Περιεχόμενα

1. Εισαγωγή…………………………………………………………………………..3
2. Συνδυαστική βιοσύνθεση………………………………………………………….4
2.1. Στρατηγικές και μοριακά εργαλεία στη υπηρεσία της Συνδυαστικής
Βιοσύνθεσης……………………………………………………………5
3. Φυσικά προϊόντα με σημαντική βιοτεχνολογική σημασία………………………..5
3.1. Πολυκετίδια…………………………………………………………….6
3.1.1. Βιοσύνθεση πολυκετιδίων……………………………………………..6
3.1.2. Κατηγορίες συνθασών των πολυκετιδίων……………………………..7
3.1.2.1.

Οι συνθάσες PKs τύπου Ι……………………………………...8

3.1.2.2.

Οι συνθάσες PKs τύπου ΙΙ…………………………………....13

3.1.2.3.

Οι συνθάσες PKs τύπου ΙΙΙ…………………………………..15

3.2. Πεπτίδια που βιοσυντίθενται εκτός ριβοσωμάτων…………………....16
3.2.1. Βιοσύνθεση των NRPs……………………………………………….17
3.3. Υβριδικοί πεπτίδο-πολυκετιδικοί μεταβολίτες………………………..20
4. Χημική σύνθεση φυσικών προϊόντων και νέων φυσικών προϊόντων……………22
5. Χημειο-βιολογικές προσεγγίσεις για τη βιοσύνθεση νέων φυσικών προϊόντων...24
5.1. Χήμειο-ενζυμική σύνθεση in vitro…………………………………….24
5.1.1. Η in vivo χήμειο-ενζυμική σύνθεση γλυκοπεπτιδικών αντιβιοτικών..24
5.1.2. Γλυκοζυλίωση………………………………………………….…….25
5.2. Χήμειο-ενζυμική σύνθεση in vivo………………………..……………27
5.2.1. Βιοσύνθεση κατευθυνόμενη από τoν πρόδρομο μεταβολίτη……..….27
5.2.2. Μεταλλαξιογόνος βιοσύνθεση……………………………….………27
5.2.3. Χήμειο-βιοσύνθεση………………………………………………..…29
5.2.4. Βιοκατάλυση σε άθικτα κύτταρα………………………………….…30
5.2.5. Κατασκευή συνθετικών γονιδίων και Χήμειο-ενζυμική σύνθεση
αναλόγων των πολυκετιδίων……………………………………………31
6. Νέες Τεχνολογίες του Ανασυνδυασμένου DNA για τη βιοσύνθεση φυσικών
προϊόντων………………………………………………...………………………32
7. Εργαλεία για την ανεύρεση των μεταβολικών μονοπατιών βιοσύνθεσης των
φυσικών προϊόντων και εντοπισμός νέων φυσικών προϊόντων………………….35
7.1. Προσεγγίσεις για την ταυτοποίηση των σιωπηλών μεταβολικών
μονοπατιών………………………………………………………….…38

1

7.1.1. Διερεύνηση ολόκληρων γονιδιωμάτων…………………...………….38
7.1.2. Στρατηγική του PCR…………………………………………………39
7.1.3. Σάρωση του γονιδιώματος……………………………………….…..39
7.1.4. Πρόβλεψη

με

βάση

τη

βιοπληροφορική

ανάλυση

και

τις

φυσικοχημικές ή τις φαρμακολογικές ιδιότητες του τελικού προϊόντος.40
7.1.5. Συνδυασμός απενεργοποίησης γονιδίου και συγκριτική ανάλυση των
φυσικών προϊόντων……………………………………………….…….42
7.1.6. Συνδυασμός ετερόλογης έκφρασης και συγκριτικής ανάλυσης των
παραγομένων φυσικών προϊόντων…………………………………...…44
7.1.7. Γονίδιο-ισοτοπική προσέγγιση………………………………….…....44
7.1.8. Ενεργοποίηση του σιωπηλού μονοπατιού…………………….…..….45
7.1.9. Προσεγγιση της μεταγοδιωματικής…………………………………..47
8. Ετερόλογη έκφραση γονιδίων που κωδικοποιούν για μονοπάτια βιοσύνθεσης
φυσικών προϊόντων……………………………………...…………………...…..47
8.1. Γενικά θέματα που αφορούν στην ετερόλογη έκφραση των μονοπατιών
βιοσύνθεσης των πολυκετιδίων…………………………………….…48
8.2. Απευθείας μεταφορά του αποσυνθετικού συμπλέγματος γονιδίων, που
κωδικοποιούν για πολυκετίδια, σε γενετικά παρόμοιο παρένθετο
μικροοργανισμό……………………………………………...………..49
8.3. Ετερόλογη

έκφραση,

σε

γενετικά

παρόμοιους

παρένθετους

οργανισμούς, μεταβολικών μονοπατιών, τα οποία κωδικοποιούνται από
συμπλέγματα γονίδιων, που εδράζονται σε μεγάλα τμήματα DNA.….49
8.4. Ετερόλογη έκφραση σε γενετικά ανόμοιους, παρένθετους οργανισμούς,
μεταβολικών μονοπατιών, τα οποία κωδικοποιούνται από συμπλέγματα
γονίδιων, που εδράζονται σε μεγάλα τμήματα DNA…………..……...51
8.5. Η ετερόλογη έκφραση, σε συνδυασμό με τη συνδυαστική βιοσύνθεση,
αποτελεί τη βάση για βιοσύνθεση νέων φυσικών προϊόντων…………52
8.5.1. Συν-έκφραση ενός ή περισσότερων γονίδιων………………...…...…52
8.5.2. Πολλαπλό σύστημα πλασμιδίων για τη συν-έκφραση στο E.coli…....53
8.5.3. Κλωνοποίηση και τροποποίηση των γονίδιων, των μεταβολικών
μονοπατιών βιοσύνθεσης φυσικών προϊόντων, με τη χρήση της τεχνικής
της κλωνοποίησης μέσω ανασυνδυασμού………………..…………….53

2

Συνδυαστική Βιοσύνθεση βιοδραστικών δευτερογενών μεταβολιτών
1. Εισαγωγή
Οι οργανισμοί έχουν την ικανότητα βιοσύνθεσης απλών ή πολύπλοκων
χημικών ενώσεων (μεταβολίτες). Οι μεταβολίτες διαχωρίζονται σε δυο κατηγορίες,
στους πρωτογενείς και στους δευτερογενείς μεταβολίτες. Οι πρωτογενείς
μεταβολίτες απαντώνται σε όλους του οργανισμούς και περιλαμβάνουν βιομόρια που
ανήκουν στις κατηγορίες των σακχάρων, νουκλεοτιδίων, αμινοξέων και λιπαρών
οξέων. Σε αυτήν την κατηγορία ανήκουν και μεταβολίτες που απαιτούνται για την
ανάπτυξη και διαφοροποίηση των οργανισμών. Οι δευτερογενείς μεταβολίτες
παρουσιάζουν εξειδίκευση ανάλογα με το είδος του οργανισμού και επιδεικνύουν μια
τεραστία δομική και χημική ποικιλότητα. Ο αριθμός τους ξεπερνά αυτόν των
πρωτογενών μεταβολιτών και πλησιάζει τους 250.000. Πολλοί δευτερογενείς
μεταβολίτες παρουσιάζουν βιοδραστικές ιδιότητες.
Οι δευτερογενείς μεταβολίτες που παρουσιάζουν

βιοδραστικές ιδιότητες

συχνά αναφέρονται με τον όρο φυσικά προϊόντα. Οι μικροοργανισμοί και τα φυτά
βιοσυνθέτουν ένα σημαντικό αριθμό (περίπου 43.000) φυσικών προϊόντων. Στις
περισσότερες περιπτώσεις, ο βιολογικός τους ρόλος στους παραγωγούς οργανισμούς,
δεν είναι ξεκάθαρος. Οι βιοδραστικές ιδιότητες των δευτερογενών μεταβολιτών
βρίσκουν κυρίως εφαρμογές στη υγεία ως φάρμακα (αντι-ιϊκα, -βακτηριακά, καρκινικά και αντι-μυκητιακά), στη βιομηχανία και στη γεωργία. Το 45-50% των
χημικών ενώσεων που χρησιμοποιούνται σε κλινικές δοκιμές προέρχονται από
φυσικά προϊόντα. Τα πολυκετίδια (polyketides, PKs) και τα πεπτίδια που συντίθενται
εκτός ριβοσωμάτων (non-ribosomal proteins, NRPs) αποτελούν μερικά από τα πλέον
σημαντικά φυσικά προϊόντα.
Η αξιοποίηση των φυσικών προϊόντων όπως τα PKs και NRPs περιορίζεται
είτε λόγω της περιορισμένης παραγωγή τους από τους παραγωγούς οργανισμούς είτε
λόγω αδυναμίας καλλιέργειας του οργανισμού είτε της πολύπλοκης χημικής δομής
τους. Ως εκ τούτου, η αύξηση της παραγωγής τους, η διεύρυνση της ποικιλότητας της
χημικής δομής τους ώστε να διευρύνεται και η βιολογική τους δράση και η ανεύρεση
νέων φυσικών προϊόντων αποτελούν στόχους της Συνδυαστικής Βιοσύνθεσης
(Combinatorial Βiosynthesis), ενός κλάδου της Μεταβολικής Μηχανικής.

3

2. Συνδυαστική Βιοσύνθεση
Η Συνδυαστική Βιοσύνθεση είναι γνωστή ως η μεταβολική μηχανική των
μονοπατιών βιοσύνθεσης φυσικών προϊόντων. Ως Συνδυαστική Βιοσύνθεση, υπό
την στενή έννοια, ορίζεται η κατασκευή ενός μεταβολικού μονοπατιού, μέσω της
συναρμολόγησης γονίδιων από διαφορετικούς οργανισμούς, με σκοπό τη βιοσύνθεση
νέων φυσικών προϊόντων. Ωστόσο, υπό την ευρεία έννοια, η συνδυαστική
βιοσύνθεση είναι η in vivo ή η in vitro βιοσύνθεση οποιασδήποτε χημικής ένωσης, η
οποία παρουσιάζει κάποια βιοδραστική ιδιότητα. Ωστόσο, οι προοπτικές που
προσφέρει η συνδυαστική βιοσύνθεση περιορίζονται από βιολογικά και τεχνικά
προβλήματα.
Κατά αρχήν, δεν υπάρχουν κανόνες επιλογής των γονιδίων από τους
διάφορους οργανισμούς. Η στρατηγική της τυχαίας επιλογής γονιδίων αποτελεί
βασικό πρόβλημα, διότι με αυτόν τον τρόπο δε λαμβάνονται υπόψη τόσο οι
αλληλεπιδράσεις των πρωτεϊνών, οι οποίες επιτρέπουν τη ροή των ενδιαμέσων
μεταβολιτών όσο και η εξειδικευμένη δραστηριότητα των ένζυμων, η οποία τα
καθιστά ανενεργά ή μερικώς ενεργά για πολλά υποστρώματα.
Επιπλέον, η απόδοση πολλών παραγωγών μικροοργανισμών είναι εξαιρετικά
χαμηλή και οι οργανισμοί αυτοί δεν είναι δεκτικοί σε γενετικές επεμβάσεις. Ως εκ
τούτου, είναι απαραίτητη η μεταφορά και έκφραση των συμπλεγμάτων γονιδίων που
κωδικοποιούν το μεταβολικό μονοπάτι σε διάφορους ξενιστές ώστε να βελτιωθεί η
παραγωγή του.
Η μεταφορά σε νέο ξενιστή δημιουργεί νέα προβλήματα, όπως την κατασκευή
κατάλληλων φορέων μεταφοράς, διότι τα συμπλέγματα γονιδίων (π.χ. PKs και NRPs)
έχουν τεράστιο μέγεθος (30-250kb). Επίσης, το μεγάλο μέγεθος των συμπλεγμάτων
γονιδίων απαιτεί νέες προσεγγίσεις, ώστε να είναι δυνατόν να πραγματοποιηθούν
γενετικές επεμβάσεις που αποσκοπούν στην απενεργοποίηση ή/και τροποποίηση των
υπαρχόντων γονιδίων ή την ενσωμάτωση νέων γονιδίων στο υπάρχον σύμπλεγμα.
Επίσης, μερικά από τα αναμενόμενα προβλήματα, είναι η επάρκεια
πρωτογενών μεταβολιτών καθώς και η ρύθμιση του μεταβολικού μονοπατιού στο
ξενιστή. Σημαντικό πρόβλημα, επίσης, είναι το γεγονός ότι πολλά γονίδια δεν
εκφράζονται επαρκώς στον ξενιστή ή τα προϊόντα δεν είναι λειτουργικά.

4

Η ανάπτυξη της Συνδυαστικής Βιοσύνθεσης (Σ.Β.) των φυσικών προϊόντων
και ιδιαίτερα των πολυκετιδίων, απαιτεί την ανάπτυξη νέων τεχνολογιών και
στρατηγικών.
2.1. Στρατηγικές και μοριακά εργαλεία στη υπηρεσία της Συνδυαστικής
Βιοσύνθεσης
Η στρατηγική που ακολουθείται έχει δυο άξονες. Ο πρώτος άξονας αφορά
στην επιλογή του βιοδραστικού προϊόντος και ο δεύτερος αφορά στις τεχνολογικές
δυνατότητες βιοσύνθεσης νέων φυσικών προϊόντων με διευρυμένη ή/και ενισχυμένη
φαρμακολογική δράση.
Η επίτευξη αυτών των στρατηγικών στόχων προϋποθέτει την ανάπτυξη νέων
μοριακών εργαλείων ιδιαίτερα στην περίπτωση των πολυκετιδίων (Polyketides, PKs)
και των πεπτιδίων που βιοσυντίθενται εκτός ριβοσωμάτων (Nonribosomal proteins,
NPRs). Μερικά από τα πιο σημαντικά μοριακά εργαλεία είναι τα εξής:
1. ο εντοπισμός νέων φυσικών προϊόντων και η ανεύρεση των μεταβολικών
μονοπατιών βιοσύνθεσής τους
2. η ανάπτυξη νέων μεθόδων κλωνοποίησης και τροποποίησης μικρών ή
μεγάλων τμημάτων DNA
3. η έκφραση εξαιρετικά μεγάλων τμημάτων DNA,
4. η χημική σύνθεση των φυσικών προϊόντων ή προδρόμων τους και η
τροποποίησή τους μέσω βιολογικών προσεγγίσεων
5. η σάρωση δεκάδων χιλιάδων νέων φυσικών προϊόντων για βιολογική δράση.

3. Φυσικά προϊόντα με σημαντική βιοτεχνολογική σημασία
Τα πολυκετίδια και τα πεπτιδία που βιοσυντίθενται εκτός ριβοσωμάτων
κατέχουν προνομιούχο θέση μεταξύ των άλλων φυσικών προϊόντων σε ότι αφορά την
βιοτεχνολογική τους σημασία διότι αποτελούν φυσικά προϊόντα με εξαιρετικά
σημαντική φαρμακολογική δράση. Για παράδειγμα, οι πωλήσεις του πολυκετιδίου
lovastatin το 2007 ξεπέρασαν τα 5δις δολάρια.

5

6 . Το ευρύ φάσμα βιοδραστικών ιδιοτήτων των PKs έχει καταστήσει αυτά τα μόρια το επίκεντρο διερεύνησης τόσο σε ότι αφορά τις δυνατότητες υπερπαραγωγής τους όσο και της επέκτασης της δομικής τους πολυπλοκότητας. Άλλες μικροβιακές πηγές παραγωγής PKs αποτελούν τα μυξοβακτήρια και ορισμένοι μύκητες. ως υπόστρωμα επιμήκυνσης της ανθρακικής αλυσίδας. PKs) είναι μια ομάδα δευτερογενών μεταβολιτών με εξαιρετική ποικιλότητα σε ότι αφορά τη δομή και τις βιολογικές τους ιδιότητες. ως υπόστρωμα έναρξης και το μηλονύλο-CoA. μαλάκια και έντομα. Βιοσύνθεση πολυκετιδίων Η διαδικασία βιοσύνθεσης των PKs είναι παρόμοια με αυτή των λιπαρών οξέων. 3. Οι συνθάσες των λιπαρών οξέων (Fatty acid synthases. Επιπλέον. PKs έχουν εντοπισθεί και χαρακτηρισθεί σε φυτά.1. καταστολή καρκινικών κυττάρων. καρδιακές νόσους και φλεγμονές. οι συνθάσες των πολυκετιδίων (PKSs) αξιοποιούν ένα πλήθος ακυλο-ομάδων ως υπόστρωμα έναρξης και επιμήκυνσης (Εικόνα 1). FASs) χρησιμοποιούν σχεδόν αποκλειστικά το ακέτυλο-CoA. Ο φυσιολογικός ρόλος των PKs σε αυτούς τους οργανισμούς δεν είναι ακόμα γνωστός. Πολυκετίδια Τα πολυκετίδια (polyketides. σπόγγους.1. Περίπου το 60% των βιοδραστικών PKs προέρχονται από ακτινοβακτήρια.1.3. Αντίθετα. Ένας σημαντικός αριθμός PKs έχει δοκιμασθεί σε κλινικές μελέτες και χρησιμοποιούνται ως φάρμακα ενάντια σε πολλές μικροβιακές ή ιολογικές μολύνσεις. στα βακτήρια και στα ζώα.

με βάση την αρχιτεκτονική των δομικών (λειτουργικών) περιοχών (domains). ομαδοποιούνται σε 3 τύπους: τύπου Ι. Τα γονίδια που κωδικοποιούν τις PKSs συνήθως οργανώνονται σε oπερόνια (βακτήρια) ή συμπλέγματα γονίδιων (ευκαρυωτικά). Εικόνα 6). Κατηγορίες συνθασών των πολυκετιδίων Οι συνθάσες των πολυκετιδίων (PKSs) είναι μια ομάδα ενζύμων ή συμπλεγμάτων ενζύμων εξαιρετικά μεγάλου μοριακού βάρους. τύπου ΙΙ και τύπου ΙΙΙ.2.1. Οι PKSs. 3. η οποία αναφέρεται ως άρθρωμα (module) (Εικόνα 2. Στις συνθάσες τύπου ΙΙ οι δομικές περιοχές αποτελούν διακριτές πολυπεπτιδικές αλυσίδες και κάθε πολυπεπτιδική αλυσίδα έχει συγκεκριμένη ενζυμική δράση ενώ στις συνθάσες τύπου Ι οι δομικές περιοχές συντήκονται και απαρτίζουν μια πολυπεπτιδική αλυσίδα. 7 . Υποστρώματα που χρησιμοποιούνται στη βιοσύνθεση πολυκετίδιων (PKS) και των λιπαρών οξέων (FAS).Εικόνα 1. Οι συνθάσες Τύπου ΙΙΙ είναι απλούστερες και μοιάζουν με τη συνθάση της χαλκόνης των φυτών. Οι PKSs Τύπου Ι μοιάζουν τη συνθάση των λιπαρών των βακτηρίων ενώ οι Τυπου ΙΙ μοιάζουν με τη συνθάση των λιπαρών των θηλαστικών. Τα αρθρώματα ενώνονται και σχηματίζουν μια γραμμή παραγωγής.

στο οποίο προσδένεται μέτα-μεταφραστικά μια φωσφοπαντεθεΐνη. 3. οι οποίες είναι: η άκυλο-μεταφοράση (ΑΤ).2. η οποία συγκρατεί την αναπτυσσομένη πολυκετιδική αλυσίδα μέσω ενός θειοστερικού δεσμού. Στην πρώτη κατηγορία ανήκουν οι αρθρωτές Τύπου Ι PKS. Η ΑΤ καταλύει είτε την επιλογή του μορίου έναρξης είτε του μορίου επέκτασης και τη μεταφορά του στη δομική περιοχή ACP. Η πρόσδεση της φωσφοπαντεθεΐνης στη σερίνη καταλύεται από μεταφοράσες της φωσφοπαντεθεΐνης (PPTases). Η βκέτο-άκυλο-συνθάση (KS) καταλύει τη δημιουργία C-C δεσμών και την επιμήκυνση της ανθρακικής αλυσίδας (Εικόνα 3). Οι συνθάσες PKs τύπου Ι Οι συνθάσες PKs τύπου Ι ομαδοποιούνται σε δυο κατηγορίες. οι οποίες είναι οργανωμένες σε αρθρώματα (Εικονα 6). Συνθάσες των πολυκετιδίων Τύπου Ι (Β) και Τύπου ΙΙ (Α).1.1. Συνήθως οι PPTases κωδικοποιούνται από γονίδια που εδράζονται κοντά στο σύμπλεγμα των PKSs. Κάθε άρθρωμα φέρει τις βασικές λειτουργικές (δομικές) περιοχές. 8 . Όλες οι ACP δομικές περιοχές φέρουν ένα συντηρημένο κατάλοιπο σερίνης. η άκυλο μεταφέρουσα πρωτεΐνη (Τ ή ACP) και η β-κέτο-άκυλο-συνθάση (KS).Εικόνα 2.

DH και ER λειτουργούν διαδοχικά και ολοκληρώνουν τη διαδικασία επιμήκυνσης. Διαδικασίες έναρξης και επιμήκυνσης της πολυκετιδικής αλυσίδας. μια αφυδατάση. ACP και KS). Οι δομικές περιοχές KR. Οι δομικές περιοχές που συνήθως απαντώνται στα διάφορα αρθρώματα περιλαμβάνουν μια β-κέτο-αναγωγάση (KR). 9 . DH και ER.Εικόνα 3. μηλονύλο ή μέθυλο-μηλονύλο θειοεστέρα) που έχει εκφορτωθεί στην κατωφερική ΑCP. Κατά την έναρξη της διαδικασίας η ΑΤ επιλέγει το υπόστρωμα (π. Η συμπύκνωση έχει ως αποτέλεσμα την επιμήκυνση της πολυκετιδικής αλυσίδας. προπιονύλο-CοΑ) το ενεργοποιεί και μεταφέρει την ενεργοποιημένη προπιονύλο-ομάδα στη φωσφοοπαντεθεΐνη της γειτονικής ΑCP. συνήθως. (b) Βασική μονάδα (φέρει τις δομικές περιοχές AT. η οποία άρχισε με την ΑΤ και την ΚS (Εικόνα 4 ).χ. Κάθε άρθρωμα. (c) Μονάδα φόρτωσης/έναρξης (φέρει τις δομικές περιοχές AT και ACP) .χ. η οποία καταλύει την αναγωγή των κέτο-ομάδων προς αλκοολικές. Αντιδράσεις που καταλύονται από τις KR. φέρει και επιπρόσθετες λειτουργικές δομικές περιοχές που καταλύουν άλλες αντιδράσεις. Η KS αποκαρβοξυλιώνει το ενεργοποιημένο υπόστρωμα (π. Εικόνα 4. η οποία καταλύει την τελική αναγωγή για τον πλήρη κορεσμό του μορίου των πολυκετιδίων. δημιουργώντας ένα καρβανιόν (το καρβανιόν αναπαρίσταται ως μια ομάδα με αρνητικό πρόσημο) και καταλύει τη συμπύκνωση του με τον ενεργοποιημένο μηλονύλο-θειοεστέρα. H ανωφερική ΑCP μεταφέρει την προπιονύλο-ομάδα σε ένα συντηρημένο κατάλοιπο σερίνης (αναπαρίσταται ως SH) της ΚS. (DH) η οποία καταλύει την απομάκρυνση ενός μορίου νερού και δίδει ακόρεστους θειοεστέρες ή/και μια ενόυλο-αναγωγάση (ER).

10 . φέρει μια δομική περιοχή. Στις αρθρωτές PKS. Επίσης. Έχουν προταθεί δυο κατηγορίες συνδέσμων. τα οποία εδράζονται σε διαφορετικές πολυπεπτιδικες αλυσίδες. Εικόνα 5. με αποτέλεσμα την απελευθέρωση και κυκλοποίηση της πολυκετιδικής αλυσίδας προς μακρολακτόνη (Εικόνα 5Β).Το τελικό άρθρωμα της γραμμής παραγωγής των Tύπου Ι PKS. Η συνθάση της DEBS καταλύει το σχηματισμό της 6-deoxyerythronolide B (6-dEB). οι διαφορετικές δομικές περιοχές συνδέονται μεταξύ του με συνδέσμους (αλληλουχίες 17-21 αμινοξέων). έχει προταθεί η ύπαρξη συνδέσμων μεταξύ των δομικών περιοχών. η οποία έχει δράση θειοεστεράσης (ΤΕ) και η οποία καταλύει την υδρόλυση του θειοεστερικού δεσμού και απελευθέρωση της μακρολιδικής αλυσίδας (Εικόνα 5Α) ή μια ενδομοριακή αντίδραση. Οι σύνδεσμοι. πέραν των βασικών και των επιπρόσθετων δομικών περιοχών. οι οποίοι συνδέουν ομοιοπολικά αρθρώματα. Η βιοσύνθεση της ερυθρομυκίνης (erythromycin) αποτελεί ένα κλασικό παράδειγμα της λειτουργίας την αρθρωτών συνθασών των πολυκετιδίων (Εικόνα 6). Η δράση της ΤΕ που εδράζεται στο τελικό άρθρωμα. τα οποία ανήκουν στην ίδια πολυπεπτιδική αλυσίδα και οι σύνδεσμοι οι οποίοι συνδέουν αρθρώματα.

τα οποία κατανέμονται σε τρεις πρωτεΐνες (DEBS1. η ώριμη πολυκετιδική αλυσίδα απελευθερώνεται (release) και κυκλοποιείται μέσω της δράσης μιας θειοεστεράσης (TE). μια αναγωγική δομική περιοχή καταλύει την αναγωγή της κετονικής ομάδας.ενδιάμεσου μεταβολίτη στη διαδικασία βιοσύνθεσης της ερυθρομυκίνης. Η αναπτυσσόμενη πολυκετιδική αλυσίδα μεταφέρεται από την ACP του αρθρώματος 2 στην KS του επόμενου αρθρώματος. Κάθε μια από τις DEBS φέρει δύο αρθρώματα. δεν έχει αντιβιοτική δράση. σε αυτήν τη φάση. H DEBS1 φέρει το αρχικό άρθρωμα φόρτωσης (loading). Η γραμμή παραγωγής (assembly line) της 6-dEB περιέχει 7 αρθρώματα. Η 6-dEB γλυκοσυλιώνεται (tailoring steps) προκειμένου να σχηματισθεί η βιοδραστική erythromycin. Με αυτό τον τρόπο και προοδευτικά. επεκτείνεται το μήκος της πολυκετιδικής αλυσίδας (χρησιμοποιείται κάθε φορά ένα μόριο μέθυλο-μηλονύλο-CoA). Οι δομικές περιοχές AT και ACP του αρθρώματος φόρτωσης φορτώνουν το προπιονύλο-CoA (μόριο έναρξης) στην KS του αρθρώματος 1 ενώ η AT δομική περιοχή του αρθρώματος 1 φορτώνει το μέθυλομηλονύλο (μόριο επέκτασης) στην ACP δομική περιοχή του αρθρώματος 1. Στη συνεχεία. Στο τέλος της διαδικασίας. Μετά από κάθε επέκταση της αλυσίδας γίνεται η αναγωγή της κετονο-ομάδας. 2 και 3). όπου εδράζονται οι καταλυτικές δραστηριότητες της συμπύκνωσης. Η 6-dEB. Η αντίδραση της συμπύκνωσης καταλύεται από την KS του αρθρώματος 1. 11 .

Οι μύκητες διαθέτουν τρεις υπο-κατηγορίες τύπου Ι PKS (Εικόνα 7). οι οποίες λειτουργούν κατά ένα επαναληπτικό τρόπο.Εικόνα 6. 12 . Δομή και οργάνωση της συνθάσης της deoxyerythronolide B (DEBS) και διαδικασίες βιοσύνθεσης της ερυθρομυκίνης. Δηλαδή. το ίδιο πολυενζυμικό σύστημα χρησιμοποιείται πολλές φορές. Στη δεύτερη κατηγορία ανήκουν οι επαναλαμβανόμενες (iterative type I PKS).

άρθρωμα επέκτασης (extension). Οι συνθάσες PKs τύπου ΙΙ Οι PKSs Τύπου ΙΙ λειτουργούν με ένα επαναληπτικό τρόπο (iterative fashion) και καταλύουν τη βιοσύνθεση αρωματικών πολυκετιδίων.Εικόνα 7 . D. όπως κετοαναγωγάσες (KR). H KSa καταλύει την αντίδραση της συμπύκνωσης ενώ η KSb δε φέρει την ενεργό κυστεΐνη (απαραίτητη για τη δραστηριότητα της συμπύκνωσης) και καταλύει την αποκαβοξυλίωση του μηλονύλο-ACP προς ακέτυλο-ACP. Διάταξη των γονίδιων στις PKS των μυκήτων. κατά την έναρξη της σύνθεσης των πολυκετιδίων. β) μια ακυλο-μεταφοράση (ΑΤ) και γ) μια ακυλο-μεταφέρουσα πρωτεΐνη (ACP η Τ). 3. Αναγωγική PKS-NRPS. Αρθρωμα φόρτωσης (loading). Επιπρόσθετες ενζυμικές υπομονάδες. τελικό άρθρωμα (processing). Μερικά αναγωγική PKS από το Penicillium patulum. Η αναπτυσσόμενη πολυκετιδική αλυσίδα επιμηκύνεται κατά δύο ή τρία άτομα άνθρακα σε κάθε κύκλο αλλά παραμένει συνδεδεμένη στην ίδια Τ δομική περιοχή ενώ η KS και η ΑΤ δρουν επαναληπτικά (Εικόνα 8). C. κυκλάσες (CY) και αρωματάσες (ARO) συνεργάζονται με τη «βασική μονάδα» για την ολοκλήρωση της βιοσύνθεσης του πολυκετιδίου. H KSb συχνά αναφέρεται ως παράγοντας επιμήκυνσης (CLF). Αναγωγική PKS από το Aspergillus terreus.1. Β. οι οποίες συνιστούν τη «βασική μονάδα» (Εικόνα 8): α) ένα ετεροδιμερές της κετοσυνθάσης a (KSa) και της κετοσυνθάσης b (KSb ή CLF). Μη-αναγωγική PKS.2. Στη συγκροτημένη τύπου ΙΙ ΡKS υπάρχει μόνο μια Τ δομική περιοχή. 13 . μια ΑΤ δομική περιοχή και μια δομική περιοχή KS για τα βήματα που αφορούν την επιμήκυνση της πολυκετιδικής αλυσίδας. Μια τυπική τύπου ΙΙ PKS αποτελείται από τρεις πρωτεΐνες. Α.2.

Μια δομική περιοχή (KR δραστηριότητα) ανάγει την πολυκετιδική αλυσίδα και μια άλλη δομική περιοχή (δράση κυκλάσης) κυκλοποιεί την πολυκετιδική αλυσίδα.Εικόνα 8. Κατά την έναρξη της διαδικασίας. Η KS καταλύει τη συμπύκνωση της 1ης και της 2ης άκυλο-ομάδας. Στη συνεχεία. Εικόνα 9. Βιοσύνθεση της δοξορουβικίνης. Η ΑΤ καταλύει το φόρτωμα μια 2ης άκυλο-ομάδας στην περιοχή Τ. η οποία καταλύει την επαναλαμβανόμενη συμπύκνωση ενός προπιονύλο-CoA και εννέα μηλονύλο-CoA προς το σχηματισμό του τετρακυκλικού ανθρακικού σκελετού του αντιβιοτικού δοξορουβικίνη (Εικόνα 9). η Τ μεταφέρει ένα μηλονύλο-CoA στην ΚS και έχουμε μια νέα συμπύκνωση του κετοβαλερύλο-CoA με το μηλονύλο-CoA. 14 . Ένα τυπικό παράδειγμα της Τύπου ΙΙ PKS αποτελεί η συνθάση της δοξορουβικίνης (doxorubicin). μια ΑΤ δομική περιοχή καταλύει το φόρτωμα του προπιονύλο-CoA και στη συνέχεια του μηλονύλο-CoA. Στη συνεχεία. Η KS καταλύει το σχηματισμό ενός κετοβαλερύλο-CoA. η 1η άκυλοομάδα μεταφέρεται στην περιοχή KS. Η ΑΤ καταλύει το φόρτωμα μιας άκυλο-ομάδας (1ης) στην Τ. μέσω της διαδοχικής προσθήκης του μηλονύλο-CoA προς το σχηματισμό ενός δεκακετιδίου (ανθρακυκλινικός δακτύλιος). Η δοξορουβικίνη αλληλεπιδρά με το DNA και αναστέλλει τη βιοσύνθεσή της. Η διαδικασία αυτή επαναλαμβάνεται 8 φορές χρησιμοποιώντας ως υπόστρωμα το προηγούμενο ολιγοκετίδιο. το οποίο παραμένει συνδεδεμένο στην ΚS.

το οποίο. Οι συνθάσες PKs τύπου ΙΙΙ Οι συνθάσες τύπου ΙΙΙ περιλαμβάνουν τις φυτικές συνθάσες της χαλκόνης. Εικόνα 10. χρησιμοποιούν τo υπόστρωμά τους (μηλονύλο-CoA) χωρίς την παρέμβαση μιας άκυλο-μεταφέρουσας πρωτεΐνης ( ACP ). 15 .3. όπως είναι οι συνθάσες που καταλύουν τη βιοσύνθεση φυσικών προϊόντων. Οι φυτικές συνθάσες τύπου ΙΙΙ είναι ομοδιμερή. Ένα παράδειγμα συνθάσης Τύπου ΙΙΙ αποτελεί η συνθάση ΤΗΝ. κυκλοποιείται προς τέτρα-υδρξυναφθαλένιο (ΤΗΝ). Η THN συνθάση των πολυκετιδίων (RppA) καταλύει τη συμπύκνωση πέντε μηλονύλο-CoA προς το σχηματισμό ενός πεντακετιδίου.1.2. η οποία καταλύει τη συμπύκνωση πέντε μορίων μηλονύλο-CoA προς το σχηματισμό ενός πεντακετιδίου και την κυκλοποίησή του προς τετραυδροξυναφθαλένιο (ΤΗΝ) (Εικόνα 10 ). στη συνεχεία. ανήκουν στις επαναλαμβανόμενες PKSs και φέρουν δυο ενεργές περιοχές. Διαδικασίες βιοσύνθεσης της ναπυραδιομυκίνης (napyradiomycin). οι οποίες καταλύουν μία ή διαδοχικές αντιδράσεις της συμπύκνωσης. Οι αλληλουχίες αμινοξέων αυτών συνθασών δεν παρουσιάζουν σημαντικές ομολογίες. αντίθετα με όλες τις άλλες συνθάσες των PΚs. ωστόσο ανάλυση της κρυσταλλικής δομής μέσω περίθλασης ακτίνων Χ έδειξε ότι διαθέτουν κοινές δομές με τις άλλες συνθάσες των PΚs. Το ΤΗΝ αποτελεί ένα ενδιάμεσο μεταβολίτη στη βιοσύνθεση του αντιβιοτικού napyradiomycin. όπως το αντιβιοτικό βανκομικίνη (vancomycin). Οι συνθάσες τύπου ΙΙΙ. Στην ομάδα των τύπου ΙΙ συνθασών ανήκουν και βακτηριακής προέλευσης συνθάσες. τις συνθάσες του στιλβενίου και τις συνθάσες της ρεσβερατόλης.3.

παρουσιάζουν ένα ευρύ φάσμα βιοδραστικών ιδιοτήτων (π.3. Τα αμινοξέα ενός NRP μπορεί να υποστούν τροποποιήσεις. όπως γλυκουιλίωση. ανοσοκατασταλτικά. Αμινοξέα που απαντώνται στα NRP Τα NRPs που έχουν απομονωθεί από διάφορους μικροοργανισμούς (βακτήρια και μύκητες).2 Πεπτίδια που βιοσυντίθενται εκτός ριβοσωμάτων Ο όρος πεπτίδια που βιοσυντίθενται εκτός ριβοσωμάτων (NonRibosomal Peptides. κυτταροστατικά. των οποίων η βιοσύνθεση δεν πραγματοποιείται στα ριβοσώματα. κυκλικά ή διακλαδιζόμενα πεπτίδια. αντιβακτηριακά) (Εικόνα 12). Εικόνα 11. NRPs) αναφέρεται σε γραμμικά. 16 . αλογόνωση και υδροξυλίωση. Τα αμινοξέα που χρησιμοποιούνται για τη βιοσύνθεση των NRP ανήκουν είτε στην κατηγορία των πρωτεΐνογενών (απαντώνται σε πρωτεΐνες) είτε στην κατηγορία των μη-πρωτεΐνογενών (δεν απαντώνται σε πρωτεΐνες) είτε είναι άρυλo-οξέα (aryl acids) (Εικόνα 11). ακυλίωση.χ. αποτελούμενα από λιγότερα από 20 κατάλοιπα αμινοξέων.

Τ και C. Η κυκλοσπορίνη έχει ανοσοκατασταλτική δράση. οι οποίες καταλύουν τη βιοσύνθεση ολιγοπεπτιδίων χωρίς τη συμμετοχή ριβοσωμάτων. καθώς και ο τύπος των δομικών περιοχών κάθε αρθρώματος. η μπλεομυκίνη έχει αντικαρκινική δράση.1. διότι καθορίζει τόσο τη σειρά όσο και το είδος του αμινοξεος που θα ενσωματωθεί. η οποία καταλύει το σχηματισμό του πεπτιδικού δεσμού μεταξύ του άμινο-άκυλο ή 17 . 3. προσδιορίζει τη δομική ποικιλότητα κάθε ενός από τα NRPs που παράγονται από τις διάφορες NRPSs. Ο αριθμός και η σειρά των αρθρωμάτων. τις NRP συνθετάσες (NRPSs). Η δομή αντιπροσωπευτικών NRPs και οι βιοδραστικές τους ιδιότητες. Ένα τυπικό άρθρωμα NRPS αποτελείται από τις δομικές περιοχές Α. Τη δομική περιοχή συμπύκνωσης C. η αντεροβακτίνη έχει δράση σιδεροφόρου και η γραμισιδίνη έχει δράση αντιβιοτικού. H δομική περιοχή αδενυλίωσης (A) είναι υπεύθυνη για την επιλογή και ενεργοποίηση του υποστρώματος προς ένα ΑΜΡ-εστέρα καθώς και την πρόσδεση του θειοεστέρα στη φωσφοπαντεθεΐνη της δομικής περιοχής Τ (συχνα αναφέρεται ως PCP) με την ταυτόχρονη κατανάλωση ΑΤΡ (Εικόνα 13Α). καθώς και τις τροποποιήσεις που θα γίνουν. Βιοσύνθεση των NRPs Η βιοσύνθεση των NRPs πραγματοποιείται από μια κατηγορία πολυλειτουργικών πρωτεϊνών.2. Οι NRPSs οργανώνονται σε αρθρώματα και κάθε άρθρωμα φέρει όλες εκείνες τις λειτουργίες που απαιτούνται για την ενσωμάτωση και τροποποίηση ενός αμινοξέος.Εικόνα 12.

Το άρθρωμα έναρξης των NRPSs. Εικόνα 13. τη δομική περιοχή αναγωγής (R) και τη δομική περιοχή οξείδωσης (Ox). Διαδικασίες έναρξης και επέκτασης. αποτελείται από δύο δομικές περιοχές. 18 . Στο τελικό άρθρωμα των NRPSs. η οποία καταλύει το σχηματισμό ετεροκυκλικων δακτυλίων. την A και την Τ. συμπύκνωσης και μετατόπισης της αναπτυσσόμενης ολιγοπεπτιδικής αλυσίδας. (Α) Η δομική περιοχή Α καταλύει την αδενυλίωση του αμινοξέος καθώς και την ακυλίωσή του στη δομική περιοχή Τ. οι δομικές περιοχές έχουν την ακόλουθη διάταξη: C-A-Τ. Η ολιγοπεπτιδική αλυσίδα επιμηκύνεται διατηρώντας μια ελεύθερη αμινομάδα στο Ν-άμινο αμινοξύ. καταλύει την απομάκρυνση ή την κυκλοποίηση της ολιγοπεπτιδικής αλυσίδας (Εικόνα 5Α). τη δομική περιοχή της μεθυλομεταφοράσης (ΜΤ). συνήθως. οι οποίες καταλύουν τον επιμερισμό (Ε) ενος L-αμινοξέος προς D-αμινοξύ (Εικόνα 13). H TE δομική περιοχή. Η λειτουργία του αφορά στην επιλογή του αμινοξέος και τη σύνδεσή του στη δομική περιοχή Τ. (Β) Η δομική περιοχή C καταλύει το σχηματισμό του δεσμού C-N μεταξύ του ανωφερικού πεπτιδύλο-Τ και του κατωφερικού άμινο-άκυλο Τ. όπως και στις συνθάσες των PKs. Τα αρθρώματα μπορεί να φέρουν επιπλέον δομικές περιοχές. Το διπεπτίδιο παραμένει προσδεδεμένο στη Τ δομική περιοχή του κατωφερικού αρθρώματος. η οποία καταλύει τη μεταφορά μιας μέθυλο ομάδας από τη S-αδενόσυλο-μεθειονίνη σε μια αμινομάδα (Ν-μεθυλίωση) (Εικόνα 14). Το αποτέλεσμα είναι η επιμήκυνση κατά ένα κατάλοιπο αμινοξέος. τη δομική περιοχή κυκλοποίησης (Cy).πεπτιδύλο-S-PCP από το ανωφερικό άρθρωμα και του άμινο-άκυλο κατάλοιπου που είναι προσδεδεμένο στη Τ δομική περιοχή του κατωφερικού αρθρώματος (Εικόνα 13Β).

7 από τα 11 κατάλοιπα στην κυκλοσπορίνη είναι μεθυλιωμένα. Η βιοσύνθεση της σουρφακτίνης (surfactin) αποτελεί ένα κλασικό παράδειγμα της λειτουργίας των αρθρωτών NRP συνθασών (Εικόνα 16). Πολλά NRPs φέρουν κατάλοιπα Ν-μεθυλιωμένων αμινοξέων. Εικόνα 16. Για παράδειγμα. που εμπλέκεται στη βιοσύνθεση του κυκλικού λιποπεπτιδίου σουρφακτίνη. Διαδικασίες επιμερισμού των αμινοξέων που απαντώνται στα NRPs Εικόνα 15. Το αντιβιοτικό αυτό έχει την ικανότητα να διαπερνά τη μεμβράνη των Gramαρνητικών και των Gram-θετικών βακτηρίων. το όποιο είναι συνδεδεμένο με ένα από τα αμινοξέα. που απαντώνται στα NRPSs. 19 . Διαδικασίες Ν-μεθυλίωσης των αμινοξέων. Η σουρφακτίνη αποτελείται από επτά αμινοξέα σε κυκλικό σχηματισμό και ένα λιπαρό οξύ με 13-15 άτομα άνθρακα. Οργάνωση της NRP συνθετάσης της σουρφακτίνης (surfactin).Εικόνα 14.

τα οποία προέρχονται βιοσυνθετικά από αμινοξέα και μικρού μήκους ανθρακικής αλυσίδας καρβοξυλικά οξέα. Παραδείγματα υβριδικών πεπτίδο-πολυκετιδικών φυσικών προϊόντων. 20 .3. Μερικά παραδείγματα των υβριδικών πεπτίδο-πολυκετιδικών φυσικών προϊόντων. Εικόνα 17.3. Οι σκιασμένες περιοχές προσδιορίζουν τα σημεία σύνδεσης του πεπτιδικού και του πολυκετιδικού τμήματος. Υβριδικοί πεπτίδο-πολυκετιδικοί μεταβολίτες Ως υβριδικοί πεπτίδο-πολυκετιδικοί μεταβολίτες (NPR-PK) θεωρούνται τα φυσικά προϊόντα. δίδονται στην εικόνα 17. με βιοδραστικές ιδιότητες.

Στην πρώτη κατηγορία ανήκουν τα NRP-PKs. Τα περισσότερα φυσικά προϊόντα βιοσυντίθενται από ενζυμικά συστήματα της πρώτης κατηγορίας. Ένα τυπικό παράδειγμα βιοσύνθεσης υβριδικού πεπτίδο-πολυκετιδικού φυσικού προϊόντος δίδεται στην εικόνα 18Β. (Β) Το μονοπάτι βιοσύνθεσης της μπλεομυκίνης. τα υβριδικά NRP-PKs διαχωρίζονται σε δυο κατηγορίες. τα οποία βιοσυντίθενται από φυσικά συνδεδεμένα συμπλέγματα γονίδιων.Η βιοσύνθεση των NRP-PKs δεν προϋποθέτει την άμεση λειτουργική σχέση μεταξύ των NRPSs και PKSs. 19 και 20 αναφέρονται σε ενδιάμεσους μεταβολίτες του μονοπατιού. 18. που έχουν απομονωθεί από καλλιέργειες του παραγωγού οργανισμού S. η υβριδική NRPS-PKS καταλύει την άμεση μεταφορά ενός NRPS-προσδεμένου πεπτιδύλο-ενδιάμεσου σε άρθρωμα της PKS. Οργάνωση της υβριδικής συνθάσης της μπλεομυκίνης (bleomycin). το πολυκετιδικό τμήμα συντίθεται ανεξάρτητα από το πεπτιδικό και στη συνέχεια συνδέονται με τη δράση μιας λιγάσης. (Α) Η συνθάση της μπλεομυκίνης αποτελείται από 10 αρθρώματα NRPS και 1 άρθρωμα PKS. Στην πρώτη κατηγορία. Στη δεύτερη κατηγορία. 21 . Οι αριθμοί. Α Β Εικόνα 18.verticillus και ο αριθμός 7 αναφέρεται στη μπλεομυκίνη. που κωδικοποιούν NRPS-PKS (Εικονα 18Α) ενώ στη δεύτερη κατηγορία τα συμπλέγματα γονίδιων που κωδικοποιούν NRPS και PKS δεν είναι συνδεδεμένα. Με βάση το μηχανισμό βιοσύνθεσής τους.

η lovastatin είναι ένα πολυκετίδιο. όπως είναι τα πολυκετίδια.4. όταν τροποποιηθούν μέσω της ημι-σύνθεσης (amoxillin. Συχνά.χ. methicillin. το οποίο παράγεται από διάφορους οργανισμούς. Για παράδειγμα. διότι το παράγωγο του φυσικού προϊόντος. παρουσιάζουν μεγαλύτερη ανθεκτικότητα στις β-λακταμάσες (πενικιλινάσες). φαρμακολογικά πιο ενεργό και ασφαλέστερο του πρωτογενούς φυσικού προϊόντος. Η ημι-σύνθεση χρησιμοποιείται όταν το φυσικό προϊόν έχει πολύπλοκη χημική δομή και η ολική χημική σύνθεσή του είναι αναποτελεσματική. ο αρωματικός δακτύλιος φέρει δυο μεθυλομάδες). Η διαδικασία της ημι-σύνθεσης για την τροποποίηση φυσικών προϊόντων φαρμακοβιομηχανία. 22 . διότι μειώνει τα επίπεδα χοληστερόλης και βιοσυντίθεται στο μύκητα Aspergillus terreus. η οποία προέρχεται από χημική παρέμβαση στη δομή της lovastatin (Εικόνα 17Α) και παρουσιάζει πιο αποτελεσματική δράση σε σύγκριση με τη lovastatin. η ημι-συνθετική διαδικασία είναι απαραίτητη. Χημική σύνθεση φυσικών προϊόντων και νέων φυσικών προϊόντων Ένας σημαντικός αριθμός φυσικών προϊόντων έχει κατασκευασθεί μέσω ολικής χημικής σύνθεσης (total chemical synthesis) από απλές πρώτες ύλες. μόνο που σε αυτήν τη περίπτωση. Η δυνατότητα σύνθεσης της βασικής χημικής δομής του φυσικού προϊόντος διευκόλυνε τη διεύρυνση της πολυπλοκότητάς τους μέσω της σύνθεσης αναλόγων ορισμένων φυσικών προϊόντων. Ωστόσο. η πρώτη ύλη είναι ένα απομονωμένο φυσικό προϊόν. η πολυπλοκότητα της χημικής δομής των περισσοτέρων φυσικών προϊόντων καθιστά την ολική χημική σύνθεσή τους είτε αναποτελεσματική και με μεγάλο κόστος είτε ανέφικτη. Εναλλακτικά. το οποίο προκύπτει. ο αρωματικός δακτύλιος φέρει μια υδροξυλομάδα). το όποιο παρουσιάζει σημαντική φαρμακολογική δράση. Η διαδικασία αυτή είναι τύπος χημικής σύνθεσης. Η ημι-σύνθεση έχει δώσει αποτελέσματα και στην περίπτωση πιο πολύπλοκων ενώσεων. τα έχει βρει εφαρμογές στη αντιβιοτικά της β-λακτάμης (π. Για παράδειγμα. μπορεί να χρησιμοποιηθεί η χημική διαδικασία της ημι-σύνθεσης (semi-synthesis). Η simvastatin είναι μια ημισυνθετική ένωση. είναι σταθερότερο.

απόσταξης ή χρωματογραφίας. 23 . Η τεχνολογία αυτή αναφέρεται ως συνδυαστική χημεία (combinatorial chemistry). Οι διαδικασίες ημι-σύνθεσης της simvastatin με πρώτη ύλη το φυσικό προϊόν lovastatin. η χημική ένωση Α αντιδρά με τη χημική ένωση Β και δίδει ως προϊόν το ΑΒ. Στην πρώτη διαδικασία (5) έχουμε υδρόλυση της lovastatin προς το σχηματισμό της mononacolin J. που αποσκοπούν στην προστασία των C11 και C13 υδροξυομάδων. Αντίθετα. η συνδυαστική χημεία προσφέρει τη δυνατότητα να κατασκευασθεί κάθε πιθανός συνδυασμός των ενώσεων Α1-Βn. Η «προστατευμένη» mononacolin J μεθυλιώνεται και σχηματίζεται η «προστατευμένη» simvastatin.Εικόνα 19. B1-Αn. το οποίο απομονώνεται μέσω κρυστάλλωσης. στη συνεχεία. Για παράδειγμα. η όποια υπόκειται σε χημικές επεμβάσεις. από την οποία. η ομάδες προστασίας απομακρύνονται ώστε να προκύψει η simvastatin Η ανάπτυξη της οργανικής σύνθεσης και της προσομοίωσης μέσω πληροφορικής επέτρεψε την ταυτόχρονη σύνθεση μεγάλων αριθμών χημικών ενώσεων με διαφορετική δομή.

Σε αυτήν τη περίπτωση. η οποία να απενεργοποιεί το συγκεκριμένο αντιβιοτικό. Η τροποποίηση της δομής της Tyc μπορεί να βελτιώσει το θεραπευτικό της δείκτη (therapeutic index. με επιθυμητή δομή. όπως είναι τα πολυκετίδια.5. 5. διότι προκαλεί λύση της εξωτερικής μεμβράνης των βακτηρίων.1. είναι η προσθήκη γλυκοζύλο ομάδων (Εικόνα 20). διότι προκαλεί λύση της κυτταρικής μεμβράνης των ερυθροκυττάρων. στην παραγωγή νέων φυσικών προϊόντων. Χήμειο-ενζυμική σύνθεση in vitro Ο συνδυασμός της σύνθεσης χημικών ενώσεων επιθυμητής δομής και της in vitro τροποποίησής τους μέσω της χρήσης ανασυνδυασμένων ενζύμων. 5. Μια τροποποίηση που μπορεί να πραγματοποιηθεί στη Tyc. αναφέρεται ως χήμειο-ενζυμική σύνθεση. η χημική σύνθεση παρέχει τη δυνατότητα κατασκευής ποσοτήτων πρώτης ύλης (πρόδρομου του φυσικού προϊόντος) και η τεχνολογία του ανασυνδυασμένου DNA την παραγωγή σε ποσότητα του ενζύμου. Η χημική σύνθεση επιτρέπει την κατασκευή ενός γραμμικού ολιγοπεπτιδίου. με αποτέλεσμα να μειώνεται η θεραπευτική της δράση. Για την καλύτερη κατανόηση της χήμειο-ενζυμικής προσέγγισης. Επίσης. μέσω βιολογικών προσεγγίσεων. η ελάχιστη ποσότητα αντιβιοτικού η οποία προκαλεί την ελάχιστη λύση των αιμοσφαιρίων και τη μέγιστη αναστολή ανάπτυξης των βακτηρίων). παραθέτονται δυο παραδείγματα. με αλληλουχία αμινοξέων πανομοιότυπη με αυτήν της 24 . διότι δεν έχει ανευρεθεί κάποια βακτηριακή πρωτεΐνη.1. η χρησιμοποίηση της Tyc έχει ένα σημαντικό μειονέκτημα.1. Ωστόσο. Οι δυνατότητες που παρείχε η οργανική χημικών ενώσεων αξιοποιήθηκαν. επέτρεψε τη σύνθεση και μαζική παραγωγή χημικών ενώσεων μικρού μοριακού βάρους. Η in vitro χήμειο-ενζυμική σύνθεση γλυκοπεπτιδικών αντιβιοτικών Η tyrοcidine (Tyc) είναι ένα δεκαπεπτίδιο της κατηγορίας των NRPs και παρουσιάζει αντιβιοτική δραστηριότητα. Η πιθανότητα ανάπτυξης ανθεκτικότητας των βακτηρίων σε αυτή την ομάδα αντιβιοτικών είναι σπάνια. Χήμειο-βιολογικές προσεγγίσεις για τη βιοσύνθεση νέων φυσικών προϊόντων Η ραγδαία ανάπτυξη της οργανικής χημείας επέτρεψε τη σύνθεση πολύπλοκων χημικών ενώσεων.

της συνθετάσης της τυροσιδίνης (ΤΕ) και έτσι σχηματίζεται ένα ανάλογο της τυροσιδίνης (propargylglycine-substituted tyrocidine analog). είναι απαραίτητη για τη βιολογική δράση πολλών φυσικών προϊόντων. ο οποίος μιμείται τις φυσιολογικές συνθήκες. δηλαδή μπορεί να καταλύει την κυκλοποίηση ολιγοπεπτιδίων μολονότι αυτά φέρουν τροποποιημένα αμινοξέα. Σε αυτήν την περίπτωση.Tyc. 5. Η χημική σύνθεση γραμμικών ολιγοπεπτιδίων επιθυμητής αλληλουχίας αμινοξικών καταλοίπων. Ως εκ τούτου. Η εξειδίκευση της ΤΕ για το υπόστρωμα (το ολιγοπεπτίδιο) είναι σχετικά χαλαρή. Η προσθήκη των σακχάρων.1.2. τα αμινοξέα του συνθετικού ολιγοπεπτιδίου μπορούν να φέρουν τροποποιήσεις. είναι μια σχετικά απλή διαδικασία στη οργανική σύνθεση. είναι δυνατή η σύζευξη σακχάρων στο κυκλικό ολιγοπεπτίδιο. στον αγλυκονικό 25 . Το γραμμικό ολιγοπεπτίδιο κυκλοποιείται μέσω της δράσης μιας ανασυνδυασμένης θειοεστεράσης. Ένα συνθετικό ολιγοπεπτίδιο. μεσω ημισύνθεσης (Εικόνα 20). το οποίο φέρει στο καρβόξυ-τελικό άκρο του ένα συμπαράγοντα (N-acetylcysteamin. Η θειοεστεράση αυτή καταλύει την αποκοπή του γραμμικού ολιγοπεπτιδίου της Tyc από τη συνθάση της Tyc και την κυκλοποίηση του ολιγοπεπτιδίου προς το βιοδραστικό κυκλικό μόριο της Tyc. SNAC). Το ανάλογο της τυροσιδίνης. Χήμειο-ενζυμική προσέγγιση στη βιοσύνθεση γλυκοπεπτιδικών αντιβιοτικών. Το σύμπλεγμα γονιδίων που κωδικοποιεί για τη συνθάση της Tyc έχει κλωνοποιηθεί και χαρακτηρισθεί και γνωρίζουμε ότι στο τελικό άρθρωμα φέρει το γονίδιο που κωδικοποιεί μια θειοεστεράση (ΤΕ). μετά από χημική επεξεργασία. όπου η ώριμη ολιγοπεπτιδική αλυσίδα είναι συνδεδεμένη στο ένζυμο μέσω του φωσφοπαντοθενικού. Η ετερόλογη έκφραση του γονιδίου ΤΕ επέτρεψε την απομόνωση σημαντικών ποσοτήτων δραστικού ενζύμου. Εικόνα 20. σε μια αγλυκονική πολύπλοκη ένωση. Η προσθήκη της γλυκοζύλοομάδας. οι οποίες επιτρέπουν τη σύζευξή τους με σάκχαρα (Εικόνα 20). Το γεγονός αυτό επέτρεψε την in vitro κυκλοποίηση του συνθετικού ολιγοπεπτιδίου. γλυκοζυλιώνεται προς το σχηματισμό ενός γλυκοπεπτιδικού αντιβιοτικού. Γλυκοζυλίωση Πολλά φυσικά προϊόντα φέρουν δεόξυ-σάκχαρα.

Τα γονίδια που εμπλέκονται στα μονοπάτια βιοσύνθεσής τους είναι γνωστά. Η προσθήκη της γλυκοζύλο-ομάδας. μεταξύ δομικά ανόμοιων φυσικών προϊόντων. είναι δυνατή η προσθήκη ενός τροποποιημένου δεόξυ-σακχάρου. μέσω ημι-σύνθεσης. οι GTs δε παρουσιάζουν μεγάλη εκλεκτικότητα ως προς τα υποστρώματα που μεταφέρουν. Επιπλέον. Το πρόβλημα αυτό επιλύθηκε με τη χρήση ένζυμων. σε μια συγκεκριμένη θέση της αγλυκονικής ένωσης. Αξιοποίηση των γλυκοζύλο-μεταφορασών στην ανταλλαγή σακχάρων. 26 . Αμφότερα παρουσιάζουν αντιβιοτική δράση για βακτήρια και οι παραγωγοί οργανισμοί Micromonospora echinospora (calicheamicin) και Amycolatopsis orientalis (vancomycin) έχουν απομονωθεί και καλλιεργηθεί. Εικόνα 21. γεγονός το οποίο παρέχει τη δυνατότητα διεύρυνσης της βιολογικής δράσης του αρχικού φυσικού προϊόντος. Οι συνθετικές δυνατότητες των GTs στην κατάλυση της ανταλλαγής σακχάρων. Ως εκ τούτου.κορμό της χημικής ένωσης. καταλύεται από γλυκοζύλο-μεταφοράσες (GTs). Η συνδυασμένη δράση της CalG1 και της γλυκοζύλο-μεταφοράσης GtfE καταλύει την ανταλλαγή σακχάρων μεταξύ της calicheamicin και της vancomycin. Η γλυκοζύλο-μεταφοράση CalG1 καταλύει την ανταλλαγή σακχάρων μεταξύ της calicheamicin και της TDP (νουκλεοτιδο-σάκχαρα). μεταξύ δομικά ανόμοιων φυσικών προϊόντων. είναι προς το παρόν εξαιρετικά δύσκολη. δίνεται στη εικόνα 21. Η calicheamicin ανήκει στα πολυκετίδια και η vancomycin είναι ένα γλυκοζυλιωμένο NPR (εξαπεπτίδιο).

ο οποίος δεν έχει εντοπιστεί μέχρι τώρα στη φύση (unnatural precursor) και ο οποίος αναγνωρίζεται ως υπόστρωμα από τα ένζυμα του μεταβολικού μονοπατιού και ενσωματώνεται στο τελικό προϊόν της μεταβολικής διαδικασίας (Εικόνα 22). για τη βιοσύνθεση του τελικού προϊόντος. ο οποίος έχει χημική δομή ανάλογη με αυτήν του φυσικού ενδιάμεσου μεταβολίτη (μεταλλάξο-μεταβολίτης. Βιοσύνθεση κατευθυνόμενη από τoν πρόδρομο μεταβολίτη Η διαδικασία της βιοσύνθεσης κατευθυνόμενης από τον πρόδρομο μεταβολίτη (Precursor Directed Biosytnthesis. Μεταλλαξιογόνος βιοσύνθεση Η μεταλλαξιογόνος βιοσύνθεση (Mutational biosynthesis.2. της φαινόξυ-μέθυλοπενικιλίνης (Penicillin V). 5. Ωστόσο. ενός συνθετικού μεταβολίτη. Στην πιο απλουστευμένη της μορφή.χ. είχε ως αποτέλεσμα τη βιοσύνθεση ενός αναλόγου της πενικιλίνης. μύκητες). αντιβιοτικού). mutasynthons). ωστόσο στη μεταλλαξιογόνο βιοσύνθεση χρησιμοποιούνται μικροοργανισμοί. Για παράδειγμα. Σε αυτήν την περίπτωση. προστίθεται ένας συνθετικός μεταβολίτης. Ως εκ τούτου. απαιτείται η προσθήκη υψηλής συγκέντρωσης του συνθετικού μεταβολίτη. Mutasynthesis) βασίζεται στη διαδικασία PDB. το οποίο εμπλέκεται στο μεταβολικό μονοπάτι βιοσύνθεσης του επιθυμητού τελικού προϊόντος (π. το οποίο κωδικοποιεί για ένα ένζυμο. ο παραγωγός μικροοργανισμός δεν έχει εναλλακτικές λύσεις και χρησιμοποιεί ως υπόστρωμα το μεταλλαξο-μεταβολίτη. διότι βιοσυντίθεται ένα μείγμα φυσικών και μη-φυσικών προϊόντων με παρόμοιες φυσικές ιδιότητες.1.2. η προσθήκη φαινόξυοξικού οξέος στο θρεπτικό μέσο καλλιέργειας του Penicillium chrysogenum. οι οποίοι φέρουν ένα απενεργοποιημένο γονίδιο (λόγω μετάλλαξης). Η προσέγγιση αυτή έχει δώσει θεαματικά αποτελέσματα όσον αφορά στην παραγωγή αναλόγων διαφόρων φυσικών προϊόντων. Χήμειο-ενζυμική σύνθεση in vivo 5. αυτή η διαδικασία περιλαμβάνει την προσθήκη στο θρεπτικό μέσο του παραγωγού μικροοργανισμού (βακτήρια.2. Ως εκ τούτου. ώστε να ανταγωνίζεται με το φυσικό μεταβολίτη.2.5. PDB) θεωρείται η πρώτη εφαρμογή της χημικής σύνθεσης στη βιοσύνθεση νέων βιο-δραστικών ενώσεων. Με αυτόν τον 27 . σε αυτήν τη διαδικασία υπάρχουν μειονεκτήματα. στο θρεπτικό μέσο του μεταλλαγμένου παραγωγού μικροοργανισμού.

τρόπο. ο παραγωγός μικροοργανισμός. (α) Η διαδικασία βιοσύνθεσης ενός φυσικού προϊόντος από το αγρίου-τύπου στέλεχος (παραγωγός μικροοργανισμός). Μία από τις πρώτες εφαρμογές της μεταλλαξιογόνου βιοσύνθεσης ήταν η βιοσύνθεση αναλογών της νεομυκίνης (neomycin). Εικόνα 22. (γ) Η βιοσύνθεση κατευθυνόμενη από τον πρόδρομο μεταβολίτη. 28 . στο θρεπτικό μέσο καλλιέργειας προστίθεται ένα ανάλογο του φυσιολογικού ενδιάμεσου μεταβολίτη (μεταλλαξο-μεταβολίτης). του μεταλλαγμένου στελέχους. (β) Η διαδικασία βιοσύνθεσης του φυσικού προϊόντος όταν έχει προκληθεί μια συγκεκριμένη μετάλλαξη στον παραγωγό μικροοργανισμό. Σχηματική αναπαράσταση της διαδικασίας της βιοσύνθεσης κατευθυνόμενης από τον πρόδρομο μεταβολίτη και της διαδικασίας της μεταλλαξιογόνου-βιοσύνθεσης. Όταν στο θρεπτικό μέσο καλλιέργειας. υπέστη τυχαίες μεταλλάξεις. τα οποία δεν παράγουν neomycin. το τελικό προϊόν που παράγεται. Σε αυτήν τη διαδικασία χρησιμοποιείται ένα μεταλλαγμένο στέλεχος του παραγωγού μικροοργανισμού και στο θρεπτικό μέσο προστίθεται ένας μεταλλαξο-μεταβολίτης (mutasynthon). Σε αυτήν τη διαδικασία. προστέθηκε ένα συνθετικό ανάλογο (στρεπταμίνη) του φυσιολογικού ενδιαμέσου μεταβολίτη (δεοξυστρεπταμίνη). με τη χρήση του μεταλλαξογόνου ΜΝΝG (προκαλεί σημειακές μεταλλάξεις στο DNA) και επελέγησαν μεταλλαγμένα στελέχη. Streptomyces fradiae. το οποίο ανταγωνίζεται με το φυσιολογικό υπόστρωμα. (δ) Η μεταλλαξιογόνο-βιοσύνθεση. δεν περιέχει προσμίξεις και απομονώνεται σχετικά εύκολα και σε ποσότητα (Εικόνα 22δ). Στην περίπτωση αυτή. τότε ο συνθετικός μεταβολίτης χρησιμοποιήθηκε ως υπόστρωμα και το τελικό προϊόν ήταν ένα ανάλογο της neomycin. σε κάποιο σημαντικό βήμα της πορείας βιοσύνθεσης του φυσικού προϊόντος.

Μεταλλαξιογόνο-βιοσύνθεση του αντιβιοτικού νεομυκίνη. κατασκευάστηκε ένα στέλεχος. το πολυλειτουργικό σύμπλεγμα της PKS) και της παροχής συνθετικών αναλόγων στο μεταλλαγμένο μικροοργανισμό. τότε παύει η λειτουργία αυτής της κετοσυνθάσης της DEBS1. Ο παραγωγός μικροοργανισμός είναι η Saccharopolyspora erythrae.χ.3. Στη φυσιολογική πορεία βιοσύνθεσης.Εικόνα 23. H χήμειο-βιοσύνθεση βασίζεται στη συνδυασμένη απενεργοποίηση μιας δομικής περιοχής του γονιδίου στόχου (π. έχει οδηγήσει στην ανάπτυξη μιας νέας προσέγγισης της μεταλλαξιογόνου βιοσύνθεσης. Ως εκ τούτου. 5. Είναι γνωστό ότι το φυσιολογικό υπόστρωμα του αρθρώματος 2 είναι ένα δικετίδιο. του αρθρώματος 1. Η προσέγγιση αυτή χρησιμοποιήθηκε για πρώτη φορά στη βιοσύνθεση αναλόγων της ερυθρομικίνης (erythromycin). με χημική δομή 29 .2. Ο μεταλλάξο-μεταβολίτης ενσωματώνεται στο τελικό προϊόν και έτσι παράγεται ένα ανάλογο της νεομυκίνης (neomycin). H ερυθρομικίνη έχει παρόμοιο φάσμα αντιβιοτικής δράσης με αυτό της πενικιλίνης και ως εκ τούτου αποτελεί μια εναλλακτική λύση για ασθενείς που παρουσιάζουν αλλεργία στην πενικιλίνη. Καλλιέργεια του μεταλλαγμένου παραγωγού μικροοργανισμού (Streptomyces fradiae) εμβολιάζεται με το μεταλλάξομεταβολίτη (streptamine). μέσω ενός θειοεστερικού συνδέσμου (Εικόνα 24). Εάν απενεργοποιηθεί το γονίδιο ΚS. Με βάση τα παραπάνω. της χήμειο-βιοσύνθεσης (Chemobiosynthesis). Χήμειο-βιοσύνθεση Η μελέτη της ενζυμολογίας και της μοριακής βιολογίας των αρθρωτών συνθασών των πολυκετιδίων. όπου το γονίδιο που κωδικοποιεί την ΚS του αρθρώματος 1 είναι απενεργοποιημένο. η αναπτυσσόμενη πολυκετιδική αλυσίδα μεταφέρεται από άρθρωμα σε άρθρωμα και παραμένει προσδεδεμένη στο ενζυμικό σύστημα. το οποίο είναι συνδεδεμένο με το ένζυμο μέσω ενός θειοεστερικού δεσμού. εάν στο θρεπτικό μέσο καλλιέργειας του μεταλλαγμένου στελέχους προστεθεί ένα συνθετικό δικετίδιο.

τότε η βιοσυνθετική διαδικασία θα προχωρήσει και το τελικό προϊόν θα είναι ένα ανάλογο της erythromycin (Εικόνα 24).4. Βιοκατάλυση σε άθικτα κύτταρα Η ανάπτυξη της σύνθεσης συνθετικών πρόδρομων των φυσικών προϊόντων σε συνδυασμό με την ανάπτυξη της Τεχνολογίας του Ανασυνδυασμένου DNA.coli με την ταυτόχρονη πρoσθήκη στο θρεπτικό της monacolin J καθώς και της κατάλληλα 30 . Μια σημειακή μετάλλαξη στο γονίδιο της KS καθιστά ανενεργή την κετοσυνθάση της DEBS1. Ενδελεχής έλεγχος της εξειδίκευσης της LovD έδειξε. Για παράδειγμα.ανάλογη του φυσιολογικού δικετιδίου. Η έκφραση της LovD στην E. προς το σχηματισμό της lovastatin. Το γονίδιο LovD κωδικοποιεί για μια στέρεοεξειδικευμένη ακυλομεταφοράση. 5. Η χήμειο-βιοσυνθετική διαδικασία παραγωγής αναλόγου του 6-EB. ότι το ένζυμο δέχεται πολλά υποστρώματα με παρόμοια δομή. Εικόνα 24.2. η οποία καταλύει τη μεταφορά μιας μέθυλοβουτυρύλο ομάδας στο monacolin. το σύμπλεγμα γονίδιων που εμπλέκεται στη βιοσύνθεση της lovastatin έχει χαρακτηριστεί. επιτρέπει την in vitro ή την in vivo χρήση των ενζύμων για την παράγωγη νέων φυσικών προϊόντων.

Επίσης. παρείχε τη δυνατότητα κατασκευής συγκεκριμένων αθρωμάτων και δομικών περιοχών. που παράγονται μετά την έκφραση των συνθετικών γονιδίων στο E. σε μεγαλύτερα έως και 32kb. 31 . 5. KR. τη θειοεστεράση (ΤΕ). Εικόνα 25.2. Η τεχνολογία αυτή επέτρεψε την έκφραση γονιδίων. AT. οι οποίοι διαθέτουν γένωμα με υψηλό περιεχόμενο σε GC. οι οποίες μπορούν να κλωνοποιηθούν. με μήκος 500bp. τα οποία προέρχονται από παραγωγούς οργανισμούς. Στη συνεχεία. έχει ως αποτέλεσμα τη βιοσύνθεση της simvastatin (Εικόνα 17A). τα οποία δεν παράγονται στη φύση από τους παραγωγούς οργανισμούς (μη-φυσικά προϊόντα) (Εικόνα 25).coli. ACP). Διαγραμματική απεικόνιση των συνθετικά κατασκευασμένων γονιδίων. τον ενδοπεπτιδικό σύνδεσμο (LC). Κατασκευή συνθετικών γονιδίων. Οι αντιδράσεις που λαμβάνουν χώρα και η χημική δομή του τελικού προϊόντος (ΤLΚ). τον ενδοπεπτιδικό σύνδεσμο (LN). το άρθρωμα δότη (KS. αυτά τα τμήματα DNA συγκροτηθήκαν. ACP). KR.5. τα οποία παρουσιάζουν μια σχετικά καλύτερη διαπερατότητα της μεμβράνης στους προστιθέμενους συνθετικούς μεταβολίτες.coli. τα οποία συνδέθηκαν προειμένου να σχηματισθούν τμήματα DNA μήκους 5kb.coli. σε ετερόλογο ξενιστή. Τα γονίδια αυτά κλωνοποιήθηκαν σε τέσσερις διαφορετικούς πλασμιδιακούς φορείς έκφρασης και τα ανασυνδυασμένα πλασμίδια μεταφέρθηκαν στο E. Η τελική διευθέτηση των πρωτεϊνών.τροποποιημένης άκυλο-ομάδας. Κατασκευή συνθετικών γονιδίων και Χήμειο-ενζυμική σύνθεση αναλόγων των πολυκετιδίων H χημική σύνθεση επέτρεψε την κατασκευή τμημάτων DNA επιθυμητής αλληλουχίας. Το γεγονός αυτό επέτρεψε το συνδυασμό αθρωμάτων και δομικών περιοχών από τις ίδιες ή διάφορες PKSs και NRPSs και τη βιοσύνθεση πολυκετιδίων. AT. Η απόδοση της διαδικασίας αυτής βελτιώνεται με τη χρήση μεταλλαγμένων στελεχών του E. μέσω κλωνοποίησης. ACP). το άρθρωμα δέκτη (KS. που κωδικοποιούν για το άρθρωμα φόρτωσης (ΑΤ. συνδυαστική συναρμολόγηση των αρθρωμάτων της PKS και χρησιμοποίησή τους στη βιοσύνθεση φυσικών προϊόντων. το διαπεπτιδικό σύνδεσμο (LI).

2 και 3. μετά από κλωνοποίησή τους σε δύο ή τρία συμβατά πλασμίδια.6. των τριών αρθρωμάτων DEBS1. Στη DEBS1 αντικαταστήθηκε η περιοχή KR του αρθρώματος 2 με τις DH/ER/KR από το άρθρωμα 2 της συνθάσης της ραπαμικίνης (rapamycin). η προσέγγιση που χρησιμοποιήθηκε για την κατασκευή της πρώτης βιβλιοθήκης αναλόγων της ερυθρομυκίνης. Νέες Τεχνολογίες του Ανασυνδυασμένου DNA για τη βιοσύνθεση φυσικών προϊόντων Η γενετική μηχανική των PKS γονιδίων. Τα πλεονεκτήματα που προσφέρει αυτή η προσέγγιση. Οι αλλαγές στις δομικές περιοχές είχαν ως αποτέλεσμα τη δημιουργία μιας μεταλλαγμένης PKS. με την ταυτόχρονη έκφραση στο Streptomyces αρθρωμάτων των PKS. στον παραγωγό οργανισμό (οργανισμός. Έκφραση των μεταλλαγμένων γονιδίων στο Streptomyces coelicolor είχε ως αποτέλεσμα τη βιοσύνθεση περίπου 50 νέων πολυκετιδίων (Eικόνα 26). Η προσέγγιση αυτή βελτιώθηκε. οι οποίες είχαν υποστεί μεταλλάξεις είτε στη δομική περιοχή Α είτε στη KR. προσεγγίστηκε με τη διαδοχική κλωνοποίηση σε ένα πλασμίδιο. 2 και 3. DEBS1. Συνδυαστική βιοσύνθεση της DEBS. Στην DEBS2 απομακρύνθηκε ένα τμήμα της δομικής περιοχής KR του αρθρώματος 5 και στην DEBS3 αντικαταστάθηκε η ειδική δομική περιοχή ΑΤ του αρθρώματος 6 με μια αντίστοιχη περιοχή του αρθρώματος 2 της συνθάσης της rapamycin. 2 και 3. Για παράδειγμα. ο οποίος τυπικά βιοσυνθέτει το φυσικό προϊόν). είναι γενικά δύσκολη. Eικόνα 26. γίνονται 32 . Οι μεταλλάξεις έγιναν σε κάθε ένα από τα αρθρώματα DEBS1.

φέρουν cDNA ή DNA από διαφορετικούς οργανισμούς. εντοπίζονται διασκορπισμένα στο γονιδίωμα. Την τελευταία πενταετία έχει κατασκευαστεί μια σειρά φορέων έκφρασης. Τα γονίδια που εμπλέκονται στη βιοσύνθεση πολυκετιδίων. Στο τεχνητό μεταβολικό μονοπάτι βιοσύνθεσης.coli (διαθέτουν διαφορετική θέση έναρξης αντιγραφής και διαφορετικά γονίδια επιλογής) και κάθε φορέας φέρει δύο προς έκφραση γονίδια. οι όποιοι έχουν τη δυνατότητα να συνεκφράζονται στο E. pDuet1.coli. Στο πρώτο στάδιο πραγματοποιείται η βιοσύνθεση των υποστρωμάτων (μαλόνυλο-CoA και εστέρες του CoA) μέσω της δράσης των ενζύμων 4CL-1. Η κατασκευή της τεχνητής βιοσυνθετικής οδού στο ανασυνδυασμένο E. 33 .coli διαχωρίζεται σε τρία στάδια. η βιοσύνθεση φυτικών πολυκετιδίων.κατανοητά στο παράδειγμα της εικόνας 27. Δηλαδή. μπορούν να εκφραστούν ταυτόχρονα οκτώ γονίδια (Εικόνα 27). στο δεύτερο στάδιο πραγματοποιείται η βιοσύνθεση του πολυπεπτιδίου από τα ένζυμα CHS/CHI και στο τρίτο η τροποποίησή του από τα ενζυμα FNS και F3H/FLS. Εικόνα 27. Οι διαφορετικοί πλασμιδιακοί φορείς έκφρασης. (B). μπορεί να έχουν μια πρωτότυπη δομή (κατασκευή μέσω χημικής σύνθεσης). Για παράδειγμα. Βιοσυνθετική οδός των πολυκετιδίων στα φυτά (Α) και το ανασυνδυασμένο E. γεγονός που επιτρέπει τη βιοσύνθεση νέων πολυκετιδίων. τα καρβοξυλικά οξέα που παρέχονται ως υπόστρωμα. όπως είναι τα φλαβονοειδή και τα στιλβένια.coli. έχει επιτευχθεί με την κλωνοποίηση 8 cDNA σε 4 συμβατά πλασμίδια (Εικόνα 27). στο E. στα φυτά.

απομάκρυνσης ή ενσωμάτωσης τμημάτων DNA. Το πλασμίδιο pRed/ET φέρει τα γονίδια που κωδικοποιούν για τις RecE/RecT ή Redα/Redβ. εκατέρωθεν. με το φορέα-στόχο. Αυτό το τμήμα DNA εισάγεται στο E. Τα ενζυμα αυτά επιτρέπoυν την εισαγωγή του επιθυμητού τμήματος DNA στον DNA στόχο. Το τμήμα DNA στόχος μπορεί να εδράζεται σε έναν οποιονδήποτε φορέα ή στο χρωμόσωμα του βακτηρίου. Bασικό βήμα της παραπάνω διαδικασίας αποτελεί ο ανασυνδυασμός μεταξύ της κατασκευής. τις επιθυμητές ομόλογες αλληλουχίες ανασυνδυασμού (hm). την κλωνοποίηση οποιουδήποτε τμήματος DNA (Εικόνα 28). ο οποίος μπορεί να είναι είτε ένα πλασμίδιο είτε ένα κοσμίδιο είτε ένα τεχνητό βακτηριακό χρωμόσωμα (BAC) (Εικόνα 28). 34 . τα οποία εκφράζουν τα ζεύγη πρωτεϊνών RecE/RecT ή Redα/Redβ του προφάγου Rac ή του φάγου λ. οι οποίες καταλύουν τις διαδικασίες ανασυνδυασμού. το οποίο φέρει το DNA στόχο (target). η οποία αναφέρεται ως κλωνοποίηση μέσω ανασυνδυασμού (Red/ET recombineering). Κατασκευή του προς ένθεση τμήματος DNA (marker). Διαδικασίες ένθεσης ενός τμήματος DNA στο φορέα στόχο ή στο βακτηριακό χρωμόσωμα. Εικόνα 28. συχνά. Μια εναλλακτική λύση στο πρόβλημα προσφέρεται μέσω μιας νέας προσέγγισης τροποποίησης. η οποία φέρει το γονίδιο και τους βραχίονες ομολογίας (hm).coli. διότι δεν είναι εύκολο να πραγματοποιηθούν γενετικές παρεμβάσεις.coli. το όποιο φέρει. οποιουδήποτε μεγέθους. Η προσέγγιση αυτή επιτρέπει μέσω ομόλογου ανασυνδυασμού σε στελέχη του E. αντίστοιχα.Το μεγάλο μέγεθος των συμπλεγμάτων γονιδίων. όπως για παράδειγμα η απομάκρυνση ενός γονιδίου ή τμήματός του ή η αντικατάσταση με ένα άλλο ή η προσθήκη ενός επιθυμητού τμήματος DNA. προκαλεί τεχνικά προβλήματα.

7. αντικατάσταση (replacement) ή απομάκρυνση (deletion) οποιουδήποτε τμήματος DNA ή την προσθήκη ή την απομάκρυνση μίας και μόνο βάσης (point motations) από το DNA στόχο (Εικόνα 29). η φασματοσκοπία μάζας και ο πυρηνικός παραμαγνητικός συντονισμός. έχουν σημαντική επίδραση στην ελάττωση του χρόνου που απαιτείται για τη δομική ανάλυση των φυσικών προϊόντων.Η τεχνολογία της κλωνοποίησης μέσω ανασυνδυασμού (Red/ET Recombineering) επιτρέπει την ένθεση (insertion). Η πρώτη προσέγγιση αφορά στην απομόνωση και το χαρακτηρισμό της χημικής δομής και βιολογικής δράσης των διαφόρων φυσικών προϊόντων. Εικόνα 29. MST or HST). Σχηματιστική αναπαράσταση των γενετικών επεμβάσεων που πραγματοποιούνται με τη χρήση της κλωνοποίησης μέσω ανασυνδυασμού. Εργαλεία για την ανεύρεση των μεταβολικών μονοπατιών βιοσύνθεσης των φυσικών προϊόντων και εντοπισμός νέων φυσικών προϊόντων Η ανεύρεση των μεταβολικών μονοπατιών βιοσύνθεσης των φυσικών προϊόντων βασίζεται σε δυο προσεγγίσεις. Οι 35 . Ο συνδυασμός τεχνικών διαχωρισμού. όπως η χρωματογραφία υψηλής πίεσης. η εκχύλιση στερεής φάσης. Ο παραδοσιακός τρόπος εξέτασης της βιολογικής δράσης των φυσικών προϊόντων τείνει να αντικατασταθεί με αυτοματοποιημένες μεθόδους σάρωσης μεσαίας ή υψηλής αποδοτικότητας (Medium or High-throuput screening.

36 . ένα παράδειγμα σάρωσης μεσαίας αποδοτικότητας της παρουσίας βιοδραστικών δευτερογενών μεταβολιτών. είναι αναγκαίο.χ. κύτταρα. όταν το βιολογικό δείγμα είναι ένα έμβρυο και απαιτείται μικροσκοπική παρακολούθηση ώστε να διαπιστωθούν εμβρυακές αναπτυξιακές ανωμαλίες. το προς εξέταση βιολογικό δείγμα (π. αντί-φλεγμονώδη δράση και άλλα. Παρόμοιες μελέτες πραγματοποιούνται με βακτήρια. Για παράδειγμα. τα οποία επωάζονται υπό κατάλληλες συνθήκες και στη συνέχεια μικρή ποσότητα (nanoliters) του φυσικού προϊόντος (σε υγρή μορφή) μεταγγίζεται σε κάθε πηγαδάκι. Ένα από τα σημαντικά εργαλεία των βιολογικών δοκιμών. από τον ίδιο τον ερευνητή. το οποίο φέρει 96-3456 πηγαδάκια δοκιμής. Στη εικόνα 30. Τα δοχεία μικρο-τιτλοδότησης δε χρησιμοποιούνται για τα πειράματα αλλά αποτελούν τις αποθήκες των διαχωρισμένων φυσικών προϊόντων.χ. πρωτεΐνες) κατανέμεται σε δοχεία μίκροτιτλοδότησης δοκιμής (assay plates). Γενικά. όμως. οι μετρήσεις να γίνονται χειρονακτικά. για αναστολή ή διέγερση των κυτταροδιαιρέσεων. δειγματοληψία. Τα φυσικά προϊόντα. διατηρούνται σε δοχεία μικρο-τιτλοδότησης (stock plates). μετά το διαχωρισμό τους. Κατά την έναρξη του πειράματος. Συχνά. μετρήσεις ανάπτυξης των κυττάρων) πραγματοποιούνται με αυτοματοποιημένα συστήματα.μέθοδοι αυτές επιτρέπουν τη σάρωση χιλιάδων δειγμάτων ημερήσια. ο έλεγχος περιλαμβάνει τη δράση των φυσικών προϊόντων σε κατάλληλες σειρές καλλιεργούμενων ευκαρυωτικών κυττάρων (κύτταρα-δείκτες) ή ακόμη και σε κύτταρα που απομονώνονται από ανθρώπους. Σημειώνεται. ότι όλες οι παραπάνω διεργασίες (π. δίδεται διαγραμματικά. είναι το δοχείο μίκρο-τιτλοδότησης. αντί-ιική δράση.

ότι το βιοσυνθετικό 37 . ότι ορισμένα από τα εκχυλίσματα προκάλεσαν τον πολλαπλασιασμό των κυττάρων ενώ άλλα την αναστολή του πολλαπλασιασμού τους. βιοσυντίθενται από PKSs και των NRPSs. Τούτο είναι δυνατό. διερευνώντας το γένωμά του για πιθανά μεταβολικά μονοπάτια. από υγιείς ανθρώπους και από ασθενείς με τη νόσο Grohns. Μετά από επώαση παρατηρήθηκε. εξετάστηκε η επίδραση των εκχυλισμάτων που έδωσαν σε συνθήκες υψηλής ή χαμηλής συγκέντρωσης κυττάρων δείκτες.Εικόνα 30. Ανάλυση του γονιδιώματος έδειξε. οι οποίες κατά κανόνα κωδικοποιούνται από συμπλέγματα γονιδίων. Σε ένα δεύτερο βήμα. διότι τα πλέον σημαντικά φυσικά προϊόντα.coli σε δοχεία μικροτιτλοδότησης. Η δεύτερη προσέγγιση αξιοποιεί το δυναμικό της χημικής ποικιλότητας που κωδικοποιείται από το γονιδίωμα. Οι κλώνοι (40kb) εκφραστήκαν στο E. Διαγραμματική απεικόνιση σάρωσης βιοδραστικών δευτερογενών μεταβολιτών. Αραιωμένο δείγμα του υπερκείμενου (1:30 v/v) μεταφέρθηκε σε δοχεία μικροτιτλοδότησης δοκιμής (assay plates). Σε όλα τα πειράματα υπήρχαν σημεία ελέγχου δηλαδή εκχυλίσματα από βακτηριακά κύτταρα. Μια μεταγονιδιωματική βιβλιοθήκη κατασκευάστηκε από DNA της μικροχλωρίδας του λεπτού εντέρου. PKs και NRPs. τα οποία δεν έφεραν κανένα κλωνοποιημένο τμήμα DNA. στα οποία προηγουμένως είχε εναποτεθεί δείγμα κυττάρων CV-1 (κύτταρα-δείκτης). Ακλούθησε η εκχύλιση της καλλιέργειες και το υπερκείμενο μεταφέρθηκε σε ένα δοχείο μικροτιτλοδότησης (master plate). που οδηγούν στη βιοσύνθεση φυσικών προϊόντων. Είναι δυνατό να υπολογίσουμε το βιοσυνθετικό δυναμικό ενός παραγωγού οργανισμού.

σε σύγκριση με τα φυσικά προϊόντα που έχουν ήδη απομονωθεί από αυτόν τον μικροοργανισμό. Το πρώτο συμπέρασμα. όπως η γονιδιωματική (αλληλούχιση εκατοντάδων γονιδιωμάτων βακτηρίων). βασίζεται στην in silico σάρωση γονιδιωμάτων. μετά από μια γρήγορη ανάλυση των πληροφοριών. των οποίων έχει προσδιοριστεί η αλληλουχία. Πιθανά. Προσεγγίσεις για την ταυτοποίηση των σιωπηλών μεταβολικών μονοπατιών Οι προσεγγίσεις για την ταυτοποίηση των σιωπηλών μεταβολικών μονοπατιών βασίζονται σε διεπιστημονικά πεδία. καταδεικνύει ότι ο αριθμός συμπλεγμάτων γονιδίων.1. της μεγαλύτερης ομάδας οργανισμών που παράγουν 38 . ωστόσο. ξεπερνά κατά πολύ τους γνωστούς δευτερογενείς μεταβολίτες. Στη περίπτωση κατά την οποία το πιθανό προϊόν είναι άγνωστο τα γονίδια που εμπλέκονται στην βιοσύνθεση του αναφέρονται ως ορφανό σύμπλεγμα βιοσυνθετικών γονιδίων (orphan biosynthetic gene cluster). μόνο μία από αυτές τις συνθάσες φαίνεται να έχει σχέση με τη βιοσύνθεση ενός δευτερογενούς μεταβολίτη (nostopeptolide). Για παράδειγμα. Διερεύνηση ολοκλήρων γονιδιωμάτων Η προσέγγιση της διερεύνησης ολόκληρων γονιδιωμάτων. οι άλλες άλλες συνθάσες (PKSs και NRPSs) δεν εκφράζονται στις συγκεκριμένες εργαστηριακές συνθήκες (σιωπηλό σύμπλεγμα βιοσυνθετικών γονιδίων. Η πιθανή λειτουργία των γονιδίων έχει προσδιοριστεί με αυτοματοποιημένες μεθόδους βιοπληροφορικής (π. silent biosynthetic gene cluster) ή παράγεται ένα φυσικό προϊόν. σύγκριση ανά ζεύγη των αμινοξικών αλληλουχιών).+ 7. η αναλυτική βιοτεχνολογία. Έχει προσδιοριστεί η αλληλουχία του γονιδιώματος τουλάχιστον 700 μικροοργανισμών και έχει καταχωρηθεί στις δημόσιες βάσεις δεδομένων. για παραγωγή φυσικών προϊόντων.χ.1. η τεχνολογία του ανασυνδυασμένου DNA και το γεγονός ότι τα γονίδια που κωδικοποιούν για τη βιοσύνθεση των PKs και NRPs οργανώνονται στο γονιδίωμα ως ένα σύμπλεγμα γονιδίων. φαίνεται να είναι μεγαλύτερο. Το γονιδίωμα 13 ακτινοβακτηρίων. 7. το οποίο δεν εντοπίζεται μέσω της διαθέσιμης τεχνολογίας. η βιοπληροφορική. τα οποία κωδικοποιούν πιθανές PKSs ή NRPSs. που πιθανά εμπλέκονται στη βιοσύνθεση φυσικών προϊόντων.δυναμικό των μικροοργανισμών. το γονιδίωμα του κυανοβακτηρίου Nostoc punctioforme περιέχει 22 συμπλέγματα γονίδιων.1. για συναινετικά μοτίβα αμινοξικών αλληλουχιών.

Τότε. Σάρωση του γονιδιώματος Η προσέγγιση αυτή βασίζεται στο γεγονός.2.3. Στη συνέχεια. επιλέγονται τα γονίδια στόχοι.1. Καταρχήν. 39 . Οι εκκινητές αυτοί χρησιμοποιούνται σε αντιδράσεις PCR. Τα προϊόντα της PCR αντίδρασης χρησιμοποιούνται ως ανιχνευτές. συμπεριλαμβανομένων του Streptomyces coelicor (το πλέον χαρακτηρισμένο στέλεχος των ακτινοβακτηρίων) και του Streptomyces avermitis (στέλεχος που χρησιμοποιείται ευρέως στη βιομηχανική παραγωγή αντιβιοτικών). η αλληλουχία του γονιδιώματος του μικροοργανισμού δεν είναι στη διάθεση μας. παρουσιάζει παρόμοιες τάσεις. 7. Συγκεκριμένα.6-0. με ανιχνευτή ένα προϊόν PCR από ένα δεύτερο γονίδιοστόχο. με μήτρα το DNA από τον άγνωστο μικροοργανισμό. που κωδικοποιούν για γνωστά γονίδια.8kb) τμήματα DNA (αναφέρονται ως genome sequence tags. μπορούμε να διερευνήσουμε το γένωμα του μικροοργανισμού. τα οποία παράγουν γνωστά φυσικά προϊόντα. αρχικά. από τον άγνωστο οργανισμό. μέσω της προσέγγισης PCR. Στη συνέχεια. προσδιορίζεται η αλληλουχία βάσεων μερικών εκατοντάδες κλώνων (shot gun sequencing) από τη δεύτερη βιβλιοθήκη (genome sequence tags. GSTs). Στρατηγική του PCR Σε πολλές περιπτώσεις. προσδιορίζονται συντηρημένες αμινοξικές περιοχές και κατασκευάζονται εκφυλισμένοι εκκινητές.αντιβιοτικά. ότι τα γονίδια που εμπλέκονται στη βιοσύνθεση των PKs ή των NRPs συγκροτούνται σε ένα σύμπλεγμα (η αλληλουχία του γονιδιώματος του παραγωγού οργανισμού δεν είναι γνωστή). μέσω πολλαπλής σύγκρισης των αμινοξικών αλληλουχιών πολυπεπτιδίων. Αξιολόγηση 11 παραγωγών ακτινοβακτηρίων. το οποίο πιθανά εμπλέκεται στο μεταβολικό μονοπάτι. Για την πιο έγκυρη διάγνωση του συμπλέγματος γονιδίων.. για την παρουσία συμπλεγμάτων PKS και NPRS γονιδίων. κατασκευάζονται δυο γονιδιωματικές βιβλιοθήκες από τον άγνωστο οργανισμό. Ωστόσο. 7. μόνο 14 αντιστοιχούν σε συμπλέγματα PKS ή NRPS.1. για τη σάρωση γονιδιωματικών βιβλιοθηκών. ενδείκνυται να επανεξετάζονται οι θετικοί γονιδιωματικοί κλώνοι της πρώτης σάρωσης. τα οποία ομοιάζουν με τα γονίδια στόχους. αποκάλυψε την παρουσία 118 συμπλεγμάτων PKS ή NRPS γονιδίων. Η μια βιβλιοθήκη φέρει μεγάλα τμήματα DNA (40-80kb) ενώ η δεύτερη φέρει μικρά (0.

7. του αγνώστου συμπλέγματος. Με βάση αυτές τις προβλέψεις. Αναμένεται. Για παράδειγμα.χ. με σχετικά μικρό αριθμό συνοδών γονιδίων. Ένα από αυτά τα συμπλέγματα φαίνεται να κωδικοποιεί μια τύπου Ι συνθάση των πολυκετιδίων. φάσμα απορρόφησης στο UV. τότε οι πιθανές βιολογικές δράσεις του μπορεί να αξιοποιηθούν για τον προσδιορισμό του. μάζα) του τελικού προϊόντος. οι οποίες εμπλέκονται στο δευτερογενή μεταβολισμό. το οποίο κωδικοποιείται από το σιωπηλό σύμπλεγμα γονιδίων. ότι αυτό το στέλεχος φέρει μερικά συμπλέγματα γονιδίων. όπως μια ασυνήθη μονοοξυγονάση (Εικόνα 31). από διαφορετικούς μικροοργανισμούς. με τα γνωστά. οι διαδικασίες εκχύλισης και κλασμάτωσης μπορούν να βελτιστοποιηθούν. UV.GSTs). πολικότητα. επέτρεψε την πρόβλεψη της πιθανής χημικής δομής του τελικού προϊόντος. με κάποια ακρίβεια. είναι δυνατή η in silico πρόβλεψη της χημικής δομής του φυσικού προϊόντος. αναλύονται με μεθόδους. η οποία περιείχε πάνω από 1600 γνωστά συμπλέγματα γονιδίων. Τα συμπλέγματα γονιδίων που προκύπτουν. παρουσιάζει ομοιότητες με φαρμακολογικά δραστικές ομάδες ενώσεων. Ως εκ τούτου. Η αποτελεσματικότητα αυτής της προσέγγισης έχει βρει εφαρμογές στην απομόνωση βιοδραστικών ενώσεων. ανάλυση του γονιδιώματος του παραγωγού αντιβιοτικών ενώσεων μικροοργανισμού Streptomyces sp. ELSD). Ανάλυση αυτού του συμπλέγματος γονιδίων επιτεύχθη με τη χρήση μίας βάσης δεδομένων. οποιοδήποτε σύμπλεγμα γονιδίων θα εκπροσωπείται στα GSTs. τις χρωματογραφικες μεθόδους και ιδιαιτέρα τις μεθόδους προσδιορισμού (MS. τα οποία εμπλέκονται στη βιοσύνθεση δευτερογενών μεταβολιτών. που έχουν τη δυνατότητα κωδικοποίησης τροποποιητικών ενζύμων.4. Τα GSTs που περιέχουν αλληλουχίες γονιδίων. του 40 . σε ό. ότι μετά την ανάλυση των αλληλουχιών.1. Η συσχέτιση των επί μέρους γονιδίων.Eco86 έδειξε. του φυσικού προϊόντος. οι φυσικοχημικές ιδιότητες (π.τι αφορά τους οργανικούς διαλυτές. υπολογίζονται. επιλέγονται και χρησιμοποιούνται ως ανιχνευτές. οι οποίες περιγράφονται παρακάτω. Πρόβλεψη με βάση τη βιοπληροφορική ανάλυση και τις φυσικοχημικές ή τις φαρμακολογικές ιδιότητες του τελικού προϊόντος Σε περίπτωση που η αλληλουχία των προς διερεύνηση συμπλεγμάτων των γονιδίων (σιωπηλό μονοπάτι) είναι γνωστή είτε μέσω αλληλούχισης ολόκληρου του γονιδιώματος ή τμήματός του. Στις περιπτώσεις που η προβλεπόμενη χημική δομή. για τη σάρωση της πρώτης βιβλιοθήκης (BAC κλώνοι).

παρουσιάζει εξαιρετική ομοιότητα με την αμινοξική αλληλουχία ενζύμων. ο παραγωγός μικροοργανισμός καλλιεργήθηκε σε διάφορα θρεπτικά μέσα καλλιέργειας και το υπερκείμενο κάθε καλλιέργειας εξετάστηκε για την ύπαρξη τελικών προϊόντων. η υδροξυλάση που κωδικοποιείται από το ORF14. Η πυρανόνη αυτή φαίνεται να αποτελεί υπόστρωμα για δύο τύπους οξειδοαναγωγασών. Φυλογενετική ανάλυση της HOXC αποκάλυψε σημαντική ομολογία αμινοξέων με γνωστές οξυγονάσες. για να προσδιορισθεί εάν η δομή του πολυκετιδίου είναι γραμμική ή κυκλική. εξετάστηκε η θειοεστεράση (ΤΕ) του τελικού αθρώματος (άρθρωμα 9. Ιδιαιτέρα. 41 . Η σύγκριση των αμινοξικων αλληλουχιών της ΤΕ με άλλες ΤΕ κατέδειξε. εδράζονται στον κοινό γενετικό τόπο (Εικόνα 25). Με βάση τις παραπάνω προβλέψεις. Μια πιθανή θέση δράσης αυτού ενζύμου είναι η αιθυλική ομάδα της πυρανόνης. της OXRC και της HOXC. Τα γονίδια που κωδικοποιούν για αυτές τις οξειδοαναγωγάσες. Η τελευταία χημική ένωση υπόκειται σε αυτόματη υδρόλυση και έτσι σχηματίζεται μια αλκένυλ-φουρανόνη. των οποίων η χημική δομή να μοιάζει με αλκένυλ-φουρανόνη.αγνώστου συμπλέγματος γονιδίων. που υδροξυλιώνουν μακρολίδες. Εικόνα 31) του άγνωστου συμπλέγματος γονιδίων. οι οποίες καταλύουν το σχηματισμό μιας κυκλικής δομής με 7 άτομα άνθρακα. ότι η τελική δομή της μακρολακτόνης είναι γραμμική. ότι όλα αυτά τα ένζυμα μπορούν να υδροξυλιώσουν το πέμπτο άτομο άνθρακα της πυρανόνης. Επιπλέον. Για παράδειγμα. φαίνεται ότι σχηματίζεται μια δομή πυρανόνης. Φυλογενετική ανάλυση των OXRCs έδειξε.

πρώτα αναγνωρίζεται το πιθανό σιωπηλό μονοπάτι μέσω βιοπληροφορικής ή άλλων στρατηγικών και στη συνέχεια.Eco86. Διαγραμματική αναπαράσταση της διαδικασίας της απενεργοποίησης γονιδίου και συγκριτική ανάλυση των φυσικών προϊόντων. 7. Σύμπλεγμα γονιδίων του Streptomyces sp. στην ανάλυση αυτή χρησιμοποιούνται τεχνικές όπως υγρή χρωματογραφία συνδεδεμένη με ανιχνευτή μάζας (LC/MS) και υγρή χρωματογραφία με ανιχνευτή πολλαπλών διόδων (DAD-HPLC).1. τα οποία πιθανά κωδικοποιούν για τη σύνθεση ενός φυσικού προϊόντος και το προβλεπόμενο μεταβολικό μονοπάτι για τη βιοσύνθεση ενός φυσικού προϊόντος. Αποτελείται από 16 ανοικτά πλαίσια ανάγνωσης. Συνδυασμός απενεργοποίησης γονιδίου και συγκριτική ανάλυση των φυσικών προϊόντων Μία εναλλακτική μέθοδος.Εικόνα 31. Ανάλυση του φάσματος των δευτερογενών μεταβολιτών στο αγρίου τύπου στέλεχος και στο μεταλλαγμένο. Σε αυτήν τη μέθοδο. αφορά στην απενεργοποίηση γονιδίων του σιωπηλού μονοπατιού. Συνήθως. περιείχε σημαντικές ποσότητες αλκένυλ-φουρανόνης. Πράγματι. Ο γενετικός τόπος του συμπλέγματος γονιδίων είναι 65kb. προσδιορίζει την ύπαρξη κάποιου δευτερογενή μεταβολίτη (Εικόνα 32). από τις μεθόδους που προαναφερθήκαν. Για την καλύτερη κατανόηση της μεθόδου. Οι βιοδραστικές ιδιότητες της αλκένυλφουρανόνης εξετάστηκαν και έχει δειχθεί ότι παρουσιάζει εντομοκτόνο δράση. με βιοδραστικές 42 .5. Η συνθάση του πολυκετιδίου αποτελείται από 4 ανοικτά πλαίσια ανάγνωσης και περιέχει συνολικά 9 αρθρώματα. παρατίθεται ένα παράδειγμα Τα μυξοβακτήρια παράγουν πολλούς δευτερογενείς μεταβολίτες. Εικόνα 32. ένα από τα γονίδια του συμπλέγματος απενεργοποιείται (η αλληλουχία του συμπλέγματος γονιδίων είναι γνωστή). το τελικό προϊόν που ανευρέθηκε στο υπερκείμενο.

ότι κωδικοποιείται μια υβριδική PKS-NRPS. Έτσι. ότι το στέλεχος αυτό παράγει myxalamide (υβριδικό PKS-NRPS) (Εικόνα 33). Ανάλυση της αλληλουχίας των γονιδιωματικών κλώνων έδειξε.ιδιότητες. το γονιδίωμα του βακτηρίου χρησιμοποιήθηκε για την κατασκευή μιας βιβλιοθήκης κοσμιδίων. Τα περισσότερα μυξοβακτήρια είναι δεκτικά σε γενετικές παρεμβάσεις. Ανάλυση (HPLC) του υπερκείμενου καλλιέργειας τους στελέχους Stigmatella aurantiaca Sg15 (CBS38) έδειξε. ότι δεν παράγεται myxalamid (Εικόνα 33). όπως τα mixalamids (αναστολείς της ροής ηλεκτρονίων). Η βιβλιοθήκη αυτή σαρώθηκε με εκφυλισμένα προϊόντα PCR για γονίδια των PKSs ή NRPSs και απομονώθηκαν αλληλοεπικαλυπτόμενα κοσμίδια. Στη συνέχεια. 43 . Οι μεταβολίτες αυτοί βιοσυντίθενται από διάφορες υβριδικές PKS-NRPSs. το γονίδιο που φαίνεται ότι κωδικοποιεί την NRPS (myxA) απενεργοποιήθηκε. Σύγκριση του πρότυπου δευτερογενών μεταβολιτών του αγρίου τύπου στελέχους (CBS38) και του μεταλλαγμένου (CBS39) έδειξε.

όπου και εκφράζεται. που κωδικοποιείται από σιωπηλά συμπλέγματα γονιδίων. Σε αυτήν την προσέγγιση.aurantiaca (CBS38) και του μεταλλαγμένου (CBS39).1. 7. 7. πρώτα εντοπίζεται το σύμπλεγμα γονιδίων. Συνδυασμός ετερόλογης έκφρασης και συγκριτικής ανάλυσης των παραγόμενων φυσικών προϊόντων Μία άλλη στρατηγική που ακολουθείται για τον προσδιορισμό του τελικού προϊόντος. ακολουθεί σύγκριση της αμινοξικής αλληλουχίας των συνθασών των 44 . Γονίδιο-ισοτοπική προσέγγιση Η γονίδιο-ισοτοπική (GI) προσέγγιση (μέθοδος) σχεδιάστηκε για τον προσδιορισμό σιωπηλών μονοπατιών.7. Το πρότυπο της ανάλυσής τους συγκρίνεται με αυτό του ξενιστή. μεταφέρεται στον ετερόλογο ξενιστή. Στη συνέχεια. myxochromid S. τότε παρατηρούνται σημαντικές διαφορές (Εικόνα 34).1. το σύμπλεγμα γονιδίων που συχνά εδράζεται σε έναν κλώνο BAC ή σε ένα κοσμίδιο. M-D. Σε αυτήν την περίπτωση. που εμπλέκονται στη βιοσύνθεση NRPs ή υβριδικών NRP-PKs.6. Σύγκριση του πρότυπου δευτερογενών μεταβολιτών του αγρίου τύπου στελέχους S. είναι η έκφρασή τους σε ετερόλογους ξενιστές. M-A. Εικόνα 34. M-B. myxalamid A. myxalamid C. MC. άγνωστο myxalamid. Τα πιθανά φυσικά προϊόντα απομονώνονται από το υπερκείμενο της καλλιέργειας ή μετά από εκχύλιση του παραγωγού ξενιστή. Χημική δομή των myxalamid. τα οποία μετέχουν στη βιοσύνθεση NRPs ή υβριδικών NRP-PKs.Εικόνα 33. Εαν το σιωπηλό μονοπάτι εκφράζεται. myxalamid B. Διαγραμματική αναπαράσταση της διαδικασίας ετερόλογης έκφρασης και συγκριτικής ανάλυσης των παραγόμενων φυσικών προϊόντων. myxalamid D. MS. που δε φέρει το επιλεγμένο BAC.

Ο παραγωγός οργανισμός καλλιεργήθηκε σε διαφορετικές συνθήκες και εξετάστηκε σε ποια από αυτές εκφράζεται το ορφανό (orphan) μονοπάτι. Το προβλεπόμενο πρόδρομο μόριο (το αμινοξυ) προστίθεται στο μέσο καλλιέργειας του παραγωγού οργανισμού ως σημασμένο σταθερό ισότοπο και τα φυσικά προϊόντα. με βάση τις αμινοξικές αλληλουχίες της δομικής περιοχής Α. ανάλυση έδειξε. το οποίο φέρει ένα λιπαρό οξύ. ότι υπάρχουν τρία συμπλέγματα γονιδίων. έγινε πρόβλεψη για τη σύσταση των αμινοξέων του CLP. κυκλικό λιποπεπτίδιο (cyclic lipopeptide. Τα διάφορα κλάσματα εξεταστήκαν με NMR για την παρουσία του φυσικού προϊόντος.δομικών περιοχών Α. ο παραγωγός οργανισμός καλλιεργήθηκε υπό επιλεγμένες συνθήκες και στο θρεπτικό μέσο προστέθηκε ένα από τα προβλεφθέντα αμινοξέα (σημασμένο με ένα σταθερό ισότοπο). Επιπλέον. αναλύονται μέσω NMR. Το υπερκείμενο της καλλιέργειας εκχυλίστηκε και ο διαχωρισμός του πραγματοποιήθηκε με διαφορετικές μεθόδους. Στη συνέχεια. Η ανάλυση αυτή παρέχει ενδείξεις. τα οποία κωδικοποιούν για διαφορετικά σιωπηλά μονοπάτια.1. όπου εξετάζεται η δραστηριότητα του τελικού προϊόντος (assay-guided approach). Για την καλύτερη κατανόηση της μεθόδου. Το αντιβιοτικό ονομάστηκε orfamides και παρουσιάζει αντιμυκητιακή δράση. Η γονίδιο-ισοτοπική (GI) προσέγγιση συγκρίνεται με μια παλαιότερη μέθοδο. ότι το ολιγοπεπτίδιο ήταν κυκλικό και έφερε ένα λιπαρό οξύ. το οποίο πρόκειται να ενσωματωθεί στο τελικό προϊόν. γεγονός που επέτρεψε την καλύτερη κλασμάτωσή του. η οποία βασίζεται στην ανάπτυξη ενός πρωτόκολλου. Στη συνεχεία. Ανάλυση του γονιδιώματος του Pseudomonas fluorescens Pf-5 έδειξε. Ενεργοποίηση του σιωπηλού μονοπατιού 45 . Ένα από τα σιωπηλά μονοπάτια φαίνεται να κωδικοποιεί για ένα κυκλικό NRP. για τουλάχιστον ένα αμινοξύ. Εικόνα 35. CLP). παρατίθεται ένα παράδειγμα (Εικόνα 35). 7. με άλλες γνωστές δομικές περιοχές Α.8. που είναι σημασμένα.

nidulanς. το οποίο κωδικοποιεί ένα ενεργοποιητή (apdR). το σιωπηλό μεταβολικό μονοπάτι δεν εκφράζεται κατά την καλλιέργεια του παραγωγού μικροοργανισμού. Σε αυτές τις περιπτώσεις. Διερεύνηση των ανωφερικών και κατωφερικών αλληλουχιών του συμπλέγματος. η καλλιέργεια υπόκειται σε διάφορες επεμβάσεις. που εμπλέκεται στη βιοσύνθεση του φυσικού προϊόντος. Ανάλυση του γονιδιώματος του A. της aspyridone (Εικόνα 36). Η πρώτη προσέγγιση περιλαμβάνει την εξέταση της έκφρασης των γονιδίων στο αγρίου τύπου παραγωγό στέλεχος και σε ένα μεταλλαγμένο στέλεχος. έδειξε την παρουσία ενός γονιδίου. Αυτό μπορεί να οφείλεται στο γεγονός. προσδιορίζονται τα γονίδια.nidulans προέβλεψε την ύπαρξη ενός συμπλέγματος γονιδίων. Στο μεταλλαγμένο στέλεχος έχει απενεργοποιηθεί ένας ρυθμιστής του δευτερογενούς μεταβολισμού. ότι η βιοσύνθεση του δευτερογενούς μεταβολίτη απαιτεί τη διέγερση κάποιου ειδικού σήματος. Χημική επαγωγή της καλλιέργειας των μετασχηματισμένων κυττάρων. το μονοπάτι παραμένει σιωπηλό (δηλαδή δεν εντοπίζεται κάποιος δευτερογενής μεταβολίτης). Η υπερέκφραση του laeA έχει ως αποτέλεσμα την επαγωγή της μεταγραφής γονιδίων. Δύο προσεγγίσεις έχουν αναπτυχθεί και εφαρμόστηκαν για τον προσδιορισμό των προϊόντων σιωπηλών μονοπατιών στον Aspergilus nidulans. ο οποίος εδράζεται κοντά στο σύμπλεγμα γονιδίων. τα οποία εμπλέκονται στο δευτερογενή μεταβολισμό. οι οποίες είχαν καλλιεργηθεί υπό διαφορετικές συνθήκες καλλιέργειας. που κωδικοποιεί για υβριδικές NRPS-PKSs. τότε το πρόβλημα προσεγγίζεται με γενετικές μεθόδους. είχε ως αποτέλεσμα την παραγωγή ενός νέου φυσικού προϊόντος. Στην περίπτωση κατά την οποία. Ωστόσο. τα οποία κωδικοποιούν σιωπηλά μονοπάτια. β. laeA (μια πρωτεΐνη που εδράζεται στον πυρήνα και ρυθμίζει τη μεταγραφή των γονιδίων που εμπλέκονται στο δευτερογενή μεταβολισμό). τα οποία παρουσιάζουν μεταβολές στην έκφρασή τους και πιθανά ανήκουν σε συμπλέγματα γονιδίων. δεν παρατηρήθηκε η παραγωγή κάποιου μεταβολίτη στο υπερκείμενο καλλιεργειών. Η δεύτερη προσέγγιση περιλαμβάνει την έκφραση ενός πιθανού ενεργοποιητή γονιδίων. μεταβολή του pH. α.Σε ορισμένες περιπτώσεις. όπως εξέταση διαφορετικών θρεπτικών μέσων. Το γονίδιο apdR κλωνοποιήθηκε σε ένα φορέα έκφρασης και μεταφέρθηκε στον A. ούτε και στον ετερόλογο ξενιστή. έκθεση σε υπεριώδη ακτινοβολία. Έτσι. 46 . ρυθμός οξυγόνωσης.

εκπροσωπούνται στους κλώνους της βιβλιοθήκης. επέτρεψε τόσο την υπερπαραγωγή τους όσο και τη σύνθεση αναλόγων των προϊόντων. αέρας. όπως είναι τα κοσμίδια η τα BAC. μέσω της Συνδυαστικής Βιοσύνθεσης. 7. που κωδικοποιούν για ένζυμα. η ετερόλογη έκφραση σιωπηλών βιοσυνθετικών μονοπατιών σε ξενιστές (παρένθετους) μικροοργανισμούς παρείχε δυνατότητες βιοσύνθεσης νέων (ανθρωπογενών) φυσικών προϊόντων. Εξέταση του υπερκείμενου καλλιέργειας του στελέχους αγρίου τύπου (WT) και αυτού που εκφράζει το apdR (SB4.Εικόνα 36. Ως εκ τούτου.1.1). τα οποία μπορεί να εμπλέκονται στη βιοσύνθεση φυσικών προϊόντων. 47 . έδαφος. Η μεταγονιδιωματική βασίζεται στην απομόνωση DΝΑ από διαφορετικά περιβάλλοντα (π. με αξιόλογες προοπτικές στην αναγνώριση νέων φυσικών προϊόντων (Εικόνα 30). Ετερόλογη έκφραση γονιδίων που κωδικοποιούν για μονοπάτια βιοσύνθεσης φυσικών προϊόντων Η ετερόλογη έκφραση γονιδίων. μικροοργανισμοί που δεν είναι δυνατόν να καλλιεργηθούν.χ.9. Επίσης. στόμαχος μυρηκαστικών και ανθρώπου) και την κλωνοποίησή του σε φορείς. Πιθανή πορεία βιοσύνθεσης της aspyridone. 8. τα οποία εμπλέκονται στα μονοπάτια βιοσύνθεσης των φυσικών προϊόντων. Η αξιοποίηση αυτών των κλώνων βρίσκεται σε ανάπτυξη. Προσεγγιση της μεταγονιδιωματικής Η ανάπτυξη της μεταγονιδιωματικής έδωσε μια τεράστια δεξαμενή αλληλουχιών DNA. νερό. με πιθανές βιοδραστικές ιδιότητες.

Ωστόσο. η ανασύσταση των μεταβολικών μονοπατιών βιοσύνθεσης των φυσικών προϊόντων. τα κατάλληλα γενετικά εργαλεία. 4. γενετικά ανόμοιους με τους παραγωγούς οργανισμούς. Η χρήση κωδικονίων είναι συνήθως σημαντικός παράγοντας για την απόδοση της έκφρασης σε παρένθετο μικροοργανισμών. προϋποθέτουν νέες προσεγγίσεις. είναι σημαντικό το GC περιεχόμενο του παρένθετου οργανισμού να είναι παρόμοιο με το GC περιεχόμενο του ξένου γονιδίου. σε παρένθετους μικροοργανισμούς προϋποθέτει. Ως εκ τούτου. 3.1. Μερικοί από τους παράγοντες. λαμβάνονται υπόψη κατά την επιλογή του παρένθετου μικροοργανισμού. έτσι ώστε να προκύπτουν λειτουργικά ένζυμα. όπως για παράδειγμα των PKSs και των NRPSs. πρέπει να εκφράζονται και οι πολυπεπτιδικές αλυσίδες να αναδιπλώνονται. 5.8. Η λειτουργικότητα των ρυθμιστικών στοιχείων και η δομή των προαγωγέων καθώς και η σταθερότητα του mRNA. παράγουν Συνήθως πολυκετίδια. οι γενετικές τροποποιήσεις στα γονίδια αλλά και η μεταφορά τους στον παρένθετο μικροοργανισμό. γενετικά παρόμοιους με τους παραγωγούς οργανισμούς έως τη μεταφορά τροποποιημένων μεγάλων μεταβολικών μονοπατιών. Γενικά θέματα που αφορούν στην ετερόλογη έκφραση των μονοπατιών βιοσύνθεσης των πολυκετιδίων Οι προσεγγίσεις που ακολουθούνται στην ετερόλογη έκφραση μεταβολικών μονοπατιών βιοσύνθεσης δευτερογενών μεταβολιτών ποικίλουν . Τα γονίδια. 2. έχουν μεγάλο μέγεθος. που εμπλέκονται στη βιοσύνθεση των πολυκετιδίων. Ο παρένθετος μικροοργανισμός πρέπει να έχει τους μηχανισμούς τροποποίησης των παραγόμενων πολυπεπτιδίων. που εμπλέκονται στο μονοπάτι βιοσύνθεσης των φυσικών προϊόντων. ότι τα γονίδια που κωδικοποιούν για τα ένζυμα. 48 . αναφέρονται παρακάτω: 1. Ως εκ τούτου. το DNA παρουσιάζει των υψηλή περιεκτικότητα σε περιεχόμενο GC. που επηρεάζουν την επιτυχή ετερόλογη έκφραση των πολυκετιδίων. σε παρένθετους μικροοργανισμούς. για αυτόν το μικροοργανισμό. Ο παρένθετος μικροοργανισμός (ξενιστής) πρέπει να καλλιεργείται εύκολα στο εργαστήριο και να έχουν αναπτυχθεί.από την απευθείας μεταφορά μικρών συμπλεγμάτων γονιδίων σε παρένθετους μικροοργανισμούς. που μικροοργανισμό. που να επιτρέπουν τις γενετικές παρεμβάσεις.

7. στελέχη Streptomyces. από διάφορα οικοσυστήματα.lividans και S. μη-πρωτεϊνογενή αμινοξέα ή CoA-ενεργοποιημένα καρβοξυλικα οξέα με μικρού μήκους ανθρακική αλυσίδα). Streptomyces. αποτελούν τους καλύτερους παραγωγούς φυσικών προϊόντων. Διαφορά μέλη αυτής της ομάδας βακτηριών. Πρέπει να λαμβάνεται υπόψη. έχουν αναπτυχθεί γενετικά εργαλεία. τα οποία κωδικοποιούνται από συμπλέγματα γονίδιων. είναι αναγκαίο να μεταφερθεί και να εκφραστεί στον παρένθετο μικροοργανισμό. με σημαντικές βιοδραστικές ιδιότητες. Στην περίπτωση που το παραγόμενο επιθυμητό προϊόν έχει αντιμικροβιακη δράση ή είναι τοξικό για τον παρένθετο μικροοργανισμό. 8. Ετερόλογη έκφραση. για αυτούς τους μικροοργανισμούς. με χαρακτηριστικούς αντιπρόσωπους τους S. ότι ολόκληρο το μεταβολικό μονοπάτι 49 . Τα χαρακτηριστικά αυτά κατέστησαν τους Streptomyces από πιο καταλλήλους οργανισμούς για την ετερόλογη έκφραση μεταβολικών μονοπατιών βιοσύνθεσης φυσικών προϊόντων. σε γενετικά παρόμοιο παρένθετο μικροοργανισμό Το γονιδίωμα των ακτινοβακτηρίων έχει υψηλό περιεχόμενο σε GC και στελέχη τους αποτελούν τους καλύτερους παραγωγούς δευτερογενών μεταβολιτών. που εδράζονται σε μεγάλα τμήματα DNA Έχουν απομονωθεί. ο οποίος μπορεί να διεγείρεται. σε γενετικά παρόμοιους παρένθετους οργανισμούς. Ανάλυση των γονιδίων. Επίσης. η δυνατότητα του παρένθετου οργανισμού σε ότι αφορά την παραγωγή κατάλληλων πρόδρομων ενώσεων (π. που απαιτούνται για τη βιοσύνθεση φυσικών προϊόντων όπως τα πολυκετίδια ή πεπτίδια που βιοσυντίθενται εκτός ριβοσωμάτων. η έκφραση των ξένων γονιδίων μπορεί να υπόκεινται σε έλεγχο. τότε παράλληλα με τη μεταφορά του μεταβολικού μονοπατιού.2. Απευθείας μεταφορά του αποσυνθετικού συμπλέγματος γονιδίων. τα οποία παράγουν πολυκετίδια με βιολογική δράση αλλά τα επίπεδα παραγωγής τους είναι πολύ χαμηλά. 8. μεταβολικών μονοπατιών. όπως είναι οι τα πολυκετίδια. που κωδικοποιούν για πολυκετίδια. που κωδικοποιούν τα ένζυμα βιοσύνθεσης αυτών των πολυκετιδίων έδειξε. μέσω ενός επαγόμενου προαγωγέα.coelicolor.3.6. το κατάλληλο γονίδιο ανθεκτικότητας. όταν ο παρένθετος μικροοργανισμός βρίσκεται στη φάση στασιμότητας.χ. Εναλλακτικά.

Streptomyces shuttle vectors) περιέχει τα κατάλληλα γενετικά στοιχεία.coli. που προέρχονται από τον παραγωγό οργανισμό. το σύμπλεγμα γονίδιων που απαιτείται για τη βιοσύνθεση της daptomycin. όπως είναι τα κοσμίδια. σε αυτές τις περιπτώσεις. η griseorhodin A είναι ένα πολυκετίδιο. ο φορέας (integrative or replicative E. oriT) και την ενσωμάτωσή του (phage attachment site) στο γονιδίωμα του παρένθετου μικροοργανισμού (π. που βιοσυνθέτει griseorhodin Α και του S. Η ετερόλογη έκφραση αυτών των γονιδίων στον S.lividans είχε ως αποτέλεσμα την παραγωγή 18mg/lt του 50 . S.χ. JP95. στο S.coelicolor). Για παράδειγμα.lividans ZX1 (pMP31a).χ.lividans έχει ως αποτέλεσμα τη βελτίωση της griseorhodin A (Εικόνα 37) Εικονα 37.χ. Τα γονίδια. που εμπλέκεται στη βιοσύνθεση της clyseorhodin Α. Ο φορέας pMP31a φέρει ολόκληρο το σύμπλεγμα γονίδιων.εδράζεται σε ένα τμήμα DNA 30-35kb και ως εκ τούτου. Η ετερόλογη έκφραση επιτυγχάνεται με τη χρήση του προαγωγέα και των ρυθμιστικών στοιχείων. τότε ολόκληρο το τμήμα DNA κλωνοποιείται σε ένα φορέα. η μεταφορά ολόκληρου του συμπλέγματος γονίδιων που απαιτείται για τη βιοσύνθεση της daptomycin (NRP. καλύπτουν 34. Στην περίπτωση που τα μεταβολικά μονοπάτια κωδικοποιούνται από μεγαλύτερα τμήματα DNA (π. Η griseorhodin Α αποτελεί αναστολέα της δράσης της ανθρώπινης τελομεράσης και της ανάστροφης μεταγραφάσης των ρετροϊών. το όποιο φέρει λιπίδιο). έχει μέγεθος περίπου 128kb). όπως είναι το BAC (τεχνητό βακτηριακό χρωμόσωμα). JP95. στον Streptomyces roseosporus. Συνήθως. PC-ESI-MS ανάλυση εκχυλισμάτων του αγρίου τύπου στελέχους Streptomyces sp. που εμπλέκονται στη βιοσύνθεση της griseorhodin A.2kb του γονιδιώματος του παραγωγού μικροοργανισμού. που απομονώθηκε από το θαλάσσιο Streptomyces sp. που επιτρέπουν τη μεταφορά του (π. Για παράδειγμα. μπορεί να κλωνοποιηθεί σε ένα φορέα. lividans ή S.

coli. τα οποία κωδικοποιούνται από συμπλέγματα γονίδιων. Οργάνωση της συνθετασης της Ybt και μεταβολίτες που απαιτούνται για τη βιοσύνθεση της Ybt στο E. παρένθετους οργανισμούς. παρένθετους οργανισμούς. Ωστόσο. που προκαλεί τη βουβωνική πανώλη) (Εικόνα 38).4.coli δε βιοσυνθέτει σαλικυλικό. 51 . Τμήματα του γονιδιακού συμπλέγματος κλωνοποιήθηκαν σε δύο κοσμίδια. Εικόνα 38. το οποίο βιοσυντίθεται από το βακτήριο Yersinia pestis. Εναλλακτικά. Σε αυτήν την περίπτωση. για την επιτυχή έκφραση των γονίδιων στο E. μεταβολικών μονοπατιών. σε γενετικά ανόμοιους. το ένα κοσμίδιο φέρει όλα τα βιοσυνθετικά γονίδια και το άλλο φέρει όλα τα απαιτούμενα ρυθμιστικά στοιχεία. Για παράδειγμα. όπως το E. είναι εφικτή.λιποπεπτιδίου. Ετερόλογη έκφραση σε γενετικά ανόμοιους. απαιτούνται τεχνητοί προαγωγείς και για την επιτυχή παράγωγη του φυσικού προϊόντος ήταν απαραίτητη η προσθήκη σαλικυλικού διότι το E.coli. η yersiniabactin είναι ένα σιδεροφόρο (PKS/NRPS). 8.coli. μπορεί να επιτευχθεί η ετερόλογη έκφραση ενός μεταβολικού μονοπατιού μεσω της συν-έκφρασης δυο κοσμιδίων. που εδράζονται σε μεγάλα τμήματα DNA Η πραγματοποίηση της ετερόλογης έκφρασης κλωνοποιημένων συμπλεγμάτων γονίδιων.

Το ερώτημα που τίθεται είναι το εάν μπορούμε να παράγουμε υβριδικά πολυκετιδια. 8. Στη βιοσύνθεση της mithramycin. Συν-έκφραση ενός ή περισσότερων γονίδιων Η mithramycin. Η ετερόλογη έκφραση. είναι τεχνικά δύσκολη και σε πολλές περιπτώσεις ανέφικτη. Τα γονίδια urdGT2 και lanGT4 κλωνοποιήθηκαν σε κατάλληλο φορέα έκφρασης και στη συνέχεια μεταφέρθηκαν σε ένα μεταλλαγμένο στέλεχος του S. μέσω επεμβάσεων στο γένωμα των παραγωγών οργανισμών. 52 . landomycin και urdamycin μετέχουν τα γονιδιακά συμπλέγματα γλυκοζύλ-μεταφορασών MtmGIV. με αντικαρκινική δράση.5. τα οποία να περιέχουν διαφορετική γλυκοζύλο-ομάδα. με διευρυμένες ή νέες βιολογικές δράσεις. το όποιο βιοσυνθέτει μόνο τον πολυκετιδικό σκελετό της mithramycin.τη βιοσύνθεση ενός υβριδικού μορίου (Εικόνα 39). την premithramycinone.5.1. αποτελεί τη βάση για βιοσύνθεση νέων φυσικών προϊόντων Η μεταλλαξιογένεση μεταβολικών μονοπατιών. τα οποία φέρουν διαφορετικές γλυκοζύλο-ομαδες. Η συνδυασμένη έκφραση του urdGT2 και του lanGT4 είχε ως αποτέλεσμα.8. Για την καλύτερη κατανόηση του θέματος. Ο Streptomyces argillaceus παράγει μόνο mithramycin ενώ άλλα στελέχη στρεπτοβακτηρίων παράγουν είτε landomycin είτε urdamycin. που εμπλέκονται στη βιοσύνθεση των παραπάνω πολυκετιδίων. Τα γονίδια. μέσω ΣΒ. Η προσθήκη της γλυκοζύλο-ομάδας στον πολυκετιδικό σκελετό καταλύεται από τις γλυκοζύλ-τρανφεράσες. σε συνδυασμό με τη συνδυαστική βιοσύνθεση. Ως εκ τούτου. αποτελεί βασική στρατηγική για τη βιοσύνθεση φυσικών προϊόντων. landomycin και urdamycin είναι μία ομάδα γλυκοζυλιωμένων. urdGT2 και lanGT4. θα δοθούν μερικά παραδείγματα. η in-vivo σύνθεση νέων φυσικών προϊόντων. αρωματικών πολυκετιδίων. έχουν χαρακτηριστεί. Τα γονίδια που κωδικοποιούν τις γλυκοζύλ-μεταφοράσες έχουν κλωνοποιηθεί και χαρακτηριστεί.argillaceus (έχει απενεργοποιηθεί το MtmGIV).

με τη χρήση της τεχνικής της κλωνοποίησης μέσω ανασυνδυασμού Η εφαρμογή αυτής προσέγγισης πραγματοποιήθηκε με την ετερόλογη έκφραση του μονοπατιού βιοσύνθεσης της myxochromide S στο Pseudomonas putida. Η στρατηγική που εφαρμόζεται. Με αυτόν τον τρόπο. 8. ενός ή δύο γονίδιων. Η myxochromide S.coli και επιπλέον διαθέτει γονιδίωμα με υψηλό περιεχόμενο σε GC και προτίμηση για τα σωστά κωδικόνια Επίσης. συνδεδεμένο με ένα πολυκετίδιο και βιοσυντίθεται από το μυξοβακτήριο Stigmatella aurantiaca.3. αποφεύγεται η κατασκευή ενός τμήματος DNA.5. Ο παρένθετος ξενιστής έχει παρόμοια προσόντα με αυτά του E.Εικόνα 39. το βακτήριο διαθέτει μια μεταφοράση της φωσφοαντοθεεΐνης (Ppant). 8.2.coli Η βιοσύνθεση πολύπλοκων βιβλιοθηκών ή νέων φυσικών προϊόντων προϋποθέτει τη δυνατότητα συν-έκφρασης. για την κλωνοποίηση και την ετερόλογη έκφραση συμπλεγμάτων 53 . σε ένα παρένθετο οργανισμό. Η προσέγγιση αυτή πραγματοποιείται μέσω της κλωνοποίησης. τα οποία είναι τμήματα μεταβολικών μονοπατιών διαφορετικών οργανισμών.5. είναι ένα κυκλικό πεπτίδιο. η οποία δέχεται ένα ευρύ φάσμα υποστρωμάτων. σε 3-4 συμβατά πλασμίδια. Ο παραγωγός μικροοργανισμός αποδίδει 8mg/lt myxochromide S ενώ η απόδοση του ανασυνδυασμένου Pseudomonas putida πλησιάζει τα 32mg/lt. των μεταβολικών μονοπατιών βιοσύνθεσης φυσικών προϊόντων. γονίδιων. Πολλαπλό σύστημα πλασμιδίων για τη συν-έκφραση στο E. το όποιο να φέρει όλα τα διαφορετικά γονίδια. Η συν-έκφραση των γλυκοζυλομεταγορασών urdGT2 και lanGT4 στον Streptomyces argillaceus mutant έχει ως αποτέλεσμα τη βιοσύνθεση ενός νέου γλυκοζυλιωμένου πολυκετιδίου. Κλωνοποίηση και τροποποίηση των γονίδιων.

γονίδιων.coli. που εφαρμόζεται για την ετερόλογη έκφραση μονοπατιών βιοσύνθεσης φυσικών προϊόντων. μεταφέρεται στον κατάλληλο ξενιστή. των οποίων η χημική δομή αναλύεται. όπου μέσω Red/ET recombineering υφίσταται την οποιαδήποτε επιθυμητή τροποποίηση και στη συνέχεια. τα οποία απαιτούνται για τη βιοσύνθεση φυσικών προϊόντων. αναπαριστάται σχηματικά στην εικόνα 40. Το γενωματικό DNA (genomic DNA) του παραγωγού οργανισμού. μέσω πολλαπλών αναλυτικών μεθόδων. Το κατάλληλο κοσμίδιο μεταφέρεται στο E. σε κοσμιδιακό φορέα. Σχηματική αναπαράσταση της στρατηγικής. με τη χρήση της κλωνοποίησης μέσω ανασυνδυασμού. Η έκφραση των γονίδιων οδηγεί στη βιοσύνθεση των φυσικών προϊόντων. χρησιμοποιήθηκε για την κατασκευή μιας βιβλιοθήκης γονίδιων. 54 . Εικόνα 40.

Sign up to vote on this title
UsefulNot useful