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Remerciements

On tient vraiment remercier notre deux chers professeurs Mr khattabi et Mr Elhilali pour leurs efforts, encadrement de toute la classe et spcialement pour lexprience enrichissante et pleine dintrts quelles nous avons fait vivre durant toutes les sances de travaux pratiques de la microbiologie. On les remercie galement pour toute leur soutenance, encouragements et comprhension de tout le monde.

Sommaire

Introduction3 Sance n 1 ........................................................................................................ 2 Mise en vidence de la prsence de microorganismes dans diffrentes biotopes .............................................................................................................. 2 Sance n 2 : Techniques densemencement, disolement ............................. 2 Sance n 3 : coloration de Gram ................................................................... 2 Sance n 4 et 5 : Analyse de leau ............................................................. 2 Conclusion.21

Introduction

La microbiologie est une sous-discipline de la biologie consacre l'tude des microorganismes. Autrement dit cest la science ayant pour objet ltude des microbes (micros : petit, bios : vie) .Ce terme englobe sans distinction tous les micro-organismes vivants. Les micro-organismes constituent un monde, fait dunits cellulaires vivantes, vastes et complexes. Cette considration est due au lien entre ces tres vivants et les maladies. Le dveloppement de visualisation a permis de connatre les donnes structurelles, mtaboliques et les diverses actions de ces micro-organismes. Dans nos sances de travaux pratiques, on a essay dappliquer et dterminer quelques importantes oprations pour pouvoir mieux comprendre la microbiologie : La premire sance a eu comme grand titre : la mise en vidence de le prsence des microorganismes dans diffrentes biotopes, puis dans la deuxime sance on a vu les diffrentes techniques densemencement et disolements, dans la troisime on a tablit la coloration Gram et dans la quatrime et cinquime sances, on a bien fait une analyse deau. En suite de notre rapport on va essayer de bien dvelopper et expliquer toutes ses expriences et tablir les diffrents rsultats de chacune de ces oprations.

Sance n 1 Mise en vidence de la prsence de microorganismes dans diffrentes biotopes

I. Le but de la manipulation
Introduction gnrale sur les manipulations de microbiologie et leur intrt. Dapprendre, manipuler dans des conditions striles. De faire connaissance avec les formes vivantes microscopiques. De prouver leur existence dans les diffrents milieux naturels.

II. Matriels

Les tubes essai

Bec Bunzen

La boite de ptri

Ltaleur

Autoclave

lanse

III. Mode opratoire Prparation du milieu de culture


Un milieu de culture est un support qui permet la culture de cellules, de bactries, de levures, de moisissures afin de permettre leur tude. En principe, les cellules trouvent dans ce milieu les composants indispensables pour leur multiplication en grand nombre, rapidement, mais aussi parfois des lments qui permettront de privilgier un genre bactrien ou une famille.

La composition du milieu de culture

Glucose Extrait de viande Peptone Agar Eau distille

source de carbone et ATP=10g Source des protines Source dazote 10 g solubiliser le milieu.15g source deau.1000ml

La procdure de prparation
On pse des quantits suivantes: Glucose..4g Extrait de viande.......4g Peptone..4g Agar...6g

On les met dans 400 ml deau distille On chauffe le mlange jusqu' bullition sur une plaque chauffante. On le met dans lautoclave pour la strilisation (pendant 20 min lautoclave) Aprs refroidissement on fait couler le milieu de culture dans des boites ptri.

Mise en vidence de la prsence de microorganismes dans diffrents biotopes


a. sur le corps humain
A laide dun antiseptique, on lave notre main et ensuite on touche la surface du milieu nutritif glose et on rpte lopration avec la main pralablement lave leau de robinet puis lincubation des boites ptri 30 C pendant 24 h.

b. sur lobjet
On touche la surface du milieu nutritif par notre stylo et on fait lincubation 30 C pendant 24 h

Rsultats et interprtations
Aprs incubation pendant 24 h une temprature de 30C Eau de robinet : prsence de certaines microorganismes a renseigne sur la potabilit de leau de point de vue microbiologique, puisque cest une exigence daprs les normes ; Antiseptique : moins de prsence des microorganismes quavec leau distille Stylo : prsence des microorganismes

Sance n 2 : Techniques densemencement, disolement

1- Techniques de lensemencement
Lensemencement consiste dposer dans un milieu neuf des germes prlevs dans un milieu de culture mre. Le transport est en gnral effectu avec une anse ou une pipette Pasteur.

1 / Ensemencement avec une anse


prendre les prcautions ncessaires pour travailler dans de bonnes conditions daseptie (nettoyage paillasse, mains ...) veiller travailler dans la zone strile autour du bec Bunsen tenir le tube contenant la culture mre dans la main gauche, dboucher prs de la flamme et garder le coton dans la main. flamber louverture du tube. striliser lanse en le portant au rouge dans la flamme du bec Bunsen, la laisser refroidir dans la zone strile. prlever et repiquer rapidement dans le tube contenant le milieu de repiquage : repiquage dans un milieu liquide : repiquer ce qui est prlev lintrieur de la boucle repiquage sur milieu solide : repiquer en dplaant en zig zag laiguille sur la surface de lagar, du fond du tube vers louverture, en prenant soin de ne pas rafler la glose repasser dans la flamme laiguille ensemencer en le portant au rouge. Laiguille est prte pour un nouvel ensemencement. flamber louverture des tubes, flamber lgrement les cotons, boucher.

2 / Technique d'ensemencement avec la pipette Pasteur


Les manipulations se diffrencient des prcdentes par quelques dtails : la pipette est passe rapidement dans la flamme. l'effilure est casse la pince dans la zone strile. on aspire les bouillons de culture (viter que le bouillon de culture souille le coton, danger d'infection pour le manipulateur, pas plus que la salive du manipulateur, danger d'infection pour la culture) on souffle pour ensemencer dans le tube strile. la pipette ne sert qu'une fois
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2- Techniques disolement
Pour tudier les microorganismes, il est indispensable de les isoler et d'en faire une culture pure. Deux techniques sont alors utilises : La mthode des stries La mthode des dilutions

1) Mthode des stries

Cas d'un ensemencement en surface partir d'un prlvement liquide ou solide :


prendre les prcautions habituelles pour un ensemencement (nouvrir que le temps ncessaire l'excution des stries et n'entrebailler alors la boite que devant un bec Bunsen) porter l'anse au rouge dans la flamme du bec, la laisser refroidir dans la zone strile et avec l'autre main entrouvrir la boite de culture (solide) ou le tube (liquide) prlever une colonie ou une goutte de suspension avec l'anse, refermer la boite ou le tube et prendre la boite vierge ensemencer de la faon suivante :

partir de 1 en ensemenant selon le sens des flches jusque vers 2. Flamber l'anse, la laisser
refroidir et repartir perpendiculairement la direction prcdente 1-2 jusque vers 3.

les boites de Ptri sont mises en position renverse l'tuve 30C. Observer aprs 24 48
heures selon le cas (la position renverse permet l'eau de condensation de svaporer).

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Rsultats obtenus
Aprs lincubation 30 C :

2) Mthode des dilutions :


Cas d'un ensemencement en surface par talement d'un milieu liquide :
Cette technique permet, aprs un talement sur milieu solide, d'valuer le nombre de colonies par ml de suspension. Elle peut permettre galement, si l'on ne dispose pas de lame numration, la dtermination du nombre de cellules par unit de volume ou du nombre de cellules prsentes dans une colonie. les dilutions sont faites dans de l'eau distille ou dans un liquide physiologique de type Ringer numroter des tubes essai de 1 10, chaque tube contient 1 ml de liquide de dilution dans le tube 1, l'aide d'une pipette strile, ajouter 0.1 ml de la suspension fournie, rincer la pipette trois fois. homogniser par aspirations successives et souffler la dilution 1, en prlever 0.1 ml et verser dans le tube 2. Ainsi de suite jusqu' l'obtention de la dilution n10.

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Fabrication de l'taloir en verre la flamme d'un bec Bunsen, plier la partie capillaire environ la moiti de sa longueur de faon en faire un angle de 120 procder de mme pour plier la moiti le segment prcdent de faon ce qu'il fasse un angle aigu replier de la mme faon l'extrmit vers le haut sur un demi-centimtre environ l'taloir est maintenu dans un flacon d'alcool dposer sur une boite de Ptri contenant un milieu nutritif glos, 0.1 ml de chacune des dilutions indiques taler avec l'taloir de faon uniforme par un mouvement de balayage et de rotation sur l'ensemble de la surface de la glose (ne pas ratisser la surface de la glose). laisser scher les boites 10 min, les dposer ensuite l'tuve, aprs les avoir retournes, observer 24 heures plus tard. compter les colonies apparues aux dilutions de 3-300 colonies, faire la moyenne des chiffres obtenus en ramenant tout la mme dilution. Evaluer alors le nombre de colonies par ml de suspension donne.

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Sance n 3 : coloration de Gram

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1- La coloration de Gram
Cest la coloration de base en bactriologie qui permet de distinguer les bactries en Gram positif et en Gram ngatif, cette distinction est fondamentale pour leur identification. En effet, le violet de gentiane se fixe sur des composants cytoplasmiques et aprs ce temps de coloration, toutes les bactries sont violettes. Chez les bactries Gram ngatif, la paroi, riche en lipides, laisse passer l'alcool (ou le mlange alcool + actone) qui dcolore le cytoplasme alors que, chez les bactries Gram positif, la paroi constitue une barrire impermable l'alcool et le cytoplasme demeure color en violet.

2- Ractifs
Violet de gentiane phnique Lugol (iodo-iodure de potassium) Alcool 95% (ou mlange alcool absolu+ 1/5me dactone) Safranine (ou Fuchsine phnique de ziehl)

3- Mode opratoire
1. Raliser un frottis et le fixer la flamme 2. Verser le Violet de Gentiane sur la lame ; laisser en contact 1 minute 3. Jeter le colorant et finir de la chasser par la solution de Lugol ; laisser agir le Lugol environ 1 min 4. Jeter le Lugol et faire couler de lalcool sur la prparation ; rincer immdiatement leau 5. Recouvrir la prparation de Safranine, laisser agir environ 1 min. laver abondamment. 6. Scher au dessus de la flamme dun bec Bunsen.

4- Rsultats
A lissue de cette coloration, on peut distinguer : Des bactries colores en violet fonc ; elles ont gard le violet, le gram elles sont dites Gram positif ; Des bactries colores en rose ou rouge ple ; elles ont perdu le violet, le Gram elles sont dites gram ngatif.

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Sance n 4 et 5 : Analyse de leau

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1-Introduction
Leau tant destine la consommation humaine particulirement, doit satisfaire aux normes de qualit de leau potable, afin de vous assurer de la qualit de leau que vous consommez, vous pouvez soit consulter des sources fiables soit faire lanalyse bactriologique votre eau par des laboratoires danalyse. Afin damliorer la sant publique, toute eau est destine la consommation humaine, y compris celle contenue dans les puits individuels, des prlvements deau sont tout de mme ncessaires pour pratiquer une analyse bactriologique qui sera soumise une procdure stricte. Pour que leau soit considre comme potable, elle doit rpondre un certain nombre de critres : Qualit microbiologique suffisante, avec en particulier absence de bactries pathognes. Qualit chimique suffisante : les ions minraux doivent tre des concentrations comprises entre certaines valeurs fixes rglementairement.

2-Les milieux utiliss


Milieux liquides contenant du lactose Milieux solides contenant du lactose

Deux catgories de milieux sont distinguer suivant leur effet : Milieu non inhibiteurs Milieu slectif

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3-Isolement et identification
Test biochimiques pour la caractrisation des entrobactries
Milieu citrate de Simmons Ce milieu est un exemple de milieu synthtique, c'est dire de milieu dont la composition, qui est complexe, est connue exactement tant qualitativement que quantitativement

Aspect du milieu avant utilisation

Aspect du milieu aprs utilisation

Mode densemencement

Caractres recherchs

Rsultats

La pente est ensemence par une strie longitudinale, ralise l'anse, partir d'une suspension de la culture solide en eau distille strile. Il est important de ne pas apporter de substrats carbons. Ainsi l'ensemencement partir d'une souche pure fournie en bouillon nutritif ou en eau peptone est impossible. Mettre l'tuve pendant une semaine 37C

Utilisation du Pas de virage de citrate comme l'indicateur de seule source de pH : il n'y a pas carbone eu alcalinisation et le milieu ne prsente pas de culture. La souche est citrate de Simmons

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Eau peptone
Aspect du milieu avant utilisation Aspect du milieu aprs utilisation Mode densemencement Caractres recherchs

Rsultats

ensemencer le milieu liquide Incuber pendant 24h 37C

L'addition de ractif de Kovacs montre la production d'indole par un anneau rouge.

Apparition dune coloration rouge qui introduit la prsence dindole

Milieu Shigella-Salmonella La fermentation du lactose se traduit par une teinte rouge de la colonie La production dH2S se traduit par un noircissement du centre de la colonie
Aspect du milieu avant utilisation Aspect du milieu aprs utilisation Mode densemencement Caractres recherchs Rsultats

Isolement par la Le milieu contient mthode des du lactosepouva nt tre ferment. cadrans. Le milieu Incuber 18 24 contient du thiosulfate h 37C pouvant donner du H2S

Colonie rouge signifie la fermentation de lactose Pas de centre noir : H2S Pas de production de H2S

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Milieu Hajna-Kligler Le milieu de Hajna-Kligler est un milieu complexe, qui permet la recherche de plusieurs caractres biochimiques. Il est trs utilis dans l'identification des Enterobacteriaceae.

Aspect du milieu avant utilisation

Aspect du milieu aprs utilisation

Mode densemencement

Caractres recherchs

Rsultats

Ensemencer abondamment la surface par stries serres ou par inondation, puis le culot par simple piqre, l'aide de la mme pipette boutonne. Mettre l'tuve 24h 37C

Utilisation du glucose Utilisation du lactose Production H2S Production de gaz Recherche de la LDC

Bactrie de type fermentatif du glucose et lactose + : culot jaune et pente jaune.

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Mannitol-mobilit Ce milieu permet ltude de la dgradation du mannitol qui est un produit de dgradation du mannose
Aspect du milieu avant utilisation Aspect du milieu aprs utilisation Mode densemencement Caractres recherchs Rsultats

Ensemencer par piqre centrale laide dun fil droit. Incuber 24 h 37C R : ce milieu est utilisable uniquement pour les bactries fermentatives

Mannitol Mobilit Nitrate rductase

Caractre mannitol milieu jaune :

Mannitol +

Identification des bactries


Daprs la table ci-dessous, on dduit que ces caractres biochimiques correspond celles des caractres de E.colis. Caractre Bactries E.colis Citrobactrie Klebseila Entrobacter Shigella Salmonella LACTOSE GLUCOSE + + + + +++ + + + + H2 S + + INDOLE + + ++CITRATE MOBILITE + + + +++ + +
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Conclusion

Les micro-organismes sont des tres vivants de tailles microscopiques (invisible lil nu). Il sagit de trois grands groupes : les protistes les bactries les virus Et pour conclure, on peut dire que La microbiologie concerne ltude dorganisme trs nombreux et trs vari, cest pourquoi seul les espces dintrt mdical ou industriel sont tudies, cela veut dire que de trs nombreuses espces restes peu connues ou mme inconnues.

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