P. 1
CURS 4 Medii Sterilizare

CURS 4 Medii Sterilizare

|Views: 6|Likes:
Published by Ovidiu Ciubotariu
totul despre medii de sterilizare
totul despre medii de sterilizare

More info:

Published by: Ovidiu Ciubotariu on Oct 18, 2013
Copyright:Attribution Non-commercial

Availability:

Read on Scribd mobile: iPhone, iPad and Android.
download as PPT, PDF, TXT or read online from Scribd
See more
See less

05/28/2014

pdf

text

original

Formularea şi optimizarea mediilor pentru culturi microbiene

• Sunt soluţii apoase care conţin elementele necesare creşterii microorganismelor şi elaborării produselor dorite • Pot fi: sintetice (S) adică obţinute din amestecarea unor componente simple cu compoziţia constantă, bine definită, semisintetice (Ss), care conţin atât substanţe pure, de sinteză, cât şi componente naturale modificate (extract de porumb, supă de carne etc.), sau naturale (N), disponibile ca atare din surse naturale (de exemplu, laptele şi mustul) • Mediile semisintetice sunt complexe şi pretenţioase, în special datorită variaţiilor de calitate a componentelor provenite din surse naturale, dar larg utilizate, datorită posibilităţii lor de a întreţine o gamă largă de microorganisme folosite în biosinteze

Criterii de alegere a mediilor Ss
– Disponibilitatea componentelor şi constanţa calităţii acestora (schimările acestora pot aduce ± 20% variaţie a productivităţii) – Stabilitatea la depozitare şi păstrare – Caracteristicile reologice (de curgere) şi tensioactive (proprietăţile superficiale, implicate puternic în schimbul de gaze) – Preţul de achiziţie şi depozitare (25% din preţul final al produsului este generat de mediul de cultură) – Asigurarea calităţii produsului şi simplitatea separării

Compoziţia medie pe clase de substanţe şi elemente globale a microorganismelor
Component Carbon Azot Proteine Hidraţi de carbon Lipide Acizi nucleici Cenuşă Bacterii Drojdii 48,0 (46 - 52) 48,0 (46 - 52) 12,5 (10 - 14) 7,5 (6 - 8,5) 55,0 (50 - 60) 40,0 (35 - 45) 9,0 (6 - 15) 38,0 (30 - 45) 7,0 (5 - 10) 8,0 (5 - 10) 23,0 (15 - 25) 8,0 (5 - 10) 6,0 (4 - 10) 6,0 (4 - 10) Fungi 48,0 (45 - 55) 6,0 (4 - 7) 32,0 (25 - 40) 49,0 (40 - 55) 8,0 (5 - 10) 5,0 (2 - 8) 6,0 (4 - 10)

Limitele de mai sus depind de natura substratului limitativ din mediul de cultură (sursa de azot sau sursa de carbon)

Surse de C şi energie
- Monozaharide: glucoză, xiloză - Dizaharide: zaharoză, melasă, lactoză, maltoză - Polizaharide: amidon, dextrină, inulină, celuloză din turbă şi apele bisulfitice - Alcooli: metanol, etanol, polialcooli - Acizi carboxilici: acetic, succinic - Grăsimi şi acizi graşi - Hidrocarburi: metan, n-butan, n-pentan, nparafine - Deşeuri din industria laptelui şi industria alimentară: zer, tărâţe, făină de cereale

heteropolizaharidelor • Surse comerciale: sirop de glucoză 32-40%. glucoză cristalizată 99-100% • Poate genera uneori efecte nedorite. de tipul inhibiţiei de substrat (în aceste cazuri se reduce concentraţia glucozei în mediul de cultură în etapa de creştere sau se foloseşte un glucid cu viteză lentă de metabolizare – lactoza de ex. acizilor organici mono.Glucoza • Este foarte mult utilizată ca sursă de C şi energie. fiind adeseori chiar precursor în biosinteză • Se foloseşte la producerea antibioticelor.şi dicarboxilici.care eliberează glucoza în concentraţii departe de valoarea inhibitorie . steroidelor.. aminoacizilor. glucoză solidă cu 65-67%. polizaharidelor microbiene.

acid citric.45 .9. proteinelor monocelulare.75 0.30 .1.5 Utilizare: Drojdia de bere Alcool etilic Acid citric Alţi acizi Acetonă Butanol Vitamine Aminoacizi Lactoza – subprodus în industria brânzeturilor (soluţie tehnică 70-75%).00 .60 6.54.90 5.90 .24 .Dizaharide Melasa Componente Substanţe solide Zaharoză Zahăr invertit Rafinoză Azot total Cenuşă Valoare pH Sursa de melasă Separare zahăr brut 78.1 Rafinare zahăr 79.65 11.86.56 1.5 .8.54 1.20 43.82 . În stare pură se foloseşte la obţinerea penicilinei .12 . folosită la obţinerea etanolului.1.19 .1.20 50.82.60 0.14 .14.50 0 – 2.4 .50 .80 .1.33 7.4. drojdiei de panificaţie.54.8.40 1.

glucozei. favorizează reacţii chimice în celule . butanolului • Alcool metilic şi etilic. dar şi de tensioactivi: formează emulsii. hidrocarburile inferioare: obţinerea proteinelor monocelulare • Acizii graşi şi derivaţii lor: au rol de sursă de carbon şi energie. modifică permeabilitatea celulară. reduc spumarea.Alte surse de carbon şi energie • Amidon – alcătuit din două componente: – amiloză (M = 90 000-200 000) – amilopectină (M = 1 000 000 – 6 000 000) – folosit la fabricarea etanolului. încapsulează materialele hidrofobe. acetonei.

arahide. lucernă). SO42-. uree. pe lângă azot în mediul de cultură. sub formă de diverse săruri (Cl-. NH4+. PO43-. NO3-) • Azot organic: aminoacizi şi proteine din surse naturale (extract de porumb.Surse de azot şi proteine • Azot anorganic: azot amoniacal. şi grăsimi şi minerale • Proporţiile de proteine şi natura fragmentelor de aminoacizi din acestea depind puternic de sursa folosită . făină de soia. hidrolizat de drojdii • Componenţii naturali sau naturali modificaţi aduc. orez.

16 0.Exemple de componenţi cu aport de azot ai mediilor de cultură Sursa de azot Proteine Mat.5 42 12 73 50 65 2 1 1.02 0.15 0.14 0.12 0.1 0.26 0.1 0.08 0.54 1.43 1.04 0.2 0.15 0.22 0.60 0.18 (A – metionină B – cisteină C .21 0.42 0.8 3.7 8.24 0.6 0.16 0.13 0.10 2.40 0.1 Ca C 0.14 1.2 0.5 1.00 1.lizină) .34 1.40 1.36 0.5 1.40 0.3 0.46 0.5 0.67 0.60 5.52 0.28 0.4 0. Aminoacizi grase A B 13 47 11.66 2.1 1.07 0.9 1.05 0.60 9.3 0.32 0.5 0.15 0.2 0.5 5.90 4.2 2.13 0.04 0.62 0.02 0.40 0.6 0.26 4.28 0.7 0.26 0.7 2.7 Na K Mg S P Făină de malţ Făină de arahide Făină de orz Făină de soia Făină de secară Făină de orez Făină de carne Făină de peşte 0.

CaCO3 .Sunt intermediari ai reacţiilor redox: Cu2+. Fe2+. Fe . NaCl. S.Se regăsesc în produşii de biosinteză: P. Cl .Funcţionează ca regulatori ai presiunii osmotice şi permeabilităţii celulare: MgCl2. Mn2+. .Au rol de cofactori enzimatici: Mg2+. HPO42-. Cl.Sunt agenţi de complexare şi precipitare: SO42-.Săruri minerale .Sunt modificatori de pH: NaH2PO4. Fe3+. CO32.Sunt elemente constitutive ale biomasei: Mg.Sărurile minerale se regăsesc îndeplinind mai multe roluri în mediile de cultură . Fe(CN)6 . P. KCl etc. S. Zn2+. Co2+. Ca. Mo2+ .

Precursori şi vitamine PRECURSORI • Compuşi organici sau anorganici care intervin ca molecule intermediare în biosinteză • Pot dirija biosinteza către un anumit produs sau pot accelera procesele de biosinteză • Se adaugă treptat. pentru a preveni procesele inhibitorii VITAMINE • Sunt coenzime ale sistemelor enzimatice cu activitate precisă în metabolismul celular • Sunt implicate atât în etapa de creştere a biomasei cât şi în cea de elaborare a produsului urmărit .

PROCESELE DE STERILIZARE • Sunt procesele de distrugere sau îndepărtare a microorganismelor patogene sau apatogene din substanţe. e posibil ca prin acţiunea sa sau prin produşii biosintetizaţi să distrugă microorganismul producător) • Pasteurizarea: distrugerea microorganismelor prin încălziri repetate sub 100oC • Metoda de sterilizare se alege în funcţie de proprietăţile fizico-chimice ale materialelor supuse sterilizării. • Sunt absolut necesare. pentru a evita modificările lor calitative . obiecte etc. pentru a asigura obţinerea unor randamente mari de obţinere a produsului urmărit (în cazul infectării. spaţii închise. pe de alta. preparate. pe de o parte contaminantul consumă din substrat.

β. formaldehidă. fenol. γ • FIZICE: • CHIMICE: – Oxid de etilenă. IR.METODE DE STERILIZARE • TERMICE: – – – – – – – – Sterilizare cu aer cald la 140-200oC (uscată) Sterilizare cu vapori de apă la 120-140oC (umedă) Sterilizare prin încălziri repetate la 70-100oC (pasteurizare) Flambare Filtrare prin umpluturi fibroase Filtrare prin materiale poroase Filtrare prin membrane Utiizarea radiaţiilor UV. • PREPARĂRI ASEPTICE: . raze X. ozon etc.

. 90 min. 45 min. 10 min. 30 min. Salmonella typhi Mycobacterium tuberculosis Staphylococcus pyogenes Spori fungici Spori de Bacillus anthracis Spori nativi din sol 100 100 120 120 170 180 30 min. °C Timp Încălzire umedă Temperatură.STERILIZAREA TERMICĂ Denumire microorganism Încălzire uscată Temperatură. 10 min. 30 min. °C Timp 65 65 65 80 100 120 20 s 10 s 60 s 30 min. 30 min.

necesar pentru a distruge toate celulele sporulante Timpul termic mortal scade semnificativ cu creşterea temperaturii  În procesele practice se alege regimul de sterilizare rapidă la temperaturi ridicate. în timp de 10 minute • Timpul termic mortal: timpul de expunere la o anumită temperatură. aceasta asigură un grad sporit de siguranţă şi o mai bună conservare a calităţilor nutritive ale mediilor de cultură .STERILIZAREA TERMICĂ UMEDĂ • Este mai eficientă decât cea uscată • Punctul termic mortal: temperatura la care sunt omorâte toate celulele unei specii.

45 min.5 h 40 .8 h 10 min. °C 100 110 120 Bacillus subtilis 74 .8 min.5 . 15 min. .16 min. 7. Bacillus fusif or mis 10 -10. Bacillus mycoides 7. Bacillus megaterium 16-17 h 15 .5 .STERILIZAREA TERMICĂ UMEDĂ Timpul termic mortal pentru sporii unor microorganisme în sterilizare termică umedă Spori 80 Temperatura. 37 min. Clostridium sporogenes 10 h 90 min.75 h 175 min.5 h 32 min 4 min. Bacillus cylindricus 20 h Clostridium botulinum 5.

minute 2.STERILIZAREA TERMICĂ .Viteza de distrucţie a microorganismelor este descrisă de o ecuaţie logaritmică de tipul: dN  kN dt N – număr de microorganisme viabile / mL de mediu k – constanta vitezei de distrucţie termică.303/k – reducere zecimală (timpul necesar pentru diminuarea de 10 ori a numărului de microorganisme) . min-1 t – timpul de sterilizare.303 N 0 t lg k N 2.

polimerizare a aldehidelor nesaturate.STERILIZAREA TERMICĂ  Este folosită cel mai frecvent în procesele industriale Inconveniente: . condensare a grupelor aldehidice din zaharuri reducătoare cu grupe aminice libere. caramelizare a hidraţilor de carbon.Denaturarea proteinelor şi inactivarea lor . rezultând baze Schiff. etc. . toxice pentru majoritatea microorganismelor.Supraîncălziri care iniţiază reacţii de oxidare a fenolilor şi acidului ascorbic.Denaturarea vitaminelor şi a unor factori de creştere .

STERILIZAREA TERMICĂ Viteza de distrucţie termică este puternic dependentă de temperatură Ecuaţia Arrhenius:  Ea RT k  k0  e Ecuaţia Eyring: kB k Te h H * S *   RT R e .

coli Distrucţia termică a sporilor de R.Distrucţia termică a sporilor de E. stearothermophilus .

STERILIZAREA TERMICĂ • Etapele sterilizării .

Instalaţie de sterilizare termică în regim continuu .

Sterilizarea aerului Principalele specii de bacterii şi spori din aer .

filtre absolute HEPA (High Efficiency Particulate Air) – microfibre de sticlă • Cu radiaţii: aplicată la sterilizarea produselor şi a aerului din boxele sterile . Filtrasic). filtre de profunzime.Sterilizarea prin metode fizice • Filtrare: aplicată când preparatele sunt labile termic. membrane polimerice. azbest-celuloză (Seitz. Materiale filtrante: ceramici poroase JenaG5.

anularea eficienţei la umezire – Membrane de nitrat de celuloză: pori cu diametrul liber sub 0.• Procedee termice: chiar filtrul absolut trebuie sterilizat înainte de folosire • Filtrare prin: – Fibre de sticlă cu diametrul de 5-18 μm – permite sterilizarea avansată a unor debite ridicate de aer. hidrofob) – Poliamidă (nylon) Sterilizarea aerului .2 μm – Teflon (rezistent până la 300oC. dezavantaj: manipulare complicată şi neplăcută.

cultivare în laborator (inocul). . 7-plasmidă secţionată.condiţionare şi vânzare. 5-microorganism.bioreactor pilot.recuperarea produsului.operare la scară industrială. 15 . 4-genă tăiată dintr-un cromozom. 3-cromozom animal. 17 . 8-plasmidă recombinant. 11-diviziune celulară. 2-ţesut animal. 16 . 10multiplicarea plasmidei şi expresia genei. 13 .coli. 12 .bioreactor de laborator.ETAPE Selecţie şi ameliorare: 1-substanţe chimice. 6plasmidă. ca de exemplu E. 14 . 9-introducere în microorganism.Procese biotehnologice propriu-zise .

Etapele unui proces biotehnologic Laborator • Pentru situaţiile când microorganismul nu trebuie modificat genetic. se izolează tulpinile de microorganisme de pe fructe. migala şi experienţa în alegerea cea mai bună) • Se cultivă pe plăci Petri pe medii solidificate de agar-agar. aceste medii sunt foarte prielnice înmulţirii microorganismelor. cereale. deşeuri alimentare. adică acea colecţie de microorganisme care vor fi supuse multiplicării la scală mai mare pentru a produce metabolitul urmărit în bioreactor . rigoarea sa. sol (selecţie sub microscop) • Selecţia: se aleg acei indivizi de microorganisme capabili să sintetizeze compusul dorit (aici intervine competenţa microbiologului. având loc o multiplicare eficientă a unor microorganisme foarte similare ca performanţe cu cele selectate • Se obţine SUŞA. ci doar preluat din natură.

din ţesut viu. care se implantează într-un microorganism rezistent şi cunoscut ca evoluţie în procese de creştere şi diviziune celulară • Se confirmă reuşita diviziunii celulare. pe un mediu de cultură adecvat nevoilor microorganismului purtător al genei prelevate din ţesutul animal .Selecţie şi ameliorarea genetică • Etapa ţine de competenţa microbiologului sau a inginerului genetician • Se prelevează o genă dintr-un cromozom animal.

raze X. radiaţii γ • Agenţi chimici: alchilanţi.Etapele unui proces biotehnologic Laborator • Ameliorarea genetică a suşelor se face prin tratamente mutagene • Mutanţii sunt microorganisme care apar în cursul ameliorării ca rezultat al tratării cu diferiţi factori fizici sau chimici şi diferă de microorganismele din care provin • Agenţi fizici: radiaţii UV. nonalchilanţi. agenţi de intercalare • Numărul de cicluri de mutaţie-selecţie poate atinge câteva zeci . radiaţii ionizate. baze analoge.

Suşa trebuie să fie înalt productivă: .să fie rezistentă la acţiunea precursorilor .să fie rezistentă la acţiunea produsului sintetizat şi la enzimele de degradare . oxigen. pH.să aibă o rată de creştere a microorganismelor înaltă . temperatură) în cursul păstrării până la evoluţia în bioreactor (de la câteva ore la câteva săptămâni) .să fie rezistentă la factorii externi (lumină.

Etapele unui proces biotehnologic Laborator .

după o perioadă de dezvoltare bine stabilită de microbiolog (vârstă. – Transvazarea culturii de inocul se realizează în condiţii aseptice (sub flacără). temperatură.Etapa de laborator • Cultura de inocul (etapa 12 de pe schema generală) – Inoculul reprezintă materialul de însămânţare propriu-zis al mediului de biosinteză – Este o cultură microbiană în curs de multiplicare pe un substrat nutritiv corespunzător. aerare). în condiţii specifice de dezvoltare (pH. cantitate. agitare. aspect microscopic) .

numită cultură intermediară • Raportul volumic între inoculator/intermediar/regim este de 1/10/100 . este necesară introducerea unei etape intermediare de cultivare.Operarea în staţia-pilot • Este o etapă intermediară între faza de laborator şi aplicarea la scală industrială • Este necesară pentru a confirma rezultatele obţinute la nivel de laborator şi optimiza biotehnologia • Inoculul se transvazează pe un mediu de cultură sterilizat şi răcit la temperatura de cultivare • Dacă raportul de inoculare (cantitate de inocul/cantitate de mediu de cultură) este mic.

depozitare.Operare la scară industrială • Se aplică doar după ce etapa de operare în staţia pilot a confirmat că microorganismul conduce întradevăr la performanţa estimată la testele de laborator • Presupune cheltuieli mari cu instalarea bioreactorului de mari dimensiuni şi cu prepararea mediului de cultură sterilizat şi cu compoziţia corectă • Etapa de biosinteză este urmată de procedee fizice de recuperare a produsului. urmate de condiţionare. vânzare . ambalare.

viteza de multiplicare a numărului de indivizi este extrem de mare (în 20-30 minute.►Fermentaţie: procesul de creştere a Cinetica proceselor de biosinteză microorganismelor pe medii de cultură ► Creşterea este rezultatul interacţiunii celulelor individuale cu mediul de cultură ► La bacterii. volumul creşte mai rapid decât suprafaţa) ► La bacterii. urmată de diviziunea celulară ►Activitatea microorganismelor este condiţionată de existenţa unui anumit raport între volumul celulei şi suprafaţa ei (în cursul creşterii.sau tridimensională de substanţă nouă. mărirea volumului celular. populaţia se dublează) . creşterea are loc prin depunerea uni.

descreştere Monod: 1 – creştere staţionară (lag). 3 – creştere exponenţială. 2 .Curba de creştere Stell: a-b – inoculare. d-e . 7 – distrucţie logaritmică . c-d – creştere încetinită. 4 – retardare. 6 – distrucţie accelerată. b-c – creştere logaritmică. 5 – faza staţionară.BACTERII .creştere accelerată.

Cuprinsă între momentul introducerii inoculului şi debutul multiplicării . este cu atât mai scurtă cu cât condiţiile de viaţă (mediu nutritiv.Este o fază de adaptare la condiţiile de cultivare . temperatură) sunt mai apropiate de cele anterioare . pH.Numărul de bacterii rămâne constant sau scade uşor .Durata este în general de câteva ore.Curba de creştere Faza de lag .Bacteriile viabile îşi acumulează în celule metaboliţii esenţiali şi sistemele enzimatice necesare creşterii . aeraţie.

modificate.etapa durează 2-3 ore .diviziunile celulelor se sincronizează. datorită modului în care au fost selectate. nu conţin materiale de rezervă.Curba de creştere Faza de creştere logaritmică (multiplicare exponenţială) . crescute. multiplicate în etapele precedente) . la intervale de timp regulate. au conţinut ridicat de ARN (sunt celule “specializate” pe producţie.celulele rezultate au dimensiuni mai mari decât cele tipice speciei lor.ritmul de creştere se accelerează . numărul de celule viabile se dublează brusc .

Curba de creştere Faza staţionară maximală .are loc atunci când din mediu se epuizează substanţele nutritive sau se acumulează produşi toxici .celulele sunt mature şi au dimensiuni normale . în această etapă are loc biosinteza substanţelor urmărite ca produşi de biosinteză .faza durează de la câteva ore la câteva zile.numărul de celule viabile este maxim şi rămâne constant .

din cauza morţii acestora .Curba de creştere Faza de declin .scăderea progresivă a numărului de celule viabile. mai mari sau mai mici decât normal.uneori apare fenomenul de autoliză . se colorează slab).celulele sunt bătrâne şi cu semne de involuţie (sunt deformate. la speciile sporogene apar foarte mulţi spori .

care creşte liniar în timp. Unele bacterii au nevoie de ioni ai metalelor grele în această fază (Bacillus Subtilis are nevoie de Mn pentru iniţierea dezvoltării) • Faza de creştere liniară: pe suprafaţa mediului apare o colonie circulară. . sub forma unor reţele fine de hife • Faza de învechire viteza de creştere este încetinită.Curba de creştere la fungi  În cazul acestor microorganisme se dezvoltă micelii ramificate cu lungimi de până la 10-15 m • Faza de lag: are loc germinarea sporilor (dacă se inoculează suspensie de spori) sau se regenerează hifele rupte şi lezate (când se inoculează inocul vegetativ). Faza de lag se poate prelungi mult dacă sa adăugat o cantitate prea mică de inocul. ca urmare a efectului dăunător al produşilor de metabolism.

Parametri care evidenţiază creşterea • Determinarea masei celulare .izolarea celulelor şi cântărirea lor • Determinarea numărului de microorganisme sau a concentraţiei celulare prin metode instrumentale – Metoda turbidimetrică – multiplicarea microorganismelor determină tulburarea mediului de cultură direct proporţional cu populaţia lor – Analiza prin IR a concentraţiei de CO2 care părăseşte cultura – Numărarea celulelor sub microscop – Determinarea concentraţiei sursei de carbon din mediu .

You're Reading a Free Preview

Download
scribd
/*********** DO NOT ALTER ANYTHING BELOW THIS LINE ! ************/ var s_code=s.t();if(s_code)document.write(s_code)//-->