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UNIV U VERS SIDAD D NA ACIONAL AG GRAR RIA LA L MO OLIN NA

Potencia P al bioci ida de los l acei ites ese enciales s extra ados de d las hojas de e Schinu us moll le L. 17 753 (A Anacard diaceae e)
Eduard do Anton nio Molin nari Nov voa Marco os Miguel Retamo ozo Ram mos

Profe esor: Ferm mn Hum mberto Arvalo A O Ortiz Tra abajo fina al del cur rso de Fi itoqumic ca Mi ircoles 17 1 de juli io -201 13-

Agradecimientos El presente trabajo no hubiera podido llegar a buen puerto, si no fuera gracias a la constante asesora del profesor del curso, Mg. Sc. Fermn Arvalo, y a la ayuda imprescindible de la tcnica del laboratorio Q-6, Sra. Maura Rodrguez. Adems, es pertinente mencionar a los profesores de microbiologa, Dres. Gutirrez, Villena y Ziga; por facilitar y apoyar la lnea de investigacin microbiolgica: a todos ellos, muchas gracias. Finalmente, un enorme agradecimiento a Alexandra Florin, estudiante afiliada al Laboratorio de Ecologa Microbiana Marino Tabusso, por el enorme apoyo logstico en la elaboracin de las pruebas. Sin su ayuda, nada de esto hubiera sido posible. Por su amistad y complicidad, le dedicamos este trabajo.

Resumen Debido a la alta demanda de productos naturales, y la creciente desconfianza hacia sus pares sintticos, se busc una alternativa a los qumicos tradicionales a partir de un insumo obtenido de una planta nativa. Es por eso que se prob la actividad antimicrobiana de los aceites esenciales del molle andino (Schinus molle) en diferentes cepas microbianas. Se encontr que su efectividad es alta comparada con otros antibiticos comnmente usados. Para ello, La extraccin de los aceites se realiz por medio del arrastre de vapor y con equipo Clevenger. Si bien el primer mtodo es ms barato y simple que el primero, con el equipo Clevenger se obtuvo mayor cantidad de aceite. El aceite extrado fue deshidratado con sales anhidras de sodio. Adems, se cultiv cepas de Escherichia coli en agar nutritivo y se evalu la efectividad imbuyendo las regiones experimentales con el aceite, su efectividad cualitativamente respecto a los controles. Adicionalmente, se hizo una pequea prueba para medir el crecimiento de Saccharomyces cerevisiae, la cual tambin se ve afectada por el efecto antibitico del extracto. Finalmente, se realiz un breve estudio de mercado donde se analiza el potencial del molle como biocida, valorando su uso, comparndolo con los precios de otras alternativas, y explicando, brevemente, la

factibilidad de la introduccin de los aceites esenciales en la industria nacional.

Introduccin A lo largo del siglo XX, la qumica sinttica ha logrado grandes avances en la creacin de compuestos, orgnicos o inorgnicos, que inhiben la proliferacin de bacterias. Sin embargo, en la actualidad, como parte de un fenmeno de cambio de actitud hacia lo ecolgico y natural, (Arellano Cruz, 1998), se busca en la actualidad productos cuyo impacto sobre el ambiente sea menor, tenga un origen natural y con pocas modificaciones industriales, que se fabrique a partir de insumos locales, y que permita restituir a los pobladores parte de la ganancia, como parte de una poltica verde de precio justo. Esta corriente, que puede ser denominada mayordoma (Gonzales M., 1998), es parte de una tica ambiental cuya aspiracin es el sostn de la humanidad, sin perjucio, y ms bien con promocin, del ambiente natural; que hunde sus races en concepciones renovadas de la occidentalidad cristiana (entendida segn es expresada por Mir Quesada Cantuarias, 1981). Este trabajo pretende responder, de manera integral, a todas las demandas de esta mayordoma o stewardship (Chapin, Kofinas, & Folke, 2009), con el empleo de un insumo nativo para la elaboracin de productos funcionales, efectivos y que tienen un mnimo impacto sobre el medio ambiente. Por esto, busca dar a conocer las bondades y ventajas de los aceites esenciales extrados de las hojas del molle andino, especie

nativa de Sudamrica y abundante en nuestro pas. Se trabaj con los rganos foliares, por lo que es, en potencia, una fuente renovable y amigable del medio ambiente, que est muy acorde a las tendencias modernas. Tendencias que han sido reconocidas por el Estado Peruano desde el 2004, con la creacin de las instituciones ambientales (Ley N 28245). Sobre la caracterizacin taxonmica del molle. El molle Schinus molle L. (Linnaeus, 1753) es una planta de la Familia Anacardiaceae. Esta Familia se caracteriza por estar conformada por plantas arbreas o arbustivas, rara vez lianas; con hojas de filotaxis alterna, compuestas y imparipinnadas. En algunos gneros, la hoja se simplifica hasta ser trifoliolada o simple. Los foliolos son opuestos, sub opuestos o alternos; enteros o aserrados. Sus flores son normalmente bisexuales, aunque existen especies con flores imperfectas, actinomorfas, inconspicuas, dispuestas en panculas o inflorescencias racemosas paniculoides, que pueden alcanzar longitudes muy largas, con respecto al tamao de la flor, que es siempre pentmera. Esta posee en su verticilo externo un juego de spalos (de tres a cinco) que en algunos casos son acrescentes y persistentes. En el segundo verticilo, los ptalos, si los hubiera, son cinco, libres o basalmente unidos al receptculo. Los estambres son cinco o diez, dispuestos en uno o dos

verticilos, respectivamente, casi siempre libres, con filamentos delgados y anteras con dehiscencia longitudinal. Con un anillo intraestaminal, aunque algunas veces puede ser extraestaminal. El ovario es spero, unilocular, con un nmero de carpelos que oscila, normalmente, entre uno y cinco, aunque pueden llegar a ser hasta 12. Pocas veces el gineceo es apocrpico, si lo fuera, el pistilo es libre. Los estilos son correspondiente al nmero de carpelos, y si estos estn unidos, los primero tambin lo estarn, separndose solo en los estigmas. Los frutos son drupas o smaras drupceas, con mesocarpo seco o carnoso, y con el endocarpo ptreo. Las semillas poseen un embrin curvo, exalbuminado. Las especies son fuertemente entomfilas, particularmente melitfilas, protginas, autoincompatibles, que requieren de sol para causar la dehiscencia de los estambres. Esta familia es marcadamente tropical, tiene importancia econmica por sus especies de madera noble y frutos comestibles (como es el caso del mango o la nuez de caj). Esta familia es una rsida, perteneciente a un clado de gran importancia econmica y cultural, hecho que se nota en esta familia (Stevens, 2013). En general, las rsidas poseen una gran diversidad bioqumica (Panhwar, 2005).

La especie Schinus molle L., 1753; fue descrita en el documento que inaugur la nomenclatura binomial y en la actualidad se considera la especie tipo del gnero Schinus (Linnaeus, 1753). Se caracteriza por tener un porte arbreo, con copa redondeada, de hojas compuestas, con foliolos alternos, finos y levemente aserrados. Presenta ritidoma en la corteza. Esta especie es sumamente verstil, lo que lo ha llevado a convertirse en una plaga en otros lugares del mundo (Elfers, 1988). Es rico en resinas, que le confieren un olor caracterstico, que es usado como repelente de insectos (Conabio, 2005). Estas caractersticas poseen potencial como reemplazo a otros compuestos funcionalmente afines, como las piretrinas (Casida, 1980), con la ventaja de una menor persistencia (Gan, Lee, Liu, Haver, & Kabashima, 2005). Adems, ya se usan tradicionalmente para esos fines, como otras anacardiceas (Villavicencio-Nieto & Prez-Escandn, 2010; Bhat, Hegde, & Hegde, 2012). Sobre los mtodos de extraccin. Para la extraccin de aceites esenciales, se emplearon mtodos que aprovecharon la volatilidad de los compuestos, para extraerlos por medio de vapor de agua. El primero de ellos, el de arrastre de vapor, consiste en vaporizar agua pura de un recipiente, con el traslado subsecuente de vapor de agua hacia otro que contenga la muestra a trabajar. La temperatura har que los compuestos

voltiles salgan de las clulas, y sean arrastrados por el vapor hasta un refrigerante, que permitir colectar, condensadas, las fases lquidas. Estas se depositan en una pera de decantacin, para permitir la separacin de las partes acuosa y oleosa. Finalmente, se extrae la parte acuosa primero; quedando la parte oleosa lista para ser recuperada al final (UNAM, 2013), [Figura 1, tomada de UNAM, loc. cit.].

Respecto al otro mtodo de destilacin, la hidrodestilacin con el sistema de Clevenger, se basa en la diferencia de densidades, y en el uso de un reflujo continuo para la recuperacin de aceites en el sistema de asas de Clevenger. En este, la muestra se hace hervir, y los vapores son

recogidos, refrigerados y reflujados, almacenando la parte oleosa en un asa (UNAM, 2013) [Figura 2, tomada de bid.]

Sobre los aceites esenciales y su potencial antimicrobiano. En general, muchas investigaciones se han hecho sobre el potencial de los aceites esenciales en las ciencias mdicas. Se ha probado, sobre todo, con fines antimicrobianos (Tomczykowa, Tomczyk, Jakoniuk, & Tryniszewska, 2008; Sokovi, Glamolija, Marin, Brki, & van Griensven, 2010; Hammer, Carson, & Riley, 1999). Los aceites esenciales del molle han sido objeto de diversas investigaciones, muchas de ellas para determinar

su composicin: abundancia de compuestos terpnicos, como el limoneno, sobre todo triterpenos; pero ausencia de taninos o flavonoides (Zahed, Hosni, Ben Brahim, & Sebei, 2011; Rossini, Menndez, Dellacassa, & Moyna, 2011). Adems, existe evidencia de su efecto citotxico sobre clulas tumorales (Daz, Quesada, Brenes, Aguilar, & Cicci, 2008). Estudios anteriores confirman la efectividad del extracto para inhibir el crecimiento de Gram-positivas (Deveci, Sukan, Tuzun, & Hames Kocabas, 2010). Adems, se ha encontrado propiedades neurotxicas y antidepresivas (Machado, y otros, 2008; Machado, y otros, 2007). Tambin se ha evaluado al molle en su efectividad contra Staphylococcus aureus (Cruz-Carrillo, Rodrguez N., & Rodrguez, 2010); amen de muchos otros efectos atribuidos (Catiana Zampini, Cudmani, & Isla, 2007). An ms, se ha estudiado el efecto del extracto etanlico a nivel subcutneo (Bras, Domnguez, Minetti, & Ferrero, 2007). Por ello, fue el objetivo de los autores corroborar la abundante bibliografa, al tiempo de presentar las ventajas mercadotcnicas del uso del aceite de molle como antibitico. Metodologa y resultados Se recogi hojas apicales de los rboles de molle de la Universidad Nacional Agraria La Molina, las cuales se secaron para la extraccin por arrastre de vapor y para la extraccin por medio del sistema de

Clevenger. Se trabaj con 150 g de materia seca en cada caso. Al separar los aceites de la fase acuosa, se tuvo cuidado para evitar la emulsin de la muestra, decantndola gota por gota. Finalmente, se extrajo de ambos mtodos los aceites, se mezclaron, y se secaron qumicamente con una sal de sulfato de sodio anhidra. As, la turbidez que caracteriza a los aceites recin extrados dio paso a una diafana amarillenta: se haba logrado extraer, casi puro, el aceite esencial de molle. Se obtuvo un aproximado de 1 mL por el mtodo de arrastre de vapor, y casi 2 mL por la hidrodestilacin de Clevenger. Para la evaluacin de antibiosis bacteriana, se cultiv en una placa de agar diferentes concentraciones celulares por litro de cepas de E. coli del Laboratorio de Ecologa Microbiana Marino Tabusso [Figura 3]. Desde la parte superior, y en sentido horario, se observa la siembra de una concentracin de 10-5, 10-6, 10-6 (con la aplicacin del aceite esencial), 10-6 y 10-6 (sin aceite esencial aplicado) unidades formadoras de colonias. Se incub la placa a 37 C por tres das, segn bibliografa (Gutirrez-Correa, Moreno, Ramos, & Villena, 2011). El aceite se aplic, por recomendacin del personal, con suaves pinceladas antes de la siembra. Se trabaj con una emulsin en agua destilada al 50%, obtenida por agitacin y la adicin de una gota del detergente para pruebas biolgicas Tween 80.

Como se e puede ob bservar cla aramente, la reas sin s aceite e esencial ap plicado formaron n colonia as bacteria anas, mie entras que e la pres sencia de aceite esencial de molle inhibi, i cl laramente, la prolife eracin de e E. coli.
Fig gura3

Para la prueba p de proliferacin de Saccharom S myces cere evisiae, se e aplic sobre la placa de agar nutri itivo, una pelcula de aceite, tratando de que esta sea lo ms homognea h a posible. . Luego, se s sembr por pun ncin la cepa, a una u concen ntracin de d 10-6 UF FC. Como se observ va en la fi igura 4, al cabo de ocho horas, la l prolifer racin ce elular se vio inhib bida en compara acin al co ontrol.

Fig gura4,alaiz zq.,sinaceite e;aladerecha a,conaceite.

Los resu ultados co oncuerdan plenamen nte con la a bibliogr rafa, por lo que entendem mos que ef fectivamente este pr roducto tiene potencial. Estudio de merca ado. La factibilidad fa d de la in ntroducci n del aceite de molle pa asa por la a posibilid dad de for rmar plant taciones q que sirvan n como fuente de e materia prima p (est to es, la hojas). Com mo su feno ologa per rmite la extracci n de hoja as durante e todo el ao, a y la ta asa de reg generacin n foliar, segn Fl lores (com municacin n persona al) es de aproximad a damente un u mes, se puede e una cole ecta cada 15 das, atacando a e dosel a el alto y el bajo, b de El rendim manera alternada. a miento es s de aprox ximadame ente 100 mL m por cada 6,5 5 kg de ho ojas secas s, lo que se traduc ce en casi 15 kg de e hojas frescas. Se indic c que un u rbol alcanza la l madur rez en pa ara ser transplan ntado a lo os treinta centmetr ros, lo qu ue representa cinco meses desde la siembra en vivero o (CONAB BIO, 1997 7). A eso, hay que e sumar tres aos s de crecim miento ha asta la altu ura funcio onal de 2 m, tama o en el que el fo ollaje alcan nza su vo olumen fin nal (Flores s, comunic cacin per rsonal). Se puede e obtener ms de 15 1 kg de hojas h frescas por r rbol, aunq que por

motivos de ajuste financiero se tomar que cada rbol produce, durante cada mes, 30 kg; lo que se traduce en 200 mL de aceite. Esto, aplicado a toda la plantacin, representa 20 L de aceite mensual. El aceite de ricino tiene un precio aproximado de 400 por tonelada, segn consultas a un proveedor turco. Considerando que la densidad del aceite de ricino es de 0,9619 kg/L (Wassner, s/d), se tiene que por el precio indicado se compra, aproximadamente, 1040 L a 400 , sin incluir fletes ni transporte. Esto es 1 L a 2,6 . Segn el Banco de la Nacin, con un tipo de cambio de 3,43 PEN/EUR; tenemos que cada litro puede llegar a costar hasta S/. 8,90. Con cien rboles correctamente manejados, se puede obtener hasta 2140 soles anuales; considerando el precio de un producto a todas luces inferior. Si a eso, se le agrega un valor adicional, proveniente de la produccin orgnica y la Marca Pas; el precio aumentar (Weinberger Villarn, 2009). Si establecemos este a un valor de 30 soles el litro, la ganancia anual llega hasta los 7200 soles, con un costo de mantenimiento anual de, aproximadamente, 760 soles; y un costo de introduccin de 1610 soles, aproximadamente. En base a lo detallado, y utilizando un documento base modificado (Deutsche Gesellschaft fr Technische Zusammenarbeit, 2007), se presenta el siguiente cuadro de costos, de la pgina siguiente. Se hace para una plantacin de cien rboles.

ManodeObra NJornales PREPARACINDELTERRENO Desmonte3 Trazoymarcacin Hoyacin PLANTACIN Transportedeplantonesyabono Distribucindeplantones Abonamiento Plantacin Recalce LABORESCULTURALES Riego Cercado Podas Abonamientoyremocin Controlfitosanitario Limpieza COSECHAYPOSTCOSECHA 180 12 2 1 49,5 12 12 24 12 607 12 144 Sacos Rafia Canasta Manta Almacenamiento Costototaldeproduccin Galones 50 1 3 1 100 pieza rollo pieza pieza pieza 1 1 2 6 5 50 1 6 6 500 Destilador 802,48 ModificadodeDeutscheGesellschaftfrTechnischeZusammenarbeit,2007 Recoleccinyensacado Seleccin 2 12 24 3 12 36 Biol 5 12 60 Abono 0,5 200 30 12 6 Kg L 0,18 3 36 90 63 Mochila1 4 12 48 10 12 120 Agua Barreta1 Machete1 Tijeradepodar1 Tijerademangolargo1 294 1 12 12 Plantones 10 0,5 1 12 12 Plantones 100 0,5 0,5 12 6 Abono 100 Kg 0,18 0,5 12 6 18,48 50 5 126 1 12 12 Transporte Servicio 20 48 93,48 Carretilla Baldes3 2 12 24 1 25 25 Cordel 1 m 20 20 Serrucho1 Pala1 3 12 36 Zapapicos2 85 20 Unit.S/. Subtotal Descripcin Cantidad Unidad Unit.S/. Subtotal Descripcin

Costodeinsumos

Costodemaquinariayequipo Unit.S/. 46 60 85

COSTOTOTAL

Vidatil/aos 5 3 5

Subtotal

54,4

159,4

18,4

54,4

20

20

16

61

24 135 5 5 3

32

173,48

27

59

24,48

62

17

57,5 30 15 95 180 240 10 5 10 10 10

477,5

120

51

9,5

15,5

18

18

96

24

150

24

243

194

6 700 10

30

12

150,9

1609,88

Conclusiones y recomendaciones El aceite de hojas de molle posee efectividad antibitica, y posee potencial como para iniciar una experiencia empresarial. Se sugiere estudios especficos de fenologa y de viabilidad econmica para poder establecer, en el futuro, una industria de aceites de origen natural y nacional, para la elaboracin de antibiticos industriales y medicinales de bajo impacto ecolgico.

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