0

ISOLASI DAN UJI ANTIMIKROB METABOLIT SEKUNDER EKSTRAK KULTUR JAMUR ENDOFIT AFKR-5 DARI TUMBUHAN AKAR KUNING (Arcangelisia flava (L) Merr)

FAUZI DARMA ANGGRAINI

DEPARTEMEN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2012

ABSTRAK
FAUZI DARMA ANGGRAINI. Isolasi dan Uji Antimikrob Metabolit Sekunder Ekstrak Kultur Jamur Endofit AFKR-5 dari Tumbuhan Akar Kuning (Arcangelisia flava (L) Merr). Dibimbing oleh DUDI TOHIR dan ANDRIA AGUSTA. Jamur endofit yang berasosiasi dengan tumbuhan obat diketahui menghasilkan senyawa metabolit sekunder bioaktif seperti tumbuhan inangnya. Penelitian ini bertujuan mendapatkan metabolit sekunder bioaktif sebagai antimikrob dari jamur endofit AFKR-5 yang berasosiasi dengan tumbuhan akar kuning asal Kebun Raya Bogor. Fraksi metanol ekstrak etil asetat kultur AFKR-5 dalam media kaldu dekstrosa kentang mampu melakukan bioproduksi metabolit sekunder bioaktif F3.4 (10.375 mg/L) dengan faktor retensi 0.30. Uji aktivitas antimikrob dengan metode difusi cakram Kirby-Bauer menunjukkan bahwa F3.4 bersifat antimikrob berspektrum luas terhadap 3 mikrob patogen, yaitu bakteri Gram positif Staphylococcus aureus, bakteri Gram negatif Escherichia coli, dan kapang Candida albicans. Penentuan konsentrasi hambat minimum (KHM) dan konsentrasi bunuh minimum (KBM) dilakukan dengan metode mikrodilusi cair. F3.4 memiliki potensi tertinggi dengan nilai KHM 16 µg/mL terhadap C. albicans, 2× lebih kuat dibandingkan dengan antijamur komersial Nistatin yang hanya bersifat fungistatik dengan nilai KHM 32 µg/mL. F3.4 bersifat fungisidal dengan nilai KBM 32 µg/mL terhadap C. albicans, sehingga berpotensi dikembangkan menjadi antimikrob, khususnya sebagai antijamur.

ABSTRACT
FAUZI DARMA ANGGRAINI. Isolation and Antimicrobial Test of Secondary Metabolites from Endophytic Fungi AFKR-5 Culture Extract Associated with Akar Kuning (Arcangelisia flava (L) Merr) Plant. Supervised by DUDI TOHIR and ANDRIA AGUSTA. Endophytic fungi associated with medicinal plant were known to produce bioactive secondary metabolites similar to its host plant. This study aimed to obtain bioactive secondary metabolites as antimicrobial from endophytic fungi AFKR-5 associated with akar kuning plant from Bogor Botanical Garden. Methanol fraction of ethyl acetate extract from AFKR-5 culture in potato dextrose broth medium was capable to produce the bioactive secondary metabolites F3.4 (10.375 mg/L) with retention factor of 0.30. Antimicrobial activity test using Kirby-Bauer disc diffusion method showed that F3.4 was a broad antimicrobial spectrum on 3 pathogenic microbes, namely Gram-positive bacteria Staphylococcus aureus, Gram-negative bacteria Escherichia coli, and Candida albicans mold. The determination of minimum inhibitory concentration (MIC) and the minimum fungicidal concentration (MFC) were carried out with liquid microdilution method. F3.4 was the most potential with MIC value of 16 µg/mL against C. albicans, twice as stronger than the commercial antifungal Nystatin which was only fungistatic with MIC value of 32 µg/mL. F3.4 was fungicidal with MFC value of 32 µg/mL against C. albicans, so that it is potential to be developed as antimicrobial, especially antifungal.

ISOLASI DAN UJI ANTIMIKROB METABOLIT SEKUNDER EKSTRAK KULTUR JAMUR ENDOFIT AFKR-5 DARI TUMBUHAN AKAR KUNING (Arcangelisia flava (L) Merr)

FAUZI DARMA ANGGRAINI

Skripsi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Departemen Kimia

DEPARTEMEN KIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2012

Judul Skripsi : Isolasi dan Uji Antimikrob Metabolit Sekunder Ekstrak Kultur Jamur Endofit AFKR-5 dari Tumbuhan Akar Kuning (Arcangelisia flava (L) Merr) Nama : Fauzi Darma Anggraini NIM : G44051737 Disetujui Pembimbing I Pembimbing II Drs Dudi Tohir MS NIP 19571104 198903 1 001 Dr Andria Agusta NIP 19690816 199403 1 003 Diketahui Ketua Departemen Kimia Prof Dr Ir Tun Tedja Irawadi MS NIP 19501227 197603 2 002 Tanggal Lulus: .

Kak Sultoni. Pak Didi. seluruh staf laboran. Ibu Dra Yuliasri Jamal. dan seluruh staf LIPI Cibinong. Irma. dan motivasinya. Ungkapan terima kasih mendalam juga rasa sayang ditujukan untuk keluarga terutama Bapak. Pupu Eric Rosady. September 2012 Fauzi Darma Anggraini . Kharisma. Marlia. Dwi. Penghargaan penulis sampaikan kepada Ibu Dr Praptiwi. Kak Asep beserta staf lain dari Lab Biosains-Fitokimia Bidang Botani Puslit Biologi LIPI Cibinong yang telah banyak membantu selama penelitian. MSc. Diah. Ir Widya Rachman. serta teman-teman IPB (Malia. semangat. Satria. Bunda Retno D Lestari. karyawan Komdik Departemen Kimia. Kak Eko. para dosen IPB. Msi atas segala dukungan dan bantuannya. teman-teman Primagama Merdeka Bogor. Bu Hertina. kasih sayang. Dian. para dokter. Ungkapan terima kasih juga disampaikan kepada pihak Puslit Biologi LIPI Cibinong dan Bapak Dr Andria Agusta selaku Kepala Laboratorium Biosains-Fitokimia yang telah mengizinkan dan memfasilitasi penulis dalam melaksanakan penelitian ini. Mas Iim. Penulis mengucapkan terima kasih yang mendalam dan penghargaan kepada Bapak Drs Dudi Tohir. dorongan. puji syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas berkat limpahan rahmat dan hidayah-Nya penulis dapat menyelesaikan karya ilmiah dengan judul Isolasi dan Uji Antimikrob Metabolit Sekunder Ekstrak Kultur Jamur Endofit AFKR-5 dari Tumbuhan Akar Kuning (Arcangelisia flava (L) Merr). Kak Budi Arifin. dkk). teman-teman di Lab Biosains. Dawud. Mama. Bu Aah. Semoga karya ilmiah ini dapat bermanfaat bagi perkembangan ilmu pengetahuan. dan para sahabat atas doa. doa.PRAKATA Alhamdulillah. Prof Putra. Aulia. saran dan solusi kepada penulis selama melaksanakan penelitian dan penyusunan karya ilmiah ini. Diah Paramita. para staf IPB. Penelitian dilakukan di Laboratorium Biosains-Fitokimia Bidang Botani Puslit Biologi LIPI Cibinong. dan semua pihak yang telah ikut membantu atas segala dukungan. MS dan Bapak Dr Andria Agusta selaku pembimbing yang senantiasa dengan kesabaran memberikan arahan. Bogor. dan semangatnya. Vani.

beberapa perlombaan sains. penulis pernah aktif menjadi panitia dan peserta beberapa acara yang diadakan oleh Imasika Departemen Kimia IPB. dan karang taruna. penulis melaksanakan kegiatan praktik lapangan di Puslit Biologi LIPI Cibinong dengan judul Isolasi dan Uji Antibakteri Metabolit Utama Ekstrak Kultur Jamur Endofit GNDP-2 yang Diperoleh dari Tumbuhan Gambir. dan semenjak tahun 2007 sampai sekarang penulis aktif sebagai instruktur Smart. Kementrian Dalam Negeri Republik Indonesia. Pada tahun yang sama penulis juga berkesempatan menjadi peserta Jambore Kebangsaan Nasional di Manokwari. Selain itu. Bulan Juli– Agustus 2008. Semenjak SMA penulis aktif mengikuti organisasi kepemudaan. dan Olimpiade Sains Nasional untuk bidang Kimia pada Tahun 2004. Selama mengikuti perkuliahan. .RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan di Jakarta pada tanggal 7 Agustus 1987 sebagai putri dari pasangan Bapak Darsono dan Ibu Siti Hasanah. penulis pernah menjadi staf pengajar di bimbingan belajar BTA Bogor. Tahun 2005 penulis lulus dari SMA Negeri 2 Depok dan pada tahun yang sama lulus seleksi masuk Institut Pertanian Bogor (IPB) melalui jalur Seleksi Nasional Masuk Perguruan Tinggi Negeri (SNMPTN). Papua Barat yang dilaksanakan oleh Kesbangpol. tim marketing. generasi penerus. staf Petani Center pada Himpunan Alumni IPB. koordinator dan pembuat soal mata pelajaran Kimia di Lembaga Bimbingan Belajar Primagama sektor Bogor.

.........................................................12 DAFTAR PUSTAKA ....................2 Metode ............................................................................................7 Hasil Partisi dan Fraksionasi Ekstrak Kultur Aktif ...8 Aktivitas Antimikrob Fraksi Dominan ............10 SIMPULAN DAN SARAN Simpulan ..........................9 Bioaktivitas Antimikrob Isolat Metabolit Sekunder Dominan Fraksi Teraktif .........................................................................................................................................................................1 BAHAN DAN METODE Bahan dan Alat ...................................................................................................................... viii DAFTAR GAMBAR ............................................................................................................................................................. ix DAFTAR SINGKATAN DAN LAMBANG.........................................................................................................6 Potensi Antimikrob Ekstrak Kultur ................................ viii DAFTAR LAMPIRAN ...........................................................................................DAFTAR ISI Halaman DAFTAR TABEL ............................9 Hasil Isolasi dan Pemurnian Metabolit Sekunder Fraksi Teraktif Ekstrak Kultur ..........................17 .....................x PENDAHULUAN .....................................................4 Hasil Penapisan Metabolit Sekunder Kultur Jamur .................................................................................................................................................................................................................................................................................................2 HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil Kultivasi Jamur Endofit ........................................12 LAMPIRAN ....................................................................12 Saran .............................................................................................................

............................................ albicans (c) ................. S............................... S................................................................... dan C........................................... c..........10 .............DAFTAR TABEL Halaman 1 Rendemen ekstrak kultur AFKR-5 ..........................................4 ...9 11 Profil KLT preparatif fraksi F3 ..........9 10 Profil KLT fraksi F3 dalam ekstrak EtOAc: setelah disemprot VH (a)............ dan C..........................6 5 Zona hambat ekstrak EtOAc kultur AFKR-5 media PDB konsentrasi 100 µg/cakram terhadap E..4 .. dan setelah disemprot CH (g) . aureus (b)................................................8 4 Bobot dan warna fraksi-fraksi pada Gambar 8 .........................................................6 2 Uji aktivitas penghambatan mikrob oleh ekstrak EtOAc kultur AFKR-5 konsentrasi 100 µg/cakram......... dan e) dan hasil partisi MeOH (1) dan n-heksana (2) (b........................................9 5 Aktivitas penghambatan mikrob fraksi dominan ekstrak EtOAc kultur AFKR-5 media PDB ....... setelah disemprot VH (f)....................................................................................6 4 Profil KLT ekstrak EtOAc kultur AFKR-5 media PDB (I) dan GYP (II) ........... coli (a)...................................... fraksi MeOH: orisinal (d)............................5 3 Ekstrak EtOAc kultur AFKR-5 media PDB (a) dan GYP (b) ....................................................... d... dan f) .................8 6 Profil partisi n-heksana-MeOH (1:1) (v/v) ekstrak EtOAc kultur AFKR-5 media PDB ............... coli (a).............................8 8 Fraksi-fraksi ekstrak EtOAc kultur AFKR-5 media PDB fraksi MeOH...8 7 Profil KLT ekstrak EtOAc kultur AFKR-5 media PDB (a.......9 9 Zona hambat fraksi F3 konsentrasi 100 µg/cakram terhadap E..............................5 2 Jamur endofit AFKR-5 dalam media kultivasi PDB dan GYP ......................................... di bawah UV 254 nm (e)........................................................................................................9 6 Diameter daya hambat fraksi F3.......................... aureus (b).................................................7 3 Hasil partisi ekstrak EtOAc kultur AFKR-5 media PDB dengan n-heksanaMeOH (1:1) (v/v) ............. fraksi MeOH (I) dan n-heksana (II) setelah disemprot VH (b) dan CH (c)..................10 12 Profil KLT fraksi-fraksi hasil KLT preparatif F3 ...............11 7 Hasil uji KHM F3........11 DAFTAR GAMBAR Halaman 1 Profil isolat jamur endofit AFKR-5 selama peremajaan pada media PDA .. albicans (c) .........

...................21 6 Hasil penentuan KHM fraksi F3..12 DAFTAR LAMPIRAN Halaman 1 Komposisi dan prosedur pembuatan media............ kontrol positif Kloramfenikol (IIa dan IIb)... pada konsentrasi 100 µg/cakram terhadap: E.......... aureus (b).4 terhadap E............................................10 15 Nilai KHM fraksi F3..............20 5 Profil fraksi-fraksi hasil KLT preparatif F3 ...23 ...............................4 .... dan C......... dan Nistatin (IIc).........................................................13 Fraksi-fraksi hasil KLT preparatif F3 .......20 4 Contoh perhitungan kadar bioproduksi kultur...................................................19 3 Bagan penentuan nilai KHM ............... albicans (c) .................................................................. C... S.......................... coli (a)............................. albicans (c) .10 14 Zona hambat fraksi F3........................................................................ coli (a)..........................................4 (I)............... aureus (b).......4 dan kontrol positif .................22 7 Optimasi penentuan KHM dan KBM fraksi F3.......................................... S....18 2 Diagram alir penelitian .............................................................................

aureus SB UV v/v VH Keterangan Arcangelisia flava (L) Merr ‘akar kuning’ bobot/bobot bobot kering Candida albicans colony forming units Ce(SO4)2 1%/H2SO4 10% corn meal mealt agar ‘agar-agar tepung jagung malt’ diklorometana diameter daya hambat Escherichia coli etil asetat growth control ‘kontrol pertumbuhan’ glucose yeast pepton ‘glukosa-ekstrak khamir-pepton’ konsentrasi bunuh minimum konsentrasi hambat minimum kromatografi lapis tipis laminar air flow ‘lemari aliran udara laminar’ metanol Mueller hinton agar ‘agar-agar Mueller Hinton’ Mueller hinton broth ‘kaldu Mueller Hinton’ gas nitrogen nutrient agar ‘agar-agar nutrien’ potato dextrose agar ‘agar-agar dekstrosa kentang’ potato dextrose broth ‘kaldu dekstrosa kentang’ faktor retensi Staphylococcus aureus Sabouraud broth ‘kaldu dekstrosa Sabouraud’ ultraviolet ‘ultraungu’ volume/volume vanilin-H2SO4 . coli EtOAc GC GYP KBM KHM KLT LAF MeOH MHA MHB N2 NA PDA PDB Rf S. albicans CFU CH CMMA DCM DDH E.DAFTAR SINGKATAN DAN LAMBANG Singkatan A.flava b/b bk C.

obat seriawan. Cara inovatif untuk mengefisienkan sumber senyawa bioaktif adalah dengan memanfaatkan jamur endofit yang berasosiasi dengan tumbuhan obat tersebut. 2007. 2000). Li et al. juga telah dilaporkan pada tumbuhan akar kuning. anti-HIV. Strobel et al. antituberkular (Agusta 2009). Agusta et al. hepatoprotektor (Meistiani 2001. Jamur ini hidup berasosiasi secara simbiosis mutualisme dengan tumbuhan inangnya. dan juga antibiotik (Carrol 1988. anti-HSV-1. Di antaranya. tumbuhan ini telah digunakan untuk mengobati penyakit kuning. Jamur endofit . serta antioksidan dan antikanker (Keawpradub et al. antioksidan (Strobel et al. 1992. jamur endofit dapat memperoleh nutrisi untuk melengkapi siklus hidupnya dari tumbuhan inangnya (Petrini et al. serta dapat mengganggu kelestarian alam jika dieksploitasi secara berlebihan. Jamur endofit menginfeksi tumbuhan sehat pada jaringan tertentu tanpa menimbulkan tanda-tanda adanya infeksi (Bacon & White 2000) lalu menghasilkan enzim dan metabolit sekunder yang bermanfaat bagi fisiologi dan ekologi tumbuhan inang (Tan & Zou 2001. Clay 1988) yang dimanfaatkan tumbuhan inang untuk melawan penyakit yang ditimbulkan oleh patogen tumbuhan. Bacon & White 1994. dan senyawa alifatik. metabolit sekunder 1. 2002. 2009). dan kitinase (Zinniel et al. antiserangga (Azevedo et al. 2000). 1999. Owen dan Hundley (2004) menyebutnya sebagai chemical synthesizer inside plant. Harborne 2006). Hal ini merupakan peluang yang dapat dioptimalkan untuk memproduksi metabolit sekunder secara efisien dan cepat dengan tetap menjaga kelestarian tumbuhan obat. antidiabetes (Zhang et al. Berbagai golongan senyawa metabolit sekunder seperti alkaloid. Simanjuntak et al. Jamal et al. 2002). diisolasi dari jamur endofit AFK-8 yang berasosiasi dengan tumbuhan akar kuning asal Kalimantan (Praptiwi et al. terutama yang sudah dikategorikan langka seperti akar kuning (Setyowati & Wardah 2007). Strobel & Daisy 2003. fenil propanoid. Jamur endofit yang diisolasi dari tumbuhan obat akan memiliki aktivitas senyawa bioaktif yang sama atau bahkan lebih baik dibandingkan dengan tumbuhan inangnya. Akan tetapi. kuinon. antrakuinon.1 PENDAHULUAN Jamur endofit merupakan salah satu golongan mikrob endofit yang paling banyak ditemukan di alam (Strobel & Daisy 2003) dan sumber yang kaya akan metabolit sekunder bioaktif (Tan & Zou 2001). Penelitian sebelumnya telah dilakukan oleh para peneliti Laboratorium Biosains. 1996). Hal ini menguntungkan karena siklus hidup jamur endofit lebih singkat dari-pada tumbuhan inangnya dan dapat diproduksi dalam skala besar dengan menggunakan proses fermentasi. Jamur endofit berperanan penting dalam industri farmasi karena kemampuannya dalam memproduksi senyawa metabolit yang bervariasi. Selain itu. sebagai obat cacing. 1996. Senyawa bioaktif yang berasal dari jamur endofit ada yang berpotensi antimikrob (menghambat pertumbuhan atau membunuh mikrob-mikrob patogen) (Castillo et al. Subeki et al. Neisseria gonorrhoeae. 2005. Strobel & Daisy 2003). 1994. zat pengatur tumbuh (Tan & Zou 2001). dan Staphylococcus aureus (Jamal et al. Zhang et al. terhadap beberapa isolat jamur endofit yang berasosiasi dengan tumbuhan akar kuning. 2003). 2006). 2005). Shigela dysentriae. Agusta 2009). 2008. 1993. Prihatiningtias 2006. Puslit Biologi LIPI. 2011). baik dari struktur maupun fungsinya. Alkaloid protoberberin yang terdapat dalam akar kuning dilaporkan aktif sebagai antibiotik melawan bakteri Gram positif maupun Gram negatif seperti Escherichia coli. 2009. turunan isokumarin. antivirus (Guo et al. flavonoid. dan antimalaria (Lu et al. antikanker (Kumala 2005). peptida. terpenoid.2-diamino-9. Potensi biologis dari jamur endofit lainnya ialah sebagai antiimunosupresif (Lee et al. Castillo et al. Batubara 2003). 2002. 1995). Salmonella typhosa. Simamarta et al. dan di Ambon digunakan sebagai plester pada penyakit cacar (Heyne 1987). Khasiat antimalaria (Kaur et al.10-antrasenadion yang bersifat antibiotik. 1996. Oleh karena itu. 2002). 2000. pengobatan menggunakan tumbuhan obat membutuhkan banyak biomassa dan waktu tumbuh yang lama. Rao 1994). telah diisolasi dan dicirikan dari kultur jamur endofit (Agusta 2009). sehingga diperlukan inovasi yang efektif dan efisien sebagai solusi permasalahan tersebut. selulase. 2006. ligninase (Choi et al. contohnya senyawa taksol (Stierle et al. mikotoksin. Sebaliknya. 2010). 2005). serta penghasil enzim hidrolitik seperti amilase. Diplococcus pneumoniae. karena mekanisme perubahan kimia oleh mikroorganisme sangat mirip dengan yang terjadi pada organisme tingkat tinggi. Owen & Hundley 2004. Bidang Botani. xilanase. Tumbuhan famili Menispermaceae seperti akar kuning (Arcangelisia flava) memiliki aktivitas biologi sebagai antimikrob dan sitotoksik (Dzulkarnain et al.

alat-alat kaca. Penapisan Metabolit Sekunder Kultur Ekstraksi Kultur Filtrat (fraksi air) terlebih dahulu dipisahkan dari miselium (biomassa) dengan kertas saring. serta penentuan konsentrasi hambat dan bunuh minimum (KBM) dan (KBM) metabolit sekunder bioaktif. dan uji antimikrob. inkubator/ penangas air kocok (Kottermann). vanilin-H2SO4. syringe driven filter unit (Miller GP) ukuran 0. Filtrat ditampung dalam labu bulat dan dikering-bekukan kemudian bobotnya ditimbang. UV-viewing cabinet. Penelitian terdiri atas kultivasi isolat AFKR-5 pada media PDB dan GYP. Metode Lingkup Penelitian Tahapan yang dilakukan dalam penelitian ini dapat dilihat pada Lampiran 2.9 mg/L pada media kultivasi PDB (Jamal et al. Oleh sebab itu. agar-agar Mueller Hinton (MHA) (Criterion). antijamur komersial Nistatin (Sigma). Media yang digunakan meliputi agar-agar nutrien (NA) (Difco). penguap putar (Heidolph WB). Media yang telah berisi jamur lalu diinkubasi pada suhu kamar dan kondisi gelap minimum 7 hari.22 µm. reagen Dragendorf. 2011). Komposisi dan prosedur pembuatan media dapat dilihat di Lampiran 1. fraksionasi ekstrak kultur aktif. Seluruhnya diinkubasi di platform shaker pada suhu 27 C dengan kecepatan 120 rpm selama 14 hari.21 g/L) yang sudah steril dan dingin. sedangkan kapang uji yang digunakan adalah kapang patogen Candida albicans ATCC 10231. Ce(SO4)2 1%/H2SO4 10%.2 AFAS. 1 Erlenmeyer lainnya hanya berisi media dan digunakan sebagai blangko.5 × 0. 2009. dan antibiotik komersial Kloramfenikol (Sigma). silika gel 60 (70230 mesh ASTM). pipet. spreader. dimetil sulfoksida (DMSO). ekstraksi hasil bioproduksi kultur AFKR-5. Isolat AFKR-5 dalam agar-agar miring dipotong dengan diameter ± 0. dan kaldu Mueller Hinton (MHB) (Criterion). test tube mixer (Vortex Sibata). Kultivasi Jamur Endofit AFKR-5 (Jamal et al. gas N2. 2009. pelat kromatografi lapis tipis (KLT) silika gel 60 F254 (Merck). mikro- . autoklaf (Hiclave HVE 5. platform shaker (Innova 2100). Kultur dibuat 4× ulangan dalam Erlenmeyer 500 mL. Agusta et al. Miselium dihancurkan dan dimaserasi BAHAN DAN METODE Bahan dan Alat Bahan utama adalah AFKR-5. inkubator. pengering-beku (Eyela FDE 1200). kaldu dekstrosa Sabouraud (SB) (Criterion). salah satu galur jamur endofit AFKR hasil isolasi Dr Andria Agusta dari jaringan akar muda tumbuhan akar kuning asal Kebun Raya Bogor koleksi Lab Biosains-Fitokimia. Bakteri uji yang digunakan adalah bakteri patogen Escherichia coli ATCC 25923 dan Staphylococcus aureus ATCC 25923. pemurnian fraksi dominan teraktif dengan KLT preparatif. Kultivasi Isolat (Jamal et al. glukosa-ekstrak khamir-pepton (GYP). kaldu dekstrosa kentang (PDB) (Difco). dan laminar air flow (LAF). Puslit Biologi LIPI Cibinong. uji aktivitas antimikrob fraksi dominan ekstrak aktif. vorteks. Bidang Botani. pengaduk magnet (Cimarec 3). penelitian ini bertujuan mengisolasi metabolit sekunder bioaktif antimikrob dari kultur jamur endofit AFKR-5 yang berasosiasi dengan tumbuhan akar kuning koleksi Kebun Raya Bogor. Penggalian potensi antimikrob isolat kultur jamur endofit lainnya yang berasosiasi dengan tumbuhan akar kuning perlu dilakukan. uji aktivitas antimikrob ekstrak kultur AFKR-5. 2010) Dua potong inokulum jamur AFKR-5 setelah peremajaan berumur 1 minggu berdiameter ± 0. agar-agar dekstrosa kentang (PDA) (Difco).5 × 0.0 Hirayama). Isolat AFKR-5 selanjutnya diremajakan dalam media PDA 39 g/L. Agusta et al. Alat-alat yang digunakan adalah seperangkat alat untuk ekstraksi. purifikasi. microtiter plate. Bahan kimia meliputi pelarut yang umum di laboratorium.F3 yang berasosiasi dengan tumbuhan akar kuning asal Sukabumi juga dilaporkan memiliki kemampuan untuk memproduksi floroglusinol sebanyak 14. 2010) Peremajaan Isolat Jamur endofit AFKR-5 diisolasi dengan media agar-agar jagung-malt (CMMA) pada keadaan aseptik sampai didapatkan isolat murni kemudian dipindahkan ke dalam media NA atau agar miring.5 cm2 dan dipindahkan ke atasnya.5 cm2 diinokulasikan masing-masing pada 200 mL media PDB (24 g/L) dan media GYP (27.

Uji aktivitas antimikrob dilakukan terhadap ekstrak EtOAc dan fraksi air kultur AFKR-5 pada media GYP dan PDB. 1969).2 mL ke dalam 20 mL media MHA. Aseton digunakan sebagai pelarut dan kontrol negatif. kemudian dikeringbekukan dan ditimbang bobotnya. Fraksi MeOH dan n-heksana masingmasing dikumpulkan dan dipekatkan dengan penguap putar. suhu air bak 30 °C. Bejana pengembang diisi dengan campuran diklorometana (DCM)-MeOH 10:1 (v/v) dan dibiarkan beberapa menit hingga jenuh. 10:1. Bakteri uji dalam media MHB selanjutnya diinokulasi sebanyak 0. coli dan S. Inokulan yang sudah diberi larutan stok diinkubasi dengan suhu 30 C untuk jamur dan 37 C untuk bakteri. yang disemprotkan merata pada permukaan pelat. Uji Aktivitas Antimikrob Ekstrak Kultur Aktivitas antimikrob diuji dengan metode cakram (paper disk) Kirby-Bauer menurut panduan dalam National Committee for Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI 2003. Bercak tertentu akan berpendarflour dan ditandai dengan pensil. diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37 C. vanilin-H2SO4. Eluat yang keluar dari kolom ditampung ke dalam tabung-tabung reaksi dan dipantau dengan KLT. Ekstrak EtOAc disaring dari fragmen miselium lalu dipisahkan dengan corong pisah. masing-masing dengan konsentrasi 10 µg/µL sebanyak 10 µL. Pelat KLT silika gel 60 F254 (Merck) sebagai fase diam dan fase geraknya campuran pelarut DCM-MeOH (10:1) (v/v). Pelat yang disemprotkan pereaksi Ce(SO4)2 1%/H2SO4 10% dan vanilin-H2SO4 dipanaskan di atas penangas hingga timbul warna yang jelas pada bercak. Bedanya stok larutan uji yang digunakan adalah fraksi-fraksi dominan dari ekstrak EtOAc kultur AFKR-5 media PDB. Tabung eluat dan nilai Rf yang sama digabung dan dijadikan 1 fraksi. dan Ce(SO4)2 1%/ H2SO4 10% (Krebs et al. Hasil partisi dipantau dengan KLT. vanilin-H2SO4. Deteksi kemudian dilakukan menggunakan pereaksi pembentuk warna. 15:1. Noda yang muncul diamati di bawah sinar UV pada 254 dan 366 nm lalu disemprot dengan pereaksi Ce(SO4)2 1%/ H2SO4 10%. lalu diletakkan di atas inokulan bakteri atau kapang uji. Setiap fraksi dipekatkan. serta fraksi n- . Lapisan atas (fraksi EtOAc) dipekatkan dengan penguap putar dalam kondisi vakum.3 dengan etil asetat (EtOAc) sebanyak 3×1 L atau sampai miselium tidak berwarna sambil diaduk dengan pengaduk magnetik selama 1 jam untuk setiap ekstraksi. dan Ce(SO4)2 1%/H2SO4 10%. Uji Aktivitas Antimikrob Fraksi Dominan Tahapan uji aktivitas antimikrob sama seperti saat uji aktivitas awal. yaitu C. Metode KLT dilakukan menurut Wall-hausser (1969). Sementara kapang uji yang digunakan. Cakram kertas saring steril ditetesi 10 µL larutan ekstrak uji dengan konsentrasi 10 µg/µL dengan menggunakan mikropipet steril. Partisi dan Fraksionasi Ekstrak Kultur Aktif Ekstrak EtOAc kultur AFKR-5 pada media PDB yang aktif sebagai antimikrob selanjutnya dipartisi dengan n-heksana dan MeOH. Batas pelarut ditandai dengan pensil segera setelah pelat dikeluarkan dari bejana. 2:1. Digunakan sistem isokratik dengan komposisi fase gerak DCM-MeOH (20:1. aureus pada media NA yang diinkubasi 24 jam diambil sebanyak 2 ose kemudian dikultivasi pada media MHB pada suhu 37 C selama 48 jam dalam inkubator bergoyang. Noda yang muncul diamati di bawah sinar UV pada 254 dan 366 nm. kemudian ditimbang bobot keringnya. 1:1) (v/v) dan fase diam silika gel 60 (70230 mesh ASTM). kemudian disemprot dengan pereaksi Dragendorf. Ekstrak ditotolkan pada titik awal di pelat berukuran 3 × 6 cm2. Pereaksi yang digunakan di antaranya ialah Dragendorf. 5:1. Dibuat 3 buah pelat KLT. 3:1. lalu diamati zona hambatnya. Pemisahan kandungan kimia dari fraksi MeOH dilakukan dengan kromatografi kolom. selama 24 jam. Bercak diamati di bawah penyinaran sinar UV 254 dan 366 nm. Pelat dimasukkan ke dalam bejana dan dielusikan sampai batas pelarut atau garis depan mendekati bagian ujung. Kontrol positif ialah Nistatin dan Kloramfenikol sebagai antijamur dan antibakteri komersial. yaitu F3 dan F10. albicans diremajakan pada media SB dan diinokulasi pada media PDA dengan suhu inkubasi 30 C. Bakteri patogen E. masing-masing terdiri atas 1 atau 2 titik penotolan. Analisis Kromatografi Lapis Tipis Ekstrak EtOAc kultur jamur dipantau pada pelat KLT silika gel 60 F254. bila masih mengandung air dikeringkan dengan pengering-beku. 2006) serta Sung & Lee (2007).

4 dilakukan seperti pada uji aktivitas antmikrob awal. 128. Batas pelarut ditandai segera setelah pelat dikeluarkan dari bejana. lalu dari kolom 12 dibuang 0. Hasilnya dibandingkan dengan pengukuran nilai KHM antimikrob komersial.1 mL ke setiap kolom 1 sampai 12. penotolan berikutnya dilakukan bila penotolan sebelumnya sudah mengering sampai seluruh larutan habis. untuk uji terhadap kapang. jamur endofit AFKR-5 memiliki miselium berwarna putih seperti kapas (Gambar 1a. 2010). Untuk bakteri digunakan media MHB dan untuk kapang digunakan media SB. Secara makroskopik. Sebanyak 20 mg fraksi F3 dilarutkan dalam aseton kemudian ditotolkan sedikit demi sedikit pada seluruh titik awal di pelat berukuran 10 × 20 cm2. Tujuannya ialah memastikan isolat dapat tumbuh di media PDA tanpa kontaminan. 1b. Isolat jamur AFKR-5 koleksi dalam media agar miring sudah menghasilkan miselium berwarna hitam. serta sudah menghasilkan miselium (Gambar 1a) dan pigmen warna (Gambar 1b). Penentuan Nilai Hambat Metabolit Sekunder Dominan Fraksi Teraktif Penentuan Diameter Daya Hambat (DDH) Penentuan DDH fraksi F3. Uji dilakukan 3× ulangan (Lampiran 3). Pelat dimasukkan ke dalam bejana dan dibiarkan sampai batas pelarut atau garis depan mendekati bagian ujung pelat.1 mL media SB 1×. dan seterusnya sampai 0. Adsorben yang digunakan ialah pelat KLT silika gel 60 F254 (Merck). Bercak tertentu akan berpendar.1 mL. Penentuan Konsentrasi Hambat Minimum (KHM) Sampel uji dipersiapkan dengan konsentrasi 512 µg/mL menggunakan pelarut DMSO. Blangko berisi 0. Cakram steril diteteskan larutan stok dengan konsentrasi 10 µg/µL menggunakan mikropipet steril sebanyak 5 dan 10 µL lalu diletakkan di atas inokulan mikrob uji. konfigurasi . Inokulum dipersiapkan dari mikrob uji yang telah diremajakan dan diencerkan untuk mendapatkan koloni mikrob 15 × 105 CFU/ mL. Zona hambat yang ditandai dengan terbentuknya zona bening di sekitar cakram diamati dan diukur reratanya.06 µg/mL menggunakan microtiter plate dengan 12 × 8 kolom. yaitu Kloramfenikol (antibakteri komersial) dan Nistatin (antijamur komersial). yaitu F3. Lama waktu inkubasi juga dapat memengaruhi produksi metabolit sekunder saat proses kultivasi selanjutnya.4 heksana hasil partisi ekstrak EtOAc sebelumnya. maka harus diremajakan dan minimum berumur 7 hari sebelum dikultivasi lebih lanjut pada media cair. Agusta et al. 2010) Isolat dan Hasil Peremajaan Galur jamur endofit AFKR-5 (Gambar 1). sedangkan sebagai kontrol positif digunakan Kloramfenikol dan Nistatin. flava asal Kebun Raya Bogor (Agusta et al. Pengenceran sampel uji dilakukan berseri dari konsentrasi 512 µg/mL menjadi 256. Aseton digunakan sebagai pelarut dan kontrol negatif. selama 24 jam. Kecepatan berkembang dan ada tidaknya pigmentasi pada media PDA menjadi parameter dalam mengamati morfologi koloni. kolom 2–12 berisi 0. kemudian microtiter plate diinkubasi bergoyang pada suhu 37 C selama 2448 jam. Bejana pengembang diisi dengan campuran pelarut DCM-aseton. Isolasi dan Pemurnian Metabolit Sekunder Fraksi Teraktif Fraksi F3 yang diperoleh sebagai fraksi dominan teraktif dimurnikan dengan KLT preparatif.1 mL ke dalam kolom 1. Inokulan yang sudah diberi larutan uji diinkubasi dengan suhu 30 C untuk jamur dan 37 C untuk bakteri. sebagai nilai KHM. Bercak yang terlihat baik di bawah UV ditandai dan dikerok kemudian masing-masing dilarutkan dengan aseton dan dipekatkan dengan penguap putar. Pemisahan dilakukan menurut Wallhausser (1969). Bercak diamati di bawah penyinaran sinar UV pada 254 dan 366 nm. Sampel uji dipipet 0. Setiap fraksi dikeringkan dengan gas N2 kemudian ditimbang bobotnya. diisolasi dari jaringan akar muda tumbuhan A.1 mL ke dalam kolom 2 dan seterusnya sampai kolom 12. ditentukan konsentrasi terendah kolom masih mempertahankan kebeningannya. 1c).4 ditentukan nilai hambatnya terhadap mikrob uji. Fraksi dominan. begitu juga untuk uji terhadap bakteri patogen.2 mL media SB. dengan ciri koloni berdasarkan panduan Benson (2001). kemudian dari kolom 1 dipipet 0. kolom 1 berisi 0. 5:1 (v/v) dan dibiarkan beberapa menit hingga jenuh. 2009.1 mL media SB 2×. HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil Kultivasi Jamur Endofit (Jamal et al. dan disediakan kolom lain untuk kontrol pertumbuhan (GC) dan blangko. Dengan pengamatan visual. Misalnya. Mikrob uji tersebut dipipet 0.

belerang dan fosforus. miselium sudah berwarna cokelat (Gambar 1e. 2002. Miselium sudah mulai terbentuk pada hari ke-3 (Gambar 1a). pepton. ekstrak khamir. Faktor-faktor seperti perbedaan sumber karbon dan nitrogen. Hal ini menunjukkan bahwa isolat sudah mati dan tidak menghasilkan metabolit sekunder. Kehadiran zat lain seperti garam mineral dapat merangsang pertumbuhan dan adanya logam alkali atau fosfat dapat menyebabkan pH netral pada pepton. Pepton mengandung campuran asam amino bebas. Metabolit sekunder diproduksi untuk mengaktifkan proses sporulasi atau disekresikan sepanjang sporulasi berlangsung (Calvo et al. Media GYP terdiri atas glukosa. dan protease merupakan sumber utama nitrogen. nitrogen. kemungkinan karena nutrisi yang tersedia telah habis 2009). Kultivasi dilakukan sampai isolat kultur berumur 14 hari (Gambar 2c. Agusta 2009). Bagian bawah koloni jamur atau substrat miselium dicirikan oleh penyebaran. Kemungkinan zat warna diakibatkan adanya asosiasi antara biosintesis metabolit sekunder dan proses sporulasi pada jamur endofit. Media kultivasi jamur endofit mengandung karbon. dan ke-21 (bawah) (f). biosintesis metabolit sekunder berasosiasi dengan proses sporulasi pada jamur endofit (Agusta 2009. Ekstrak khamir amat kaya akan vitamin B. ke-5 (b). Kondisi lingkungan yang cocok sangat dibutuhkan untuk terjadinya proses sporulasi seperti media tumbuh. MacFaddin 1985. Dalam penelitian ini. peptida. Ciri-ciri ini mirip dengan koloni jamur Aspergillus sp. pH. media produksi dipertahankan pada suhu 27 °C. Calvo 1999). dan beberapa garam mineral. kisaran pH 57. 2b). Karbohidrat dan glukosida dalam kentang serta dekstrosa dalam media PDA merupakan sumber karbon untuk meningkatkan kecepatan dan pemulihan pertumbuhan jamur. juga mengandung karbohidrat tinggi dan nitrogen sehingga digunakan untuk memperkaya media kultur. Media ini mengandung sumber nutrisi kaya gizi (seduhan kentang) yang mendorong sporulasi kapang. suhu. dan khamir. Peremajaan isolat AFKR-5 optimum dilakukan pada suhu kamar dan kondisi gelap karena secara fisiologis suhu optimum untuk pertumbuhan jamur endofit sebagai organisme saprofit ialah 2230 C dan tidak memerlukan cahaya untuk tumbuh (Pelczar & Chan 2010). tembusan dengan pola pigmentasi berwarna kuning kecokelatan. 1f).21 g/L dan PDB Difco 24 g/L. dan cahaya. Pelczar & Chan 2010). ke14 (tampak atas) (c). bentuk tepi wavy (undulate atau bergelombang). Hasil Kultivasi Isolat Jamur endofit bersifat culturable (dapat ditumbuhkan pada kondisi artifisial) (Agusta .5 concentric (sepusat). ke-14 (tampak bawah) (d). 2d). Gambar 1 Profil isolat jamur endofit AFKR5 selama diremajakan pada media PDA: hari ke-3 (a). kapang. Warna tersebut mulai terbentuk setelah hari ke-5 dan semakin dominan sampai hari ke-14 (Gambar 1c. udara. dan pertumbuhan jamur secara subur (AOAC 1995. Kultur AFKR-5 dalam media PDB maupun GYP telah menghasilkan zat warna pada hari ke-7 (Gambar 2a. Pada hari ke-21. jumlah dan ukurannya bertambah besar sejalan dengan bertambah lamanya waktu inkubasi. dengan elevasi hilly (berbukit). Gambar 2 Jamur endofit AFKR-5 dalam media kultivasi PDB dan GYP hari ke-7 (a dan b) dan hari ke14 (c dan d). Secara umum. Media PDA digunakan dalam proses peremajaan isolat. Media PDB lazim digunakan untuk kultivasi jamur. mineral logam. Dalam penelitian ini digunakan 2 jenis media. dan tentunya air (Pelczar & Chan 2010). ke-21 (atas) (e). vitamin. 1d). produksi zat warna. Kondisi lingkungan yang cocok sangat dibutuhkan untuk terjadinya proses sporulasi dan juga menjadi faktor penentu terbentuknya metabolit sekunder. dan konsentrasi garam dapat memengaruhi sekresi senyawa antimikrob oleh AFKR-5. dan dikultivasi pada media produksi selama 14 hari. suhu. yaitu media GYP 27.

Pelarut ini umum digunakan dalam mengekstraksi kultur jamur endofit (Sarker et al. Peristiwa tersebut berulang hingga terjadi kesetimbangan konsentrasi. Etil asetat merupakan pelarut dengan polaritas medium (Houghton & Raman 1998). Fase diam yang dipakai ialah silika gel 60 F254. Larutan pengembang yang digunakan adalah DCM-MeOH.4079 0. ekstrak EtOAc kultur AFKR-5 dalam media PDB (Gambar 3a) memiliki kadar bioproduksi terbesar (804.75 509. CH = Ce(SO4)2 1%/H2SO4 10% Gambar 4 Profil KLT ekstrak EtOAc kultur AFKR-5 media PDB (I) dan GYP (II). Metode maserasi memerlukan banyak pelarut dan waktu yang lama dalam VH= vanilin-H2SO4. lebih besar dibandingkan dengan ekstrak dalam media GYP yang lebih kaya akan nutrisi (Gambar 3b) (509. zat aktif didesak ke luar.0766 0. tetapi dapat menjaga agar kandungan senyawa dalam contoh yang tidak tahan panas tidak rusak. Senyawa antimikrob yang bersifat atsiri akan menguap dan hilang jika dipanaskan (Branen & Davidson 1993).875 660.75 dan 660. Fraksi air (komponen polar) dipisahkan dari miselium kemudian dikering-bekukan dan didapatkan kadar bioproduksinya dalam media PDB dan GYP masing-masing sebesar 95. Profil KLT tersebut menunjukkan komponen yang lebih banyak pada media kultivasi PDB yang juga menghasilkan kemampuan . visualisasi di bawah UV 254 (a) dan 366 nm (b). Sifatnya semipolar sehingga dapat mengekstraksi komponen-komponen yang terdapat dalam kultur jamur. dan dapat berpendarflour. eluen: DCM-MeOH 10:1 (v/v). Contoh perhitungan rendemen diberikan pada Lampiran 4. merupakan silika yang dibebaskan dari air. Gambar 4 (I) dan (II) memperlihatkan profil KLT ekstrak EtOAc kultur AFKR-5 dalam media PDB dan GYP. Zat aktif akan larut dan karena perbedaan konsentrasi antara larutan zat aktif di dalam dan di luar sel. Pengadukan akan meratakan konsentrasi larutan di luar sehingga mempercepat tercapai kesetimbangan konsentrasi bahan ekstraktif. Tabel 1 menunjukkan. masingmasing selama 1 jam pada suhu kamar.125 95. Tabel 1 Rendemen ekstrak kultur AFKR-5 Ekstrak Fraksi AFKR-5 ekstrak PDB GYP EtOAc Air EtOAc Air Bobot (g) 0.125 mg/L). tergolong fase normal. Kadar bioproduksi fraksi air AFKR-5 yang lebih kecil dalam media PDB menandakan bahwa metabolit sekunder yang lebih bersifat polar dan larut air lebih sedikit jumlahnya. Ekstrak EtOAc kultur dalam media PDB dan GYP (Gambar 3) selanjutnya dianalisis KLT untuk menentukan jumlah komponen senyawa yang terdapat di dalamnya. Maserasi dilakukan berulang kali.25 Warna Merah-cokelat Merah Cokelat Kuning prosesnya. setelah disemprot penampak noda VH (c) dan CH (d).25 mg/L (Tabel 1). Kondisi KLT: pelat silika gel 60 F254.875 mg/L).6 Hasil Penapisan Metabolit Sekunder Kultur Jamur Kultur jamur endofit AFKR-5 dalam media cair PDB dan GYP terdiri atas fraksi air/filtrat kultur dan fraksi miselium/biomassa kultur.5282 Kemampuan produksi (mg/L) 804. 2006. Pelarut akan menembus dinding sel dan masuk ke dalam rongga sel yang mengandung zat aktif. Sarker & Nahar 2007).6433 0. Gambar 3 Ekstrak EtOAc kultur AFKR-5 media PDB (a) dan GYP (b). bersifat sedikit asam. Ekstraksi miselium kultur menggunakan metode maserasi dengan pelarut etil asetat (EtOAc). sampai filtrat dari kultur jamur endofit tidak berwarna lagi. yang menandakan semua senyawa yang berbobot molekul rendah sudah terekstraksi (Harborne 2006).

timol. Hasil uji aktivitas menunjukkan bahwa pada konsentrasi 100 µg/cakram terhadap mikrob uji. mengandung sumber nutrisi kaya gizi (seduhan kentang) yang spesifik mendorong sporulasi kapang. 2005). Mikrob target yang digunakan seluruhnya patogen terhadap manusia. hanya ekstrak EtOAc kultur dengan media PDB yang berpotensi sebagai antimikrob dengan spektrum luas karena menghasilkan zona hambat terhadap semua mikrob uji. dan eugenol. Uji aktivitas dilakukan secara kualitatif dengan menggunakan 2 kelompok mikroorganisme uniselular target. biru. fenilpropena/fenilpropanoid. aureus dan Gram negatif E.coli PDB air GYP + + + PDB EtOAc GYP Kontrol Kloramfenikol + + (+) Nistatin + Kontrol (-) aseton + terbentuk zona bening Sampel AFKR-5 Aktivitas antibakteri ekstrak EtOAc terhadap S. yaitu bakteri (prokariotik) dan kapang (eukariotik). terpinil. albicans (Tabel 2). albicans S. biru gelap. meskipun lebih sederhana komposisinya dibandingkan dengan media GYP (Lampiran 1). Subeki et al. sedangkan kapang yang digunakan ialah C. terpena alkohol (jingga kebiruan). Secara etnofarmasi. tumbuhan A. albicans. apiol. ungu. dan hijau tua). merah). seskuiterpena (hijau kecokelatan. flavonoid lignan. Aktivitas senyawa uji dinyatakan dengan zona bening ini.5% dalam H2SO4-HOAc glasialMeOH 5:10:85 digunakan untuk mendeteksi terpenoid. Untuk menurunkan limit deteksi. Tabel 2 Uji aktivitas penghambatan mikrob oleh ekstrak EtOAc kultur AFKR-5 konsentrasi 100 µg/cakram Aktivitas daya hambat Kapang uji Bakteri uji C. Bakteri target yang digunakan meliputi bakteri Gram positif S. lembayung muda. Inkubasi selanjutnya dilakukan pada suhu yang sesuai untuk pertumbuhan mikrob uji. Uji bioaktivitas antimikrob dilakukan dengan metode difusi cakram. tetapi ada pula yang tidak. atau merah. aureus E. warna hijau biru menunjukkan steroid. flava merupakan bentuk aktivitas antagonis. neril asetat (biru kelabu). Reagen Ce(SO4)2 1%/H2SO4 10% digunakan dalam mendeteksi keberadaan beberapa tipe alkaloid dan komponen lainnya (Houghton & Raman 1998. aureus dan E. Kemampuan antimikrob isolat jamur endofit yang berasosiasi dengan tumbuhan A. albicans. Potensi Antimikrob Ekstrak Kultur Berdasarkan Gambar 4 diketahui bahwa ekstrak kultur AFKR-5 memiliki beberapa profil metabolit sekunder. ester geranil. terutama kapang C. merah-jingga. yaitu 37 °C untuk bakteri dan 30 °C untuk kapang selama 2448 jam. 1996. hijau kebiru-biruan). Apabila terjadi hambatan pertumbuhan terhadap mikrob uji. Zona bening yang terbentuk ditunjukkan pada Gambar 5. Harborne 2006). fenolat (merah muda untuk resorsinol dan floroglusinol. coli lebih lemah dibandingkan dengan aktivitas antijamur terhadap C. Warna ungu menunjukkan triterpenoid. produksi zat warna. Penampak-noda vanilin-H2SO4 atau anisaldehida 0. merah marun. Hasil ini juga menunjukkan bahwa fraksi air kultur jamur AFKR-5 tidak menunjukkan aktivitas penghambatan. iridoid/ monoterpena lakton (biru. anetol. Larutan stok ekstrak yang diketahui konsentrasinya diserap dengan cakram kertas dan dikontakkan dengan media yang telah diinokulasi mikrob uji. perlu dilakukan uji aktivitas biologis. Hal ini kemungkinan disebabkan media PDB. Sebelumnya telah dilaporkan bahwa pelarut organik memiliki efisiensi lebih tinggi dalam mengekstraksi senyawa untuk aktivitas antimikrob dibandingkan dengan air (Lima-Filho et al. umumnya menghasilkan bercak berwarna ungu. Di antaranya mungkin ada yang mempunyai aktivitas biologis. merah untuk isoeugenol). dan pertumbuhan jamur secara subur (AOAC 1995. serta fase minyak atsiri/nheksana (merah jambu untuk estragol. 2002). biru. Populasi jamur endofit yang lebih heterogen memicu terjadinya kom- . Secara umum biosintesis metabolit sekunder ini berasosiasi dengan proses sporulasi (Agusta 2009). flava digunakan oleh masyarakat sebagai obat tradisional dan memiliki aktivitas biologi sebagai antimikrob (Dzulkarnain et al. MacFaddin 1985). maka akan terlihat zona bening pada tempattempat tertentu sepanjang ekstrak bermigrasi pada lempengan cakram. Oleh karena itu. coli.7 bioproduksi terbesar (Tabel 1). Perlakuan ini memberikan kesempatan kepada larutan stok untuk berdifusi sebelum mikrob tumbuh. ungu. Gocan 2004. cokelat untuk miristisin. sistem terlebih dahulu dibiarkan pada suhu rendah selama beberapa jam sebelum diinokulasi. Uji diarahkan pada aktivitas sebagai antimikrob. Senyawa lain yang dapat dideteksi ialah monoterpena (jingga tipis.

Untuk memudahkan isolasi zat antimikrob dalam kultur.2 Putih-kuning Gambar 5 Zona hambat ekstrak EtOAc kultur AFKR-5 media PDB konsentrasi 100 µg/cakram terhadap E. Romanengko et al. Hal ini memicu jamur endofit memiliki karakteristik antimikrob berspektrum luas. 2:1. eluen: DCM-MeOH 10:1 (v/v). Ekstrak EtOAc lebih banyak terpartisi dalam fraksi MeOH. 15:1. Rendemen fraksi MeOH dan n-heksana berturut-turut 68. 10:1. Berdasarkan Gambar 7. minyak. dapat mengganggu proses difusi komponen bioaktif.2 garis yang melengkung pada kira-kira Rf = 0. Tabel 4). d. c. Oleh karena itu.1912 Rendemen Warna rendemen (% b/b) 68. S.3852 g selanjutnya difraksionasi dengan kromatografi kolom sistem isokratik dengan komposisi fase gerak DCM-MeOH (20:1. coli (a). MeOH dan fase diam silika gel 60 (70230 mesh ASTM).8 petisi di antara kelompok mikroorganisme.8 Merah-cokelat 33. Hasil Partisi dan Fraksionasi Ekstrak Kultur Aktif Profil KLT ekstrak EtOAc kultur jamur endofit AFKR-5 dalam media PDB masih memperlihatkan beberapa komponen dengan Rf besar. kolonisasi target.8 dan 33. Gambar 7 Profil KLT ekstrak EtOAc kultur AFKR-5 media PDB (a. sudah terjadi pemisahan antara komponen polar dan nonpolar. aureus (b). dan f). Biosintesis senyawa antimikrob berperan penting dalam proses pelekatan. 1:1) (v/v). diharapkan potensi antimikrob komponen bioaktif ekstrak lebih besar setelah dipartisi. atau hidrokarbon jenuh. Gambar 6 Profil partisi n-heksana-MeOH (1:1) (v/v) ekstrak EtOAc kultur AFKR-5 media PDB. 3:1. karena terjerap sedikit atau tidak terjerap sama sekali pada fase diam yang bersifat polar (Stahl 1985). Fraksi MeOH ekstrak EtOAc sebanyak 0. komponen yang bersifat polar dan nonpolar dipisahkan. Didapatkan 10 fraksi (Gambar 8. Hal ini menunjukkan komponen yang berbeda.9 mg (Tabel 4). .3852 n-heksana 0. lemak dan minyak terkadang tidak terlalu aktif secara biologis (Houghton & Raman 1998). albicans (c). ponen ekstrak lebih banyak yang bersifat polar. Tabel 3 Hasil partisi ekstrak EtOAc kultur AFKR-5 media PDB dengan n-heksana-MeOH (1:1) (v/v) Bobot Fraksi ekstrak (g) MeOH 0. Komponen ini diduga bersifat nonpolar. visualisasi di bawah UV 366 nm (a dan b). seperti lemak. dengan fraksi dominan adalah F3 dan F10 dengan bobot masing-masing 22. dan C. 5:1.2% (Tabel 3). setelah disemprot penampak noda VH (c dan d) dan CH (e dan f). menunjukkan bahwa kom- . Walaupun beberapa bercak sama nilai Rf-nya. Di samping itu. Misalnya.6 dan 47. Partisi cair-cair menggunakan pelarut n-heksana-MeOH 1:1 (v/v) sebanyak 3× ulangan (Gambar 6). warna yang dihasilkan dengan reagen penampak-noda berbeda. Kondisi KLT: pelat silika gel 60 F254. 2008). dan e) dan hasil partisi MeOH (1) dan nheksana (2) (b. pada Gambar 7f.7 berwarna cokelat dan bercak di atasnya berwarna merah menunjukkan komponen minyak (Harborne 2006). hingga kompetisi dalam mendapatkan ruang dan nutrisi dengan mikrob lainnya (Long & Farook 2001. dan dapat melindungi sel bakteri dari senyawa antimikrob (Moshi & Mbwambo 2005). Pola KLT masing-masing fraksi dipantau dan dibandingkan dengan ekstrak EtOAc awal.

Diduga fraksi F3 mengandung metabolit sekunder golongan terpenoid (Houghton & Raman 1998. aureus (b).3. bercak berwarna kuning pudar sebelum disemprot reagen. Harborne 2006). Daya hambatnya tetap ada walaupun senyawa tersebut tidak berada bersama dengan senyawa lain dalam ekstrak.2.7 F6 11.5 F9 12 F10 47. C. sehingga kurang efektif jika dipisahkan dengan kromatografi kolom.5 (Gambar 11). aureus E.4 dengan warna pendarflour masing-masing kuning. Fraksi Bobot (mg) F1 1.9 Hasil Isolasi dan Pemurnian Metabolit Sekunder Fraksi Teraktif Ekstrak Kultur Profil KLT fraksi F3 ditunjukkan pada Gambar 10. . albicans (c). F3. bergantung pada pendeteksian yang digunakan. kuning. Tabel 4 Bobot dan warna fraksi-fraksi pada Gambar 8. Bercak tersebut ditandai sebagai fraksi F3.9 Warna No tabung Kuning + 1 Kuning + 2 Jingga 35 Cokelat jingga ++ 68 Cokelat jingga + 911 Cokelat jingga + 1223 Cokelat jingga + 2437 Cokelat jingga ++ 3859 Cokelat jingga +++ 6088 Hitam 89habis Aktivitas Antimikrob Fraksi Dominan Fraksi n-heksana ekstrak EtOAc AFKR-5 PDB dan fraksi dominan ekstrak EtOAc fraksi MeOH (F3 dan F10) diuji kembali bioaktivitas antimikrobnya menggunakan metode difusi cakram dengan konsentrasi 10 µg/cakram.9 F3 22. fraksi MeOH: orisinal (kuning pudar) (d). di bawah UV 254 nm (e).9 F8 8. Fase diam yang digunakan ialah pelat KLT silika gel 60 F254 (Merck) dan fase geraknya DCMaseton (5:1) (v/v). Dalam profil KLT ekstrak EtOAc. fraksi MeOH (I) dan n-heksana (II) setelah disemprot VH (ungu) (b) dan CH (merah muda) (c). dan jingga (Gambar 12). CH = Ce(SO4)2 1%/H2SO4 10% Gambar 10 Profil KLT fraksi F3 dalam ekstrak EtOAc: setelah disemprot VH (biru-keunguan) (a).1 F5 5. fraksi F3 terdeteksi berwarna biru-keunguan setelah disemprot penampak noda vanilinH2SO4.9 F7 4. 3. dan F3. setelah disemprot VH (ungu) (f). dan berwarna merah muda dan abu-abu kecoklatan setelah disemprot Ce(SO4)2 1%/H2SO4 10%. Hanya fraksi F3 yang bersifat antimikrob (Tabel 5. Deteksi dengan sinar UV 254 nm menunjukkan bahwa fraksi F3 terpisah menjadi 5 komponen tunggal. Hal ini menandakan fraksi F3 dalam ekstrak aktif tidak bekerja sinergis da-lam menghambat pertumbuhan mikrob. coli (a). Terpenoid setelah pemisahan dengan pelarut dengan kepolaran rendah juga menghasilkan pendarflour berwarna kuning dengan latar be- Gambar 9 Zona hambat fraksi F3 konsentrasi 100 µg/cakram terhadap E.coli Fraksi F3 + + + MeOH F10 Fraksi n-heksana Kloramfenikol + + Kontrol (+) Nistatin + Kontrol (-) aseton + menghambat pertumbuhan mikrob uji Sampel VH= vanilin-H2SO4. yaitu F3.6 F4 9. Bercak ke-2. Gambar 8 Fraksi-fraksi ekstrak EtOAc kultur AFKR-5 media PDB fraksi MeOH. Pemisahan lanjutan terhadap fraksi F3 dilakukan dengan KLT preparatif karena rendemen fraksi sedikit dan nilai Rf antar fraksi berdekatan. dan setelah disemprot CH (abuabu kecokelatan) (g). setelah dipartisi dalam fraksi MeOH dan disemprot reagen yang sama berwarna ungu. S.4 F2 0. albicans S. Tabel 5 Aktivitas penghambatan mikrob fraksi dominan ekstrak EtOAc kultur AFKR-5 media PDB Aktivitas daya hambat Kapang uji Bakteri uji C. dan 4 berpendar pada UV 366 nm.1– F3. Warna bercak yang terdeteksi beragam. Gambar 9).

yang dapat menghambat pertumbuhan mikroorganisme prokariotik seperti bakteri Gram negatif maupun positif. maka ekstrak kultur AFKR-5 mampu melakukan bioproduksi komponen F3. ketiga fraksi tersebut diduga berasal dari golongan terpenoid. Seluruh fraksi dikerok dan dilarutkan dengan aseton lalu dipekatkan dengan penguap putar. Diameter daerah bening ini merupakan daerah inhibisi sampel uji terhadap mikrob uji. dan 366 nm (c). Karena itu. eluen: DCM-aseton (5:1) (v/v). yaitu 13 mm (Gambar 14. dapat dikatakan bahwa F3.Ia dan b.72. Molekul yang lebih besar akan menyebar lebih lambat. semakin besar aktivitas antimikrob. Selanjutnya fraksi F3. Pada konsentrasi 100 µg/cakram. F3. dan Nistatin (IIc). dan 0.375 mg/L. Gambar 13 Fraksi-fraksi hasil KLT preparatif F3.4 merupakan komponen dominan fraksi F3 dengan bobot 8.1–F3. albicans (c). Hasilnya dapat dilihat pada Gambar 13.4 ditentukan nilai penghambatannya terhadap mikrob uji. 0. . Fraksi F3.16 (Gambar 12).50. Laju difusi melalui agar-agar tidak secepat laju keluarnya antimikrob dari cakram. sementara antimikrob mulai berdifusi ke dalam agar-agar disekitarnya.4 menghasilkan DDH untuk bakteri uji Gram negatif E.4 (I). Bioaktivitas Antimikrob Isolat Metabolit Sekunder Dominan Fraksi Teraktif Diameter Daya Hambat Uji bioaktivitas antimikrob fraksi F3 juga dilakukan dengan metode difusi cakram Kirby-Bauer. Setelah diinkubasi selama 24 jam. aureus sebesar 9 dan 8 mm (Gambar 14. 1966) serta bobot molekul senyawa antimikrob.Ic.10 lakang merah muda. Diameter daya hambat (DDH) komponen bioaktif F3. antiGambar 14 Zona hambat fraksi F3. maupun eukariotik (kapang). Tabel 6). coli (a). Oleh karena itu.3 mg (41% b/b fraksi F3). Kondisi KLT: pelat silika gel 60 F254. aureus (b).4 sebesar 10. eluen DCM-aseton (5:1). 0.56.4 merupakan antimikrob berspektrum luas. S. Tabel 6). albicans. mikrob uji diserap dengan kertas cakram dan dikontakkan dengan media agar-agar yang telah diinokulasi mikrob uji pada jumlah tertentu. UV 254 (b). Gambar 11 Profil KLT preparatif fraksi F3. Semakin besar diameternya. pada konsentrasi 100 µg/cakram terhadap: E. Berdasarkan hasil tersebut. bobotnya ditunjukkan di Lampiran 5. Bila dihitung berdasarkan rendemen kultur. maka akan terlihat zona bening. 0. F3. Laju difusi antimikrob melalui agar-agar bergantung pada sifat difusi dan kelarutan (Bauer et al. Dengan metode difusi ini. Air segera diserap ke dalam cakram dari media agar-agar. visualisasi: cahaya matahari (a). konsentrasi antimikrob paling tinggi paling ada di dekat cakram dan menurun secara logaritmik sebagai fungsi jarak dari cakram (Jorgensen & Turnidge 2007).4 menghasilkan DDH yang lebih sensitif terhadap kapang uji C. C. Nilai Rf fraksi F3.30. coli dan Gram positif S.4 terhadap mikrob uji meningkat dengan meningkatnya konsentrasi (Tabel 6).5 berturut-turut 0. Gambar 12 Profil KLT fraksi-fraksi hasil KLT preparatif F3. kontrol positif Kloramfenikol (IIa dan IIb). Kondisi KLT: pelat KLT silika gel 60 F254. apabila terjadi hambatan pertumbuhan terhadap mikrob uji. visualisasi: UV 254 nm. Dengan konsentrasi yang sama.

Sterol bukan komponen membran bakteri sehingga Nistatin tidak efektif bagi bakteri (Agusta 2006. Nilai KHM fraksi F3. Blangko hanya berisi media kultur sebagai kontrol untuk memastikan tidak terjadi kontaminasi pada pengujian ini. Kontrol negatif berisi media dan inokulum mikrob ditambah pelarut DMSO. Nilai KHM spesifik untuk setiap kombinasi antimikrob dan mikrob. Fraksi F3. Kloramfenikol menghasilkan nilai DDH terhadap bakteri E. Kloramfenikol diketahui bersifat bakteriostatik berspektrum luas.4 maupun kontrol positif Kloramfenikol karena meng-hasilkan DDH < 14 mm pada konsentrasi zat uji sebesar 50 µg/cakram.5 7 13 8 9 10 15 18 7 10 13.IIc.4 Sampel F3. aureus. aureus E.4 Kloramfenikol Nistatin DMSO S. GC dapat digunakan sebagai standar tidak terjadinya penghambatan pada sumuran uji yang berisi sampel uji. bakteri S. Konsentrasi sampel uji terendah yang menghasilkan tingkat kejernihan sumur uji mirip dengan blangko dapat ditentukan sebagai nilai KHM (Lampiran 6). Setelah inkubasi. coli C. Tujuannya memastikan bahwa DMSO sebagai pelarut sampel uji tidak memiliki aktivitas penghambatan terhadap mikrob uji. tetapi tidak membunuhnya sehingga pembasmian bakteri sangat bergantung pada daya tahan tubuh inang (Katzung 2001). Penentuan nilai KHM digunakan oleh laboratorium diagnostik terutama untuk mengonfirmasi resistensi dan juga untuk menentukan aktivitas in vitro antimikrob baru.11 Tabel 6 Diameter daya hambat fraksi F3. dan kapang C. diikuti dengan gangguan pada fungsinya. semakin peka mikrobnya.IIa dan b. tetapi tidak diberi sampel yang akan diuji bioaktivitasnya. Tabel 7 Hasil uji KHM fraksi F3.4 Kontrol (-) aseton Kontrol (+) Kloramfenikol Kontrol (+) Nistatin Konsentrasi 10 µg/µL (µL) 5 10 20 5 10 20 5 10 20 Rerata diameter DDH (mm) Bakteri uji Kapang uji C. Tabel 6). aureus dan E. albicans (KBM/KHM < 2) setelah dilakukan optimasi penentuan nilai konsen- .5 12 17 20 - Nilai DDH kontrol positif Kloramfenikol sebagai antibakteri komersial dan Nistatin sebagai antijamur komersial juga meningkat dengan meningkatnya konsentrasi zat uji (Tabel 6). Mekanisme kerja Kloramfenikol dalam melawan bakteri adalah dengan menghambat sintesis protein dengan cara berikatan dengan subunit 50s pada ribosom dan berefek pada penghambatan pembentukan protein (Pelczar & Chan 2010). Namun. Setelah masa inkubasi. Kontrol pertumbuhan (GC) adalah kultur yang berisi media dan inokulum mikrob uji. coli. Tabel 6).4 ditemukan bersifat fungisidal pada konsentrasi 32 µg/mL terhadap C. Semakin rendah nilai KHM sebuah antimikrob. albicans dengan nilai KHM terkecil. dan digunakan untuk menentukan kepekaan mikrob terhadap antimikrob tersebut. pertumbuhan mikrob ditentukan secara visual atau dengan membandingkan kekeruhan kultur uji dengan kultur kontrol.4 yang menghambat bakteri dan kapang.4 KHM (µg/mL) Sampel F3. Aktivitas antimikrob dapat dibandingkan dengan aktivitas kontrol positif Kloramfenikol dan Nistatin.coli 9 6. aureus 64 32 E. Pelczar & Chan 2010). artinya dapat menghambat pertumbuhan bakteri Gram positif maupun negatif. albicans menunjukkan tingkat kepekaan yang meningkat. Dibandingkan dengan fraksi F3. coli bersifat resisten baik terhadap fraksi F3. Dari hasil ini. berturutturut sebesar 64.4 terhadap bakteri Gram positif S. Hal ini mengakibatkan kacaunya organisasi di dalam struktur molekular membran. albicans sebesar 15 mm (Gambar 14. yaitu 16 µg/mL terhadap fraksi F3 (Gambar 15). Gram negatif E. dan 16 µg/mL (Tabel 7). 32. aktivitas Nistatin terbatas hanya pada kapang dan cendawan lain dengan cara bergabung dengan sterol yang terdapat dalam membran sel. Kloramfenikol didapati lebih efektif dalam menghambat pertumbuhan kedua bakteri. Konsentrasi Hambat Minimum Konsentrasi hambat minimum (KHM) adalah konsentrasi terendah antimikrob yang dapat menghambat pertumbuhan mikrob tertentu. Nilai DDH Nistatin pada konsentrasi 100 µg/cakram terhadap bakteri kapang uji C. Prinsip dasar penentuan KHM adalah mikrob uji yang disiapkan dengan kepadatan tertentu diinkubasi dengan larutan stok yang akan diuji aktivitas antimikrobnya pada konsentrasi berseri yang semakin kecil. Pada konsentrasi 100 µg/cakram. aureus sebesar 17 dan 10 mm (Gambar 14. coli dan S. albicans S. GC akan terlihat keruh yang menandakan terjadinya pertumbuhan mikrob. albicans 32 16 64 32 - Kepekaan terbesar ditunjukkan oleh kapang uji C.

Ed ke-8. aureus mikrob uji C. Di samping itu. dengan cara menghambat pembentukannya atau mengubahnya setelah selesai terbentuk. yaitu apoptosis dan non-apoptosis. Media kultivasinya ialah PDB dengan kondisi kultivasi menggunakan pengocok pada kecepatan 120 rpm. albicans.4 2× lebih baik dibandingkan dengan antijamur komersial Nistatin yang hanya bersifat fungistatik dengan nilai KHM sebesar 32 µg/mL.4. mengubah permeabilitas sel yang akan mengakibatkan terhambatnya pertumbuhan atau matinya sel. Mekanisme antijamur melalui proses apo-ptosis salah satunya ditandai dengan terjadinya degradasi DNA secara terpola dengan panjang 180 pasangan-basa.4 lebih potensial dalam menghambat bakteri Gram negatif. Mekanisme kerja antibakteri dapat terjadi melalui berbagai jalur antara lain dengan merusak struktur dinding sel. Bacteriological Analytical Manual. 2001) atau karena fraksi F3. coli. isolat AFKR-5 dalam media PDB berpotensi dikembangkan sebagai antimikrob.12 trasi bunuh minimum (KBM) fraksi F3. dan pengujian secara klinis agar dapat digunakan untuk pengembangan antimikrob khususnya antijamur untuk manusia. Diversivitas jalur biosintesis senyawa terpena pada makhluk hidup se- . Sekalipun terdapat perbedaan. menghambat kerja enzim. 2006.4 kloramfenikol DMSO nistatin pada sel mamalia/kanker (Talaro 2008). atau menghambat sintesis asam nukleat dan protein (Pelczar & Chan 2010). Gambar 15 Nilai KHM fraksi F3. merusak molekul protein dan asam nukleat. dan kapang patogen C.4. fakta bahwa bakteri Gram negatif adalah patogen paling utama dibandingkan dengan Gram positif memunculkan wawasan baru terhadap perkembangan antibakteri Gram negatif yang berasal dari jamur endofit. albicans F3. Agusta A. Hal ini dapat dikarenakan bakteri S. perlu dilakukan identifikasi jamur endofit AFKR-5. coli.4 sebesar 10.4. nilai KHM sebesar 16 µg/mL. aureus menunjukkan kepekaan yang lebih lemah dibandingkan dengan bakteri E. suhu 27 °C selama 2 minggu. Aktivitas F3. Bakteri Gram positif umumnya lebih peka terhadap senyawa antibakteri karena dinding selnya mengandung lapisan peptidoglikan yang lebih tebal (90%) dibandingkan dengan bakteri Gram negatif (520%). Bakteri uji S. albicans (Lampiran 7). Saran Perlu dilakukan optimasi faktor-faktor yang memengaruhi produksi antimikrob kultur jamur endofit AFKR-5. AFKR-5 dapat dikembangkan ke arah obat antijamur karena bersifat fungisida setelah menjalani uji klinis lebih lanjut. aureus cepat menjadi resisten terhadap beberapa antibakteri (Jawetz et al. Pada penelitian ini belum dapat dipastikan mekanisme penghambatan mikrob uji oleh fraksi F3. 1995. menghasilkan F3. 70 Nilai KHM (µg/mL) 60 50 40 30 20 10 0 E. penentuan mekanisme antimikrobnya. SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Jamur endofit AFKR-5 yang berasosiasi dengan tumbuhan akar kuning asal Kebun Raya Bogor dapat melakukan bioproduksi komponen bioaktif sebagai antimikrob berspektrum luas terhadap bakteri Gram positif S. coli S. maka bakteri Gram positif seharusnya lebih peka dibandingkan dengan Gram negatif (Fardiaz & Jenie 1988). aureus. Senyawa antibakteri dapat mencegah sintesis peptidoglikan pada sel yang sedang tumbuh. Proses ini identik dengan proses apoptosis DAFTAR PUSTAKA [AOAC] Association of Official Analytical Chemists. Oleh karena itu. dan bersifat fungisidal dengan nilai KBM 32 µg/mL.4 terhadap kapang uji C. khususnya menjadi obat antijamur. dengan kultivasi pada media PDA. Sementara mekanisme kerja antijamur secara garis besar terbagi atas 2 jalur. serta analisis lebih lanjut berupa penentuan struktur komponen bioaktif F3. Gram negatif E. Namun. Aktivitas penghambatan terbesar ialah terhadap kapang Candida albicans dengan nilai DDH pada konsentrasi 100 µg/cakram sebesar 13 mm. Gaithersburg MD: AOAC International.375 mg/L.

[CLSI] National Committee for Clinical Laboratory Standards Institute. 1988. W Maccheroni. Hess WM. . Bandung: Universitas Pajajaran. [CLSI] National Committee for Clinical Laboratory Standards Institute. Kakandumycins. Munumbicins. Keller NP. 2002. Castillo UJ. Ed ke-8. pemisahan. Lin J. Batubara I. J Agric Tech 1:55-65. Electr J Biotechnol 3:40-65. Bacon CW. 1994. Ge H et al. editor.) MERR: Menispermaceae]. Agusta A. Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Testing. 2002. Antibiotic susceptibility testing by a standardized single disk method. dan bioaktivitasnya [tesis]. 1999. Tanaman obat bersifat antibakteri di Indonesia. Biologi dan Kimia Jamur Endofit. Ed ke-9. 2010. an endophyte of Grevillea pteridifolia. Alesi K. Poter H. Ed ke-6. 2000. Biotechnology of Endophytic Fungi of Grasses. Hinze LL. New York: Marcel Dekker. Ford E. wide spectrum antibiotics produced by Steptomyces NRRL 30562. Wilson RA. Sporogenic effect of polyunsaturated fatty acids on development of Aspergillus spp. Antimicrobial in Food. Clay K. Berita Biol 8:142-151. Harper K. Azevedo JL. FEMS Lett 24:183-190. Ecology 69:10-16. Sherris JC. Teplow DB et al. Microbial Endophytes. Kirby WMM. 2001. J Cermin Dunia Kedokteran 110:3548. Keller NP. Davidson PM. Jenson JB. Handbook of Microbiological Media. Am J Clin Pathol 36:493-496. New York: Marcel Dekker. endophytic on Kennedia nigriscans. Fungal endophytes of grasses: A defensive mutualism between plants and fungi. Calvo AM. Choi YW. International Seminar Biotechnology for Enhancement The Tropical Biodiversity. Strobel GA. Sundari D. Fornango J. Calvo AM. Castillo UF. Boca Raton: CRC Pr. Wayne PA: CL-SI. Hyde KD. Boca Raton: CRC Pr. Bok JW. novel antibiotica from Streptomyces sp. 2010. Fungal endophytes in stem and leaves from latent pathogens to mutualistic symbiont. 2003. 2000. Bandung: ITB Pr. Wayne PA: CLSI. Relationship between secondary metabolism and fungal development. Ohashi K. 2009. Endophytic microorganism: A review on insect control and recent advances on tropical plants. 2006. Sears J. White JF. 2005. Condron MA. Composition of the endophytic fungi isolated from tea plant Camelia sinensis. Branen AL. Agusta A.13 bagai target obat antiinfektif: tinjauan ulang. Agusta A. Praptiwi. Ecology 69:2-9. White JF. 1993. Turck M. Benson. JO Pereira. Chozin A. Saponin akar kuning (Arcangelisia flava (L) Merr) sebagai hepatoprotektor: ekstraksi.26:1. hlm hlm 1-6. New York: McGraw-Hill. Strobel GA. Microbiol Mol Biol Rev 66:447. 1988. Bacon CW. Carrol GC. Jamal Y. Hodgkiss IJ. Institut Pertanian Bogor. NRRL 30566. 1993. J Nat Med 60:268-272. Gardner HW. 18-20 Okt 2010. 2006. W Luiz. Di dalam: Biotechnology for Enhancement The Tropical Biodiversity. 2003. Robinson R. Approved Standard. Bandung. 2003. Maranta M. CLSI Document M2 A9. Bogor: Program Pascasarjana. Shibuya H. Atlas RM. Enzyme production by endophytes of Brucea javanica. Approved Standard. 1966. Dzulkarnain B. Smith J. 1996. Hunter M. Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria that Grow Aerobically. Albert H. Fathoni A. Ford EJ. Biooxidation of berberine by the endophytic fungus Coelomycetes AFKR-1 isolated from kayu kuning [Archangelisia flava (L. Microbiology 148:2675-2685. Appl Environ Microbiol 65:3668. Microbiological Applications Lab Manual. Bauer AW.

Clardy J. Kumala S. 1969. Bioproduksi floroglusinol oleh jamur endofit coelomycetes AFAS-F3 yang diisolasi dari tumbuhan Arcangelisia flava L. Universitas Indonesia. Keawpradub N. Antioxidant and cytotoxic activities of Thai medicinal plants named khaminkhruea: Arcangelisia flava. Gocan S. Ed ke-2. penerjemah. Strobel GA. Antagonistic interactions among marine pelagic bacteria. 1996. Keragaman jenis jamur endofit pada tumbuhan pandan wangi (Pandanus amarylifolius) dan aktivitas antijamur metabolit yang diproduksinya. 2002. Melo VMM. 1987. Taxodium distichum. immunosuppressive compounds from the endophytic fungus Fusarium subglutinans. Metode Fitokimia. Cytonic acid A dan B. Meng JC. Praptiwi. Di dalam: Cazes J. Lu H. Jenie BSL. Jain M. Turnidge JD. London: Chapman & Hall. Heusser D. Ed ke-20. penerjemah. Di dalam: Stahl E. Berlin: Springer -Verlaag. Fathoni A. editor. Sidhu R. Agusta A. San Fransisco: McGraw-Hill. Farook A. Leong C. Zou WX. Jamal Y. Plant Sci 151:76-73. Lee J. hlm 855-911. Manual of Clinical Microbio- logy. Melnick J. Jorgensen JH. Wimmer H. Washington DC: ASM Pr. Songklanakarin J Sci 27:455-467. Bogor: PAU IPB. serta uji sitotoksik metabolit sekunder terhadap beberapa sel kanker secara in vitro [disertasi]. 2005. New York: Marcel Dekker. 2005. Basic and Clinical Pharmacology. Huang Y. Houghton PJ. Ford EJ. novel tridepside inhibitor of hCMV protease from the endophytic fungus Cytonaena sp. Lima-Filho JVM. Katit A. Ilyas M. Endophytic taxol producing fungi from bald cypress. 2001. Bioorg Med Chem 17:2950-2962. hlm 1152-1172. 1998.. Thin Layer Chromatography: A Labor tory Handbook. Carvalho AFFU. 2001. Soediro I. Laboratory Handbook for the Fractination of Natural Extracts. Bandung: Penerbit ITB. 2011. 2009. Balitbang Kehutanan. Microbiologi Pangan II. Yuenyongsawad S. Ong W. Ilyas M. Hess WM. Jain R. Jamal Y. Strobel GA.. Merr. Li J. Spray Reagents. Microbiology 142:2223-2226. hlm 1-6. Ed ke-9. 2004. editor. Long RA. Raman A. 2007. Jakarta: Program Pascasarjana. Baron EJ.. Terjemahan dari: Phytochemical Methods. 2001. 2009. Tan RX. J Org Chem 60:7076-7077. Appl Environ Microbiol 67:49754983. and Fibraurea tinctoria. Kaur T. Pfaller M. Ng S. Harborne JB. Lobkovsky E. Berk Penel Hayati 16:169172. Katit A. Ed ke-1. Hu J. . Diversitas dan profil metabolit sekunder jamur endofit yang diisolasi dari tumbuhan gambir (Uncaria gambier) serta aktivitasnya sebagai antibakteri. editor. Antimalarials from nature. Agusta A. 2008. Pliam NB. Di dalam: Murray PR. Isolasi dan penapisan mikroba endofit tanaman Brucea-javanica (L) Merr. Freitas SM. Dejadisai S. Jawetz E. Dai J. Berita Biol 9:149154. Kaur K. 2002. Antibacterial activity of extracts of six macroalgae from the northeastern Brazilian coast. Jakarta: Yayasan Sarana Warna. Encyclopedia of Chromatography. Ed ke-4. Landry M. Katzung BG. 2000. Krebs KG. Terjemahan dari: Useful Indonesian Plants. Coscinum blumeanum. Analysis of Terpenoids by Thin-Layer Chromatography. Carte BK. Jorgensen JH. Biota 14:81-86. Jamal Y. New bioactive metabolites produced by Colletotrium sp. 1988. Adelberg E. Braz J Microbiol 33:311-313.14 Fardiaz S. an endophytic fungus in Artemisia annua. Guo B. 1995. Ed ke-8. Tumbuhan Berguna Indonesia. 2006. Heyne K. Subglutinols A and B. Agusta A. Padmawinata K. Susceptibility test methods: dilution and disk diffusion methods. J Nat Prod 63:602-604. Mikrobiologi Kedokteran.

editor. Antimicrobial metabolite from the culture of endophytic fungus AFK-8 isolated from kayu kuning (Archangelisia flava (L. 1994. Jakarta: UI Pr. Jakarta: UI Pr. Organic and Natural Product Chemistry). Sylvia L. J Am Chem Soc 557: 64-77. Jilid ke-1 dan 2. Berk Penel Hayati 15:85-99. Setyowati FM. Nat Toxin 1:189196. Soediro I. 1994. Isolasi dan kultivasi mikroba endofit penghasil senyawa alkaloid kinkona dari Chinchona spp. Wibowo S. Micro Environ 23:209-214. Chichester: J Wiley. 2008. Simanjuntak P. Media for Isolation Cultivation-Identification Maintenance of Medical Bacteria. Chan ECS. endophytic fungus of pacific yew. Hess WM. Naoto T. (Methods in Biotechnology. Isolasi dan identifikasi senyawa alkaloid dari akar kuning (Arcangelisia flava (L) Merr) [skripsi]. Stierle A. Ford E. 2007. Bandung: ITB Pr. Meistiani Y. Vol ke-1. Susilo H. Gray AI. Fakultas Farmasi UGM. Strobel G. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. Sarker SD. Jamal Y. Riau. dan Harmastini.html [19 Mar 2012]. Agusta A. 1996. [terhubung berkala]. Science 260:214-216. 2006. and other pharmacophores in bioregulators for crop protection and pest control. Stahl E. Latif Z. Angka SL. Shibuya H. Simamarta R. Endophytes the chemical synthesizer inside plant. Niksolihin S. Terjemahan dari: Elements of Microbiology. Ed ke-2. J Indust Microbiol 17:417-425. International Seminar Biotechnology for Enhancement The Tropical Biodiversity. Natural Products Isolation. Strobel GA. Di dalam: Biotechnology for Enhancement The Tropical Biodiversity. 2004. taxanes. Viret O. Bandung. Stierle D. Mbwambo ZH. Diversity and antagonistik activity of sea ice bacte- ria isolated from the sea of Japan.go. Prana TK. Terjemahan dari: Drug Analysis by Chromatography and Microscopy: a Practical Supplement to Pharmacopoeias. 2010. Vol ke-20. Valery VM. 1992. Analisis Obat Secara Kromatografi dan Mikroskopi. Bustanussalam.15 Moshi MJ. New Jersey: Humana Pr. Taxol and taxane production by Taxomyces andreana. 2006. Keanekaragaman tumbuhan obat masyarakat Talang Mamak di sekitar Taman Nasional Bukit Tigapuluh. 1993. 2010. Sarker SD. J Ethnopharm 97:4347. Some pharmacological properties of extract of Terminalia sericea roots. Dasar-dasar Mikrobiologi. Bignami G. Praptiwi. Sieber LT. 2001. Institut Pertanian Bogor. Tjitrosomo SS. Stierle A. MacFaddin JF. Taxol from fungal endophytes and the issue of biodiversity. Yang X. Strobel GA. Mikroba Endofit Sumber Penghasil Antibiotik yang Potensial. Mikroorganisme Tanah dan Pertumbuhan Tanaman. Imas T. Ed ke-2. Chemistry for Pharmacy Student (General. 2007. penerjemah. J Mikrobiol 7:27-30. Isolasi mikroba endofit dari tanaman obat sambung nyawa (Gyunura procumbens) dan analisis potensinya sebagai antimikroba.lipi. penerjemah. Sidhu RS. Bandung: Universitas Pajajaran. . Hundley N. 2005. 2010. Fathoni A. Terjemahan dari: Soil Microorganisms and Plant Growth. Biodiversitas 8: 228-232. Prihatiningtias W. Ecology metabolite production and substrate utilization in endophytic fungi. Masataka U. Stierle D. hlm 35-43. Romanengko LA.biotek. 1985.id/index. Sci Prog 87:79-99. http://www. Hadioetomo RS. Endophytic fungi of pacific yew (Taxus brevifolia) as a source of taxol. Parwati T. 2007. Owen NL. Baltimore: Williams & Wilkins. Grothaus P. 1985. 2002. Rao NS. 18-20 Okt 2010. penerjemah. Nahar L. Pelczar MJ. Padmawinata K. Natalia IK.) Merr. Petrini OTN. Wardah.

Matsuura H. 2002. Pelaes F. Haris NB. Biology and chemistry of endophytes. Feng Z. 2003. Li Z. Suzuki M. Science 284:974-981. Vilella D. Zhang Y. 2005. 1969. Harper JK. Antibiotics. . Nat Prod Rep 18:488-459. Biol Pharm Bull 30:1865-1869. 2006. hlm 566-577. Katakura K. editor. Chairul et al. Isolation and characterization of endophytic colonizing bacteria from agronomics crops and prairie plants.16 Strobel GA. Trimurningsih. Bioprospecting for microbial endophytes and their natural products. 2007. Takahashi K. 2002. Isopestacin. Arunakumari A. Salituro G. Vidader AK. Fung PCW. Grant DM. prossesing antifungal and antioxidant activities. Zhang HW. Yamasaki M. Di dalam: Stahl E. Talaro KP. 2001. Lambrecht P. Phytochemistry 60:179-183. Yamato O. Daisy B. Berlin: Springer-Verlaag. Subeki. 1999. Zhang B. Dez M. New York: McGraw-Hill. Chan K. Zou WX. Szalkowski D. Ed ke-6. 2008. Maede Y. Sung WS. Woapong J. Tan RX. J Vet Med Sci 67:223227. Endophytes: a rich source of functional metabolites. Nat Prod Rep 23: 753-771. Microbiol Mol Biol Rev 67:419502. Barletta RG. Arif AM. Foundation in Microbiologi. an isobenzopuranone from Pestalotiopsis microspora. Ford E. Antibabesial activity of protoberberine alkaloids and 20 hidroxyecdysone from Arcangelisia flava against Babesia gibsoni in culture. Thin-Layer Chromatography: A Laboratory Handbook. Indole-3-carbaniol against human pathogenic microorganisms. Zinniel DK. Tan RX. Ruby C et al. Lee DG. Higley P. Strobel GA. Kuczmarski D. Song YC. Discovery of small molecule insulin mimetic with antidiabetic activity in mice. Wallhausser KH. Appl Environ Microbiol 68:2198-2208. Ishimaru CA. Royo I.

17 LAMPIRAN .

.

Media kaldu dekstrosa kentang (PDB) Difco Bahan Jumlah pati kentang 4 g dekstrosa 20 g air 1L pH akhir 5. . Setelah didinginkan sampai 4050 °C.2.9 g bubuk PDA dalam 100 mL air.2 g 1 L Pembuatan media peremajaan mikrob uji Sebanyak 1. masing-masing berisi 20 mL media. Setelah larut.2 pada 25 ºC  untuk komposisi media 2×. Media SB juga dibuat 2 komposisi. dituang ke 5 cawan petri. media dituang ke dalam cawan petri steril.38 g bubuk NA dilarutkan dengan 60 mL air dalam Erlenmeyer 100 mL lalu disterilkan dengan autoklaf. Semua proses sterilisasi dengan autoklaf dilakukan selama 15 menit pada suhu 121 C (15 lbs).18 Lampiran 1 Komposisi dan prosedur pembuatan media (Atlas 1993. Setelah didinginkan sampai 4050 C. Sebanyak 2. 1. Pembuatan media uji.6 g MHA dilarutkan dalam 200 mL air lalu disterilkan dengan autoklaf.7 ± 0.5 g 1 L Bahan asam kasein hidrolisat ekstrak sapi pati agar-agar air pH 7. Media dibuat seperti pada peremajaan isolat jamur. Agusta 2009) Media agar-agar dekstrosa kentang (PDA) Difco Bahan Jumlah agar-agar 15 g seduhan kentang 4 g dekstrosa 20 g air 1 L pH akhir 5. tetapi dengan melarutkan 3. Media disterilkan dengan autoklaf.5 g 17 g 1 L Pembuatan media uji Sebanyak 7. Media kaldu Mueller Hinton (MHB) Criterion Bahan asam kasein hidrolisat ekstrak sapi Pati air pH 7. media dibagi 5 masing-masing dalam Erlenmeyer 500 mL dan diautoklaf.5 g 2 g 1. Media SB.4 ± 0.2. suhu 25 ºC Media kaldu dekstrosa Sabouraud (SB) Criterion Bahan Jumlah pepton kasein 5 g pepton jaringan hewan 5 g dekstrosa 20 g air 1 L pH akhir 5.2. Setelah didinginkan sampai 4050 °C.4 ± 0.6 ± 0.5 g 2 g 1. suhu 25 ºC Pembuatan media kultivasi mikrob uji Media MHB. dengan melarutkan 4. dibuat 2× resep awal Peremajaan isolat AFKR-5. Media agar-agar Mueller Hinton (MHA) Pembuatan media kultivasi Media GYP dan 24 g bubuk PDB masing-masing dilarutkan dengan 1 L air. kemudian diinokulasikan mikrob uji dan diinkubasi pada suhu 37 C. suhu 25 ºC Jumlah 17. dan 42 g/L. suhu 25 ºC Jumlah 17.0 g SB dalam 50 mL air (60 g/L).8 ± 0. dan dibiarkan memadat.6 ± 0. media PDA dituang ke dalam 3 buah cawan petri steril.2 g MHB dalam 100 mL air. Media disterilkan dengan autoklaf. Media agar-agar nutrien (NA) Difco Bahan Jumlah agar-agar 15 g gelatin pepton 5 g ekstrak sapi 3 g air 1 L pH akhir 6. Media dibiarkan memadat.1 g MHB dalam 100 mL. Tabung dimiringkan dan dibiarkan memadat.34 g bubuk PDA dilarutkan dengan 60 mL air dalam Erlenmeyer 100 mL sambil diaduk.5 g SB dalam 50 mL air (30 g/L) dan 3.5 g 10 mg 0. media dituang ke dalam 6 tabung reaksi steril hingga masingmasing berisi 10 mL media. dengan melarutkan 2. Media MHB dibuat 2 komposisi: 21 g/L. Media disterilkan dengan autoklaf.5 g 0.2 suhu 25 ºC Media glukosa-ekstrak khamir-pepton (GYP) Bahan glukosa ekstrak khamir pepton K2HPO4 FeSO4∙7H2O MgSO4∙7H2O CaCO3 air Jumlah 20 g 1 g 5 g 0.2. masingmasing berisi 20 mL media.

19 Lampiran 2 Diagram alir penelitian .

6 mg 0.8 L = 804.3 mg 0.3 mg Bobot kering ekstrak air : 76.8 L = 95.6 mg Media kultivasi PDB: 4×200 mL = 0.20 Lampiran 3 Bagan penentuan nilai KHM: pengenceran larutan stok (a) dan penambahan inokulum mikrob uji (b) a a ) b a ) Lampiran 4 Contoh perhitungan kadar bioproduksi kultur Bobot kering ekstrak EtOAc: 643.125 mg/L Kadar fraksi air = = bobot kering volume media 76.75 mg/L .8 L Kadar fraksi EtOAc media PDB = = bobot kering volume media 643.

5 Warna fraksi Kuning pudar + Kuning pudar + Kuning pudar ++ Cokelat-jingga ++ Kuning ++ Asli / cahaya matahari Jingga pudar Jingga-cokelat Kuning pudar UV 366 nm Berpendar kuning Berpendar kuning Berpendar jingga pekat - Rf 0.3 2.50 41.7 1.3 3.50 9.8 L = 28.7 mg 0.375 3.72 0.50 mg/L 21 .1 3.50 % (b/b) Cara perhitungan kadar bioproduksi F3.16 Bobot fraksi F3 awal sebelum dipurifikasi Volume media kultivasi Cara perhitungan % rendemen F3.9 8.1 = = bobot sampel volume media 5.4 3.5 12.4 % (b/b) 28.625 2.50 6.30 0.7 mg 20 mg × 100% (b/b) × 100% (b/b) = 28.56 0.375 10.3 1.000 Warna bercak UV 254 nm Kuning pudar Ungu Jingga-lembayung Jingga-cokelat Fraksi 3.8 L = = bobot sampel bobot F3 awal 5.2 3.21 Lampiran 5 Profil fraksi-fraksi hasil KLT preparatif F3 Bobot (mg) 5.51 0.1 = 20 mg = 0.125 1.00 Kadar bioproduksi (mg/L) 7.

22 Lampiran 6 Hasil penentuan KHM fraksi F3. aureus ATCC 25923 (I). coli ATCC 25922 (II). E.  .4 (a) dan kontrol positif (b) terhadap S. albicans ATCC 10231 Tanda ( ) menunjukkan sumuran dengan konsentrasi terendah yang masih mempertahankan kebeningannya (nilai KHM dalam µg/mL). dan C.

(a) sebelum diinkubasi (b) setelah diinkubasi 24 jam (c) setelah diinkubasi 48 jam (d) kontrol pertumbuhan C.4 terhadap C. konsentrasi 32. albicans ATCC 10231 Cuplikan sumuran pada media PDA. albicans setelah diinkubasi 24 dan 48 jam . 16. masingmasing 20 µL.23 Lampiran 7 Optimasi penentuan KHM dan KBM fraksi F3. dan 8 µg/mL.