Aplicacin de la Microbiologa Predictiva para la determinacin de la vida til de los alimentos

Enrique Alfonso Cabeza Herrera

Departamento de Microbiologa, Facultad de Ciencias Bsicas, Universidad de Pamplona. Campus Universitario, Km. 1, Va Bucaramanga - Pamplona, Colombia. E-mail: enalcahe@unipamplona.edu.co enalcahe@hotmail.com
Fecha elaboracin: 09/12/2011 - Fecha revisin: 15/06/2013.

1.

Introduccin

La preservacin de los alimentos a travs de los aos ha sido necesaria para nuestra supervivencia. Las tcnicas de preservacin utilizadas en el pasado (salazn, secado, ahumado, calentamiento entendido como coccin, conservacin a bajas temperaturas y la fermentacin) siguen siendo empleadas en conjunto con otros mtodos en la actualidad, apoyados en el conocimiento que diferentes disciplinas cientficas han aportado al desarrollo en este campo (Gram et al., 2002). Actualmente y debido a la cada vez creciente exigencia de los consumidores por alimentos lo mas naturalmente posible, ha hecho que la industria agroalimentaria busque alternativas de tratamiento de alimentos conservando la seguridad y la calidad de los mismos. Tradicionalmente se han empleado mtodos fsicos de proceso como las tecnologas trmicas (pasteurizacin, esterilizacin, tindalizacin, refrigeracin, congelacin, etc.) y ms recientemente el empleo de atmsferas controladas y/o modificadas; entre los mtodos qumicos destacan la acidificacin, salazn y conservacin en almbar, mientras que la conservacin biolgica se ha encaminado hacia los procesos de fermentacin. Sin embargo, nuevas formas de tratamiento y conservacin de alimentos han ido apareciendo pudiendo distinguir dos tipos fundamentales: Nuevas tecnologas trmicas (Calentamiento con radiofrecuencias, procesado con microondas, calentamiento infra-rojo, infusin instantnea y de calor elevado, calentamiento hmico) y Tecnologas no trmicas (Alta presin hidrosttica, Campos elctricos pulsados de alta intensidad, Campos magnticos oscilatorios, pulsos lumnicos intensos, irradiacin, preservacin qumica y bioqumica, etc.) que an continan siendo foco de investigacin. Por otra parte, el objetivo que persiguen todos estos mtodos es el de rendir un producto nutricionalmente bueno, con un alto nivel de inocuidad y que su vida til sea prolongada. 2. Qu es la Vida til de un alimento?

La vida til o caducidad de un alimento puede definirse como el periodo de tiempo, despus de la elaboracin y/o envasado y bajo determinadas condiciones de almacenamiento, en el que el alimento sigue siendo seguro y apropiado para su consumo ( Dominic, 2004; Labuza, 1994), es decir, que durante ese tiempo debe conservar tanto sus caractersticas fsico-qumicas, microbiolgicas y sensoriales, as como sus caractersticas nutricionales y funcionales. En palabras de Dominic (2004), todos los alimentos poseen una caducidad microbiolgica, una caducidad qumica y/o fsico-qumica y una caducidad sensorial; la cual depende de las condiciones de formulacin, procesamiento, empacado, almacenamiento y manipulacin. Segn el Codex Alimentarius (1998) los alimentos perecederos son aquellos de tipo o condicin tales que pueden deteriorarse, entendindose aquellos como los alimentos compuestos total o parcialmente de leche, productos lcteos, huevos, carne, aves de corral, pescado o mariscos, o de ingredientes que permitan el crecimiento progresivo de

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microorganismos que puedan ocasionar envenenamiento u otras enfermedades transmitidas por alimentos; as aquellos alimentos que son considerados como perecederos generalmente poseen una vida til de 7 das, y esta vida til est limitada en la mayora de los casos por el decaimiento bioqumico o microbiolgico (Labuza, 1994), mientras que los alimentos semiperecederos (conservas en general) la vida til est limitada principalmente al deterioro fisicoqumico y/o sensorial antes que el microbiolgico (McMeekin y Ross, 2002; McDonald y Sun, 1999). El hecho que los alimentos son sistemas diversos, complejos y activos en que las reacciones microbiolgicas, enzimticas y fsico-qumicas estn interactuando de forma simultnea, hace una tarea ardua el estudio de su vida til. La preservacin de los alimentos es dependiente de la combinacin de mltiples factores y un sin fin de reacciones bio-fsico-qumicas, y si entendemos estas reacciones y sus mecanismos respectivos sera bastante exitosa la limitacin de aquellos factores que tienen mayor influencia o responsables en la alteracin o prdidas de las caractersticas deseables en los alimentos, y a veces encauzar otras reacciones hacia cambios beneficiosos. Esencialmente, la vida til de un alimento depende de cuatro factores principales a saber: la formulacin, procesado, empaque y condiciones del almacenamiento. Sin embargo, si las condiciones posteriores de manipulacin no son las correctas, entonces la vida til de los mismos puede limitarse a un periodo menor que del cual haya sido establecido. Todos los cuatro factores son crticos pero su importancia relativa depende de cuan perecedero es el alimento. Generalmente, un alimento perecedero (almacenado en condiciones apropiadas) tiene una vida til media de 14 das siendo limitado en la mayora de los casos por el decaimiento bioqumico (enzimtico/senescencia) o el decaimiento microbiano. Con las nuevas tecnologas de empaque en atmsfera modificada/controlada (CAP/MAP) en condiciones aspticas, tales alimentos pueden durar hasta 90 das (3 meses). Un alimento semi-perecedero tiene una vida til media de alrededor de 6 meses, tales como algunos quesos, mientras que los alimentos no perecederos tienen una vida til superior a 6 meses y con una duracin de hasta 3 aos cuando son mantenidas bajo condiciones apropiadas de almacenamiento (p.ej., la mayora de las conservas). 3. Mtodos para prolongar la vida til

Desde antao han sido diferentes los mtodos que se han empleado para prolongar la vida til de los alimentos desde aquellos tales como la conservacin en fro y/o la fermentacin y que, con el paso del tiempo se han ido perfeccionando al tiempo que han emergido otros. Se sabe que en la antigedad ya los romanos empleaban las bajas temperaturas Congelacin para prolongar la vida til de sus alimentos mediante la conservacin en vasijas que eran o bien recubiertas en hielo o directamente vertido en el interior de las mismas con el alimento incluido. Ya hacia finales de 1850, Louis Pasteur demuestra que la contaminacin de los vinos era asociada al desarrollo de cepas no aptas para su produccin y mediante el tratamiento trmico del zumo de uvas a 62C por 30 minutos, para luego permitir que se llevara a cabo una fermentacin natural y obteniendo as un vino con mejor calidad, luego si se inoculaba en condiciones aspticas el mosto (zumo de uvas) tratado trmicamente con un estrter proveniente de aquel vino bueno, se obtendra un nuevo vino de las mismas calidades. Bueno, esto en la teora porque hoy da sabemos que la calidad del vino est ligado no solo a la cepa de levadura, sino al tipo de uva y algunas de sus propiedades como el grado o concentracin de azcar, actividad de agua, etc.

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As las cosas, desde el punto de vista del procesado de los alimentos, podemos encontrar diversas formas de clasificacin de procesos tecnologas Mtodos que permiten obtener un producto final con unas cualidades nutricionales y de seguridad. Desde el punto de vista del empleo de calor o no, se han distinguido tradicionalmente dos tipos de procesamiento de alimentos: aquellos que involucran tecnologas trmicas y los que involucran tecnologas no trmicas (mtodos ms modernos para el procesamiento de alimentos o tecnologas emergentes), acompaados en todos los casos del empacado que buscan favorecer la calidad de los alimentos preservando su vida til. Segn la naturaleza del mtodo de conservacin, se pueden distinguir a). La conservacin biolgica; b). La conservacin qumica, y; c) la conservacin fsica. De acuerdo con la modernidad de la tecnologa podemos distinguir entre tecnologas tradicionales y tecnologas emergentes. Naturaleza del mtodo Biolgica Fermentacin: cido lctica (homohetero); alcohlica, mixta cidoFermentacin tradicional con cepas que han sido modificadas Tecnologa tradicional Tecnologa emergente

alcohlica. Qumica Agentes Inorgnicos (sales, azcar, etc.). Agentes orgnicos: cidos,

genticamente (OMG). Uso de bacteriocinas: Sustancias de origen biolgico conservacin

bioqumica.

ahumado, gases, antibiticos. Films o recubrimientos qumicos. Fsica Temperaturas altas. Temperaturas bajas. Concentracin. Evaporacin Deshidratacin. Tecnologas trmicas: Calentamiento Ohmico, Microondas, Coccin al vaco. Tecnologas presiones magnticos no trmicas: Altas Campos Campos

hidrostticas, oscilantes,

elctricos pulstiles, pulsos lumnicos intensos, irradiacin, Ultrasonidos. 4. Mtodos para la estimacin de la vida til

La estimacin de la vida til de un alimento es un requisito fundamental, y esta debe figurar, salvo ciertas excepciones, en la etiqueta de los mismos. Es variada la metodologa empleada para estimar la vida til, algunos de estos mtodos pueden parecer un tanto ortodoxos pero de acuerdo con Labuza (1994) suelen ser vlidos. Algunos de estos mtodos sern expuestos de forma breve, mientras nos centraremos en los mtodos de determinacin de la vida til a tiempo real y determinacin rpida de la caducidad Test de vida til acelerado (Acelerated Shelf Life Determinaton, ASLD) por ser los ms empleados (Dominic, 2004; Labuza, 1994). 4.1. Empleo de valores de referencia La vida til de un nuevo producto puede estimarse basndose en los datos publicados en diferentes bases de datos tales como las del ejrcito de los EE.UU. o por Labuza en: Shelf-life

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dating of foods (1982), pero el problema en este caso es que estos datos son muy limitados, por lo que no tienen informacin adicional salvo para productos similares, adems, la mayora de estos datos tienen derecho de autor y no pueden ser usados para la prediccin de la vida til, salvo dentro de la misma empresa para lneas similares sin necesidad de realizar pruebas experimentales. 4.2. Estimacin mediante asignacin de Turn Over Una segunda aproximacin para estimar la vida til es el uso de tiempos de distribucin conocidos para productos similares, mediante el anlisis de la informacin de las etiquetas de los mismos. En este caso tampoco se requiere de comprobacin previa si se est seguro de tomar este riesgo. Si se est empezando a desarrollar un nuevo producto, puede necesitarse en este caso datos para determinar el tiempo de almacenamiento en condiciones caseras reales para conseguir una buena estimacin de la vida til. Si no existe ningn producto similar en el mercado, este mtodo no puede usarse. 4.3. Pruebas de abuso de distribuciones Este mtodo de pruebas de abuso de distribuciones puede emplearse en el caso de estar seguros de la vida til de un producto o si este ya se encuentra en el mercado. En este caso, el producto es recogido del punto de venta y se mantiene en el laboratorio simulando las condiciones caseras. Este mtodo ha sido usado por varios investigadores, sobre todo en aquellos casos cuando algunos estados o pases cambian la legislacin, pero a pesar de esto, no ha sido ampliamente reportado encontrndose segn Labuza (1994), un solo estudio en la literatura reportado por Gacula y Kubala, en 1975. Este mtodo reproduce la vida til basado en la distribucin y condiciones de almacenamiento caseras. 4.4. Empleo de quejas o reclamos de los compradores Otro acercamiento para evaluar la vida til que no requiere ningn estudio inicial es usar las quejas o reclamos de los consumidores como una base para determinar cul es el problema que est ocurriendo. En los EE.UU. la mayora de las empresas manejan un nmero telefnico gratuito de atencin al consumidor en los empaques, y la informacin recogida a travs de este, se carga a una base de datos sistematizada que incluye el tipo de queja, localizacin, etc. A partir de estos datos, el departamento de I&D puede obtener una idea sobre el problema que est ocurriendo y el modo en que se presenta. Normalmente se acepta que por cada queja o reclamo reportado, entre 5060 casos no son reportados. Estos clientes representan una proyeccin de tres aos de prdida de volumen de venta. A partir de estos datos, pueden calcularse los costos en ingredientes, proceso, empacado o si los cambios de la distribucin seran econmicamente factibles para mejorar la vida til. Este acercamiento global puede usarse en conjunto con cualquiera de los tres mtodos descritos anteriormente. 4.5. Pruebas de vida til a tiempo real Este tipo de pruebas evala el efecto de la temperatura normal de conservacin sobre las propiedades microbiolgicas, fsico-qumicas y sensoriales de un alimento durante un periodo de tiempo, entendindose como temperatura normal aquella que ser empleada durante la conservacin comercial del producto, p.ej., en la evaluacin de la vida til de un yogurt se empleara una temperatura de 4C, la cual es la temperatura a la que se conservar el producto comercialmente. Para la determinacin de la vida til de un alimento debern considerarse las variables microbiolgicas, fsico-qumicas y sensoriales que mayor influencia tendrn sobre la calidad del producto.

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En torno a la evaluacin microbiolgica se ha planteado toda una discusin sobre qu grupo de microorganismos deberan considerarse para la determinacin de la vida til, por un lado encontramos el empleo de los recuentos viables totales (aerobios o anaerobios mesfilos, psicrtrofos o psicrfilos) ya que este grupo se considera en microbiologa de alimentos como un indicador del nivel de contaminacin de un producto, sin embargo surge el planteamiento de la diversidad de especies que podran en un momento puntual integrar este grupo y de cmo podran cambiar de lote a lote, de un periodo de tiempo a otro, o dentro de un mismo proceso. Entonces, es seguro emplear este grupo como indicador de vida til?......... Si se emplea este recuento podramos establecer que el valor mximo permitido oscilara en torno a 10 6 ufc/ g o mL, es decir, que la vida til microbiolgica caducara en cuanto se alcance este nivel de crecimiento en el producto final. Desde mi punto de vista particular resulta ms conveniente establecer la vida til microbiolgica de un alimento cuantificando el crecimiento de microorganismos alterantes, y dentro de este grupo establecer cul de las especies es la que mayor incidencia va a tener sobre la calidad final del producto. Por ejemplo, volvemos al caso del yogurt, en este producto la vida til podra evaluarse empleando el recuento de bacterias cido-lcticas (BAL). De todas formas tampoco resultara lgico emplear el recuento total de viables si sabemos que este producto ha sido preparado empleando un cultivo iniciador o estrter. 4.6. Pruebas de aceleracin de la vida til (ASLT) Las pruebas de aceleracin de la vida til es quiz la metodologa ms empleada hoy da para calcular la vida til de un alimento no perecedero o estable (alimentos esterilizados como por ejemplo los enlatados). En esta tcnica, se pretende estudiar varias combinaciones de producto/empaque acabados bajo diferentes condiciones de abuso de temperatura, examinando el producto peridicamente hasta el fin de la vida til; los resultados obtenidos se usan para proyectar la vida til del producto bajo las verdaderas condiciones de almacenamiento. Algunas empresas manejan base de datos de multiplicacin microbiana obtenidos del trabajo y la experiencia previa, los cuales emplean para obtener la vida til real a partir de los resultados encontrados en estas condiciones de abuso de temperatura. Esta tcnica se basa en la aplicacin de la cintica de la velocidad de Arrhenius, el cual establece que la velocidad de las reacciones qumicas se duplica aproximadamente por cada 10C de aumento de la temperatura. Sin embargo, antes de establecer una sentencia final sobre la validez o exactitud de prediccin para una aplicacin particular, es necesario examinar una serie general de factores que influyen sobre la vida til del producto. Estos incluyen (1) propiedades estructurales / mecnicas de los alimentos, (2) propiedades extrnsecas tales como la temperatura, Humedad relativa, atmsfera gaseosa, etc., (3) caractersticas intrnsecas como el pH, aw, disponibilidad de nutrientes, potencial redox (Eh), presencia de antimicrobianos, etc., (4) la interacciones microbianas y (5) factores relativos al proceso de elaboracin, mantenimiento y manipulacin final. Este mtodo no est exento de problemas. Debe tenerse cautela en la interpretacin de los resultados obtenidos y su extrapolacin a otras condiciones. Por ejemplo cuando se prueba una relacin producto/empaque, este empaque tambin tiene influencia sobre la vida til y por tanto si se modifica el empaque con permeabilidades diferentes al oxgeno, agua, anhdrido carbnico durante el almacenamiento verdadero (almacenamiento comercial), la vida til del producto se tornara desconocida; y los resultados anteriores no pueden ser aplicables. Si las condiciones de ASLT son escogidas de forma apropiada, y se usan los algoritmos adecuados para la extrapolacin, entonces la vida til bajo cualquier distribucin conocida puede ser predecible. Estas predicciones son basadas en los principios fundamentales de prdida de calidad del alimento que se han descrito antes.

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5.

Estimacin de la vida til microbiolgica: uso de herramientas predictivas.

Como ha sido comentado en muchas revisiones, la microbiologa predictiva de alimentos se constituye hoy por hoy en una herramienta valiosa para el sector agroindustrial, ya que permite obtener resultados en menor tiempo minimizando el uso de materiales de laboratorio, mano de obra, y reduciendo por tanto costos econmico. Sin embargo, la microbiologa tradicional an sirve de apoyo a la microbiologa predictiva. El modelamiento predictivo que integra el comportamiento microbiano con otras variables del proceso ha empezado a ganar inters en la industria agroalimentaria para predecir la vida til (Banks, 1994). Sin embargo, la determinacin de la vida til es un tema complejo como es difcil predecir los efectos de las variables de almacenamiento y las condiciones de abuso que un producto puede experimentar (Williams, 1992). La gran variedad y nmero de microorganismos alterantes encontrados en los productos alimenticios significa que los modelos de prediccin de alteracin son menos fciles de desarrollar que los modelos de microorganismos patgenos y su aplicacin es mucho ms limitada (Pin y Baranyi, 1998). Al igual que ocurre con el anlisis de riesgos y el HACCP, la prediccin de la vida til debe considerar todas las etapas en la produccin de un alimento. Deben obtenerse datos exactos acerca de las materias primas utilizadas, la formulacin de productos, montaje de productos, tcnicas de procesamiento, condiciones de higiene, tipo de empacado empleado, almacenamiento y procesos de distribucin y el manejo final del consumidor. Slo cuando todas estas reas estn representadas puede hacerse posible una prediccin fiable de la vida til (McMeekin y Ross, 1996b; Dalgaard, 1995). El realizar un estudio de vida til puede implicar una amplia utilizacin tanto de recursos tecnolgicos como financieros. Sin embargo, el desarrollo de modelos de prediccin podran en un plazo prudencial reducir el uso de estos recursos y mejorar el tiempo de utilizacin (Neumeyer y col., 1997a). Los estudios se han llevado a cabo sobre una gran variedad de alimentos para determinar la vida til (por ejemplo en productos crnicos: Devlieghere et al., 1999; Kant-Muermans et al., 1997; Neumeyer et al., 1997a, b; Vankerschaver et al., 1996). Sin embargo, estos estudios no han utilizado un modelo capaz de incorporar todas las variables que puedan tener un impacto sobre el crecimiento microbiano. Los principales factores que influyen en la estabilidad microbiana en los alimentos son la temperatura, pH y actividad de agua. La temperatura en particular puede variar significativamente a travs de la produccin y distribucin (Geeraerd et al., 1998). La mayora de los estudios han utilizado modelos dependientes de la temperatura, tales como el modelo de la raz cuadrada (Ratwkosky et al., 1983) o el modelo de Arrhenius, y si bien es cierto que con la mayora de los alimentos la temperatura es el principal factor que afecta la vida til, no es la nica variable (Einarsson, 1994; Gill y Jones, 1992a; Gill et al., 1988; Einarsson y Ericksson, 1986). La mayora de los modelos dinmicos propuestos (Baranyi et al., 1993a, 1996b; Van Impe et al., 1995, 1992) es necesario el empleo de ms de una variable fluctuante para predecir con precisin la vida til de los productos alimenticios. Los mtodos prcticos utilizados en la elaboracin de modelos predictivos de vida til necesitan avanzar ms (McDonald y Sun, 1999). Los mtodos estndares de anlisis microbiolgicos aunque son eficaces an son lentos. Las investigaciones futuras deberan tener en cuenta el corto perodo de vida de gran parte de alimentos refrigerados y el hecho de que los resultados son necesarios rpidamente (Gibbs y Williams, 1990). El uso de tcnicas microbiolgicas ms rpidas que las actuales ser necesario en el futuro. Vamos a explicar dos mtodos clsicos para la determinacin de la vida til de alimentos, un primer modelo desarrollado por Monod-Hinshelwood para la estimacin de la caducidad

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microbiolgica y en segundo lugar, el modelo de Arrhenius empleado fundamentalmente en la estimacin de la caducidad fsico-qumica, aunque puede emplearse en la estimacin microbiolgica como veremos en el ejercicio descrito en el numeral 6. De todas formas cabe recordar que los modelos de prediccin microbiolgica son en muchos casos generales y variados y por tanto pueden extrapolarse para la estimacin microbiolgica de la vida til de diversos alimentos. 5.1. El modelo de Monod-Hinshelwood (descrito por McMeekin y Ross, 2002) Esta aproximacin puede ser usada para el clculo de la vida til microbiolgica. En palabras de McMeekin y Ross (2002) l a experiencia ha mostrado que para la mayora de los casos donde estn implicadas asociaciones de microorganismos alterantes, el tiempo en el cual ocurre o se desarrolla la alteracin de los alimentos est directamente relacionada con el tiempo de generacin de aquel microorganismo que juega el papel predominante en dicha asociacin. Esto es, que si conocemos la microbiota alterante predominante en los alimentos perecederos y sabemos cmo cambia su poblacin en el tiempo (si asumimos que la ocurrencia de alteraciones especficas se da despus de la fase de latencia), puede establecerse la vida til del mismo mediante la siguiente relacin (aproximacin de MonodHinshelwood):

log 0 2

Donde ts es el tiempo necesario para que se desarrolle la alteracin bajo las mismas condiciones extrnsecas e intrnsecas medidas; Ns (ufc/g o cm2) es el valor correspondiente a la poblacin de seguridad (valor mximo permisible antes de considerarse alterado el producto); 2 N0 (ufc/g o cm ) es el valor correspondiente a la poblacin inicial presente en el producto; T g es el tiempo de generacin de la poblacin alterante especfica. As una vez Ns y Tg han sido determinados para esas condiciones de almacenamiento, es muy fcil determinar el tiempo de vida til reemplazando en la frmula anterior, y por tanto, puede establecerse el mantenimiento de la calidad de estos productos bajo estas condiciones. Por lo tanto, todo lo que se requiere para estimar la vida til de ese alimento es conocer la poblacin inicial (N0). Si la anterior aproximacin se aplica a diferentes temperaturas, entonces puede evaluarse el efecto de la temperatura sobre el crecimiento bacteriano, transformando los datos de velocidad de crecimiento o tiempo de generacin en una grfica de dependencia de la temperatura (como ha sido usada por Mossel e Ingram, 1955), y obtener una constante que indique como cambia la velocidad de crecimiento con el cambio de la temperatura. En este caso debera considerarse calcular k a diferentes intervalos de temperatura constantes (por ejemplo el modelo de Q10; el cual muestra como vara k cada vez que se incrementa o disminuye en 10C la temperatura de almacenamiento. Un modelo similar haba sido establecido por Svante August Arrhenius (Sueco, 1859-1927) en 1889, cuando descubri que la velocidad de las reacciones qumicas aumenta con la temperatura, en una relacin proporcional a la concentracin de molculas existentes. 5.2. El modelo de Arrhenius (efecto de la temperatura sobre la velocidad de alteracin) Las aproximaciones modernas de la Microbiologa Predictiva de Alimentos han tratado de entender y establecer un vnculo entre el crecimiento de microorganismos y los factores que regulan el crecimiento tales como la temperatura, pH, actividad de agua, potencial redox, etc.

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La gran mayora de los modelos secundarios son modelos de tipo cintico (McDonald y Sun, 1999; Labuza y Fu, 1993), de los cuales el ms comnmente usado ha sido el modelo de Arrhenius. Los modelos cinticos para la determinacin de la vida til en alimentos son generalmente basados en la ocurrencia de fenmenos y estos no han sido desarrollados para un alimento en particular. Sin embargo, los parmetros experimentales y ambientales de un modelo pueden aplicarse para un producto en especial. De estos, la temperatura es normalmente considerada como el factor ms importante en las reacciones de deterioro de los alimentos, especialmente, para la alteracin microbiana donde la velocidad de crecimiento especfico y la fase de latencia son altamente dependientes de la temperatura (Giannuzzi et al., 1998). La ecuacin de Arrhenius fue derivada empricamente basada en consideraciones termodinmicas (Labuza y Riboh, 1982), y describe la velocidad con que una reaccin cambia cuando se emplean diferentes temperaturas conocidas (Ross y McMeekin, 1994). La forma ms simple de esta ecuacin es:

k = A
o

ln = ln

Donde, k es la velocidad de reaccin; A {(ufc/ml, g o cm2)/tiempo} es un factor pre-exponencial parmetro a ser determinado (intercepto de y en una grfica de Lnk vs 1/T) , R es la constante de los gases (8.314 J mol-1 K-1), T es la temperatura absoluta (K), y Ea es denominada como la energa de activacin de la reaccin lmite de velocidad-crecimiento (Ross y McMeekin, 1994). Si en la ecuacin anterior los valores de k son calculados a diferentes temperaturas y si el lnk es graficado contra 1/T, puede obtenerse una lnea recta en la cual la pendiente (m) es igual Ea/R (Dominic, 2004; McDonald y Sun, 1999; Labuza et al., 1992; Labuza y Riboh, 1982). As el modelo de Arrhenius puede catalogarse en la clasificacin de Whiting y Buchanan (1993) como un modelo secundario. Cuando el modelo de Arrhenius es empleado para evaluar el efecto de la temperatura sobre el crecimiento microbiano, entonces k se transforma en la velocidad de crecimiento especfico (Ross y McMeekin, 1994; Giannuzzi et al., 1998), y la ecuacin de Arrhenius puede escribirse como:

Sin embargo, el crecimiento bacteriano es complejo y las extrapolaciones de las grficas pueden no mostrar linealidad, por lo tanto, la ecuacin anterior no puede encajar muy bien por debajo de los datos ptimos o por encima de las temperaturas de crecimiento. Entonces, las grficas obtenidas solo sirven para predecir el crecimiento microbiano en un limitado rango de temperatura (McDonald y Sun, 1999; Labuza y Fu, 1993). As la ecuacin que ha sido utilizada mayoritariamente para describir el efecto de la temperatura sobre el crecimiento microbiano es el modelo de la raz cuadrara propuesto por Ratkowsky et al., en 1982 (Giannuzzi et al., 1998; Neumeyer et al., 1997; Willocx et al., 1993; Adair et al., 1989).

= ( 0 )

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6.

Ejercicio de estimacin de la vida til empleando modelos predictivos y test acelerados de tiempo.

En el proceso de pasteurizacin de la leche a 72C por 15 segundos se busca reducir la carga total microbiana un 99,99%. El producto est pensado para ser mantenido en condiciones de refrigeracin (4C 0,5C). La variable microbiolgica a controlar es el recuento total de viables, cuyo lmite mximo de crecimiento permitido es 4x10 4 ufc/ml. Si la carga inicial es de 10x106 bacterias por ml, al final del proceso se detecta que la poblacin final remanente es de 1000 ufc/ml. Determine la vida til a 4C empleando los datos del test acelerado de tiempo durante 12 horas mostrados a continuacin: 10C 20C 30C Tiempo (min) ufc/ml 0 58 115 173 230 288 346 403 461 518 576 634 691 749 1000 1047 1096 1148 1202 1259 1318 1380 1445 1514 1585 1660 1738 1820 1000 1479 2188 3236 4786 7079 10471 15488 23442 34674 51286 75858 112202 165959 1000 3162 9772 30903 95499 295121 912011 2818383 8128305 21379621 45708819 75857758 100000000 112201845

Para el clculo de la vida til pueden emplearse varios modelos predictivos, pero vamos a comenzar con la aproximacin de Arrhenius. 1. El primer paso una vez obtenida la poblacin en unidades logartmicas (ln ufc ml-1) es calcular la velocidad de crecimiento especfica () para cada temperatura. Esta puede obtenerse de diversas maneras, una es graficando en las ordenadas el ln ufc ml-1 en fase exponencial y en las abscisas el tiempo (min), y a partir de esta grfica obtener la ecuacin de la recta en cuyo caso la pendiente es igual a la velocidad de crecimiento especfica (ufc ml-1min-1). Otra forma es calculando a partir de la siguiente expresin:

0 ( 0 )

Tambin puede emplearse el uso de software especficos como el DMFit, MicroFit, etc.

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10C (283K) (ln ufc/ml*min) 1/T (1/K) 2. 0,000799 0,003534

20C (293K) 0,006838 0,003413

30C (303K) 0,019400 0,003300

Con los resultados de para cada temperatura procedemos a calcular las constantes del modelo de Arrhenius: energa de activacin (Ea) y el Factor pre-exponencial A. Para este caso graficaremos en las ordenadas el ln a cada temperatura y en las abscisas el inverso de cada temperatura absoluta (1/T). Recordemos que cuando se grafica de esta forma, la pendiente de la recta (m) que se obtiene es igual a: Ea/R (y que por tanto Ea = m*R, que en todos los casos ser positiva); y el intercepto en el eje y cuando X=0 es el factor pre-exponencial en logaritmo (LnA). Figura 1. Relacin entre la velocidad de crecimiento vs temperatura mediante la cintica de Arrhenius 0 0,00325 -1 0,0033 0,00335 0,0034 0,00345 0,0035 0,00355

Ln (Ln ufc/ml*min)

-2 -3

-4
-5

-6
-7 -8

y = -13679x + 41,371 R = 0,9688

1/T (1/K)

De la grfica podemos inferir que: Ea = (m*R) R = 8,314472 J mol-1 K-1 Ea = (13679 Ln ufcK/ml*min * 8,314472 J/molK) Ea = 113733,662 Ln ufc*J/ml*min*mol. LnA = 41,371 Ln ufc/ml*min 3. Una vez obtenidos los parmetros procedemos a calcular a 4C (277K) reemplazando en la ecuacin de Arrhenius.

Ln = Ln

Ln ufc J 113733,662 ( ) Lnufc ml min mol Ln = 41,371( ) J ml min 8,314472 (mol K) 277K Ln ufc Ln ufc ) 47,13 ( ) ml min ml min

Ln = 43,27(

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ln = 8,01167

Ln ufc ml min

= 0,0003316

Ln ufc ml min

Por tanto, la velocidad de crecimiento especfico a 4C es de 0,0003316 Ln ufc/ml*min. 4. Procedemos a estimar entonces la vida til a 4C. Si nuestro valor lmite es 4,0x104 ufc/ml (10,5966 Ln ufc/ml). Si tenemos que por cada minuto se incrementa 0,0003316 Ln ufc/ml {recordemos que se obtiene del Ln ufc/ml vs tiempo (min)}, en cuanto tiempo se alcanzarn las 10,5966 Ln ufc/ml que es nuestro valor lmite? Podemos usar una sencilla regla de tres: 1 min X? 0,0003316 ln ufc/ml 10,5966 ln ufc/ml

5.

1 10,5966 / 0,0003316 /

X = 31955,97 minutos, aproximadamente 31956 minutos, o el equivalente a 22 das. Con el empleo de la cintica de Arrhenius, obtendramos un producto con una vida til media de 20 a 22 das si se conserva a temperatura de 4C. Si usamos la aproximacin de Monod-Hinshelwood, debemos conocer el tiempo de generacin a la temperatura problema, en este caso a 4C. 1. El primer paso y para este caso, debemos calcular k para cada temperatura, aunque tenemos varias opciones, emplearemos en este caso la frmula:

=
Donde Tg equivale al tiempo de generacin.

10C (283K) Tg = (0,693/) 0,000799 867,33 min

20C (293K) 0,006838 101,35 min

30C (303K) 0,019400 35,72 min

2.

El segundo paso es graficar el Log 10Tg para cada temperatura experimental en las ordenadas y la Temperatura en las abscisas.

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Figura 2. Relacin entre el tiempo de generacin (expresado en unidades Log 10) vs temperatura de crecimiento. 3,500 3,000

Log10 Tg (min)

2,500 2,000 1,500 1,000 0,500 0,000 0 5 10 15 20 25 30 35 y = -1,27ln(x) + 5,8484 R = 0,9978

Temperatura (C)

3.

A partir de la ecuacin de la recta calculamos el Log 10Tg a 4C. Si y = 1,27ln(x) + 5,8484, entonces a 4C (x). Log10Tg = 1,27*ln(4) + 5,8484 Log10Tg = 1,27*1,386 + 5,8484 Log10Tg = 1,761 + 5,8484 Log10Tg = 4,0878 Tg = 104,0878 Tg = 12240,7 min a 4C

4.

Con los datos anteriores de T g a 4C, procedemos a establecer la vida til mediante la ecuacin:

Log 0 2

4,602 3 12240,7 0,301 = 65148,16 = 45,2

Con el empleo del modelo de Monod-Hinshelwood, obtendramos un producto con una vida til media de 45 das si se conserva a temperatura de 4C.

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7.

Conclusin.

Si la vida til estimada para este producto a 4C es de 22 das con el modelo de Arrhenius, como margen de seguridad puede establecerse una vida til de 18 a 20 das a 4C. Sin embargo, con la aproximacin de Monod-Hinshelwood la vida til se ve prolongada a 45 das. En este caso como margen de seguridad podramos establecer una vida til de 40 das. Tal y como explica Labuza y Fu (1993) o McDonald y Sun (1999), cuando se emplea el modelo de Arrhenius para el crecimiento bacteriano, las extrapolaciones de las grficas pueden no mostrar linealidad, y por lo tanto, el modelo anterior no puede encajar muy bien por debajo o por encima de las temperaturas evaluadas para el crecimiento, lo anterior puede evidenciarse al comparar las Figuras 1 y 2, donde se observa que la relacin tanto de la velocidad de crecimiento como del tiempo de generacin frente a la temperatura no es lineal, sino de tipo exponencial o logartmico, es decir, se asemeja ms al proceso de crecimiento bacteriano, que por regla general es fisin binaria, la cual es de tipo exponencial. Claro que debemos recordar que no todas las bacterias siguen este proceso de crecimiento tal y como ocurre con Streptomyces spp. (Formacin de hifas y esporulacin); Mixobacterias (Formacin de cuerpos fructferos y esporulacin); Hyphomicrobium spp. (Gemacin); Nocardia spp. y Micoplasmas (Formacin de filamentos y septacin). 8. Bibliografa

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Valor de R 8.314472 0.0820574587 83.14472 8.20574587 10-5 8.314472 8.314472 8.314472 62.36367 62.36367 83.14472 0.08314472 1.987 6.132440 10.73159 0.7302413 998.9701 8.314472 107

Unidades (VPT-1n-1) JK-1mol-1 LatmK-1mol-1 cm3barmol-1K-1 m3atmK-1mol-1 cm3MPaK-1mol-1 LkPaK-1mol-1 m3PaK-1mol-1 LmmHgK-1mol-1 LTorrK-1mol-1 LmbarK-1mol-1 LbarK-1mol-1 calK-1mol-1 lbfftK-1g-mol-1 ft3psiR-1lb-mol-1 ft3atmR-1lb-mol-1 ft3mmHgK-1lb-mol-1 ergK-1mol-1