4

0.2, dan 0.4 mL selama 3 hari. Pengambilan sampel darah dilakukan sebelum diberi heparin pada hari pertama dan setelah pemberian heparin selama 3 hari. Perhitungan Dosis Sediaan MP yang biasa digunakan adalah 500 mg, 2 kali sehari. Faktor konversi dari manusia ke tikus adalah 0.018 (Laurence & Bacharach 1964). Jadi, dosis untuk tikus dengan bobot 200 g adalah 500 × 2 × 0.018 = 18 mg/200 g bb/hari = 90 mg/kg bb/hari. Dosis selanjutnya adalah 2 dan 4 kali dosis yang biasa digunakan secara empiris sehingga berturut-turut digunakan dosis pemberian kapsul MP sebesar 90, 180, dan 360 mg/kg bb/hari. MP tidak larut dalam air, maka disuspensikan dalam larutan gom arab 3%. Dosis heparin yang biasa digunakan pada manusia dewasa adalah 5000–7500 unit/mL. Dosis ini dikalikan dengan faktor konversi manusia ke tikus, yaitu 0.018, sehingga diperoleh dosis untuk tikus adalah 135 unit/mL. Sediaan heparin yang ada 5 000 unit/mL (MIMS Indonesia 2008), sehingga diperoleh dosis 0.027 mL per 12 jam atau 0.054 mL per 24 jam. Karena nilai ini terlalu kecil dan sulit untuk aplikasi, pemberian heparin dilakukan 2, 4, dan 8 kali lipatnya, yaitu 0.1, 0.2, dan 0.4 mL. Heparin diinjeksikan secara subkutan (di bawah permukaan kulit) (Waynforth 1980), di daerah tengkuk (Muhtadi et al. 2001). Pengambilan Darah Pengambilan darah dilakukan sebelum perlakuan trombositopenia, setelah 3 hari pemberian heparin, dan selama 5 hari perlakuan. Darah diambil melalui ekor dengan cara sebagai berikut: tikus dimasukkan ke kandang jepit, dipanaskan dengan lampu pijar sekitar 30 menit, kemudian ekornya digunting sekitar 5 mm, darah yang keluar ditampung ke dalam mikrotabung Eppendorf yang telah diisi Na4EDTA secukupnya. Kemudian dilakukan penghitungan jumlah trombosit dalam sampel secara manual. Trombosit dapat dihitung dengan cara langsung dan taklangsung. Pada penelitian ini digunakan cara langsung. Darah yang ditampung ditambahkan larutan Na4EDTA sebagai antikoagulan (1 mg EDTA setara untuk mencegah koagulasi 1 mL darah), lalu diencerkan dengan larutan Rees Ecker (3.8 g Na sitrat, 2 mL formaldehida 40%, 30 mg brilliant cresyl blue, ditambah akuades hingga 100 mL dan disaring), kemudian trombosit

Gambar 1 Fermentasi angkak.

Gambar 2 Kapsulasi MP. Persiapan Hewan Uji Tikus putih SD yang diperoleh dari Fakultas Peternakan IPB berumur sekitar 3 –4 minggu, kemudian dilakukan pemeliharaan untuk adaptasi dengan kondisi kandang di P2 Bioteknologi LIPI selama 4–6 minggu. Bobot badan tikus diamati selama masa adaptasi dan selama masa percobaan. Penentuan kadar trombosit tikus putih SD dilakukan jika umurnya sudah di atas 8 minggu, dengan bobot lebih dari 150 g. Hal ini diperlukan karena ada kelompok tikus yang akan dibuat trombositopenia. Tikus dibagi menjadi 6 kelompok perlakuan seperti terlihat pada Lampiran 4. Kelompok A, B dan C adalah tikus dengan perlakuan trombositopenia lalu diberi kapsul MP dengan dosis berturut-turut 90, 180, dan 360 mg/kg bb/hari. Kelompok D adalah tikus dengan perlakuan trombositopenia lalu diberi Siantan dengan dosis 810 mg/kg bb/hari sebagai kontrol positif (Wiryowidagdo 2004). Kelompok E adalah tikus dengan perlakuan trombositopenia tanpa diberi kapsul MP maupun Siantan sebagai kontrol negatif. Sementara kelompok F adalah tikus yang hanya diberi pakan standar sebagai kontrol normal. Perlakuan trombositopenia berupa pemberian heparin dengan dosis tertentu, yang diperoleh setelah uji pendahuluan, selain pakan standar selama 3 hari sebelum perlakuan. Uji Pendahuluan Tikus sebanyak 9 ekor dikelompokkan menjadi 3 kelompok, masing-masing diberi pakan standar dan heparin dengan dosis 0.1,

5

dihitung dalam kamar hitung. Cairan Rees Ecker diisap sampai garis tanda “1” kemudian dibuang. Darah diisap sampai garis tanda 0.5 dan cairan Rees Ecker sampai 101, lalu dikocok selama 3 menit. Kamar hitung yang telah diisi dibiarkan dalam keadaan mendatar dalam cawan petri tertutup selama 10 menit agar trombosit mengendap. Selanjutnya dihitung semua trombosit dalam seluruh bidang besar di tengah-tengah (1mm2) memakai lensa objektif besar. Jumlah yang diperoleh dikalikan 2000, nilai yang diperoleh merupakan jumlah trombosit per L darah (Gandasoebrata 1969). Penyuntikan heparin dilakukan untuk membuat tikus menderita trombositopenia. Dosis yang digunakan adalah dosis setelah uji pendahuluan, yang dapat menurunkan jumlah trombosit >50%. Paha tikus dibersihkan dengan kapas yang dibasahi alkohol kemudian diinjeksikan secara subkutan/di bawah kulit. Analisis Statistika Analisis statistika dilakukan dengan cara mengolah data jumlah trombosit hewan uji yang diperoleh menggunakan metode rancangan acak lengkap (RAL) dengan model Y ij = + i + ij. i adalah perlakuan dan j adalah ulangan, Y ij adalah pengamatan pada perlakuan ke-i dan ulangan ke-j, adalah rataan umum, i adalah pengaruh perlakuan ke-i dan ij adalah pengaruh acak pada perlakuan ke-i ulangan ke-j. Untuk mengetahui beda nyata antardosis angkak, digunakan analisis varians (Anova) (Matjik & Sumertajaya 2000) Laju peningkatan trombosit ditentukan dengan cara menghitung jumlah trombosit hewan uji pada berbagai dosis MP, kemudian ditentukan dosis optimumnya dibandingkan dengan kontrol positif dan negatif. Sebagai kontrol positif, hewan uji diberi perlakuan obat peningkat trombosit yang telah tersedia di pasaran yaitu Siantan, sedangkan kontrol negatif ialah perlakuan tanpa pemberian kapsul MP maupun Siantan.

No 1 2 3 4 5 6

Tabel 1 Komposisi MP Komposisi Jumlah (mg/g) Lovastatin 17 Lemak 69.4 Protein 253 Serat kasar 115.8 Total karbohidrat 539.7 Statin lainnya 5

Sumber: Lab Biopharmaceutical (2006)

Uji Pendahuluan Uji pendahuluan bertujuan menentukan dosis heparin yang dapat memberikan efek trombositopenia atau menurunkan kadar trombosit hingga di bawah normal. Uji dilakukan terhadap hewan uji yang dibagi menjadi 3 kelompok, masing-masing kelompok terdiri atas 3 ulangan. Dosis yang diberikan untuk kelompok 1 (kode p1) sebesar 0.1 mL/100 g bobot badan, kelompok 2 (kode p2) sebesar 0.2 mL/100 g bobot badan, dan kelompok 3 (kode p3) sebesar 0.4 mL/100g bobot badan. Hasil uji pendahuluan pada Tabel 2 menunjukkan bahwa pemberian dosis 0.2 dan 0.4 mL/100 g bobot badan dapat menyebabkan perdarahan pada hewan uji, bahkan menyebabkan kematian setelah pemberian heparin hari pertama. Satu ekor tikus yang bertahan hidup mengalami pembengkakan yang berwarna biru pada leher bekas suntikan heparin. Tabel 2 Hasil uji pendahuluan Jumlah trombosit setelah pemberian heparin Kode Hari ke-1 Hari ke-2 Hari ke-3
p1.1 p1.2 p1.3 p2.1 p2.2 p2.3 p3.1 p3.2 p3.3 130 000 135 000 235 000 Mati Mati 70 000 Mati 125 000 Mati 80 000 120 000 105 000 Mati Mati 65 000 Mati 110 000 Mati 90 000 65 000 70 000 Mati Mati Leher biru Mati Leher biru Mati

HASIL DAN PEMBAHASAN
Fermentasi Angkak Fermentasi angkak dilakukan untuk mendapatkan sampel MP yang akan digunakan dalam penelitian ini. Adapun kandungan MP dapat dilihat pada Tabel 1.

Trombosit hewan uji mengalami penurunan setelah pemberian heparin hari ke3 untuk dosis heparin 0.1 mL/100 g bobot badan. Dengan dosis ini, tidak terjadi perdarahan seperti 2 dosis lainnya. Karena itu, dosis ini kemudian digunakan untuk perlakuan selanjutnya. Dosis ini sebenarnya masih 2 kali lipat dosis konversi yang diperoleh untuk