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Planta Piloto de Fermentaciones Departamento de Biotecnologa

Procesos Industriales de Separacin

Sergio Huerta Ochoa


UAM-Iztapalapa

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The bioseparations needs for tomorrow (Keller et al., 2001)

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Proceso de bioseparacin
Definicin: Recuperacin, aislamiento, purificacin y refinamiento de productos sintetizados por procesos biotecnolgicos Definicin extendida: Etapas de refinamiento final de procesos tales como tratamiento de efluentes y purificacin de agua por biotecnologa
UPSTREAM - formulacin de medios - desarrollo de inculo - esterilizacin - inoculacin FERME TACI

DOW STREAM - extraccin de producto, purificacin y refinamiento - tratamiento de aguas - recuperacin de subproducto

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Por qu necesitamos bioseparacin?


Enriquecimiento del producto objetivo Reduccin de volumen Remocin de impurezas especficas Mejoramiento de la estabilidad del producto Alcanzar las especificaciones del producto Prevencin de la degradacin del producto Prevencin de otras catlisis diferentes a las deseadas Prevencin de envenenamiento del catalizador

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Retos en ingeniera de bioseparaciones


Bajas concentraciones de producto Gran nmero de impurezas Termolabilidad de bioproductos Estrecho margen de operacin de pH y fuerza inica Sensibilidad al esfuerzo cortante de bioproductos Baja solubilidad de bioproductos en solventes orgnicos Inestabilidad de bioproductos en solventes orgnicos Estrictos requerimientos de calidad
Porcentaje de pureza Ausencia de impurezas especficas Un proceso ideal de bioseparacin debe combinar alta capacidad con alta selectividad, y debe asegurar estabilidad del producto

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Efecto del producto en el proceso de separacin

aturaleza del producto

Calidad requerida (Mercado)

Extensin y tipo del proceso de separacin

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The bioseparations needs for tomorrow (Keller et al., 2001)

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Productos biolgicos
Producto Naturaleza de requerida la bioseparacin

Bebidas alcohlicas: cidos orgnicos: Vitaminas:

Cerveza, vino, licores cido actico, cido ctrico Vitamina C, vitamina B12, riboflavina

Clarificacin, distilacin Precipitacin, filtracin, adsorcin, extraccin con solventes Precipitacin, filtracin, adsorcin, extraccin con solventes Precipitacin, filtracin, adsorcin, extraccin con solventes Precipitacin, filtracin, adsorcin, extraccin con solventes Precipitacin, filtracin, adsorcin Precipitacin, filtracin, adsorcin, extraccin con solventes

Amino cidos: Antibiticos:

Lisina, glicina, fenilalanina Penicilinas, neomicina, bacitracina

Carbohidratos: Lpidos:

Almidn, azcares, dextranas Glicerol, grasas, cidos grasos

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Productos biolgicos (cont...)


Protenas:
Alimentos y sus aditivos Nutracuticos Enzimas industriales Hormonas Enzimas farmacuticas Productos derivados de plasma Anticuerpos monoclonales Factores de crecimiento Trombolticos Protenas derivadas de r-DNA Protenas de diagnstico Vacunas Filtracin, precipitacin, centrifugacin, adsorcin, cromatografa, separaciones basadas en membranas

Productos basados en DNA:

Pruebas de DNA, plsmidos, nucletidos, oligonucletidos

Filtracin, precipitacin, centrifugacin, adsorcin, cromatografa, separaciones basadas en membranas

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Un buen proceso de separacin:


Asegura la pureza deseada del producto Asegura la estabilidad del producto Mantiene costos bajos Es reproducible Es escalable Cumple con las regulaciones establecidas

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La economa del proceso est determinada por:


Capital invertido Costos de operacin Otros factores Eficiencia de las operaciones unitarias individuales Prdidas en cada etapa Destruccin o degradacin del producto durante el proceso Estado fsico del producto al final de cada etapa Costo del tratamiento del efluente

Planta Piloto de Fermentaciones Departamento de Biotecnologa Correlacin entre concentracin de producto antes de la purificacin y precio de venta
10 5 Agua Etanol 10 3 cido ctrico Penicilina Treonina Cefalosporina Gentamicina cido giberlico Glucosa oxidasa Amilasas Hormona humana de crecimiento Activador plasmingeno de tejido Vacuna B hepatitis

Amino cidos 10 1 Antibiticos Proteasas microbianas 10 -1 Enzimas 10 -3

Insulina Renina Glicerofosfato deshidrogenasa Luciferasa Enzimas teraputicas Factor VIIII Urokinasa

Enzimas de diagnstico 10 -5

Anticuerpos monoclonales

10 -7 10 -3

10 -1

10 1

10 3

10 5

10 7

10 9

10 11

Precio de venta ($/kg)

(Knight, 1989)

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Importancia econmica de la ingeniera de la bioseparacin


Costo de bioseparacin
Producto Etanol Protena unicelular Biomasa de levadura cido ctrico Glutamato monosdico Xantanas Penicilina G Enzimas a granel Protenas teraputicas/DNA Precio relativo aproximado 1 0.8 2 3.2 5 20 60 100 >500 Costo del proceso de separacin (%) 15 20 20 30-40 30-40 50 20-30 40-65 60-80

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Importancia de los procesos de separacin a diferentes niveles de produccin


Alto1 m.o. seleccionado Pureza requerida Bajo 70 - 99 % Eficiencia de recuperacin 90 - 100 % Costo recup./costo de produccin 0.1 0.2 Costo recup./(costo de produccin 0.1 0.2 + costo de desarrollo) ivel de produccin Fuente
1 2 3

Medio 2 m.o. mutados y DNA recomb. Mediana a alta 90 - 99 % 50 90 % 0.3 0.7 0.1 0.5

Bajo 3 m.o. DNA recomb. Alta 99.95 - 100 % 5 50 % 0.5 0.9 0.01 0.2

cido ctrico, 300,000 TON/ao (1987) Insulina, 1 TON/ ao (1987) Interferon, 10-5TON/ao (1987)

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Estrategias para bioseparacin


Estn disponibles un gran nmero de mtodos de bioseparacin La estrategia est basada en como estos mtodos pueden ser mejor utilizados para una separacin dada Se necesita tomar en cuenta lo siguiente: El volumen de la corriente de proceso La abundancia relativa del producto en esta corriente de proceso El uso que se le intenta dar al producto, esto es, requerimientos de pureza El costo del producto Requerimientos de estabilidad

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Las tecnologas de separacin pueden clasificarse de acuerdo a su principio fundamental (Las barras representan el costo relativo de cada proceso)

The bioseparations needs for tomorrow (Keller et al., 2001)

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Proceso de purificacin cromatogrfica de macromolculas


Pureza Refinamiento Pureza final Purificacin intermedia Remocin de: protenas, cidos nuclicos, endotoxinas y virus Captura Purificacin inicial Estabilizacin Clarificacin Concentracin Etapas

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Seleccin y combinacin de tcnicas de purificacin


Resolucin

Velocidad

Capacidad

Recuperacin
Minimice el manejo de la muestra Minimice el nmero de etapas Use diferentes tcnicas en cada etapa Cada tcnica ofrece un balance Entre resolucin, capacidad, Velocidad y recuperacin

Planta Piloto de Fermentaciones Departamento de Biotecnologa Propiedades de las tcnicas de purificacin comnmente usadas
Tcnica Propiedad explotada Capacidad Resolucin Alta Muy baja Muy baja Muy baja Alta Media Media Rendimiento Costo promedio Medio Alto Alto Variable Medio Medio Bajo Bajo Bajo Alto Medio Medio Composicin muestra
-1 >1 mg ml

Composicin producto Volumen pequeo Concentracin alta I alto Volumen pequeo Concentracin alta Concentracin de polmero alta (PEG) I alto pH diferente I bajo pH diferente Presencia de anfolitos I alto pH diferente Condiciones de desnaturalizacin potencial Diluido

Precipitacin por Carga pH

Precipitacin con Hidrofobicidad Alta (NH4)2SO4 Extraccin en dos Mezcla fases acuosas Bioafinidad Cromatografa de Carga intercambio inico Alta Alta Media

-1 >1 mg ml

Puede contener slidos I Bajo pH correcto I alto

Cromatografa de Hidrofobicidad Media interaccin hidrofbica Cromatoenfoque Carga / pI Baja Media

Alta Alta

Medio Medio Bajo Alto

Alto Medio Alto Medio

I bajo I bajo pH neutral Dependiente sobre el ligando Volumen bajo

Cromatografa de Mezcla afinidad de teido Cromatografa de Bioactividad afinidad de ligando Cromatografa de Tamao permeacin en gel

Media-Baja Muy alta Muy baja Baja

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Estrategia convencional:
Recuperacin, aislamiento, purificacin y refinamiento Basado en arreglos lgicos de mtodos de bioseparacin Las tcnicas de baja resolucin, alta capacidad (por ejemplo, precipitacin, filtracin, centrifugacin, cristalizacin) se usan primero para recuperacin y aislamiento Las tcnicas de alta resolucin (por ejemplo, adsorcin, cromatografa, electroforesis) son entonces usadas para purificacin y aislamiento

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Mtodos de bioseparacin
Baja resolucin alta capacidad
Ruptura celular Precipitacin Centrifugacin Extraccin lquido-lquido Percolacin Filtracin Extraccin con fludos supercrticos Microfiltracin Dilisis Ultracentrifugacin Adsorcin Cromatografa de lecho empacado Separacin por afinidad Electroforesis

Alta resolucin baja capacidad

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Mtodos de bioseparacin (cont...)

Alta resolucin-alta capacidad Ultrafiltracin Cromatografa de lecho fluidizado Cromatografa de membrana Cromatografa de columna de Monolith

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Captura
Definicin: Purificacin inicial de la molcula objetivo de un material crudo Meta: Rpido aislamiento, estabilizacin y concentracin Resolucin

Velocidad

Capacidad

Recuperacin Use una tcnica de alta capacidad para reducir el volumen de la muestra Concntrese en lo robusto y simple de la primera etapa de purificacin

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Purificacin intermedia
Definicin: Nueva remocin de contaminantes Meta: Purificacin y concentracin Resolucin

Velocidad

Capacidad

Recuperacin Use diferentes tcnicas en cada etapa Minimice el nmero de etapas

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Refinamiento
Definicin: Remocin final de contaminantes traza, Ajuste de pH, sales o aditivos para almacenamiento Meta: Producto final de alto nivel de pureza requerido Resolucin

Velocidad

Capacidad

Recuperacin Use diferentes tcnicas en cada etapa

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Planeando las estrategias de purificacin


Eleccin de las tcnicas
Capacidad (C) Resolucin (R) Rendimiento de protena Costo

Ordenando las tcnicas


Precipitacin (alta C y baja R) Intercambio inico (mediana C y mediana R) Cromatografa de afinidad (mediana/baja C y alta R)

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Reduccin del volumen de operacin en cada etapa


Sobrenadante

Precipitado

Centrifugacin Precipitacin

Intercambio inico

Dilisis

Reduccin del volumen

Filtracin en gel
Secado

Enzima en polvo

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Produccin de celulasas

(Ghose y Pathak, 1973)

Cultivo sumergido

Cultivo slido (Tcnica koji)

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Produccin de enzimas
Cultivo microbiano Fermentador para siembra

Cultivo sumergido Extracto crudo

Cultivo slido

Precipitacin Adicin de estabilizantes Enzima en solucin Cromatografa Secado Enzima en polvo

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Ubicacin de las enzimas

Enzimas extracelulares

Centrifugacin o filtracin

Enzimas intracelulares
Rompimiento celular Centrifugacin o filtracin

Precipitacin Secado

Cromatografa Ultrafiltracin Extraccin lquido-lquido

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Estrategia de purificacin

Produccin

Calidad Cantidad

Enzima

Economa

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Preservando la actividad
Minimizar
La desnaturalizacin La inactivacin La protelisis Otras precauciones

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El problema ms comn es la prdida de actividad repentina, debida a:

Falla del ensayo Composicin incorrecta del buffer Impureza de los reactivos Protelisis Precipitacin Presencia de un inhibidor Prdida de un inhibidor o cofactor

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Conceptos de purificacin de protenas


Factor de purificacin
Es la relacin entre la actividad especfica despus de una tcnica de purificacin y la actividad especfica en el extracto crudo

Rendimiento
Es la evaluacin de la cantidad de actividad o protena activa obtenida despus de una tcnica de purificacin. Generalmente es reportada en %. Siendo el 100% la actividad del extracto crudo

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