Caracterização da cinética da reação de hidrólise do pnitrofenil acetato a p-nitrofenol na ausência e presença da enzima α-quimiotripsina, efeito da temperatura e do pH

A. Alves Rodrigues A. I. Alves dos Reis Almeida B. N. Santana Pinto V. Leite

RESUMO: Para estudar a hidrólise do p-nitrofenil acetato (PNPA) a p-nitrofenol (PNP) em presença e ausência
da enzima α-quimotripsina (α-CT), foram variados alguns parâmetros para determinar as melhores condições da hidrólise, como pH em 7,4 e 10,0 e a temperatura em 25°C, 35°C 45°C e 60°C. Para fins comparativos foram feitas análises com soluções de tirosina (Tyr) e triptofano (Trp). Analisou-se a cinética da reação através de duas técnicas; a espectrometria de absorção UV/Vis e fluorescência. Com os resultados obtidos por essas técnicas, foi estimada a energia de ativação para o pH 7,4 e 10, a ordem da reação, a velocidade máxima (Vmáx) para a reação catalisada e a temperatura de desnaturação da α-CT. As temperaturas de desnaturação encontradas foram T = 48,1±0,428 °C para pH 7,4 e T = 48°C para pH 10. Para pH 7,4 sem enzima Ea = 62 kJ/M , com enzima Ea = 22 kJ/M; para o pH 10,0 sem enzima Ea = 8,6 kJ/M, com enzima Ea = 28 kJ/M. A reação é de primeira ordem.

PALAVRAS – CHAVE: α-quimiotripsina, PNPA, PNP, Cinética, pH e Temperatura

I. INTRODUÇÃO O objetivo da pesquisa é realizar um estudo a respeito da hidrólise do PNPA a PNP considerando o efeito da temperatura e do pH. A fim de analisar a eficiência da α-CT como catalizador foi feita a reação na presença e ausência dessa enzima. A hidrólise do PNPA para PNP ocorre quando uma molécula de água ataca o carbono da carbonila do PNPA, gerando por fim uma molécula de álcool e um ácido carboxílico [Figura 1] [1].

Figura 1 Reação de hidrólise de um éster a acido carboxílico Essa reação é influenciada pelo pH do meio e pela temperatura. Quando o pH ≥ 7 temos mais íons hidróxidos disponíveis no meio, de forma que a reação é deslocada no sentido dos produtos, logo a velocidade da reação aumenta. Com aumento da temperatura do sistema as moléculas adquirem mais energia cinética, o que aumenta o choque entre elas, consequentemente há maior formação de produtos e aumento da velocidade de reação. A α-CT é uma proteína encontrada no intestino bovino, é composta por 245 aminoácidos [2] e massa molar de 24800 g/mol [3]. Seu pH de funcionamento ótimo é 8. Essa proteína é capaz de clivar ligações peptídicas entre aminoácidos, onde pelo menos um deles tenha cadeia lateral aromática. A α-CT também pode ser empregada para catalisar reações de hidrólise de p-nitrofenil ésteres [3]. Por ser uma proteína a α-CT tem uma estrutura tridimensional que é mantida por interações fracas do tipo ligações de hidrogênio, pontes dissulfeto, interações hidrofóbicas, forças de van der Waals e interações eletrostáticas (pares iônicos), as quais podem ser rompidas por agentes desnaturamtes, como o pH, temperatura e estresse mecânico. Com o aumento da temperatura a velocidade de vibração molecular aumenta e as interações fracas são rompidas. Alterações no pH modificam o estado iônico das cadeias laterais dos aminoácidos o que interfere nas ligações de hidrogênio e nas interações eletrostáticas [4]. Foram empregadas técnicas de espectrometria de absorção UV/Vis e fluorescência em nossas análises. O PNPA e PNP absorvem em diferentes comprimentos de onda na técnica de espectrometria de absorção UV/Vis, o que possibilita analisar o andamento da hidrólise com a variação da absorvância em um determinado comprimento de onda. A α-CT possui três aminoácidos que são sensíveis a técnica de fluorescência; a tirosina, o triptofano e a fenilalanina, pois estes possuem grupos aromáticos. Assim podemos analisar a desnaturação da α -CT consoante à temperatura empregada. II. MATERIAIS E METODOS II.1 Aparelhagem Nesse experimento foram utilizados: pipetas volumétricas, pipetador automático, béqueres, balões volumétricos, balança analítica, cuvette de quartzo, banho termostático, termômetros, tubos de ensaio, eppendorfs, banho de gelo, espectrofotômetro de absorção UV/Vis, fluorímetro, erlenmeyer.

1

II.2 REAGENTES Nesse experimento foram utilizados: tampão fosfato 10mM a pH = 7,4 com 0,15M NaCl, tampão fosfato 10mM a pH = 10 com 0,15M NaCl, tampão etanol 95:5 (% v/v) pH = 7,4, tampão etanol 95:5 (% v/v) pH=10, p-nitrofenol 1mM em água:etanol 95:5, p-nitrofenil acetato 10mM em etanol, solução de tirosina, solução de triptofano e solução de α-CT.

II.3 PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL A partir da solução de PNP inicial, preparou-se cinco soluções de 5 mL cada, utilizando como solvente o tampão etanol a pH 7,4, com as seguintes concentrações: 1×10-5M, 2.5×10-5M, 5×10-5M, 7.5×10-5M e 1×10-4M. Foram também preparadas as mesmas soluções, porém o solvente era o tampão etanol a pH 10. Utilizando um espectrofotômetro de absorção UV/Vis, foi feita uma varredura de 250nm a 500nm da solução mais concentrada para cada um dos pHs, foi observado para ambos que a maior absorvância ocorria quando λ = 401nm. Esse valor de λ foi fixado e então foi medido a absorvância das cinco soluções em pH 7,4 e para as cinco soluções em pH 10, dessa forma foram obtidas curvas de calibração do PNP. Para analisar a hidrólise do PNPA a PNPA sem enzima, utilizou-se a solução de PNPA inicial para preparar 2mL de soluções de PNPA em tampão etanol pH 7,4 e tampão etanol pH 10 com as seguintes concentrações: 1,2×103M, 0,6×10-3M. As soluções e o tampão foram mantidas no banho de gelo, a fim de evitar que a hidrólise começasse a ocorrer. Essas soluções foram diluídas vinte vezes em tampão arrefecido e foi retirado 1 mL dessas e colocado em um eppendorf no banho de gelo. Os erlenmeyers contendo o restante das soluções foram colocados em banhos térmicos com diferentes temperaturas (25°C, 35°C e 45°C). A tempos predeterminados retirou-se 1 mL de cada solução e colocou-se em eppendorfs numerados no gelo. Esses foram submetidos a análise do espectrofotômetro de absorção UV/Vis para determinar suas absorvâncias. Além disso, preparou-se 5mL de soluções de α-quimiotripsina, tirosina e triptofano com concentração de 10 µM cada, a solução de α-quimiotripsina foi guardada no gelo. O procedimento foi feito em duas temperaturas diferentes, para isso, tanto as soluções de aminoácidos como a solução de enzima foram dividas em duas frações iguais, sendo uma delas colocada num banho a 25°C e a outra parcela a 60°C. Em seguida foram feitas os espectros de absorção para determinar o λmáx de todas as soluções, como a absorvância foi superior a 0,1 para as soluções de α-quimiotripsina, essas foram diluídas. Todas as soluções foram utilizadas para fazer os espectros de fluorescência, fixando-se o λmáx encontrado. Avaliou-se também a estabilidade da enzima através de uma rampa de temperatura. Procedeu-se de modo que as mesmas soluções de aminoácidos e enzima utilizadas anteriormente foram submetidas ao Fluorímetro. Com base no λmáx encontrado na fluorescência, fixou-se o par λex/ λem no fluorímetro, variou-se a temperatura de 25°C a 60°C com a velocidade de 1°C/min e em seguida foi feito o arrefecimento até 25°C com a mesma velocidade. Por fim analisou-se o efeito da α-quimiotripsina na hidrólise do PNPA a PNP. A partir da solução inicial de PNPA preparou-se soluções em etanol com cinco concentrações: 2.5x10-4 M, 6x10-4 M, 1,2x10-3 M, 2,5x10-3 M, 5x10-3 M. A seguir foi preparado 10mL de uma solução de α-quimiotripsina a 200 µM em tampão, todas as soluções foram colocadas em banho de gelo. Uma amostra de tampão foi levada ao banho termostático para cada temperatura utilizada no experimento; 25°C, 35°C e 45°C. Em cada cuvette foi colocado 2,74mL de tampão, 100 µL de α-quimiotripsina 200 µM e após agitar por inversão se adicionou 150 µL da solução de p-nitrofenil acetato em etanol, colocou-se primeiro a solução de PNPA mais diluída e posteriormente repetiu-se para as outras soluções, incluindo a solução inicial de PNPA com concentração 1x10-2 M. II.4 MÉTODOS Para as análises foi levado em conta a Lei de Beer- Lambert

A= ɛlc
Onde A = absorvância, ε = coeficiente de absortividade molar (L. mol-1. cm-1), c = concentração (mol.L-1) e l = caminho óptico = 1 cm Foi empregada a ferramenta Solver do Microsoft Excel 2010 para criar linhas de ajuste para as seguintes equações: Equação cinética para reações de primeira ordem

2

[PNP]= (1- exp(-kt)) x [PNPA]0
Equação cinética para reações de segunda ordem

[
Equação de Michaelis-Meten:

]=[

A]

[ [

A] A]

=

[ ] [ ] [ ] [ ] [ ]

=
Equação de Arrhenius:

l
III. RESULTADOS

=l A

Ao fazer a curva de calibração do PNP foi possível obter o valor da absortividade molar que é dada pela inclinação da reta. Todos os resultados obtidos estão expostos na tabela abaixo.

Amostra a pH 7,4 1 2 3 4 ̅ médio

Absortividade molar (ε) 12565 16322 15196 16322 15759±1770 5 6 7 ---

Amostra a pH 10

Absortividade molar (ε) 19216 18107 18036 --18107±662

̅ médio

Tabela I: Absortividades molares a pH 7,4 e pH 10 O Gráfico I apresenta a curva de calibração feita para amostra 3, o valor de é obtido pelo coeficiente angular da reta. As outras amostras foram submetidas ao mesmo tratamento.

Curva de calibração PNP
amostra 3
1 Absorvância 0,8 0,6 0,4 0,2 0,391 0,175 2,00E-05 4,00E-05 6,00E-05 0,781 y = 15196x + 0,0184 R² = 9,99E-01 Absorvância Linear (Absorvância)

0 0,00E+00

Concentração mol/L

Gráfico I: Curva de Calibração do PNP para a amostra 3

3

A partir da Lei de Beer-Lambert obtiveram-se as concentrações de PNP formado ao logo do tempo de hidrólise e criou-se um gráfico. Para descobrir a ordem da reação utilizou-se um modelo de equação de primeira ordem, a ferramenta Solver do Excel ajustou a equação ao gráfico ao variar o valor da constante de velocidade (k). Através desse ajuste obteve-se um valor para a constante de velocidade de primeira ordem e também a soma dos quadrados das distâncias entre os pontos experimentais e os de ajuste. No Gráfico II e no Gráfico III as concentrações experimentais foram encontradas considerando ε = 15196±1770 L.mol-1.cm-1 na equação de Beer-Lambert.

Velocidade da hidrólise do PNPA
4,00E-05 3,50E-05 3,00E-05 [PNP] (M) 2,50E-05 2,00E-05 1,50E-05 1,00E-05 5,00E-06 0,00E+00 0,00 3.000,00 6.000,00 9.000,00 12.000,00 Tempo (s)

Experimental Ajuste de 1ª ordem

Gráfico II: Velocidade de hidrólise do PNP para amostra 3 e ajuste de 1ª ordem

Amostra 1 2 3 4 5 6 7

pH 7,4 7,4 7,4 7,4 10 10 10

K1 1,62E-05 5,08E-05 8,67E-05 7,60E-05 1,81E-02 1,88E-02 1,45E-02

Tabela II: Constantes de velocidade para ajuste de 1ª ordem Utilizando novamente o Solver fez-se também o ajuste para uma reação de 2ª ordem, que pode ser visto no gráfico abaixo.

4

Velocidade de hidrólise de PNPA
4,00E-05 [PNP] (M) 3,00E-05 2,00E-05 1,00E-05 0,00E+00 0 5000 10000 15000 Tempo (s) Ajuste de 2ª ordem Experimental

Gráfico III: Velocidade de hidrólise do PNPA para a amostra 3 e ajuste de 2ª ordem Como a soma dos quadrados das distâncias entre os pontos experimentais e de ajuste para a reação de 1ª ordem é menor do que para a de 2ª ordem, conclui-se que a reação de hidrólise de PNPA a PNP é uma reação de 1ª ordem. Obteve-se os espectros de fluorescência para a tirosina, o triptofano e a α-quimiotripsina as temperaturas de 25°C e 60°C para os valores de pH 7,4 e 10. Para uma melhor comparação dos resultados juntou-se os espectros a pH 7,4 no Gráfico IV. Para pH 10 os resultados obtidos foram semelhantes aos do pH 7,4.

Espectros de Fluorescência a 25°C e 60°C pH = 7,4
200 Intensidade (a.u.) 150 100 50 0 250 290 330 370 410 450 490 Comprimento de onda (nm) a-CT - 2uM - 25°C Trp - 10uM - 25°C Trp - 10uM - 60°C a-CT - 1,4uM - 60°C Tyr - 10uM - 25°C Tyr - 10uM- 60°C

Gráfico IV: Espectros de Fluorescência da enzima e dos aminoácidos a 25°C e 60°C A tabela III expressa os valores de λmáx encontrados através da fluorescência.

Soluções λmáx a 25°C λmáx a 60°C

α-CT 337

Triptofano Tirosina 357 304

355

357

304

Tabela III: Resultados obtidos a partir dos espectros de fluorescência Com base nos λmáx obtidos, foram feitas rampas de temperaturas usando fluorescência para as diferentes soluções.

5

Rampa de Temperatura α-CT 2uM e Trp 10uM pH 7,4
160 140 120 100 80 60 40 20 0 20 30 40 Temperatura 50 60 Intensidade (.au.)

Trp (25°C - 60°C) Trp (60°C - 25°C) a-CT (25° - 60°C) a-CT (60°C - 25°C)

Gráfico V: Rampa de Temperatura da α-CT e do Trp de 25 a 60°C e de 60 a 25°C Com base nos pontos obtidos no gráfico acima para a α-CT, foi possível estimar a temperatura de desnaturação e a fração desnaturada utilizando a função distribuição normal como forma de ajuste. Este resultado pode ser visualizado no Gráfico VI.

Temperatura de desnaturação α-CT 2uM
e fração desnaturada pH 7,4
70 60 Intensidade (a.u.) 50 40 30 20 10 0 0 10 20 30 40 50 60 70 Temperatura (ºC) 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 Experimental Ajuste Fração desnaturada

Gráfico VI: Temperatura de desnaturação e fração desnaturada para a amostra 8

6

Temperatura de desnaturação α-CT 1uM
e fração desnaturada pH 7,4
50 Intensidade (a.u.) 40 30 20 10 0 0 10 20 30 40 50 60 70 Temperatura (°C) 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 Ajuste Experimental Fração desnaturada

Gráfico VII: Temperatura de desnaturação e fração desnaturada para a amostra 9

Temperatura de desnaturação α-CT 1,3uM
e fração desnaturada pH 10
80 70 Intensidade (a.u.) 60 50 40 30 20 10 0 0 10 20 30 40 50 60 70 Temperatura (°C) 0,2 0 0,8 0,6 0,4 Ajuste Experimental Fração desnaturada 1,2 1

Gráfico VIII: Temperatura de desnaturação e fração desnaturada para a amostra 10

Amostras pH [α-CT] Molar Temperatura de desnaturação (°C) % da forma desnaturada a temperatura de desnaturação (°C)

8 7,4 2,0x10-6 47,76 48,38

9 7,4 1,0x10-6 50,45 52,72

10 10 1,3x10-6 48,00 50,88

7

% desnaturada a 25°C % desnaturada a 35°C % desnaturada a 45°C

0,00 0,12 22,58

0,00 0,00 7,41

0,00 0,05 22,49

Tabela IV: Dados obtidos através das rampas de temperatura Foi feito o estudo da velocidade da hidrólise do PNPA na presença da enzima. Preparou-se soluções com seis concentrações diferentes de PNPA para cada pH a temperaturas predeterminadas e então foi adicionada a enzima. A reação foi acompanhada através de espectrometria de absorção UV/Vis. Com os resultados obtidos, foram construídos gráficos de [PNPA] por tempo para as diferentes soluções, foram considerados os primeiros pontos como pode ser visto abaixo.

Velocidade inicial hidrólise PNPA 1,25E05 M
pH 7,4 35°C com enzima
8,00E-06 [PNPA](M) 6,00E-06 4,00E-06 2,00E-06 0,00E+00 0 20 Tempo (s) 40 60 y = -5,89E-08x + 6,98E-06 R² = 9,98E-01

Experimental Linear (Experimental)

Gráfico IX: Velocidade inicial para a hidrólise de PNPA com enzima a temperatura 35°C Todos os gráficos obtidos apresentaram o mesmo comportamento, mas com velocidades iniciais diferentes, como se pode perceber na Tabela V.

Amostra 1 pH7,4 25°C Amostra 2 H 7,4 35°C Amostra 3 pH 7,4 45°C Amostra 4 pH 7,4 45°C Amostra 5 pH 10 25°C Amostra 6 pH 10 35°C Amostra 7 pH 10 45°C [PNPA] Velocidade (M/s) Velocidade (M/s) Velocidade (M/s) Velocidade (M/s) Velocidade (M/s) Velocidade (M/s) Velocidade (M/s) 1,25E-05 5,71E-08 4,14E-08 5,78E-08 7,86E-08 8,53E-08 8,84E-08 1,03E-07 3,00E-05 7,00E-08 5,43E-08 7,97E-08 1,08E-07 7,23E-08 1,50E-07 1,52E-07 6,00E-05 8,25E-08 6,13E-08 1,29E-07 1,31E-07 1,28E-07 6,44E-08 2,21E-07 1,25E-04 8,24E-08 --2,00E-07 1,99E-07 1,64E-07 1,52E-07 2,84E-07 2,50E-04 9,28E-08 --1,95E-07 1,24E-07 1,81E-07 2,20E-07 3,88E-07 5,00E-04 8,54E-08 6,77E-08 1,98E-07 1,34E-07 2,19E-07 2,28E-07 4,05E-07
Tabela V: Velocidades iniciais obtidas a diferentes condições de temperatura e pH para seis concentrações de PNPA. A velocidade inicial corresponde ao valor negativo da inclinação da reta. Utilizando a equação de MichaelisMenten e os gráficos de velocidade inicial em função da [PNPA] foi possível determinar as constantes k2 e KM.

8

pH 7,4 35oC
2,00E-07 Velocidade (mol/s) 1,50E-07 1,00E-07 5,00E-08 0,00E+00 0,00E+00 1,00E-04 2,00E-04 3,00E-04 4,00E-04 5,00E-04 6,00E-04 [PNPA] (M)

k2 e KM

Ajuste Experimental

Gráfico X: Gráfico obtido através da equação de Michaelis–Menten para k2 e KM Os gráficos para as demais amostras são semelhantes ao anterior, porém os valores de k2 e KM são diferentes. Foi também possível obter a velocidade máxima das reações utilizando a equação de Michaelis-Menten novamente.

1,50E+07 1,20E+07 1 / V (s/mol) 9,00E+06 6,00E+06 3,00E+06 0,00E+00 0,00E+00

Vmax pH 7,4 35o C

y = 1,00E+02x + 5,00E+06 R² = 1,00E+00

Experimental Linear (Experimental)

2,00E+04

4,00E+04

6,00E+04 (mol-1)

8,00E+04

1,00E+05

1 / [PNPA]

Gráfico XI: Gráfico obtido através da equação de Michaelis–Menten para Vmáx A Tabela VI mostra todos resultados de k2 , KM e Vmáx

Amostra

Temperatura (°C)

pH

K2

KM

Vmáx

11 12 13 14

25 35 45 45

7,4 7,4 7,4 7,4

1,35E-02 1,03E-02 3,00E-02 2,34E-02

7,49E-06 8,17E-06 2,00E-05 1,08E-05

9,01E-08 6,86E-08 2,00E-07 1,56E-07

9

15 16 17

25 35 45

10 10 10

3,36E-02 3,44E-02 6,85E-02

4,31E-05 3,91E-05 6,07E-05

2,24E-07 2,28E-07 4,46E-07

Tabela VI: Valores de k2, KM e Vmáx para diferentes valores de pH e temperatura Utilizando os valores de k1 para a reação sem enzima e k2 para a reação com enzima, foi possível descobrir as energias de ativação para pH 7,4 e pH 10. Para tal utilizamos a equação de Arrhenius.

Energia de ativação a pH 7,4
3,12E-03 3,18E-03 3,24E-03 3,30E-03 3,36E-03 3,42E-03 0,00E+00 -1,00E+00 Ln K2 -2,00E+00 -3,00E+00 -4,00E+00 -5,00E+00 1 / Temperatura (K-1) y = -2,65E+03x + 4,73E+00 R² = 4,70E-01 Experimental Linear (Experimental)

Gráfico XII: Energia de ativação Descobriu-se que para a reação sem enzima Ea = 61527,09 kJ/M para pH 7,4 e Ea = 8647,05 kJ/M para pH 10. Para a reação com enzima Ea = 22033,35 kJ/M para pH 7,4 e Ea = 27853,48 kJ/M para pH 10.

IV. DISCUSSÃO A absortividade molar das soluções em pH 7,4 e pH 10 foram diferentes. Isso deve-se ao fato que a valores de pH elevado o grupo hidroxila do PNP pode liberar um próton e ionizar o PNP, dando-lhe uma carga negativa que aumenta a absortividade. Para a reação sem enzima os valores de k1 em pH 10 são cerca de 1000 vezes maiores do que para pH 7,4. Tal fato ocorre devido a maior quantidade de OH- a pH 10, que chega a ser 800 vezes maior do que em pH 7,4. A reação de hidrólise do PNPA a PNP é dependente do pH, logo como o pH é maior a velocidade da reação aumenta. De acordo com o Gráfico IV, quanto maior a temperatura menor é a intensidade da fluorescência independentemente do pH. Isso se deve ao fato de que a temperaturas mais elevadas as moléculas podem perder energia de forma não radiativa. Além disso, fica claro que a temperatura de 60°C o λmáx da α-CT se aproxima ao do triptofano. A α-CT possui em sua cadeia polipeptídica resíduos de triptofano, que após a desnaturação são expostos e alteram o λmáx, uma vez que é o principal responsável pela fluorescência dentre os aminoácidos aromáticos que compõem a enzima. Assim a alteração do λmáx é um indicativo da desnaturação da proteína. Analisando o Gráfico V, observou-se que independentemente do pH a α-CT é desnaturada com o aumento da temperatura e não há renaturação ao retornar a temperatura inicial. Um indicativo desse fato é que a rampa de arrefecimento da α-CT se assemelha a rampa do triptofano. Pelos Gráficos VI, VII e VIII foi possível obter as temperaturas e frações de desnaturação da enzima, não há influência significativa do pH na temperatura de desnaturação. Segundo a literatura [5], era esperado que com o aumento do pH a temperatura de desnaturação fosse menor, devido a ionização da cadeia lateral da tirosina que desestabiliza a estrutura da enzima, porém esse fato não foi observado no experimento. O que pode ser justificado pelo fato da enzima ter um pH ótimo de funcionamento básico e que a ionização da cadeia lateral da tirosina é mais significativa para valores de pH ≥ 10,1 que corresponde ao pKa da tirosina. Para as reações com enzima, foi verificado que a Vmáx aumenta ao elevar o pH. Entretanto, em pH 10 a velocidade global da reação é maior quando não há enzima. Isso se reflete também nas energias de ativação. A pH 10 há grande quantidade de OH- no meio, de forma que a enzima acaba protegendo o PNPA do ataque da

10

hidroxila, pois a velocidade com que a enzima atua no PNPA é muito menor do que a velocidade com que ocorre o ataque da hidroxila.

V. CONCLUSÃO Percebeu-se que a reação sem enzima é de 1ª ordem. Concluiu-se que o pH não influencia significativamente na temperatura de desnaturação da enzima, e que até a temperatura de 45oC ainda há grande quantidade de enzima na forma nativa, o que possibilita que a reação possa ser catalisada até esse valor de temperatura. A α-CT é um catalizador eficiente para hidrólise de PNPA em pH 7,4, entretanto a utilização dessa enzima em pH 10 não é interessante.

VI. AGRADECIMENTOS Agradecemos a Deus pela paciência e graça para realizar este trabalho. Agradecemos aos integrantes dos grupos que disponibilizaram seus dados para nossa pesquisa. Agradecemos a CAPES pela oportunidade de intercâmbio. Agradecemos a Universidade de Coimbra e a professora Maria João pelo auxílio na pesquisa.

VII. BIBLIOGRAFIA
1. Hydrolysis of a Carboxylic Acid Ester: Neutral and Base Enhanced Reaction of p-Nitrophenyl Acetate. Acedido em 02 de Outubro de 2013 em http://web.viu.ca/krogh/chem331/Hydrolysis%20Lab%202006.pdf 2. Meloun B., Kluh I., Kostka V., Morávek L., Prusík Z., Vanĕcek J., Keil B, Sorm F. (1996). Covalent structure of bovine chymotrypsinogen A.. Acedido em 01 de Novembro de 2013 em http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/5972866 3. Anderson J., Byrne T., Woelfel K. J., Meany J. E., Spyridis G. T., Pocker Y. (1994). The Hydrolysis of pNitrophenyl Acetate: A Versatile Reaction To Study Enzyme Kinetics. Acedido em 03 de Outubro de 2013 em http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/ed071p715?journalCode=jceda8 4. 5. Voet, D., Voet, J. (2011). Biochemistry. Hoboken: John Wiley & Sons. Apura J., Mendes M., Uva M., (2012). Estudo da estabilidade da α-quimotripsina numa gama alcalina de pH por absorção UV. Acedido em 26 de Outubro de 2013 em http://goo.gl/nikGcS

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