAS PLACAS VERTIDAS

Placa con 15-20 ml de medio

Incubar a 37 C 1 C

Incubar a 22 C 1 C

HPA STANDARD METHOD. AEROBIC COLONY COUNT BY THE POUR PLATE METHOD W 4. Centre for Infections. Issue no: 4.2 Issue date: 08.08.08 Issued by Standards Unit, Evaluations and Standards Laboratory in conjunction with the Regional Food, Water and Environmental. Coordinators Forum Page no: 1 of 14. W 4i4.2. National Public Health Service for Wales

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PARMETROS FSICO-QUMICOS PARA EL CONTROL DE LA CALIDAD DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

CC del Medio Listo para el Uso (LPU) Evaluacin fsico-qumica pH a 20 25 C Cantidad dispensada o espesor de la capa de agar Estabilidad del gel/consistencia/humedad Color Transparencia Brillantez Presencia de precipitados Homogeneidad Rajaduras en la superficie Burbujas/cogulos/cristales
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Organolptica

Capacidad amortiguadora del pH

TECHNICAL SPECIFICATION ISO/TS 11133-2 Corrected version 2004-08-01

Medicin del pH
PH

- Mtodo potenciomtrico Medicin directa (medios lquidos) Medicin directa con electrodos de contacto de superficie (medios slidos) Medicin por semislidos) maceracin (medios slidos y

Rodrguez Martnez C y col. Buenas Prcticas de Preparacin y Empleo de Medios de Cultivo. Curso Maestra en Procesos Biotecnolgicos. IFAL, UH, La Habana, Cuba, 2011

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Medicin del pH por maceracin

Se pesa la cantidad indicada del medio de ensayo para 100 ml por triplicado en 3 matraces de Erlenmeyer de 250 ml de capacidad Se prepara el medio en cada matraz segn indicaciones y se esteriliza Se enfra hasta gelificar Se cortan los geles con una esptula y se extrae el agar Se mezclan los 100 ml del medio de cada triplicado con 100 ml de agua destilada o desionizada (pH de 5,5 a 7) Se mezclan las porciones por separado en una licuadora hasta obtener una suspensin Se filtran por papel de filtro neutro Se mide el pH en cada muestra Se promedia el valor de los triplicados
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Cantidad dispensada o espesor de la capa de agar Medicin de la altura del agar en la placa Medicin de la masa del agar en la placa Medicin del volumen de medio en los tubos/botellas

Chequear altura del gel en 4 puntos (extremos de los 2 dimetros perpendiculares de la placa) Determinar la media de las alturas. Hmed = 4.0 0.2 mm

Basu S, Pal A, Desai PK. Quality Control of Culture Media in a Microbiology Laboratory. Indian Journal of Medical Microbiology, 2005; 23(3):159-63.

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CONTROL DE PROCESO DE LLENADO DEL VOLUMEN/MASA DISPENSADO EN EL LABORATORIO

Plan de muestreo similar al de control de esterilidad Se determina a la masa de cada unidad de envase vaco Se pesa una vez dispensado el volumen Se pesa despus de esterilizar y refrescar Se calcula el volumen resultante
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Estabilidad del gel/consistencia/humedad Por penetrometra en equipos Nikan, Agarmat u otros

Se aplica una fuerza (masa) con un mbolo terminado en esfera sobre el agar Se recoge la fuerza (masa) aplicada al momento de la ruptura del agar
Fortaleza aceptable: 300 - 500 din/cm2

HUMEDAD (prdida por desecacin): secado hasta masa constante (gravimetra)

Generalmente > 95 %
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OTROS PARMETROS DE CALIDAD DE LOS MEDIOS

Temperatura de gelificacin
Se dispensan 100 ml de medio a t > 60 C en un vaso de precipitado (beaker) Se coloca un termmetro en el interior Se anota la temperatura a la cual se gelifica el medio (ofrece resistencia para mover el termmetro dentro del medio gelificado) n =i n

t1 =

t n =1 i i

donde: ti - temperatura promedio de gelificacin n - nmero de la rplicas del tubo tin - temperatura del tubo (i) de la rplica (n)
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Temperatura de fusin
Se dispensan 100 ml de medio a t > 60 C en un vaso de precipitado (beaker) Se coloca un termmetro en el interior Se deja gelificar Se comienza a calentar a temperatura media Se anota la temperatura a la cual se funde el medio (no ofrece resistencia para mover el termmetro dentro del medio) donde: ti - temperatura de fusin de cada tubo

Tf

n =i

t n =1 i i

n =i

- sumatoria de la temperatura de fusin de cada tubo n =1 i

i - nmero de la rplicas
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OTROS PARMETROS DE CALIDAD DE LOS MEDIOS

Capacidad amortiguadora del pH

Efectividad de la solucin de minimizar el cambio de pH como resultado de la adicin de una cantidad estndar de cido o base

b1 = da/dpH b2 = db/dpH,

Medir el volumen (ml) de solucin 0,1 1 N de NaOH de HCl necesarios para provocar el cambio de pH en una unidad, expresar en mmol
donde da db son los milimoles de cido o base requeridos para cambiar el pH en una unidad dpH

Rodrguez Martnez C y col. Buenas Prcticas de Preparacin y Empleo de Medios de Cultivo. Curso Maestra en Procesos Biotecnolgicos. IFAL, UH, La Habana, Cuba, 2011

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ESTUDIOS DE ESTABILIDAD DE LOS MEDIOS LISTOS PARA EL USO

ESTUDIOS DE ESTABILIDAD DE LOS MLPU

OBJETIVO:
Masa: prdida de masa 5 % pH: dentro del rango tpico de valores Esterilidad: estril a 21 C 1 C y/o a 36 C 1 C por 48 h Crecimiento de m.o. objeto: 70 % Inhibicin de m.o. no objeto: 0 % crecimiento

Guidelines prepared for CABRI by DSMZ, CBS and BCCM, 17 May 1998. Page layout by CERDIC (reproduced, with few changes, from The Oxoid Manual, 6th edition, 1990 Ulisse S y col. Veterinaria Italiana, 2006; 42(3), 237-47 PhD Claudio Rodrguez Martnez

Ulisse S y col. Veterinaria Italiana, 2006; 42(3), 237-47

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OTROS PARMETROS EMPLEADOS PARA EL CONTROL DE LA CALIDAD DE LOS MEDIOS PARA DIFERENTES APLICACIONES

Diagnstico clnico: Sensibilidad, Especificidad, Exactitud Perfil de lpidos, aminocidos, vitaminas, entre otros

Industrias de fermentacin y sntesis microbiana

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Rodrguez Martnez C y col. Buenas Prcticas de Preparacin y Empleo de Medios de Cultivo. Curso Maestra en Procesos Biotecnolgicos. IFAL, UH, La Habana, Cuba, 2011

REGISTRO DE LA EVALUACIN DE MEDIOS DE CULTIVO

La informacin a registrar es:

Medio de cultivo evaluado.
No. ID No. lote de medio evaluado. Fecha de realizacin del anlisis. Cepa empleada (gnero y especie del m.o. y tipo y No. de coleccin). Medio de referencia utilizado para evaluar la Productividad. Medio de referencia utilizado para evaluar la Selectividad. Resultado de productividad (unidades). Resultado de selectividad (unidades). Medio de cultivo conforme (S/NO). Personal responsable.
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OTRAS ACTIVIDADES DE LABORATORIO

Adems de los aspectos de CC: Verificacin de los nuevos mtodos de referencia o validados (Exactitud/Precisin/Sensibilidad y Especificidad Analticas, entre otros) Determinacin de la incertidumbre de las mediciones Validacin de los mtodos modificados o desarrollados por el laboratorio Programas de control externo de la calidad Esquemas de acreditacin y certificacin Estudios de estabilidad de los MLPU
DRAFT. HOKLAS. Supplementary Criteria No. 27. Issue No. 1. HKAS Executive. July 2003 Microbiology Quality AssuranceRevisited. Small microbiology laboratories can have a QA program. Focus On. Issue 3, 2004 EUROPEAN STANDARD. EN ISO 7218. Microbiology of food and animal feeding stuffs General requirements and guidance for microbiological examinations (ISO 7218:2007)

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