PRODUKSI ANTIBODI MONOKLONAL MENGGUNAKAN KONJUGAT FUMONISIN B1-OVALBUMIN SEBAGAI ANTIGEN UNTUK DETEKSI FUMONISIN SECARA IMUNOASAI

ROMSYAH MARYAM

SEKOLAH PASCASARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2007

PERNYATAAN MENGENAI DISERTASI DAN SUMBER INFORMASI

Dengan ini saya menyatakan dengan sebenar-benarnya bahwa disertasi yang berjudul:

PRODUKSI ANTIBODI MONOKLONAL MENGGUNAKAN KONJUGAT FUMONISIN B1-OVALBUMIN SEBAGAI ANTIGEN UNTUK DETEKSI FUMONISIN SECARA IMUNOASAI adalah karya saya sendiri dan belum pernah diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi manapun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan oleh penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka.

Bogor, Agustus 2007

Romsyah Maryam NRP F 226014011/IPN

SUMMARY
ROMSYAH MARYAM. Production of Monoclonal Antibodies using Fumonisin B1-Ovalbumin Conjugate as the Antigen for the Detection of Fumonisin by Immunoassay. Under supervision of ANTON APRIYANTONO as the chairman, RIZAL SYARIEF, FRANSISKA R. ZAKARIA and LIES PAREDE as the advisory committee members. Fumonisins are mycotoxins produced by Fusarium spp. mainly F. verticillioides and F. proliferatum which are commonly found in grains such as corn, rice dan wheat. Fumonisin B1 (FB1) the most abundant and most toxic, is classified as a possible carcinogen for humans (Group 2B) and one of the five important mycotoxins in the world. The toxicity of FB1 for humans and animals, as well as its economic impact have been reported worldwide. In order to minimize the risks of FB1 contamination some countries have set the maximum levels of fumonisin in foods and feeds. Although there is no report on mycotoxicoses related to FB1 contamination in Indonesia, some findings indicated high concentration of fumonisin contamination in agricultural products could affect the national income. Analytical methods play crucial roles in the detection of fumonisin contamination in foods and feeds. Immunoassay is one of the most reliable, rapid, sensitive, specific, and economical method. This assay based on polyclonal or monoclonal antibodies. The objective of this study was to produce monoclonal antibodies (MAb) against FB1 and to generate direct competitive enzyme-linked immunosorbent assay (dc-ELISA) for fumonisin analysis. This study includes several activities: (1) Synthesis of fumonisin B1-Ovalbumin antigen (FB1-Ova) and the enzyme conjugate fumonisin B1-horseraddish peroxidase (FB1-HRP), (2) Production and characterization of monoclonal antibodies against FB1, (3) Optimization and validation of the dc-ELISA, (4) Application of dc-ELISA for the detection of fumonisin in foods or feeds. FB1 used for the synthesis of FB1-Ova and FB1-HRP was isolated from F. verticillioides and F. nygamai culture in corn which produced FB1 1.54 g/kg and 0.87 g/kg, respectively. The average of protein concentration of the antigen produced from the conjugation of FB1 and Ova via glutaraldehyde reaction was 0.0933 0.0178 mg/ml (n=5). The antigen was proven to be immunogenic to BALB/c mice and could be used for the antibody sreening using indirect competitive ELISA (ic-ELISA). The reaction of FB1 and HRP resulted in the formation of FB1-HRP enzyme conjugate which could be used as a label in the analysis of FB1 by dc-ELISA. Monoclonal antibodies were produced by fusion of the splenic lymphocytes from the FB1-Ova immunized BALB/c mice with Sp2/0-Ag 14 myeloma cells using polyethylene glycol (PEG 4000). Antibodies produced by the hybridoma cells were screened, and eight clones of the hybridomas with high antibody titers were selected for cell cloning. The highest antibody-producing hybridoma (2B2F6) was clonned by limited dilution. The secreted antibodies from subclone 2B1F6F7 belonged to the immunoglobulin G1 (IgG1) subclass. The concentration of the antibodies from the supernatant and the ascitic fluids after precipitation with ammonium sulphate and purification using HiTrap Protein A HP were 2.81 mg/ml and 1.62 mg/ml, respectively.

The optimum condition for the dc-ELISA to detect 50 ng/ml FB1 required an antibody dilution of 1:10,000 and a FB1-HRP enzyme conjugate dilution of 1:400. The antibodies gave a specific reaction to FB1 with cross reactivity against fumonisin B2 (FB2) of 49%. The method sensitivity was 0,5 ng/ml with IC50 of 2,9 ng/ml. The dcELISA of spiked corn samples (40 ng FB1/g) showed good precision (SD=1.5%) and accuracy (SD=7.7%) with FB1 recovery ranging from 88.2 to 103.1%. FB1 standards in the concentration range of 1-50 ng/ml gave a linear response (R2= 0.9949) with regression equation Y= 7.1862 Ln(x) + 68.35. However, the linearity was reduced by the corn matrices (R2= 0.9841) at the same concentration range of FB1 standards. The ELISA method developed in this research had a good agreement with high performance liquid chromatographic method (HPLC) which indicated by the analytical results of FB1 in corn detected by the two methods (R2 = 0.9898). Analysis of commercial broiler dan layer feeds (n=10) using dc-ELISA revealed the presence of FB1 in the feeds ranging between 46.1 482.8 ng/g for the broiler feeds and 20.7 85.5 ng/g for the layer feeds. These levels were lower compared to the FB1 levels in poultry feeds in general. During storage at ambient temperature for six weeks, the concentration of FB1 in commercial chicken feeds gradually increased. This indicated that the production of FB1 by Fusarium spp. continued during the storage. However, the concentration of FB1 in both broiler and layer feeds were still low to cause mycotoxicoses in poultry. Direct competitive ELISA (dc-ELISA) is the most common immunoassay method used for the analysis of mycotoxins such as fumonisin. The dc-ELISA developed in this study using monoclonal antibodies showed a good performance when applied for the analysis of FB1 contaminated foods and feeds. The method is suitable for laboratories in the developing countries such as Indonesia in terms of support for food safety programs and global trade.

Keywords: monoclonal antibody, fumonisin B1-ovalbumin conjugate, fumonisin detection, immunoassay

RINGKASAN
ROMSYAH MARYAM. Produksi Antibodi Monoklonal Menggunakan Konjugat Fumonisin B1-Ovalbumin Sebagai Antigen untuk Deteksi Fumonisin Secara Imunoasai. Di bawah bimbingan ANTON APRIYANTONO sebagai ketua komisi pembimbing, RIZAL SYARIEF, FRANSISKA R. ZAKARIA dan LIES PAREDE sebagai anggota. Fumonisin adalah mikotoksin yang dihasilkan oleh kapang Fusarium spp. terutama F. verticillioides dan F. proliferatum yang banyak dijumpai pada komoditas pertanian seperti jagung, beras dan gandum. Fumonisin B 1 (FB1) merupakan jenis fumonisin yang paling banyak ditemui di alam dan paling toksik, diklasifikasikan sebagai senyawa karsinogen (Grup 2B). FB1 termasuk dalam lima mikotoksin penting yang menjadi perhatian dunia. Toksisitas FB1 pada manusia dan hewan, serta dampak ekonomi yang disebabkan mikotoksin ini telah banyak dilaporkan. Oleh karenanya, untuk mengurangi risiko yang disebabkan karena kontaminasi FB1 beberapa negara telah menetapkan batas maksimum kandungan fumonisin ini dalam bahan pangan dan pakan. Meskipun di Indonesia belum ada laporan mengenai mikotoksikosis yang disebabkan oleh fumonisin dan belum ada laporan mengenai kerugian ekonomi, namun dari beberapa laporan yang mengindikasikan kontaminasi FB1 pada bahan pangan dan pakan yang cukup tinggi dapat mempengaruhi perekonomian nasional. Metode analisis memegang peranan penting dalam mendeteksi kontaminasi fumonisin pada bahan pangan dan pakan. Imunoasai adalah salah satu metode yang paling dapat diandalkan karena dengan metode ini proses analisis dapat dilakukan secara cepat dan mudah dengan sensitivitas dan spesifitas yang tinggi, serta ekonomis. Teknik ini menggunakan antibodi poliklonal atau monoklonal. Tujuan dari penelitian ini yaitu memproduksi antibodi monoklonal (AbMk) spesifik terhadap FB1 dan mengembangkan metode enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kompetitif langsung untuk analisis fumonisin. Penelitian ini terdiri dari beberapa kegiatan: (1) Sintesis antigen fumonisin B1-ovalbumin (FB1-Ova) dan konjugat enzim fumonisin B1horse raddish peroxidase (FB1-HRP), (2) Produksi dan karakterisasi antibodi monoklonal spesifik terhadap FB1, (3) Optimisasi dan validasi ELISA kompetitif langsung, (4) Aplikasi ELISA kompetitif langsung untuk mendeteksi fumonisin pada bahan pangan atau pakan. FB1 yang digunakan untuk sintesis antigen FB1-Ova dan FB1-HRP diisolasi dari biakan kapang F. moniliforme dan F. nygamai pada media jagung yang masingmasing menghasilkan FB1 1,54 g/kg dan 0,87 g/kg. Rataan konsentrasi protein dari antigen yang dihasilkan dari konjugasi FB1 dengan Ova melalui reaksi dengan glutaraldehida yaitu 0,0933 0,00178 mg/ml (n=5). FB1-Ova yang terbentuk dari reaksi tersebut bersifat imunogenik, terlihat dengan adanya respon antibodi pada mencit BALB/c yang diimunisasi dengan antigen tersebut, dan dapat digunakan sebagai pereaksi untuk pengujian antibodi secara ELISA kompetitif tidak langsung. Reaksi antara FB1 dan enzim horseraddish peroxidase (HRP) menghasilkan FB1-HRP enzim konjugat yang dapat digunakan sebagai label pada analisis FB1 secara ELISA kompetitif langsung. Antibodi monoklonal dihasilkan melalui fusi sel limfosit mencit yang diimunisasi FB1-Ova dengan sel mieloma Sp2/0-Ag14 menggunakan polietilen glikol (PEG 4000). Antibodi yang dihasilkan oleh hibridoma diskrining, dan delapan klon

dari sel hibrid dengan titer antibodi yang tinggi diseleksi untuk kloning sel. Hibridoma yang menghasilkan antibodi tertinggi (2B2F6) diklon melalui pengenceran terbatas. Antibodi yang disekresikan oleh subklon 2B2F6F7 termasuk dalam subkelas imunoglobulin G1 (IgG1). Konsentrasi antibodi dari supernatan dan cairan asites setelah pengendapan dengan ammonium sulfat dan pemurnian melalui kolom HiTrap Protein A HP masing-masing 2,81 mg/ml dan 1,62 mg/ml. Kondisi optimum ELISA tak langsung untuk mendeteksi 50 ng/ml FB1 memerlukan pengenceran antibodi 1:10.000 dan konjugat enzim FB1-HRP 1:400. Antibodi tersebut memberikan reaksi yang spesifik terhadap FB1 dengan reaksi silang terhadap fumonisin B2 (FB2) sebesar 49%. Sensitivitas metode ini yaitu 0,5 ng/ml dengan IC50 2,9 ng/ml. Analisis sampel jagung yang diberi standar FB1 (40 ng/g) secara ELISA kompetitif langsung menunjukkan presisi (SD=1,5%) dan akurasi (SD=7,7%) yang baik dengan rekoveri berkisar antara 88,2-103,1%. FB1 standar pada kisaran konsentrasi 1-50 ng/ml menunjukkan garis linear (R2=0,9949) dengan persamaan regresi Y=7,1862 Ln(x) + 68,35. Namun, linearitas menurun dengan adanya matriks jagung (R2= 0,9841) pada kisaran konsentrasi standar FB1 yang sama. Perbandingan analisis FB1 dalam jagung (n=10) secara ELISA kompetitif langsung dengan metode KCKT menunjukkan korelasi yang baik di antara kedua metode tersedbut (R2=0,9898). Analisis pakan ayam komersial (n=10) secara ELISA kompetitif langsung menunjukkan adanya kontaminasi FB1 pada kisaran 46,1482,8 ng/g untuk pakan ayam pedaging dan 20,785,5 ng/g untuk pakan ayam petelur. Konsentrasi tersebut lebih rendih dibandingkan dengan konsentrasi FB1 pada pakan ayam pada umumnya. Perlakuan penyimpanan kedua jenis pakan pakan tersebut pada temperatur kamar selama enam minggu menunjukkan adanya peningkatan konsentrasi FB1. Hal ini menunjukkan bahwa produksi FB1 oleh Fusarium spp. terus berlangsung selama penyimpanan. ELISA kompetitif langsung adalah metode imunoasai yang paling banyak digunakan untuk analisis mikotoksin termasuk fumonisin. Metode ELISA kompetitif langsung yang dikembangkan pada penelitian ini dengan menggunakan antibodi monoklonal menunjukkan performan yang baik ketika diaplikasikan untuk menganalisis bahan pangan dan pakan yang terkontaminasi FB1. Metode ini sesuai untuk digunakan pada laboratorium-laboratorium di negara berkembang seperti Indonesia guna mendukung program keamanan pangan dan perdagangan global.

Kata kunci: antibodi monoklonal, konjugat fumonisin B1-ovalbumin, deteksi, fumonisin, imunoasai

Hak Cipta Milik Institut Pertanian Bogor, Tahun 2007 Hak Cipta Dilindungi
Dilarang mengutip dan memperbanyak tanpa izin tertulis dari IPB, sebagian atau seluruhnya dalam bentuk apapun, baik cetakan, fotokopi, mikrofilm dan sebagainya

PRODUKSI ANTIBODI MONOKLONAL MENGGUNAKAN KONJUGAT FUMONISIN B1-OVALBUMIN SEBAGAI ANTIGEN UNTUK DETEKSI FUMONISIN SECARA IMUNOASAI

ROMSYAH MARYAM

Disertasi Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Doktor pada Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor

SEKOLAH PASCA SARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2007

Penguji Luar Komisi pada Ujian Tertutup: Dr. drh. Retno D. Soejoedono, MS Penguji Luar Komisi pada Ujian Terbuka: 1. Dr. drh. Agustin Indrawati, M.Biomed 2. Dr. Tri Budhi Murdiati, MSc.