SDS- PAGE

Normalmente se carga la misma secuencia 2 veces (en 1 gel o en 2 dependiendo del nº de muestras): una para la tinción de Coomasie, y otra para Western Blot. ► urante todo el proceso las prote!nas (tanto las muestras como el patrón) "an de mantenerse en #r!o. $ Coger la cu%eta y el gel. &liminar los e'cesos de poliacrilamida. (impiar %ien los cristales del gel para eliminar posi%les restos de poliacrilamida (so%re todo el cristal trasero )ue va estar en contacto con la goma) $ *ntar el cristal trasero (el )ue tiene la "endidura) y la goma con grasa para lograr una per#ecta ad"erencia. +#lo,ar las tuercas (en cru-) e introducir el gel entre las placas. +pretar las tuercas (t% en cru- y gradualmente) $ +.adir el running buffer (conservado a /ºC) 0a de %a.ar los dos e'tremos del gel. 1ellenar el espacio entre el gel y la placa. +segurarse de )ue no "ay #ugas. 1ellenar la %ase de la cu%eta. 2arcar en el cristal la %ase de los pocillos, ya )ue una ve- retiremos el peine no se van a distinguir. 1etirar el peine. (impiar los pocillos con una ,eringuilla y tampón de carga para visuali-arlos %ien. 3reparación del running buffer (2l):4ris(56g)7 8ly (1//g)7 9 9 (16g)7 02: dest. $ +.adir a la muestra el tampón de carga (9 9; sample buffer) <ste #unciona me,or a 4.+. +plicar un vortex. $ 3reparación del patrón: se reali-a a una dilución 1:26 en tampón de carga. $ esnaturali-ar el patrón y las muestras durante = minutos a >=ºC. $ Cargar el patrón y las muestras en el gel (26;2= μl) usando una ,eringuilla 0amilton. 4ras cada carga limpiamos la ,eringuilla en el tampón. +notar el orden de carga. $ Correr el gel. 8eles en gradiente: +plicar un volta,e de 166? "asta )ue las muestras lleguen al #inal del gel concentrador y su%irlo a 266? "asta )ue lleguen al #inal del gel. &l proceso dura apro'. 1". @ &s importante )ue el ampera,e sea A 26 m+ por gel. $ ?aciar el tampón de la cu%eta. 9eparar los cristales usando un %istur! y eliminar la -ona de los pocillos. 9i las carreras destinadas a la tinción de Coomasie y al Western Blot estBn en el mismo gel separarlas. 0acer dos cortes en el gel para conocer la posición de carga (&,emplo: es)uina superior y es)uina in#erior derec"as, de manera )ue el patrón )ueda a la i-)uierda de las marcas) $ 4inción de Coomasie: 9umergir el gel en el colorante y mantener 56 minutos en agitación. 1eciclar el colorante. este.ir el gel (destaining solution) un m!nimo de 5;/ "oras en agitación (o me,or 1 noc"e), y con papel en el recipiente..

3reparación de la destaining solution (2=6ml): 226 ml 02: 7 1C. $ 3reparación de los di#erentes elementos. si no estB en el rango "ay )ue preparar tampón nuevo. cogiDndola con pin-as)0acerla #lotar en 02: destilada mo.=l para empapar todos los elementos)3or cada litro me-clamos F66ml de transfer buffer 1. Normalmente se re)uiere 1. Cortar un tro-o del mismo tama. &nsam%la./)y m+E556.os y el papel de #iltro en el trans#er %u##er. &l patrón )ueda a la i-)uierda y las muestras a la derec"a.o (a migración de produce de cBtodo a Bnodo.ustar el p0./6min) ya )ue al introducir el sandwich va a su%ir.adir %ase para a. @ 1eali-amos en la mem%rana 2 cortes opuestos a los del gel (i-)uierda superior e in#erior). ► 3ara conservarlo a /ºC "ay )ue "acerlo sin metanol (1.+.as de aire entre el gel y la mem%rana "acer rodar por encima del segundo papel de #iltro un tu%o de cristal mo.2='7 266 ml de metanol. 0emos de introducir el gel en un recipiente con transfer buffer un m!nimo de 56 minutos a /ºC WESTERN-BLOT 4rans#. Hntroducimos el 3apel de #iltro (2) cassete en la cu%eta con el panel negro mirando "acia el 2em%rana cBtodo(negro). @ 9umergir previamente los estropa.1.visi%le.65 4ris 2=m2 7 1/. y a.=l para un Western (1l para la cu%eta y 6.e este a 256m+. 3ara conservar el gel se sumerge en 026 destilada.) 3anel negro .= ml de metanol. $Western Blot. p0 E F.2='.o )ue el gel (manipular en todo momento con muc"o cuidado. Cubeta con transfer buffer. Gnodo (7)3anel %lanco &stropa.Bndola completamente por las dos caras.o CBtodo (.o de los 256 m? (unos 56. &s esta%le 1 mes a 4. 8el 3apel de #iltro (2) &stropa. &)uili%rarlo un m!nimo de 56 minutos en transfer buffer.ado. ya )ue Dste volatili-a.5 (F. ► &s importante no a. un m!nimo de 56 minutos.adir Dste en el momento de usarlo. 9umergir en el transfer buffer y mantener en agitación a /ºC "asta el momento de usarla.F.e del cassete. 9e puede reali-ar una #oto en el transiluminador colocBndolo so%re el convertidor de lu. a /ºC y en agitación (o toda la noc"e a /ºC sin agitación) Membrana. y )ueremos )ue el inicio todo el monta. Gel. @ 3ara eliminar las %ur%u.e por de%a. a mem%rana de nitrocelulosa o &+&.= ml de Bcido acDtico 7 12./ g 8ly 1>2m2 7 266ml de metanol 7 a#orar con 02: destilada "asta 1l.*? en lu. &n#riar destapado y sin conectar a la #uente "asta )ue %a. $ 3reparación del transfer buffer. Composición (1l): 5.

+ y en agitación 1". Hntroducir la mem%rana en un recipiente lo mBs pe)ue.+ y en agitación 1". DETECCIÓN ECL @ Como precaución.4Meen 6. 1 noc"e) o una trans#erencia rBpida (apro'. 0emos de usar una dilución 1:=6666 (en solución de %lo)ueo).$ 9e puede reali-ar una trans#erencia lenta (apro'. 1eciclar el colorante. como se descri%e arri%a))ue conservamos a . 9e le puede dar un vortex y un spin.61L: 2 lavados rBpidos 7 5 lavados de 16 minutos en agitación.61L Hncu%ar con el anticuerpo primario a 4.ustar el p0 a C. 1") +m%as se reali-an a /ºC y en agitación. $Blo)ueo de la mem%rana. +. 3reparación de la solución de %lo)ueo: +gitar el tarro con polvo del Kit &C( y preparar una dilución al 2L en 4B9. &liminar cuidadosamente. cam%iar el recipiente. $ 4inción de la mem%rana con 1o. 1:1666: 1 μl anticuerpo7 />> μl 02: estDril 7 />> μl de glicerol FCL. . 2arcar con lBpilas %andas del patrón.4Meen 6. $ este.== g de 4ris7 >g de NaCl 7 F66 ml de 02:. 0emos de usar una dilución 1:166666 (en solución de %lo)ueo) &l volumen a utili-ar sigue los mismos criterios )ue para el anticuerpo primario. 9e reali-a a partir de una dilución previa (1:1666.e (m+) Hnicio Nin ≈ 40 ≈ 60 ≈ 230 ≈ 330 el anticuerpo.ir con 4B91' en agitación "asta )ue la mem%rana estD completamente deste.61L. 9e reali-a a partir de una dilución previa (1:1666))ue conservamos a . 3reparamos el volumen m!nimo indispensa%le para cu%rir la mem%rana (en placas de 16cm: Fml.I (con 0Cl). ya )ue tra%a. 3reparación de 4B9 16' (1l): I6.26ºC. $Hncu%ar con el anticuerpo secundario a 4. $ (avar en 4B9. o %ien durante 1" a 4. = minutos.amos con volJmenes tan pe)ue.ida.4Meen 6.e (?) (enta I6 1Bpida 166 Jltimo lavado para no diluir +mpera. en los portas: 5ml)9e le puede aplicar un vortex y un spin.+ en agitación. ademBs de aspirar %ien la solución antes de cam%iar de etapa. &liminar cuidadosamente con una pipeta el e'ceso tras el $ ?olta.adir la solución de %lo)ueo.os. +#orar a 1l.o posi%le y a.o 3ounceau. +gitar 1= minutos en el agitador magnDtico. 3uede incu%arse o %ien toda la noc"e a /ºC. $ 1eali-ar 2 lavados rBpidos en 4B9.26ºC. 3reparación de 1666 μl.

o la lupa para controlar )ue no eliminamos las cDlulas. $ +.ido aspirando con pipetas 3asteur con la punta estrec"ada.adir y eliminar las di#erentes soluciones %a. .5 veces (siempre )ue continJe amarilla)Normalmente %asta con 1ml. N+asa H.B y de. $ 9ecar %ien la mem%rana e introducir entre las 2 lBminas de una ca. $ +. 3B9c atemperado.o "ay )ue "acer una dilución 1:166 en 3B9.2=L (='). $ +temperar a 4. $ (avar en 4B9.al con 1 minuto de e'posición. 2&2.adir unas gotas de una me-cla de in"i%idor de tripsina: N+asa H (6. 9e usa 6. Hncu%ar a 5CºC. @ 9e pueden eliminar los anticuerpos de la mem%rana y volver a usarla.eras. Compro%ar al microscopio )ue la tripsini-ación "a #uncionado. 3ara ello: $ Hncu%ar la mem%rana en stripping solution a =6ºC y en agitación.in"i%idor de tripsina. 3uede usarse 2.a para pel!culas. @ (a tripsina comercial )ue usamos va en solución con & 4+.4Meen 6. 56.1mlOcm 2 de mem%rana. +. ti.1mgOml) 3reparamos 2 ml )ue despuDs congelaremos. pipetas pulidas al #uego. 3ara preparar 1ml me-clamos: >>6μl 3B9 7 16 μl N+asa H. (a N+asa H se reconstituye a una concentración de 16mgOml en 0 2:. &s importante eliminar las meninges. $ 3oner so%re un tro-o de papel secante Parafilm y so%re Dste la mem%rana (no "a de estar seca).ar actuar = minutos controlando )ue la distri%ución sea uni#orme.adir la solución +./6 minutos. pero "emos de a.2=L.1eali-ar 2 lavados en 3B9. N12 7 B2C atemperado. 16 minutos.+ las soluciones + y B del Kit &C(. tripsina 6. %ote con &t:0 y algodón. $ isección de la corte-a cere%ral del em%rión. 1eciclar la solución y guardar a /ºC.1L $ 1epetir el protocolo de detección &C( empe-ando con 1" de %lo)ueo.adir tripsina 6.46. &n la cBmara oscura e'poner en papel de radiogra#!a (suele dar se. 2e-clar en una proporción 1:1 en un vial tapado con papel de aluminio.@ &s importante )ue el tiempo de incu%ación no e'ceda el indicado para el anticuerpo secundario para )ue no "aya demasiado ruido de #ondo.ustar el tiempo)1evelar en la mB)uina de 1P. $ 1eali-ar 2 lavados de 16 minutos con gran cantidad de 4B9. 9eparar en palium y subpalium. SIEMBRA DE NEUROES ERAS PRIMARIAS $ Hntroducir en la campana: lupa. placas. 3ara o%tener la concentración de tra%a. pin-as. $ isgregar rBpida y suavemente el te. @0emos de a.61L: 2 lavados rBpidos 7 5 lavados de 16 minutos en agitación.

$ Ni. pasar a un tu%o Nalcon. en una cantidad m!nima para )ue impregne las cDlulas (y as! no manipular para retirar el e'ceso) Hncu%ar a 5CºC.o: tripsina 1'. 1"56 minutos. 16 minutos.e celular y sem%rar a una densidad de =666 cDlulasO 1. a.N12 de la siguiente manera: resuspender en 5. 9uele tardar unos 1= minutos en disolverse. "omogenei-ar.B9+ si es para una inmuno#luorescencia con pero'idasa) $ Hncu%ar con el anticuerpo primario diluido en cBmara oscura y "Jmeda a 4. 16 minutos a /ºC.o./ml de 2&2. 9ecar (al aire. $ +. 3reparar la dilución adecuada para sem%rar a una densidad de 16 5 cDlulasO ml teniendo en cuenta el volumen a sem%rar. .adir tripsina. $ 1esuspender en 1. INMUNO LUORESCENCIA DE CULTI!O CELULAR @ 1eali-amos la #i. @ 9e puede sem%rar so%re un porta para #acilitar los posteriores tratamientos. $ +.adir 2&2 7 B2C y el in"i%idor de tripsina (opcional) $ 1eali-ar un conta. 2ml de 2&2 7 B2C.ación: cu%rir con 3N+ /L en 3B9. $ (avar con 3B9 (el volumen depende del diBmetro de la placa): 3ipetear el 3B9 so%re un lateral de la placa cuidadosamente.adir el 3B9 y agitar con el agitador magnDtico (unas 266 rpm.$ 3asar a una nueva placa y reali-ar 2 lavados con 2&2. Compro%ar )ue la tripsini-ación "a #uncionado. tapado para )ue no se contamine) durante = minutos.ar )ue llegue a "ervir.ación y los primeros lavados en campana. 1eali-ar un conteo celular. centri#ugar con el 31 (/ minutos). 9e "a de usar a /ºC. @ (a preparación del 3N+ /L.N12. )ue depende de la placa (3ocillos de placa multipocillos: 1. $ &liminar el medio de cultivo.N12 7 B2C y 3B9 en el %a. in"i%idor de tripsina (1mgOml) @ &liminar todos los l!)uidos sin aspirar con %om%a de e'tracción (con propipeta) %a. y eliminar. resuspender. $ 1eali-ar 5 lavados de 16 minutos cada uno con 3B9 (en 3B9.o la lupa para no eliminar las cDlulas ya )ue estBn en semisuspensión. lo m!nimo para )ue el pese mueva) y en calor (apro'. y #uera del %a. 1=6ºC) "asta su completa disolución sin de.3B9 se "a de reali-ar en campana en todo momento y con guantes. $ &liminar el medio vie.+. 3reparamos =6ml (2g 3N+ 7 =6ml de 3B9)3esar el 3N+.o a 5CºC.I ml). 3asar a un tu%o Nalcon. (a siem%ra puede reali-arse en un pocillo con un porta al #ondo para #acilitar los tratamientos posteriores.= ml. SIEMBRA DE NEUROES ERAS SECUNDARIAS $ +temperar 2&2.

@ (a "umedad es importante cuando tra%a. del cual no verteremos todo el volumen en el creador de gradientes. Nestina (progenitores) y tu%ulina (neuronas)se usan a una dilución 1:=6 en 3B9.as. @ 9i "ay cristales mBs grandes los ponemos .=cm: 266μl) $ 1eali-ar 5 lavados de 5 minutos cada uno con 3B9 en oscuridad. )ue preparamos a partir de una dilución 1:2 en glicerol. depende del tama. @ (os polimeri-adores (en primer lugar 4&2& y luego +39) no se a. as! la 3+ )ue )uede nos servirB como control. o toda la noc"e a /ºC a oscuras.9e preparan en un tu%o Nalcon.5" a 4. &l volumen.untos detrBs.ugado con una sonda #luorescente (antira%%it con rodamina. $ 3reparación del gel separador.+ 1odamina (tetrametilrodamina isocianato) Qa%sE ==6 nmR QemE=C6nm. &l gradiente va del =. por lo )ue preparamos una dilución 1:166.+ durante 1". e. (os disponemos en la cu%eta de la siguiente manera: cristal cuadrado.etar con 2 pin-as. @ Compro%ar )ue las tiras y sus peines son del mismo grosor. 4apar la cu%eta (con silicona grasa en la tapa y en la goma) y su. cristal con "endidura. 4ras el Jltimo eliminar el e'ceso con una pipeta para no diluir el anticuerpo secundario. $ Hncu%ar con el anticuerpo secundario con. 4ras el Jltimo eliminar el e'ceso con una pipeta. dos tiras en los e'tremos derec"o e i-)uierdo. $ 2ontar con gelvatol a oscuras.os. como siempre. tras ello se me-cla suavemente sin "acer %ur%u.ar )ue el medio se e)uili%re 2. en cBmara oscura y "Jmeda a 4. 3reparamos los geles al =L y al 26L.aden "asta el Jltimo momento.amos con volJmenes muy pe)ue. PREPARACIÓN DE GELES DE POLIACRILAMIDA EN GRADIENTE $ 9e preparan > geles.B9+1L.o del porta (3laca de 5. &l volumen depende del tama.= cm: 266μl) $ 1eali-ar 5 lavados de 5 minutos cada uno con 3B9 en oscuridad. @ 0ay )ue usar guantes p) la poliacrilamida es tó'ica. (impiar > pares de cristales para geles con acetona y papel.B9+1L. .26L. 1:1666 en 3B9. +le'a /FF) diluido 1:266.o de la placa (5. Normalmente usamos una dilución 1:266.

&l creador de grad. $ &liminar el iso%utanol por decantación.adimos 0 26 destilada. con una pipeta apro'.= ml 566 μl C= μl 1= μl ?olumen totalE 8el /L 02: destilada 3oliacrilamida 1F ml 5. 1 ml de iso%utanol (#ase superior) rBpida pero suavemente. &speramos a )ue se "omogeneice. 0ay )ue "acer una dilución 1:16 pOv.as) +.>= ml /.Cuando pase todo el l!)uido rBpidamente apagamos la %om%a.en cada cilindro girando suavemente y compro%ar )ue estB cerrado (llaves de paso estBn verticales) $ Hntroducimos la 3+ =L en el cilindro mBs cercano a la %om%a vertemos y en el mBs le.=2 p0 F. Controlar )ue el l!)uido pasa correctamente. 9e prepara en un Nalcon y se de. se coloca so%re el agitador magnDtico.F 9 9 16L 3ersul#ato amónico(+39) 4&2& 8el =L 1I. . 9on necesarios unos 2 ml $ Conectar el creador de gradiente a la %om%a y la %om%a a la cu%eta (con una pin-a preparada sin apretar). con un pe.= ml 566 μl C= μl 1= μl 8el 26L 2. (impiar el circuito: llenamos los cilindros de 0 2: destilada.F 9 9 16L 566 μl +39 C= μl 4&2& 56 μl 3reparación de +39.1 ml +39 7 1ml 02: destilada.2= ml 1>. +%rimos las 2 llaves y enc"u#amos la %om%a. 3ara preparar 1ml: 6.o el tu%o de la %om%a y enc"u#ar "asta )ue pase todo el l!)uido.a un poco de l!)uido sin verter.F ml C. +. movemos un poco y la eliminamos por decantación. (a solución se distri%uye so%re los geles con una pipeta.?olumen totalE 56 ml 02: destilada 3oliacrilamida 4ris. "asta )ue el l!)uido so%repase el cristal. colocar una vaso de precipitados %a.=2 p0 C.amos )ue polimerice durante unas "oras.>= ml C. $ 3reparación del gel concentrador.adimos a lo largo de cada gel.ano la 3+ 26L.= ml I. 0Cl 1.>I ml 4ris.0Cl 6. e. +%sor%er con papel de #iltro grueso. pin-amos la goma )ue va de la %om%a a los geles y la retiramos de la %om%a (es importante )ue no entren %ur%u. Compro%ar )ue la goma de la %om%a estB limpia.

$ 2antener 16 minutos en "ielo. $ Centri#ugar 16 minutos a mB'ima velocidad a /ºC.166 (1L)7 2=> μl 4C+.0Cl 6. $ isolver en /= μl de 4ris.$ Hntroducir los peines "umedecidos con +39("aciendo coincidir el %orde superior con el cristal con la "endidura) 4apar y de. $ Conservamos el so%renadante. y le a. esec"ar el so%renadante.adimos: 15> μl de 4riton P. )ue pasamos a otro vial. PRECIPITACIÓN DE MEDIO RECOMBINANTE PARA PAGE. &liminar el so%renadante. $ 9e reali-a a partir de 1 ml de medio de cultivo. anotando la #ec"a. &nvolver los geles en papel "Jmedo y guardar en la nevera. 1epetir. cu%riendo los viales para )ue no se contaminen. $ e.26ºC). 9N. Centri#ugar = minutos. $ isolver el pellet en 1 ml de acetona (. $ Centri#ugar 16 minutos a mB'ima velocidad a /ºC.=2 p0 F(o en 26 μl si lo )ueremos concentrar mBs) .ar polimeri-ar unas "oras.ar secar 16 minutos al aire.

2 g de %icar%onato sódico (Na0C:5) $ Hntroducir en la campana: matra.adir Na:0 16N $ &n campana a#orar con el resto de 02: "asta 1l. $ Hntroducir en un tu%o para centri#ugar unos 5 ml de medio.+. &nc"u#ar la %om%a.de 1l. •9i p0 T C.12 0am.o a 5CºC el tiempo .me-clar el %icar%onato. $ +gitar a C=6 rpm "asta su completa disolución y a.5 a.o a 5CºC y el anti%iótico (penicilinaO estreptomicina)a 4.adir =6ml de NC9 16Li a travDs del #iltro.PREPARACIÓN DE MEDIO DE CULTIVO DMEM-F12 HAM 3rotocolo 9igma para la preparación de 1l de ul%ecoSs modi#ied &agleSs medium nutrient N. en el %a. +rrastrar con un poco de 026 posi%les restos de 2&2.5.C. #rasco de 2&2 y 02: estDril apirógena comercial. &n el matra.=l autoclavados.usto para )ue se descongelen.C.5 a. C=6 ml de 0 2:.22μm.2. $ Con una pipeta 3asteur o%turada pasar un poco de medio del tu%o al vial de cDlulas descongeladas. 2 #rascos de 6. durante apro'.2.adir 0Cl 1N U9i p0 V C. . 2e-clar suavemente e introducir la suspensión en el tu%o de centr!#uga. 2&2 y apro'. $ 3esar 1. 1= min.2. Nec"aW +coplar el #iltro a la otra %otella y #iltrar =66 ml de medio. $ +temperar 2&2 7 NC9 16Li 7 3enO9trep. +. $9acar las cDlulas del congelador y mantenerlas en el %a.o a 5CºC. 4apar y rotular: W 2&2 7 NC9 16L 7 3enO9trep . +coplar a una %otella el #iltro con el tu%o de la %om%a. Nec"aW DESCONGELACI"N DE C#LULAS PARA SU SIEMBRA @ Normalmente se reali-a con 2 viales (m!nimo para e)uili%rar la centr!#uga y mB'imo para )ue el proceso no sea muy lento) @ (a descongelación y la centri#ugación "an de "acerse muy rBpidamente.ustar el p0 a C. ya )ue el 29: usado en la congelación es nocivo para las cDlulas. el anti%iótico. una pro%eta y un #iltro de 6. $ Hntroducir en la campana: NC9 16L. %icar%onato. $ +temperar el NC9 16L inactivo en el %a. y = ml de penicilinaOestreptomicina con una pipeta a travDs del #iltro.C. Niltrar =66 ml de medio (medido previamente con la pro%eta)4apar y rotular: W 2&2.

o de la placa y de si son o no recom%inantes (placas de 16 cm: FmlR recom%inantes: I ml) TRIPSINI'ACI"N DE CULTI!OS @ *samos la tripsina para despegar a las cDlulas. $ Centri#ugar con 31 (166rpm. @ &n a)uellos pasos en los )ue "aya )ue aspirar. distri%uir %ien e incu%ar a 5CºC.as. &l volumen óptimo depende del tama. &l o%.Nec"aY +. @ 9i la tripsina (.amos con neuroes#eras no usamos la %om%a de e'tracción. +.a escurrir la placa ligeramente inclinada y se vuelve a aspirar) @ 9i )ueremos recoger el medio y usarlo para la siem%ra de cDlulas. RENO!ACI"N $% RECOGIDA& DE MEDIO DE CULTI!O 9e reali-a cada 2 d!as para eliminar cDlulas muertas. @ Normalmente se reali-a con 2 placas simultBneamente. $ +. . / min.+. +. sino )ue eliminamos el l!)uido con propipeta y %a. 3reparamos tu%os con 1ml de tripsina y >ml de 3B9. 4.+) $ 3reparar 2 placas por cada vial y rotular XNom%re.etivo puede ser tanto multiplicar cultivos con#luentes. $ +.NC916L.9N si pretendemos recoger el medio de cultivo. lo pasamos a un tu%o Nalcon.o o con medio. $ +temperar en el %a. se de. si tra%a.o la lupa para no eliminar las cDlulas )ue estBn en semisuspensión.adir C ml de medio a cada una. 9e puede lavar con 3B9 1'. )ue es de F ml).con medio vie. (a tripsina comercial es 16'.@ 0ay )ue ir con precaución para no "acer %ur%u. con la precaución de )ue ese medio estD a /ºC en todo momento.o a 5CºC medio nuevo y el 3B9. como unir cultivos con pocas cDlulas.adir 2 ml de medio en cada uno y resuspender las cDlulas con la pipeta.o a 5CºC el medio y el 3B91' y la tripsina a 4.adimos a la placa el volumen necesario de la solución con la )ue vamos a limpiar para )ue no se se)ue y rBpidamente centri#ugamos el tu%o (16 minutos a velocidad mB'ima y a /ºC) 1otular XNom%re y LNC9. 4omaY Congelar a ZF6ºC $ (impiar con =ml de 3B9 (o medio vie.adir el medio nuevo. #ec"a descongelación cDlulas.adir 1ml de la suspensión a cada una de las placas (as! o%tenemos el volumen deseado Zpara placas de 16cm.o o 9N): 3ipetear so%re una pared de la placa. $ +spirar con una pipeta 3asteur el medio )ue )ueremos eliminar con la placa inclinada y sin tocar las cDlulas (tras aspirar una ve-. $ esec"ar el so%renadante de los tu%os centri#ugados.& 4+) es nueva "ay )ue alicuotarla. $ +temperar en el %a. Nec"a recogida. 0omogenei-ar y aspirar con la pipeta 3asteur.

Hncu%ar a 5CºC.ar escurrir y volver a aspirar) $ +.adir 1 ml de la suspensión de cDlulas a cada una de las placas. 29: (=66 μl) $ +spirar el medio de las placas a congelar. pipeta de 1ml.F6ºC.adir 1ml de tripsina.) &liminar el 3B9 con la pipeta 3asteur (de igual manera de. 29: (antio'idante). se conserva a . tu%os de congelación. U9&CCH:N&9 &N 3+1+NHN+.adir 1ml de medio de congelación a cada placa.adimos 2 o 5 ml. @ 9in atemperar a 5CºC. 3lacas de 16cm: Fml. 1ecoger la suspensión. 1etirar el e'ceso. $ +spirar el e'ceso de tripsina con la pipeta. = minutos. $ +. Ni. $ 1otular tu%os de congelación de rosca. . e. para cultivos recom%inantes: =ml) $ +. e. de manera )ue )ueda una pel!cula recu%riendo todo el cultivo.adir medio (1ml menos del volumen #inal deseado.9N. + 5CºC.(avar con B9+ 1LO3B9 (5'16min) $(:pcional)3ara #acilitar el acceso del anticuerpo al ant!genos. • C1H:9&CCH:N&9: 9ecar el corte unos 56min. pasar a un tu%o y Dste a la #iam%rera.9N(C6L). 29: (16L) 3ara =ml: 2&2. +spirar. tripsina 1' atemperada a 5CºC. Calentar a la mB'ima temperatura durante unos 16 minutos citrato sódico p0 I. NC9i (1ml). de medio en cada placa tripsini-ada (con lo )ue la tripsini-ación se detiene).26ºC): 2&2.ar actuar 1 minuto. $ (avar con =ml de 3B9 (p) el medio lleva componentes )ue in"i%en la tripsina.ar con 3N+ /L O3B9.ar actuar 1 minuto. NC9i. INMUNOCITO(U)MICA CON PERO*IDASA $ 9onic "edge"og (ant!geno de mem%rana) $ &l primer paso var!a en #unción del tipo de secciones.=ml). $ &n placas nuevas a. Congelar a . puntas a-ules. 1esuspender las cDlulas.$ &liminar el medio aspirando con la pipeta 3asteur suave y rBpidamente. 16 min. $ (avar con 3B9. /ºC.adir 1 ml de tripsina 1' en cada placa. CONGELACI"N DE CULTI!OS $ Hntroducir en campana: "ielo. #iam%rera de congelación. NC9i (26L). $ 3reparación del medio de congelación (en tu%o Nalcon y en #r!o. sin de. $ +. Compro%ar )ue la tripsini-ación "a #uncionado. @ 3ara multiplicar las placas (1:2 o 1:5) $ +. 1epartir y de.ar escurrir y volver a aspirar. respectivamente. en #r!o: 2&2. Hncu%ar = min.9N (5.ar escurrir. 9e reali-an los siguientes lavados: Pilol (2'16min)R &t:0 166L: 2minR &t:0 >IL: 2 minR &t:0 F6L: 2minR &t:0 C6L: 2minR &t:0 =6L: 2minR 3B9: 2min. 1esuspender con la pipeta.

+.ar actuar 56 minutos a 4. +gitar.612 en un vaso de precipitados.Calcular el volumen ) se necesita segJn el nº de secciones.Iml β. &t:0 >IL (5min). en cBmara oscura y "Jmeda. 3reparar el volumen necesario segJn el nº de secciones. &n el momento de uso: 5ml +BO 0 2: 7 56 ml 4ris.mercaptoetanol.0Cl p0 I. en cBmara oscura y "Jmeda o a /ºC toda la noc"e. en cBmara óscura y "Jmeda. &t:0 166L (=min). 1etirar y de.I 7 0 2: "asta a#orar a I6ml.(a dilución depende del anticuerpo (dom. 3ara F ml: 02: destilada: 5.adir =6[l B.+ (mientras se reali-an los lavados).0Cl 12 p0 C.26ºC. 8uardar en alicuotas de 5ml (un uso)a . =L β. 3reparación de la solución H: ilución del +B comercial (cancer!geno)F1 mg +BO 1=ml 02:.ar > min a 4. &)uili%rar con 3B9.+.+.= ml 3B9 7 =6[l +. 3reparación: >F6 μl B9+1LO3B9 7 1=[l 8oat serum 7 1=[l de goat anti. 2L9 9. 2=μlOsección.6=L+-ul de %romo#enol: 6. $ (avar con B9+1LO3B9 (16min) $ Hncu%ación en el anticuerpo primario (disuelto en B9+1LO3B9)durante /". e.=m2\] 4ris 6. o 2" a 4. $ 3ara "acer la muestra permanente: 1eali-ar los siguientes lavados:0 2: (2'=min).F ml 9 9 16L : 1. +.FR 16L 8licerol.1:=666) $ (avar con B9+1LO3B9 (5'16min) $ Hncu%ación con el anticuerpo secundario. $ Hnactivar pero'idasas endógenas: Hncu%ar 26 minutos con una solución recien preparada: C6ml 2e:0 7 5ml 02:2 (56L) $ (avar con B9+ 1LO3B9 (5'16min) $ Blo)uear con una solución: 1ml B9+1LO3B9 7 166 μl (2 gotas)de Normal goat antiserum. a 4.ir con una me-cla de: 9olución H (I6 ml)7 9olución HH (C2 μl)durante 1= minutos. introducir el porta durantee 1min./ml ER ./ ml 6. $ (avar con 3B9 (=min) $ 4e. 9e usan apro'.mercaptoetanol: 6. &n#riar con 02: durante unos = minutos.=2.F: 1ml 8licerol: 6. Pilol (2'=min)2ontar con histokitt. ra%it Hg. +plicar so%re las secciones.F ml 6.ar 56 minutos a 4.HH. 9e incu%a 1 "ora a 4. toda la noc"e. 9in apartarlo de la #uente de calor.6. $ e.8 %iotinilado (8+1) Calcular el volumen segJn el nº de secciones (2=μlOsección) $ (avar con 3B9 (5'16min) $ 3reparación del reactivo +BC: 2e-clar 2.0Cl p0 I.=2. SAMPLE BU $ 9 9 reducing %u##er: I2. a /ºC.+.+ en cBmara "Jmeda y oscura. 3reparación de la solución HH: =66[l 02: 7 166[l 02:2 56L &l resultado se o%serva al 2.: a partir de los = minutos.

esnaturali-ar a .iluir la muestra con al menos 1:/ con tampón de carga. / min. >=ºC.