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Bioquímica Experimental I Licenciatura em Bioquímica 2º Ano/1º Semestre

Separação e Análise de componentes celulares por centrifugação diferencial

Turma: PL3 Grupo: 3 Alunos: Alexandre Cirilo, nº 41875 Inês Silva, nº 41698 Joana Leandro, nº 41863 Patrícia Marques, nº 42629

Índice

Resumo.......................................................................................................................................... 3 Materiais....................................................................................................................................... 4 Tratamento dos Resultados .......................................................................................................... 5 Doseamento de proteínas pelo método do biureto com desoxicolato .................................... 7 Fração mitocondrial – Determinação da atividade do succinato: citocromo c oxidorreductase ................................................................................................................................................. 10 Fração lisossomal – Determinação da atividade do fosfatase ácido ...................................... 13 Distribuição dos marcadores enzimáticos estudados ............................................................. 19 Análise da Fração Nuclear - Isolamento do DNA: ................................................................... 22 Conclusão .................................................................................................................................... 25 Bibliografia .................................................................................................................................. 26

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Resumo
Nesta atividade laboratorial, foi realizada a separação de frações celulares (fração nuclear, mitocondrial, microssomal e solúvel/citosólica) a partir de um homogenato de fígado de porco. Na preparação deste último foi necessário recorrer a um homogeneizador de Potter-Elvehjem, por centrifugação diferencial a uma velocidade cada vez maior, sendo, desta forma, possível separar as várias frações celulares do tecido. Após as centrifugações sucessivas, obtiveram-se pellets correspondentes à fração nuclear, aos mitocôndrios “pesados” e “leves” e à fração solúvel/citosólica, as quais, posteriormente foram analisadas através do espetrofotómetro de UV-Vis, sendo obtidos os valores de absorvência. Na determinação da atividade do succinato desidrogenase, de forma a analisar a presença de atividades enzimáticas características da fração mitocondrial, analisou-se, durante alguns minutos, a variação das absorvências das frações após a adição de succinato de sódio e de citocromo c. Na determinação da atividade enzimática do fosfatase ácido, de maneira a comprovar a presença dos lisossomas, mediram-se as absorvências após 10 minutos de reação. O método do Biureto foi utilizado de forma a determinar a concentração proteica em cada uma das frações, de maneira a determinar as atividades especificas dos enzimas presentes nas mesmas. Por fim, foi realizada uma análise à fração nuclear de forma a isolar e avaliar assim a pureza do DNA. As absorvências foram medidas em dois comprimentos de onda: 260 e a 280 nm.

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Materiais
1. Preparação do homogenato de fígado de rato e centrifugação diferencial Os materiais utlizados nesta fase foram um homogeneizador de PotterElvehjem para romper as membranas celulares e soltar o conteúdo celular para o meio de isolamento. Utilizou-se, também, tubos de centrífuga, papel de filtro e uma supercentrífuga refrigerada. 2. Determinação da actividade do succinato: citocrómo c oxireductase O material usado para esta parte do procedimento é um espectrofotómetro UV-Vis e cuvettes de plástico. Estas cuvettes têm uma absorvência desprezável no comprimento de onda em que se pretendia trabalhar. 3. Determinação da actividade do fosfatase ácido Tal como no procedimento experimental anterior, o material utilizado foi um espectrofotómetro UV-Vis e cuvettes de plástico. 4. Doseamento de proteínas pelo método do biureto com desoxicolato Como material foi utilizado o espectrofotómetro UV-Vis e cuvettes de vidro. 5. Análise da fracção nuclear – isolamento do DNA Utilizaram-se cuvettes de quartzo e o espectrofotómetro UV-Vis.

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Tratamento dos Resultados
Os componentes subcelulares apresentam diferentes tamanhos e densidades. Estas diferenças são as responsáveis pela possibilidade de usar a centrifugação diferencial para separar os diferentes componentes. Embora estes valores (tamanho e densidade) não sejam iguais de célula para célula, é possível estabelecer um intervalo para cada organito.

Fonte: Protocolo experimental: Separação e Análise de Componentes Celulares por Centrifugação Diferencial, página 5.
Quadro 1: Variações típicas no tamanho e na densidade dos componentes subcelulares.

Segundo este quadro, os fragmentos de membrana plasmática são os primeiros a sedimentar, de seguida os núcleos e como ultimo os mitocôndrios. Esta conclusão tem como base o tamanho dos organitos, visto que, o meio em que as partículas se encontram tem menor densidade que as partículas. Quanto maior o tamanho das partículas mais rápido estas sedimentam. Na centrifugação, a velocidade e o tempo de centrifugação são os dois fatores importantes para a forma como a separação ocorre.

Fonte: Protocolo experimental: Separação e Análise de Componentes Celulares por Centrifugação Diferencial, página 4.
Imagem 1 – Centrifugação diferencial de um homogenato celular.

Na primeira centrifugação, 1 000 x gav durante 10 minutos, o pellet 1 corresponde á fração nuclear, que contêm os núcleos e restos de células, que sedimentaram em primeiro 5

lugar. Na centrifugação 2, 3 000 x gav durante 10 minutos, o pellet é uma fração mitocondrial, composta por mitocôndrios, perossixomas e lisossomas. Na centrifugação 3, 10 000 - 15 000 x gav durante 20 minutos, o pellet é uma fração microssomal, composta por ribossomas livres, polissomas e pequenas vesiculas provenientes do retículo endoplasmático e do complexo de golgi. O sobrenadante final, S3, tem a fração solúvel ou citosólica composta que contêm pequenos organitos e as proteínas solúveis. No entanto, as partículas de pequenas dimensões, que se encontrem perto do fundo do tubo de centrifuga, sedimentarão ao mesmo tempo que as de maior massa e, as de grandes dimensões podem arrastar partículas de outros tamanhos, dando origem a pellets impuros e heterogéneos. Antes de centrifugar, pesou-se o fígado a homogeneizar, para calcular o volume de meio de isolamento que se adicionava:   10 mL de meio de isolamento/ g de fígado m(fígado) = 16,6898 g

Adicionou-se, então, aproximadamente 166,898 mL de meio de isolamento para as correspondentes g de fígado medidas.

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Doseamento de proteínas pelo método do biureto com desoxicolato
O método do biureto é um dos métodos mais rápidos e mais utilizados para dosear a quantidade de proteínas existente numa determinada amostra, ocorrendo formação de um complexo de cobre com as ligações peptídicas (complexo de cor violeta). O número de ligações peptídicas que são estabelecidas pode ser quantificado por espetrofotomeria UVVis. Foi utilizada uma curva-padrão de forma a determinar o intervalo em que se pode aplicar a lei de Lambert-Beer, para posteriormente se calcular as concentrações das diferentes frações. Com uma solução de BSA de concentração conhecida, prepararam-se dez tubos de ensaio de acordo com o seguinte quadro: Tubo BSA 5mg/mL (mL) H2O (mL) Biureto com desoxicolato (mL) 0 0.00 1.00 2.00 1 0.05 0.95 2.00 2 0.10 0.90 2.00 3 0.20 0.80 2.00 4 0.30 0.70 2.00 5 0.40 0.60 2.00 6 0.50 0.50 2.00 7 0.60 0.40 2.00 8 0.80 0.20 2.00 9 1.00 0.00 2.00

Quadro 2: Curva-padrão do doseamento proteico pelo método do biureto com desoxicolato

Após serem medidas as absorvências foram obtidos os seguintes resultados: Amostra 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 0.033 0.053 0.078 0.120 0.169 0.217 0.261 0.306 0.387 0.469 Ensaios, Abs540 nm 2 0.037 0.058 0.081 0.122 0.175 0.220 0.269 0.310 0.392 0.470 Média 3 0.044 0.067 0.092 0.133 0.174 0.224 0.265 0.320 0.394 0.472 0.038 0.059 0.084 0.125 0.173 0.220 0.265 0.312 0.391 0.470 mProteína (mg) 0.00 0.25 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 4.00 5.00

Quadro 3: Valores da Absorvência medidos para a curva-padrão

A partir dos valores obtidos em casa ensaio calculou-se a média: Exemplo para a amostra 0: µ= (=) µ = (=) µ = 0.038 7

Procedeu-se da mesma forma para as restantes soluções. Calculou-se a massa de proteína presente em cada uma das amostras, procedendo-se da seguinte forma: Exemplo para o tubo 1: c= ( =) m = c x V c = 5 mg/mL m = 5 x 0,05 = 0,25 mg

A partir da média dos valores das absorvências registadas e a massa calculada de proteína presente em cada tubo, foi possível traçar a reta de calibração:
0,6

0,5

y = 0,0876x + 0,0406 R² = 0,9978

0,4

Abs540nm

0,3

0,2

0,1

0 0 1 2 3 4 5 6

mproteína (mg)
Quadro 4: Curva de calibração de doseamento de proteína pelo método do biureto

A reta obtida é do tipo y = mx + b, em que y corresponde ao valor de absorvência a 540 nm e o x representa a massa de proteína.

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Cálculo da massa de proteína presente na fração:

Sendo a reta obtida, do tipo y = mx+b; onde y representa o valor de absorvência a 540nm e x, a massa de proteína (em mg); é possível calcular a massa de proteína presente na fração por substituição das variáveis pelos valores obtidos experimentalmente.

 Exemplificação para a amostra de Homogenato:

y = 0,0876x + 0,0406 0,0876x = y – 0,0406 x=

x=

x ≈ 0,347 mg

Amostras Homogenato Pellet 1 Pellet 2 Pellet 3 Sobrenadante 3

Absorvência 540nm 1 2 3 0,071 0,076 0,063 0,16 0,067 0,055 0,062 0,074 0,07 0,057 0,234 0,073 0,077 0,087 0,113

Média Abs 0,071 0,067 0,07 0,073 0,087

m (mg) [Proteína] (mg/mL) 0,347 2,776 0,301 2,408 0,336 1,792 0,37 1,973 0,53 2,826

Quadro 5 – Homogenato e frações com os respectivos valores de absorvência a 540nm, média das absorvências, massa de proteína presente em cada fração (em mg) e concentração proteíca (em mg/ml).

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Fração mitocondrial – Determinação da atividade do succinato: citocromo c oxidorreductase
Na centrifugação, o pellet obtido para a fracção mitocondrial contém mitocôndrios, peroxissomas e alguns lisossomas. Para analisar a existência de actividade enzimática do succinato desidrogenase na fracção mitocondrial, considerou-se a cadeia respiratória e o ciclo do ácido cítrico, vias metabólicas muito importantes. A oxidação do succinato a fumarato, no TCA, é catalisada pelo enzima succinato desidrogenase. Este enzima faz parte dos complexos II e III da cadeia transportadora de electrões, segundo a reacção global:

Succinato + (cyt c.Fe3+)2 → Fumarato + (cyt c.Fe2+)2 + 2 H+

Utiliza-se o KCN para impedir a re-oxidação do citocrómo c a nível do complexo IV (citocromo oxidase). A determinação da actividade enzimática a realizar consiste na medição espectrofotométrica da redução do citromo c pelo succinato, isto é, seguir a redução do citocromo c pelo aumento da absorvência a 550 nm ao longo do tempo.

Tabela 2 – conteúdo das cuvettes para a determinação da actividade do succinato

Reagentes Tampão de fosfatos (pH 7,2) 10 mM Solução de Citrocomo c 1mM Solução de KCN 0,3 M Amostra Solução de sucinato 0,5 M

Vreagente (µL) 2000 80 7,5 50 40

Vtotal (mL)

2,1775

Observação: Os reagentes foram adicionados segundo esta ordem.

Após a preparação das cuvettes, mediu-se as absorvências das amostras a 550 nm. A água foi utilizada como zero do ensaio.

O aumento da absorvência ao longo dos 60 segundos demonstra que o enzima succinato desidrogenase está a catalisar a reacção de oxidação do enzima. O Declive da recta traçada a partir do gráfico da absorvência em função permite-nos calcular a velocidade inicial da reação. Observação: Para exemplificar, utiliza-mos os valores do homogenato.
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Absorvência a 550nm do homogenato ao longo de 60s
0,68 0,66 0,64 Absorvência 0,62 0,6 0,58 0,56 0,54 0 10 20 30 40 50 60 Tempo (segundos) y = 0,002x + 0,5466 R² = 0,9963

Como os valores de absorvência lidos neste ensaio estão dentro dos limites da lei de LambertBeer, entre 0,1 e 1,5, não foi necessário diluir as fracções. V0 = 0,002 x 60 = 0,12 UA/min

Pela lei de Lambert-Beer: Em que c é a concentração molar (M), é o percurso óptico (cm) e é o coeficiente de absorção molar (M-1 cm-1). Neste caso, (citocromo c) = 21 000 M-1 cm-1. (Fonte: Protocolo experimental: Separação e Análise de Componentes Celulares por Centrifugação Diferencial, página 23).

Para calcular volume inicial em mol/min utiliza-se o volume total das cuvettes calculado anteriormente: Volume = 2,1775 mL

Conversão de mol/min para nmol/min: 1,243 x 10-8 x 109 = 12,43 nmol/min

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Os tubos de ensaio continham 50 µL de cada fracção. Calculo da actividade enzimática:

Actividade total do enzima corresponde à actividade do volume total do homogenato: 41 516,2 U

Amostra

Volumet (mL) Homogenato 167 Pellet 1 20 Pellet 2 16,7 Pellet 3 16,7 Sobrenadante 3 16,2

∆Abs550/∆t (min-1) 0,12 0,066 0,084 0,138 0,0006

Actividade (U/mL) 248,6 152,4 169,845 283,07 1,24

Actividade (U) 41516,2 3048 2836,41 4727,34 20,15

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Fração lisossomal – Determinação da atividade do fosfatase ácido
No processo de centrifugação diferencial, os lisossomas, organitos notoriamente heterogéneos em relação ao seu tamanho, co-sedimentam com outros organitos, ficando, deste modo, dispersos por várias frações. Nos lisossomas, encontram-se inúmeros enzimas envolvidos na degradação de biomoléculas, daí a sua relativa importância na organização celular. Através de um enzima específico, o fosfatase ácido, conseguimos determinar a presença dos lisossomas nas amostras recolhidas, recorrendo à espetrofotometria de UVVis. Este mesmo enzima é responsável pela hidrólise das ligações éster de fosfato de forma não específica. Sendo assim, vários compostos que possuem grupos fosfato terminais são aptos para serem usados como substrato. Neste trabalho, recorremos ao p-nitrofenilfosfato (pNPP), um substrato artificial, incolor. O pNPP, aquando da hidrólise pelo fosfatase ácido, resulta na produção de pnitrofenol (pNP), um composto amarelo, sendo possível a sua determinação por métodos espetrofotométricos, e na libertação de fosfato inorgânico (Pi).

Figura 1 - Reacção do p-nitrofenilfosfato (pPP) a p-nitrofenol (pNP), catalizada pelo fosfatáse ácido.

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Para o doseamento da atividade do fosfatase ácido, adicionaram-se os reagentes apresentados no Quadro 6.

Reagente
Fração (mL) Fração diluída 1/10 em H2O (mL) Desoxicolato de sódio 0,5% (m/v) (mL) Tampão acetato de sódio (pH 5,0) 0,5M (mL) pNPP 10mM (p-nitrofenilfosfato) (mL) NaOH (hidróxido de sódio) (mL)

Tubo Vtotal (mL) A B 0,1 - 0,1 0,2 0,2 4,0 0,2 0,2 0,5 0,5 3,0 3,0

Quadro 6 – Conteúdo das cuvettes para o doseamento da atividade do fosfatase ácido.

É importante referir que foi, também, preparado um tubo controlo, igual aos anteriores mas em que o volume de fração celular é substituído por água. Após ter sido efetuada a preparação das amostras segundo o Quadro 6, mediram-se as absorvências dos vários tubos a 400 nm, usando o conteúdo do tubo controlo como branco. Como o tubo de controlo só contém os reagentes, necessários para a determinação da atividade do fosfatase ácido, e água, o valor de absorvência obtido nos diferentes tubos corresponde ao valor de absorvência das amostras, sendo o valor das absorvências dos reagentes naturalmente excluídos.

Tubo A Homogenato B A Pellet 1 B A Pellet 2 B A Pellet 3 B A Sobrenadante 3 B
Quadro 7 – Abs400.

Amostra

Abs400 0,521 0,010 0,364 -0,020 0,157 -0,035 0,698 -0,003 0,298 -0,031

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Os valores de absorvência nulos e negativos não devem ser tidos em conta, sendo desprezados nos cálculos. Como era esperado, os valores de absorvência dos tubos A são superiores aos dos tubos B, devido, certamente, à diluição efetuada numa razão 1/10, em água, pelo que, no espetrofotómetro, o número de fotões que colidem com as moléculas da amostra é menor. Isto resulta, assim, em valores de absorvência significativamente menores nos tubos B do que os que foram obtidos nos tubos A. No cálculo da concentração das amostras, podemos recorrer à Lei de Beer-Lambert, dado que os valores de absorvência obtidos encontram-se entre 0.1 e 1.5, onde a lei é linear, logo, aplicável.

A=εlc

   

A – Absorvência ; ε – Coeficiente de absorção molar ; l – Espessura da cuvette (distância atravessada pela luz no objecto contendo a amostra); c – Concentração da substância absorvente.

Desta forma, era esperado um valor superior nas amostras de homogenato, o que foi verificado através da observação do Quadro 7, apenas no tubo B. Dado que o pellet 3 apresenta um valor de absorvência, no tubo A, superior ao do tubo equivalente, no homogenato. Em seguida, supostamente, no pellet 3, seria observável o segundo maior valor de absorvência, devido ao facto de se tratar da fração mitocondrial, ou seja, onde se encontram os mitocôndrios, lisossomas e peroxissomas. No entanto, só se verifica isto para o tubo B, sendo que o pellet 3 apresenta o maior valor de absorvência no tubo A. O menor valor de absorvência, em ambos os tubos (A e B), foi verificado no pellet 2. Principalmente, devido ao facto de ser neste que se encontra a fração mitocondrial “pesada”, pelo que a maior parte deposita-se no fundo da cuvette, diminuindo, assim, a probabilidade de um fotão incidir com uma molécula da amostra, logo, o valor de absorvência resultante será menor relativamente aos valores de absorvência obtidos nas outras amostras. O sobrenadante 3 corresponde à fração solúvel ou citosólica, isto é, a parte solúvel da célula, contendo proteínas solúveis (incluindo um grande número de enzimas tais como lipases ou transaminases) e outras moléculas de pequenas dimensões. Os valores de absorvência obtidos para o mesmo, em ambos os tubos (A e B), são relativamente baixos, quando comparados com os outros. Teoricamente, os valores de absorvência obtidos para o sobrenadante 3 já eram esperados, dado que na fração citosólica não devem existir lisossomas. O pellet 1, por sua vez, corresponde à fração nuclear. Portanto, nesta amostra, encontram-se, muito provavelmente, núcleos, contendo o material genético, e alguns restos

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de células que sofreram rutura parcial ou não chegaram a sofrer rutura, e ainda, fragmentos de membrana plasmática.  Exemplificação dos cálculos para a amostra de homogenato, não diluída, isto é, no tubo A:

= = ≈ 0,0521 min-1

Abs400nm = 0,521

U (Unidade enzimática) – Neste caso, determina a quantidade de enzima que catalisa a formação de 1 µmole de pNP por minuto (µmole/min).

Para calcular a atividade enzimática em U/mL:

Vreacção =
Atividade (U/mL) = vreacção x Vcuvette

Recorremos à Lei de Beer-Lambert:

Abs = Ɛlc

ΔAbs = Ɛ Δc l

Δc =

Ɛ

ƐpNP = 21 000 M-1 cm-1

Determinação da concentração da amostra:

c=

Ɛ

c=

c ≈ 2,481x10-5 M

No nosso trabalho, dado que os valores obtidos para as absorvências no tubo A estão abaixo de 1, podemos considerá-los nos cálculos, sendo desprezados os do tubo B. No entanto, caso seria preciso recorrer aos valores de absorvência deste mesmo tubo B, teríamos que multiplicar o valor da concentração obtido por 10, visto que as amostras encontram-se diluídas numa razão 1/10.

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Cálculo da velocidade de reação:

Vreacção =

Vreacção =

x

Ɛ

M min-1

Vreacção = 0,0521 x

Vreacção ≈ 2,481x10-6 M min-1

Cálculo da atividade do fosfatase ácido: Atividade (U/mL) = (vreacção x Vcuvette)/(Vfração na cuvette) Atividade (U/mL) =

É de salientar que a molaridade do coeficiente de absorção molar é expresso em mol L-1, logo, para converter de mol para µmole, é necessário multiplicar por 106. Deste modo, obtém-se:

Atividade (U/mL) =

Atividade (U/mL) ≈ 0,09924 U/mL

Cálculo da atividade total: Atividadet (U) = Atividade (U/mL) x Vtotal da fração Atividadet (U) = 0,09924 x 167 Atividadet (U) ≈ 16,573 U

Amostra Homogenato Pellet 1 Pellet 2 Pellet 3 Sobrenadante 3

Volumet (mL) 167,0 20,0 16,7 16,7 16,2

Diluição ΔAbs400 0,521 0,364 0,157 0,698 0,298

ΔAbs400/Δt (min-1) 0,0521 0,0364 0,0157 0,0698 0,0298

Atividade (U/mL) 0,09924 0,06933 0,02990 0,13295 0,05676

Atividade total (U) 16,573 1,3866 0,4994 2,2194 9,1951

Quadro 8: Fração lisossomal - determinação da atividade do fosfatas ácido

Os lisossomas têm dimensões semelhantes às dos outros organitos celulares e são heterogéneos, obtendo-se, deste modo, pellets heterogéneos. Alguns lisossomas que se 17

encontravam perto do fundo do tubo da centrífuga podem ter sido arrastados por moléculas de maiores dimensões, sedimentando. A atividade enzimática permite inferir a quantidade de enzima presente numa dada amostra. Se o valor obtido for bastante elevado, isso traduz-se numa grande quantidade de enzima presente nessa amostra em estudo. Através da observação do Quadro 8, verifica-se uma atividade notoriamente elevada no Homogenato e no Pellet 3. Sendo esperado, teoricamente, que tal acontecesse. Dado que se trata da fração mitocondrial no Pellet 3, contendo os lisossomas, mitocôndrios e peroxissomas, tal como foi anteriormente explicado. A elevada quantidade de fosfatase ácido presente no Pellet 3 deve-se, muito provavelmente, ao facto da maioria dos lisossomas sedimentarem e a quantidade relativa de outros organitos ser menor, isto é, existem menos contaminantes.

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Distribuição dos marcadores enzimáticos estudados
Cálculo da massa da proteína:

mproteína = [proteína] x Volumet

Exemplificando para o Homogenato: mproteína = 2,481x10-5 x 167,0 mproteína ≈ 4,143 x 10-3 mg

Cálculo da actividade específica: Atividade específica (U/mg) =

Exemplificando para o fosfatase ácido no homogenato: Atividade específica (U/mg) = Atividade específica (U/mg) ≈ 4000 U/mg

Amostra mproteína (mg) Homogenato 4,153 x 10-3 Pellet 1 3,466 x 10-4 Pellet 2 1,248 x 10-4 Pellet 3 5,551 x 10.4 Sobrenadante 3 2,299 x 10-4
Quadro 9: Massa das proteínas nas diferentes amostras.

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Amostra Homogenato do fígado de rato Pellet 1 Pellet 2 Pellet 3 Sobrenadante 3

Volumet (mL) 167,0 20,0 16,7 16,7 16,2

[proteína] (mg/mL)

Succinato: citocrómo c oxidoreductase Atividade Atividade específica (U/mL) (U/mg) 248,857 3048 169,875 283,07 1,244 10030511 175879976 5110559,56 8515944,64 87667,17

Atividade do fosfatase ácido Atividade Atividad específica e (U/mL) (U/mg) 0,09924 0,06933 0,02990 0,13295 0,05676 4000 4000,57 900 3999,7 4000

2.481 x 10-5 1.733 x 10-5 7.476 x 10-6 3.324 x 10-5 1.419 x 10-5

Quadro 10: Valores das actividades enzimáticas e específicas, volume total e concentração proteica das diferentes amostras

Os valores de actividade obtidos na tabela acima exemplificada são extremamente improváveis pelo que não podemos concluir nada.

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Comparando os resultados obtidos para cada amostra e para cada marcador enzimático verifica-se que, na amostra de homogenato, a quantidade de mitocôndrios foi muito superior à quantidade de lisossomas, dado que a actividade específica do enzima succinato desidrogenase, para uma menor concentração proteica, foi muito superior à actividade específica do enzima fosfatase ácido. O mesmo se verificou para o sobrenadante 3 e pellet 2. Devido ao explicado anteriormente acerca do pellet 1, pode-se inferir que nesta amostra predominavam os lisossomas em relação aos mitocôndrios. Excepto para esta amostra, verifica-se que a actividade do enzima succinato desidrogenase foi superior à do fosfatase ácido, indicando que nas restantes amostras a quantidade de mitocôndrios foi superior à de lisossomas. A centrifugação diferencial realizada não teve a eficácia esperada, obtendo-se amostras heterogéneas e com alguns contaminantes. A maioria dos contaminantes surgiu no sobrenadante 3, pois, teoricamente, esperava-se que estas amostras não contivessem lisossomas ou mitocôndrios. Deste modo, pode-se concluir que na separação dos mitocôndrios, os resultados experimentais não correspondem aos previstos, pois não se obteve uma maior percentagem destes nos pellets 2 e 3. Para o caso dos lisossomas, os resultados experimentais corresponderam ao previsto porque, apesar de se ter obtido estes organitos em todas as frações, verificou-se uma maior quantidade no pellet 3. Apesar de não se ter obtido uma separação total dos lisossomas, houve uma separação parcial, ao contrário do que se obteve para os mitocôndrios. Como referido, a presença de lisossomas noutras frações pode ter ocorrido por organitos de menores dimensões serem arrastados, durante a centrifugação, pelos de maiores dimensões. Para se fazer uma melhor separação dos componentes celulares, poder-se-ia recorrer a outro tipo de centrifugação ou complementar esta centrifugação com outra para se obter pellets menos heterogéneos, explorando-se as diferenças de tamanho e densidade dos componentes celulares.

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Análise da Fração Nuclear - Isolamento do DNA:

Diluição 1/10 Abs260nm Abs280nm Abs260nm Abs280nm 2,201 1,117 1,132 0,553
Quadro 11 – Valores de absorvência (260nm e 280nm), com e sem diluição.

Com o intuito de calcular a concentração de DNA, registou-se os valores de absorvência em dois comprimentos de onda, a 260 nm e 280 nm. A escolha destes comprimentos de onda justifica-se pelo facto de, em primeiro lugar, ser verificado um valor de absorvência máximo das moléculas a 260 nm e, a 280 nm, ser verificado um valor de absorvência máximo para as proteínas, nomeadamente, devido à presença de certos aminoácidos aromáticos, tais como a fenilalanina, a treonina e o triptofano. Para além disso, as leituras de absorvência a 280 nm dão informação acerca do grau de contaminação do Pellet 1. O recurso à diluição 1/10 tem o objectivo de obter valores de absorvência dentro do intervalo de valores em que a Lei de Beer-Lambert é linear, isto é, teoricamente aplicável. Sendo os valores de absorvência das amostras originais, ou seja, sem diluição, desprezados. Para calcular o grau de purificação do Pellet 1, correspondente à fração nuclear na qual se inclui o DNA, recorreu-se aos valores das absorvências a 260 nm e a 280 nm. Para tal, é necessário obter a razão entre estes mesmos valores, dividindo o valor de absorvência a 260 nm pelo valor de absorvência a 280 nm.

Amostra Fração de DNA

[DNA]inicial (mg/mL) 0,566

mDNA (em 20 mL de homogenato) (mg) 11,32

% DNAfigado (m/m) 0,0678 2,047

Quadro 12 – Resultados da análise da fração nuclear.

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Nos cálculos seguintes, considerou-se 1 U.A260 correspondente a uma concentração de DNA de 50 µg/mL.

Cálculo da concentração de DNA (na amostra diluída) em mg/mL:

[DNA]inicial (mg/mL) = ?

Sabemos que 1 U.A260 corresponde a uma concentração de DNA de 50 µg/mL.

Logo, vem: 1,132 U.A260 (diluição 1/10) = 50 x 1,132 = 56,6 µg/mL = 0,0566 mg/mL. Agora, para obter a concentração real, multiplicamos pelo facto de diluição: 0,0566 x 10 = 0,566 mg/mL.

[DNA]inicial (mg/mL) = 0,566 mg/mL

Cálculo da massa de DNA no homogenato (20mL) em mg:

O Pellet 1, correspondente à fração nuclear, foi diluido em 20 mL da solução tamponada Tris-HCl pH (8,0) 10 mM; NaCl 150 mM; EDTA 100 mM.

[DNA] = 0,566 = 11,32 mg

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Cálculo da massa de DNA no fígado:

mfígado = 16,6898 g = 11,32 mg = 0,01132 g

Sabemos que: %(m/m) = x 100 = x 100 = 0,0678 %

Logo, podemos inferir que em cada 100 g, existem 0,0678 g de DNA.

Cálculo da razão entre as absorvências a 260 nm e 280 nm:

=

2,047

A razão entre as absorvências foi de aproximadamente 2,047; um valor perto de 2. Deste modo, podemos inferir que a contaminação de proteínas foi relativamente reduzida na amostra de DNA, dado que este valor encontra-se muito próximo de 2. No entanto, é de salientar que nesta fração existiam restos celulares, consequentes de rupturas parciais ou até que não sofreram ruptura nenhuma e, para além disso, moléculas de RNA que não foram degradas, permanecendo na amostra. Influenciando o grau de pureza do DNA. Para além disso, aquando da centrifugação, é possível que algumas proteínas de menores dimensões que se encontram perto do fundo do tubo da centrífuga podem ter sedimentado. Sendo arrastadas com a fração nuclear, que por sua vez possui moléculas de maiores dimensões. Assim sendo, o grau de pureza é igualmente afectado. Obtendo-se, deste modo, um Pellet impuro.

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Conclusao
Através desta atividade experimental foi possível realizar a separação de organelos celulares, verificou-se que a centrifugação diferencial consiste numa técnica rápida e eficiente. O método do biureto é um método rápido e bastante utilizado para realizar o doseamento de proteínas numa determinada amostra, sendo a sua presença confirmada pela formação de um complexo de cobre, o que confere uma cor violeta à amostra. No doseamento da atividade do fosfatase ácido, os valores das absorvências do tubo A foram superiores aos do tubo B devido à diluição efetuada, o que diminuiu o número de fotões que colidem com as moléculas da amostra. Na análise da fração nuclear, foi obtido uma percentagem de massa total de DNA por massa de fígado de 0.0678%. Dado que amostra está contaminada com moléculas de RNA. De forma a aumentar a eficiência da centrifugação, poderíamos ter realizado um maior número de centrifugações ou, então, após termos suspendido as diferentes frações, realizarmos novas centrifugações. = 2.047, podemos deduzir que a

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Bibliografia
NELSON, L. David, COX, M. Michael., Lehninger, Principles of Biochemistry, 5ª edição, W, H, Freeman and Company, 2008

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