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Henry

Laboratorio
en el

Diagnostico Clinico
Homenaje a

Todd-Sanford & Davidsohn


John Bernard Henry, M.D.

Distinguised Service Professor Director. Pathology 200 College of Medicine Dircelo): Transfusion Medicine and Transfusion Medicine Fellowship Program Attending Pathologist, University Hospital Siale University of New York Upstate Medical University Syracuse, New York

Frederick R. Davey, M.D.


Prolessor and Chair. Department ot Pathology. State University ot New York Upstate Medical University. Syracuse. New York

Matthew R. Pincus, M.D , Ph.D.


Prolessor ol Pathology. State University of New York Downstate Medical Center; Chair. Department ot Pathology and Laboratory Medicine. Harbor Veterans Affairs Medical Center. Brooklyn. New York

Chester J. Herman, M . D , Ph.D.


Professor ot Pathology, Emory University School ol Medicine: Director. Pathology. Grady Health System, Atlanta. Georgia

Gregory A.Threatte, M.D.


Professor ot Pathology; Director ot Core Laboratories and Outreach. Upstate Medical University. Syracuse, New York

Richard A. McPherson, M.D.


Prolessor ot Pathology; Chair. Division ot Clinical Pathology. Department ot Pathology. Medical College ot Virginia. Virginia Commonwealth University; Director. Clinical Pathology. Medical College ot Virginia Hospitals, Richmond. Virginia

Gail L. Woods, M.D.


Prolessor ot Pathology; Director. Clinical Microbiology. University of Texas Medical Branch. Galveston. Texas

Contenido

Seccin I. Patologa clnica / Medicina de laboratorio


Gregory A. Tetrault, M.D., John Bernard Henry, M.D.

1. L a b o r a t o r i o clnico: o r g a n i z a c i n , objetivos y p r c t i c a
John Bernard Henry, MD,Anthony S Kurec,
M
S.HIASCPI

3 50 60 79 92 108 138 148

DiM.WiUam

Dcnwyler.M.7

2 . L a b o r a t o r i o s d e consulta m d i c a
Gregory A. Threatte, M o

...

3. Principios de i n s t r u m e n t a c i n

. .

Andy N.D. Nguyen. MSM. MD.. Robert L Sunheimer, M S , MriASCPiSC, John Bernard Henry, M D.

4. A u t o m a t i z a c i n d e l l a b o r a t o r i o clnico
Rodney S. Markin, /no, cft.O.

5. I n t e r p r e t a c i n de los resultados de l a b o r a t o r i o
Motthew R. Pincus, M D, pii D, Naif Z. Abraham.]r.. M a. i o.

6. I n f o r m t i c a , t r a t a m i e n t o de i m g e n e s e i n t e r o p e r a b i l i d a d
Raymond D.Aller, A I O , Ulysses J. Balis, MD

7. Estadstica e x p e r i m e n t a l
Gregory A. Tetrault. M.D.

8. G a r a n t a de calidad d e l l a b o r a t o r i o clnico
Gregory A. Tetrault, M.D.

Seccin II. Qumica clnica


Mathew R. Pincus, M.D., Ph.D., John Bernard Henry, M.D.

9. Evaluacin de la funcin r e n a l , b a l a n c e de a g u a , e l e c t r l i t o s , e q u i l i b r i o cido-base y gases sanguneos


D. Roben Dufour, M D

159

10. I n t e r m e d i a r i o s m e t a b l i c o s , ionesinorgnicos y m a r c a d o r e s b i o q u m i c o s del m e t a b o l i s m o d e l h u e s o


Elena Nkolova Hrstova, M D, John Bernard Henry. M D

180 21 I 224 249 264 281 304 335

11. H i d r a t o s de c a r b o n o
Paul . Knudson, Mo, Ruth S.Weinstock, M.R.PhO,John Bernard Henry. MD

12. Lpidos y d i s l i p o p r o t e i n e m i a
Paul S. Bachorik, BiO, Margo A. Denke. MD . van A. Stem, M D PhD. re A P. Bosyl M. Rifikind, MD.FR.CP

13. P r o t e n a s especficas
Richard A. McPherson. M o

14. E v a l u a c i n de la f u n c i n y el d a o h e p t i c o
D. Roben Dufour. M D

/5. E n z i m o l o g a clnica
D. Roben Dufour, MD. John A. Loa, n D.,John Bernard Henry, MD

16. Evaluacin de la f u n c i n e n d o c r i n a
Joan H. Howanitz. Mo,John Bernard Henry. M o

17. Toxicologa y m o n i t o r i z a c i n t e r a p u t i c a de f r m a c o s
Matthew R. Pincus, M o, Hi a, Naif Z. Abraham Jr., M.D.. PhD.

III

Seccin III. Orina y otros fluidos


Gregory A. Threatte, MD.. John Bernard Henry, M.D.

18. E x a m e n bsico de la o r i n a
Christine Fller, M), Gregory A. Threatte, M D, John Bernard Henry, M.D

367 403 425 432 446

19. L q u i d o c e f a l o r r a q u d e o , sinovial y lquidos serosos del o r g a n i s m o


Gregory P. Smith, M.D., Carl R. Kjeldsberg, M.D

20. L a b o r a t o r i o en a n d r o l o g a y la e v a l u a c i n de la f e r t i l i d a d
Siddhartha Sarkar, Pi-.D.John Bernard Henry. M.D

21. T r a t a m i e n t o en el l a b o r a t o r i o de las tecnologas de r e p r o d u c c i n asistida


AndrVan Steirteghem.MD.PhD.

22. A s p e c t o s d e l l a b o r a t o r i o en el t r a t a m i e n t o de la gestacin
Robert Wenk, M D . . M S , Miriam Blitzer. Hi..

23. D i a g n s t i c o de l a b o r a t o r i o de las a l t e r a c i o n e s gastrointestinales y pancreticas


David G. Heisig. M.D.. Gregory A. Theatte. MD., John Bernard Henry, M.D.

462

Frederick R. Davey, MD.,

John Bernard Henry, M.D.

24. E x a m e n bsico de la sangre


Michael W. Morris.
M S , DLMIASCPISH.,

479
M D

Frederick R. Davey.

25. H e m a t o p o y e s i s
Frederick R. Davey. Mo, Robert . Hutchison. MD

520 542 586 623 . . 642 660 718 . . 776 806

26. T r a s t o r n o s e r i t r o c i t a r i o s
M. Torek Elghetany, M D, Frederick R. Dovey, M D

27. A l t e r a c i o n e s de los leucocitos


Robert . Hutchson, M D, Frederick R. Davey, M.D

28. P l a q u e t a s en sangre
Jonathan L Miller, MO .Ph .D.

29. C o a g u l a c i n , fibrinlisis e h i p e r c o a g u l a c i n
Elizabeth M. Van Cott, M D , Michael Laposata, M D , P h D .

30. I n m u n o h e m a t o l o g a
WendyV. Beadlyng, M s. MTIASCPISRB, Laura Cooling, MD.MSI ,ohn Bernard Henry, Mo

31. M e d i c i n a transfusional
Leonard I. Borat, MD.MBA, Eduardo Delaflor Weiss, M D , John Bernard Henry, MO

32. H e m a f r e s i s
Jeffrey L Winters, M D . Alvaro A. Pineda, M D

33. A l m a c e n a m i e n t o de tejidos y clulas m a d r e


Charlene A. Hubbell. 6 s. MTIASCPISB. John Bernard Henry, M D

Seccin V. Inmunologa e inmunopatologa


Richard A. McPherson, M.D., John Bernard Henry, M.D.

34. V i s i n g e n e r a l d e l s i s t e m a i n m u n e y de los t r a s t o r n o s inmunolgicos


Richard A. McPherson, M.D.

817 821

35. I n m u n o e n s a y o s e i n m u n o q u m i c a
Ybshiro Ashihara, PII.D., Yosushi Kasahara, Pii.o., D.M.SC., Roben M. Nakamura, M
D

36. E x a m e n d e l a b o r a t o r i o d e l s i s t e m a i n m u n e c e l u l a r

850

He/ene MA Paxton. M.SMTIASCPI, Susanna Cunningham-Rundles, . Maurice R.G. 0 Gorman, M.Sc...D/ABMUI

Contenido

37. E v a l u a c i n del f u n c i o n a m i e n t o de las i n m u n o g l o b u l i n a s y la i n m u n i d a d h u m o r a l


Richard A. McPherson, MD

878 892 914

38. C o m p l e m e n t o y cininas: m e d i a d o r e s de la i n f l a m a c i n
Ene Wagner, pto. Haixiang Jiang, Mo.fto. Michael M Frank. MD

39. C i t o c i n a s y m o l c u l a s de a d h e s i n
HD o n s Massey, MD. FI D. DO S . Richard A. McPherson, M D

40. A n t g e n o l e u c o c i t a r i o h u m a n o : c o m p l e j o m a y o r de histocompatibilidad del h o m b r e


Armead H. Johnson. iD. Carolyn Katovich Hurley. f i D . Roben]. Haraman. cwrMC.usn.MD,udnh A.Wade. 8 k

927 949 963

41. C o m p l e j o m a y o r de h i s t o c o m p a t i b i l i d a d y e n f e r m e d a d
julio C Delgado. M o, Edmond j.Yunis, MD

42. T r a s t o r n o s i n m u n o d e f i c i t a r i o s
Charlotte Cunnmgham-Rundles. MD.fhD.

43. Evaluacin clnica de l a b o r a t o r i o de las e n f e r m e d a d e s r e u m t i c a s sistmicas


Carlos Alberto Yon Mhlen,
MO.F*D..

974 990 1000 1016

Roben M. Nakamura.

M O

44. Vasculitis
Rex M. McCallum. MD. David] Bylund. MD.

45. E n f e r m e d a d e s a u t o i n m u n e s organoespecficas
David / Bylund. M D. Roben M. Nakamura. M D

46. E n f e r m e d a d e s alrgicas
Henry A. Homburger.MD.

47. D i a g n s t i c o y m a n e j o d e l c n c e r m e d i a n t e m a r c a d o r e s t u m o r a l e s serolgicos
Jomes T.Wu. rto

1028

Gail L. Woods, M.D., John Bernard Henry, MD

48. Infecciones vricas


Michael Coste/lo, w D, Margaret Yungbluth, MD

1045 1072 1088 1119 1131 1144 1158


Fred W.Westenfeld.
MIIASCPISM

49. Infecciones causadas p o r c l a m i d i a s , rickettsas y m i c o p l a s m a s


Gail L Woods, D . David H. Walker, MD

50. B a c t e r i o l o g a m d i c a
barbara S. Reisner, i* o. Gail L Woods, M O

51. P r u e b a s de sensibilidad in vitro a los a n t i m i c r o b i a n o s


Michael B. Smitli. MD, Gail L. Woods. Mo

52. Infecciones p o r e s p i r o q u e t a s
Michael 8. Sm;(i, M D . Randall T. Hoyden, MD . David H. Persing. M D . m D., Gail L Woods. M D

53. M i c o b a c t e r i a s
Gail L Woods. MD

54. E n f e r m e d a d e s m i c t i c a s
Washington C.Wmn.jr,
MD.MRA,

55. P a r a s i t o l o g a m d i c a
Thomas R. Fritsche, Mr>,mo,ames W. Smith, MD.

1196 1241

56. P a t o l o g a m o l e c u l a r de e n f e r m e d a d e s infecciosas
Martn G. Cormican, MD, Michael A. Pfaller, M.D

57. M a n e j o y r e c o g i d a de m u e s t r a s p a r a el diagnstico de las e n f e r m e d a d e s infecciosas


Gail L. Woods, MD

1254

Contenido

Chester, J. Hermn. M.D.. Ph.D., John Bernard Henry. MD.

58. I n t r o d u c c i n a la p a t o l o g a m o l e c u l a r
Chester / Hermn. MD..PII.D, John Bernard Henry. * I . D

1273 1275 1287 1296 1304 1333 1344 1355 1372

59. Diagnsticos m o l e c u l a r e s : tcnicas y principios bsicos


Ehzabelli R. Unger.
PIo.
MD,

Margaret A. Piper.

PhD.MP.H.

60. R e a c c i n en c a d e n a de la p o l i m e r a s a y o t r a s tecnologas de amplificacin


james C. Zimring, MD. PID. Frederick S. No/te, no.

61. Tecnologas de la h i b r i d a c i n en serie


jacques Scnrenzet. M o Jonathan R. Hibbs. M D . David H. Persing. MD.PhD.

62. A p l i c a c i o n e s de la c i t o g e n t i c a en la p a t o l o g a m o d e r n a
Constance K. Stein, PhD.

63. O r g a n i z a n d o un l a b o r a t o r i o de diagnstico m o l e c u l a r
Andrea Ferreira-Gonzalez. PhD, DavidA.WHkinson. MD.PhD.. Coreton T. Garren, MD..PI.D.

64. O n c o p r o t e n a s y d e t e c c i n t u m o r a l p r e c o z

Motthew R. Pincus, M D Hi D, Paul W Brandl-Rauf. M D , Ph o. D . P H . William Koslosky, M o., William Appruzzese, PhD.

65. T c n i c a s m o l e c u l a r e s en el diagnstico de neoplasias h e m a t o p o y t i c a s


David S.Viswanatha, MD, Ridiard S. Larson, M D , PhD

66. D i a g n s t i c o m o l e c u l a r de las e n f e r m e d a d e s genticas


Wayne W. Grody. MD.. PhD, Walter W. Noli, MD.

67. P r u e b a s d e p a t e r n i d a d : e m p l e o d e l A D N , p o l i m o r f i s m o y o t r o s m a r c a d o r e s genticos
Herbert F. Polesky, M D.

1390 1402

68. P r u e b a s forenses d e i d e n t i d a d m e d i a n t e anlisis d e l A D N


Vctor W. Weedn. M o) D, Rlionda K. Roby, M P H

1. Soluciones fisiolgicas, t a m p o n e s , indicadores cido-base, m a t e r i a l e s de r e f e r e n c i a e s t n d a r y t a b l a de conversin de t e m p e r a t u r a s 2. Pesos ideales, superficie c o r p o r a l e ndice de m a s a c o r p o r a l ( I M C ) 3 . C l c u l o a p r o x i m a d o d e l v o l u m e n sanguneo t o t a l ( V S T ) 4. Tabla p e r i d i c a de los e l e m e n t o s 5 . U n i d a d e s del s i s t e m a i n t e r n a c i o n a l ( S I )
H. Peter Lehmann. Pt 0, jolin Bernard Henry, MD

1417 1420 1424 1425 1426

.. ...

VI

Autores

Naif Z. A b r a h a m , Jr., M.D.. Ph.D. Staff Pathologist. Veterans Affairs Medical Center; Assistant Professor. State University of New York Upstate Medical University, Syracuse. New York R a y m o n d D. Aller, M.D. Clinical Professor. Department of Pathology and Laboratory Medicine. Emory University School of Medicine. Atlanta. Georgia: Vice President. Medical Affairs and Informatics. MDS Laboratory Services (United States). Nashville. Tennessee W i l l i a m A p p r u z z e s e , Ph.D. Staff Member and Clinical Assistant Professor. Department of Environmental Sciences. Columbia College of Physicians and Surgeons. New York. New York Yoshihiro A s h i h a r a , Ph.D. General Manager. Research Laboratories. Incorporated. Tokyo. Japan Fujirebio

M a r t i n G . C o r m i c a n , M.D. Professor of Bacteriology (Medical Microbiology). Department of Bacteriology. Clinical Sciences Unit, National University of Ireland, Galway; Consultant Microbiologist. University College Hospital Galway. Galway. Ireland M i c h a e l C o s t e l l o , Ph.D. Technical Director. Advocate Shared Services Laboratory. Park Ridge, Illinois C h a r l o t t e C u n n i n g h a m - R u n d l e s , M.D.. Ph.D. Professor, Departments of Medicine. Pediatrics, and Immunobiology. Mount Sinai School of Medicine. New York. New York S u s a n n a C u n n i n g h a m - R u n d l e s , Ph.D. Professor of Immunology: Vice. Chair of Academic Affairs, Department of Pediatrics; Director. The Immunology Research Laboratory, Weill Medical College of Cornell University, New York. New York F r e d e r i c k R. Davey, M.D. Professor and Chair, Department of Pathology. State University of New York Upstate Medical University. Syracuse. New York J u l i o C. D e l g a d o , M.D. Instructor. Department of Pathology. Harvard Medical School; Assistant Medical Director. HLA Laboratory. Dana-Farber Cancer Institute, Boston. Massachusetts M a r g o A . D e n k e , M.D. Associate Professor. University of Texas Southwestern Medical Center. Dallas. Texas W i l l i a m K. D e t t w y l e r , M.T. Senior Consultant. Health Systems Concepts. Incorporated. Longwood. Florida D. R o b e r t D u f o u r , M.D. Professor of Pathology. George Washington University Medical Center, Washington. DC; Clinical Professor of Pathology. Uniformed Services University of the Health Sciences. Bethesda. Maryland; Chief. Pathology and Laboratory Medicine Service. Veterans Affairs Medical Center. Washington. DC. M . T a r e k E i l g h e t a n y , M.D Associate Professor and Vice Chairman. Department of Pathology. University of Texas Medical Branch, Galveston. Texas A n d r e a F e r r e i r a - G o n z a l e z , Ph.D. Associate Professor. Medical College of Virginia. Virginia Commonwealth University; Technical Director of Molecular Diagnostics. Medical College of Virginia Hospitals, Virginia Commonwealth. University. Richmond. Virginia

Paul S. B a c h o r i c k , Ph.D. Professor (retired). The Johns Hopkins University School of Medicine. Baltimore. Maryland Ulysses J . Balis, M O Instructor in Pathology. Harvard Medical School and Massachusetts General Hospital. Boston. Massachusetts W e n d y V. B e a d l i n g , M.S., M T < A S C P ) S B B Assistant Professor. Department of Clinical Laboratory Science, State University of New York Upstate Medical University, Syracuse, New York M i r i a m Blitzer, Ph.D. Professor and Chief, Division of Human Genetics. Department of Pediatrics. University of Maryland, Baltimore. Maryland L e o n a r d I. B o r a l , M . D . M.B.A. Associate Professor of Clinical Laboratory Medicine and Pathology, University of Medicine and Dentistry of New Jersey, Newark; Staff Pathologist, Jersey Shore Medical Center, Neptune. New Jersey Paul W. B r a n d t - R a u f , M . D , Ph.D., D.P.H. Professor. Department of Environmental Sciences. Columbia College of Physicians and Surgeons, New York, New York D a v i d J . B y l u n d , M.D. Laboratory Director. Scripps Reference Laboratory. San Diego. California Laura C o o l i n g , M . D . M.SC. Assistant Professor. Department of Pathology. University of Michigan Medical School; Assistant Director, Blood Bank and Transfusion Medicine, University of Michigan Hospitals. Ann Arbor. Michigan

vii

M i c h a e l M. F r a n k , M.D. Samuel L. Katz Professor and Chairman of Pediatrics, and Professor of Immunology and Medicine, Duke University Medical Center, Durham. North Carolina T h o m a s R. F r i t s c h e , M.D . Ph.D. Associate Professor, Department of Laboratory Medicine, University of Washington; Head, Clinical Microbiology Division. University of Washington Medical Center. Seattle. Washington C h r i s t i n e E. Fuller, M D . Fellow, Department of Pathology, Washington University School of Medicine; Fellow. Department of Pathology, Barnes- Jewish Hospital, St. Louis, Missouri C a r l e t o n T. G a r r e t t , M.D ., Ph.D. Professor of Pathology, Medical College of Virginia, Virginia Commonwealth University; Medical Director, Molecular Diagnostics Laboratory, Department of Pathology, Medical College of Virginia Hospitals, Richmond. Virginia W a y n e W . G r o d y , M.D., P h . D Professor. Divisions of Molecular Pathology and Medical Genetics, Departments of Pathology and Laboratory Medicine and Pediatrics, UCLA School of Medicine: Director, Diagnostic Molecular Pathology Laboratory, UCLA Medical Center, Los Angeles, California R o b e r t J . H a r t z m a n , C A P T , M C , U S N , M.D. Director, C. W. Bill Young Marrow Donor Recruitment Program and Research Program, Naval Medical and Research Insitute, Bethesda. Maryland R a n d a l l T. H a y d e n , M.D. Director. Clinical Microbiology, St. Jude Children's Research Hospital. Memphis, Tennessee D a v i d G. H e i s i g , M.D. Associate Professor of Medicine. Department of Medicine, State Universit of New York Upstate Medical University Syracuse. New York J o h n B e r n a r d H e n r y , M.D. Director, Pathology 200, College of Medicine; Distinguished Service Professor; Director, Transfusion Medicine & Transfusion Medicine Fellowship; Hemapheresis. HLA, Progenitor Cell and Parentage Testing Laboratories; Attending Pathologist, University Hospital. State University of New York Upstate Medical University, Syracuse, New York C h e s t e r J. H e r m a n , M.D.. Ph.D. Professor of Pathology, Emory University School of Medicine; Director. Pathology, Grady Health System, Atlanta. Georgia

J o n a t h a n R. H i b b s , M.D. Director, Bacteriology Laboratory Wadsworth Center. New York State Department of Health. David Axelrod Institute, Albany, New York H e n r y A . H o m b u r g e r , M.D. Professor of Laboratory Medicine, Mayo Medical School and Mayo Graduate School of Medicine. Rochester, Minnesota J o a n H . H o w a n i t z , M.D. Vice Chair, Department of Pathology. State University of New York at Brooklyn; Director of Laboratories. Kings County Hospital Center, Brooklyn. New York E l e n a N i k o l o v a H r i s t o v a , M.D. Resident in Anatomic and Clinical Pathology. State University of New York Upstate Medical University, Syracuse. New York C h a r l e n e A. H u b b e l l , B.S MT<ASCP)SBB Adjunct Assistant Professor, Clinical Laboratory Science, College of Health Professions; Supervisor, Histocompatibility, Immunogenetics and Progenitor Cell Bank, State University of New York Upstate Medical University, Syracuse, New York C a r o l y n K a t o v i c h H u r l e y , Ph.D. Professor. Department of Microbiology. University Medical Center. Washington.

Georgetown DC

R o b e r t E. H u t c h i s o n , M.D. Professor of Pathology. Director of Clinical Pathology, and Director of Hematopathology, State University of New York Upstate Medical University. Syracuse, New York H a i x i a n g J i a n g , M . D , Ph.D. Assistant Research Professor. Department of Pediatrics. Duke University Medical Center, Durham, North Carolina A r m e a d H. J o h n s o n , Ph.D. Professor, Department of Pediatrics, Georgetown University Medical School, Washington. DC Y a s u s h i K a s a h a r a , Ph.D., D.M.SC Visiting Professor. Kyorin University School of Public Health: Research Fellow. Keio University of Medicine. Tokyo, Japan C a r l R. K j e l d s b e r g , M.D. Professor and Chair. Department of Pathology, University of Utah: University Hospital (Laboratory Services) Chairman and Pediatric Pathology (Laboratory Services) Chairman. University of Utah Hospital and Primary Children s Medical Center. Salt Lake City, Utah

viii

Autores

Paul E. K n u d s o n , M.D. Associate Professor of Medicine, Division of Endocrinology. Diabetes and Metabolism: Joslin Diabetes Center. State University of New York Upstate Medical University. Syracuse, New York W i l l i a m K o s l o s k y , M.D. Consultant. Harbor Veterans Affairs Medical Center. Brooklyn. New York A n t h o n y S. K u r e c ,
M.S., H ( A S C P ) D L M

R i c h a r d A . M c P h e r s o n , M.D. Professor of Pathology; Chair. Division of Clinical Pathology, of Virginia. Department of Pathology. Medical College Virginia Commonwealth University; Director.

Clinical Pathology. Medical College of Virginia Hospitals. Richmond. Virginia J o n a t h a n L. Miller, M . D . Ph.D. Professor of Pathology; Director of Academic Aftairs. Department of Pathology: Director of Special Hematology Laboratory. Syracuse, New York M i c h a e l W. M o r r i s , Professor.
M.S.. D L M I A S C P I S H

Clinical Associate Professor. Department of Clinical Laboratory Science, College of Health Professions: Administrator for Pathology Marketing and University Pathologists Laboratories, State University of New York Upstate Medical University. Syracuse. New York M i c h a e l L a p o s a t a , M.D.. Ph.D. Professor. Department of Pathology: Director of Clinical Laboratories. Harvard Medical School. Boston, Massachusetts R i c h a r d S. L a r s o n , M.D.. Ph.D. Assistant Professor, Department of Pathology, University of New Mexico School of Medicine; Laboratory Director, University Hospital Rapid Response Laboratories. University Hospital. Albuquerque. New Mexico H. Peter L e h m a n n , Ph.D. Professor Emeritus. Department of Pathology. Louisiana State University Medical Center. New Orleans. Louisiana J o h n A. Lott, Ph.D. Professor. Department of Pathology, The Ohio State University; Director of Clinical Chemistry, The Ohio State University Hospitals, Columbus. Ohio R o d n e y S. M a r k i n , M . D . Ph.D. Professor and Vice Chair, Department of Pathology and Microbiology: Associate Dean for Clinical Aftairs. College of Medicine, University of Nebraska Medical Center. Omaha. Nebraska H. D a v i s M a s s e y , M . D , Ph.D., D.D.S. Chief Resident in Pathology. Medical College of Virginia, Virginia Commonwealth University, Richmond, Virginia Rex M. M c C a l l u m , M.D. Associate Clinical Professor of Medicine. Division of Rheumatology. Allergy and Clinical Immunology. Duke University School of Medicine; Vice Chair for Clinical Services. Department of Medicine. Duke University School of Medicine and Hospital. Durham. North Carolina

University Hospital,

State

University of New York Upstate Medical University.

Department of Clinical Laboratory Science;

Manager. Department of Pathology. University Hospital. State University of New York Upstate Medical University, Syracuse. New York R o b e r t M . N a k a m u r a , M.D. Professor. Departments of Immunology and The Scripps Experimental and Molecular Medicine.

Research Institute: Senior Consultant and Chairman Emeritus, Department of Pathology. Scripps Clinic and Research Foundation. La Jolla. California A n d y N.D. N g u y e n , Associate Professor. Director.
M S M E , M.D.

Department of Pathology.

University of Texas Medical School at Houston; Hematology Laboratory and Chemistry Memorial Hermann Hospital. Laboratory. Lyndon B. Johnson Hospital; Director. Coagulation Laboratory. Houston, Texas W a l t e r W . N o l l , M.D Professor of Pathology. and Molecular Genetics Dartmouth-Hitchcock Lebanon. Dartmouth Medical School. Diagnostic Laboratories, Center, Hanover. New Hampshire; Director. Clinical Chemistry Medical

New Hampshire

F r e d e r i c k S. N o l t e , Ph.D. Associate Professor. Medicine, Laboratory Director, Laboratories, Atlanta. Pathology and Laboratory Clinical Microbiology and Emory Medical Georgia Emory University School of Medicine;

Molecular Diagnostic Laboratories.

M a u r i c e R . G . O ' G o r m a n , M Sc.. Ph.D.. D(ABMLi) Associate Professor-Pediatrics. Northwestern Diagnostic The University Medical School; Director.

Immunology and Flow Cytometry Laboratories. Children's Memorial Hospital. Chicago. Illinois

ix

Autores

H e l e n e M.A. P a x t o n , M.S., M T I A S C P ) Vice President of Manufacturing. Regulatory Affairs and Research and Development, PanBio InDx, Incorporated. Baltimore. Maryland D a v i d H. P e r s i n g , M.D.. Ph.D. Medical Director. Infectious Disease Research Institute; Vice President, Diagnostics Research. Corixa Corporation, Seattle. Washington M i c h a e l A. Pfaller, M.D. Professor. Department of Pathology; Director, Molecular Epidemiology and Fungus Testing Laboratory, University of Iowa College of Medicine. Iowa City, Iowa M a t t h e w R. P i n c u s , M . D , Ph.D. Professor of Pathology. State University of New York Downstate Medical Center; Chair. Department of Pathology and Laboratory Medicine, Harbor Veterans Affairs Medical Center. Brooklyn. New York A l v a r o A . P i n e d a , M.D. Professor of Laboratory Medicine and Director of Transfusion Medicine Fellowship Program. Mayo Medical School and Mayo Graduate School of Medicine: Consultant. Transfusion Medicine. Mayo Clinic. Rochester. Minnesota M a r g a r e t A. Piper, Ph.D.. M . R H . Senior Consultant. Technology Evaluation Center. BlueCross BlueShield Association, Chicago, Illinois H e r b e r t F. Polesky, M.D. Professor (retired), Department of Laboratory Medicine and Pathology, University of Minnesota School of Medicine, Minneapolis. Minnesota: Formerly Director, Memorial Blood Centers of Minnesota, Minneapolis, Minnesota B a r b a r a S. R e i s n e r , Ph.D. Assistant Professor, Department of Pathology: Associate Director. Clinical Microbiology Laboratory, University of Texas Medical Branch. Galveston, Texas Basil M. R i f k i n d , M.D., F.R.C.P. Special Assistant for Clinical Studies,

S i d d h a r t h a Sarkar, Ph.D. Clinical Professor, Department of Pathology: Director. Andrology Service. University Hospital, State University of New York Upstate Medical University. Syracuse, New York Jacques Schrenzel, Assistant Professor. Consultant. Division University Hospital. M.D Geneva University Medical School: of Infectious Diseases, Geneva Geneva, Switzerland

G r e g o r y P. S m i t h , M.D. Assistant Clinical Professor. Department of Pathology. University of Utah; Staff Pathologist, Department of Pathology. St. Mark's Hospital. Salt Lake City. Utah J a m e s W . S m i t h , M.D. Professor Emeritus. Department of Pathology and Laboratory Medicine, Indiana University School of Medicine, Indianapolis, Indiana M i c h a e l B. S m i t h , M.D. Assistant Professor; Associate Director, Clinical Microbiology and Laboratory Information System. University of Texas Medical Branch. Galveston, Texas C o n s t a n c e K. S t e i n , Ph.D. Associate Professor of Pathology and Pediatrics; Director of Cytogenetics and Associate Director of Molecular Diagnostics. University Hospital. State University of New York Upstate Medical University, Syracuse, New York E v a n A . S t e i n , M . D , Ph.D.. F.C.A.P Voluntary Professor. Pathology and Laboratory Medicine, University of Cincinnati. Cincinnati, Ohio: President and Chief Executive Officer, Medical Research Laboratories, Highland Heights, Kentucky R o b e r t L. S u n h e i m e r , M.S., M T ( A S C P ) S C Associate Professor in Clinical Laboratory Science. State University of New York Upsate Medical University, Syracuse, New York G r e g o r y A. Tetrault, M.D. Medical Director, Shared Laboratory Services. Chesapeake, Virginia

L.C..

National Institutes

G r e g o r y A . T h r e a t t e , M.D. Professor of Pathology; Director of Core Laboratories and Outreach, Upstate Medical University, Syracuse, New York E l i z a b e t h R. U n g e r , Ph.D., M.D. Acting Chief, Human Papillomavirus Section. Centers for Disease Control and Prevention; Clinical Associate Professor, Department of Pathology and Laboratory Medicine, Emory University School of Medicine. Atlanta. Georgia x

of Health, National Heart, Lung, and Blood Institute. Division of Heart and Vascular Diseases, Bethesda. Maryland R h o n d a K. Roby, M . R H Senior Forensic Specialist, Human Identification, Applied Biosystems. Foster City, California

Autores

E l i z a b e t h M . V a n C o t t , M.D. Director, Coagulation Laboratory, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School. Boston. Massachusetts A n d r e V a n S t e i r t e g h e m , M.D.. Ph.D. Full Professor, Medical School; Scientific and Laboratory Director. Center for Reproductive Medicine, Medical School and University Hospital, DutchSpeaking Brussels Free University. Brussels. Belgium D a v i d S . V i s w a n a t h a , M.D Assistant Professor. Department of Pathology, University of New Mexico School of Medicine; Staff Hematopathologist. University of New Mexico Health Sciences Center. Albuquerque. New Mexico C a r l o s A l b e r t o Von M i i h l e n , M.D.. Ph.D. Full Professor of Rheumatology and Internal Medicine, Pontifical Catholic University School of Medicine, Porto Alegre, RS, Brazil J u d i t h A. W a d e , B Sc. Professor, Department of Surgery, and Faculty of Medicine, University of Toronto; Formerly Head, Histocompatibility Laboratory, Toronto Hospital University Health Network, Toronto. Ontario. Canada Eric W a g n e r , Ph.D. Immunologist, Ste-Justine Hospital, Quebec, Canada

R o b e r t E. W e n k , M.D.. M.S. Clinical Professor of Pathology. Pennsylvania State University, Hershey, Pennyivania; Clinical Associate Professor of Human Genetics, University of Maryland; Attending Pathologist, Division Head of Clinical Pathology, Sinai Hospital, Baltimore. Maryland F r e d W. W e s t e n f e l d , M T ( A S C P > S M Clinical Faculty. University o Vermont: Microbiology Manager (Chief Technologist) Fletcher Allen Health Care. Burlington. Vermont D a v i d S. W i l k i n s o n , M . D . Ph.D. Professor and Chairman, Department of Pathology; Professor of Health Administration. Medical College of Virginia Campus. Virginia Commonwealth University. Richmond, Virginia W a s h i n g t o n C . W i n n , Jr., M . D , M.B.A. Professor of Pathology. University of Vermont College of Medicine; Director, Clinical Microbiology Laboratory, Fletcher Allen Health Care. Burlington, Vermont J e f f r e y L. W i n t e r s , M.D. Assistant Professor. Department of Pathology and Laboratory Medicine; Associate Director of the Blood Bank. University of Kentucky Chandler Medical Center: Associate Medical Director. Central Kentucky Blood Center; Director of Transfusion Service. Cooper Drive Division of the Veterans Affairs Medical Center, Lexington, Kentucky Hemapheresis Gail L. W o o d s , M.D. Professor of Pathology; Director. Clinical Microbiology, University of Texas Medical Branch. Galveston. Texas J a m e s T . W u , PhD Professor of Pathology, University of Utah Health Science Center; Director of Special Chemistry Laboratory. Associate Regional University Pathologists (ARUP). Salt Lake City. Utah M a r g a r e t Y u n g b l u t h , M.D. Associate Professor of Clinical Pathology, Northwestern University Medical School. Chicago: Staff Pathologist, St. Francis Hospital. Evanston, Illinois E d m o n d J . Y u n i s , M.D. Professor, Department of Pathology. Harvard Medical School: Director. HLA Laboratory, Dana-Farber Cancer Institute. Boston. Massachusetts J a m e s C. Z i m r i n g , M . D . Ph.D. Pathology Resident, Department of Pathology and Laboratory Medicine, Emory University. Atlanta. Georgia

Montreal.

D a v i d H. W a l k e r , M.D. Professor and Chairman. Department of Pathology; Director, World Health Organization Center for Tropical Diseases. University of Texas Medical Branch. Galveston, Texas Victor W . W e e d n , M . D , J.D. Principal Research Scientist and Director of Biotechnology and Health Initiatives, Carnegie Mellon University, Pittsburgh. Pennsylvania R u t h S. W e i n s t o c k , M . D , Ph.D. Professor of Medicine; Chief, Endocrinology. Diabetes and Metabolism; Medical Director. Joslin Diabetes Center. State University of New York Upstate Medical University; Chief. Endocrinology Veterans Affairs Medical Center, Syracuse, New York E d u a r d o D e l a f l o r W e i s s , M.D. Attending Pathologist and Director, Transfusion Service, Monmouth Medical Center, Long Branch, New Jersey

CAPTULO 33

A L M A C E N A M I E N T O DE TEJIDOS Y CLULAS M A D R E

811

de la sangre perifrica tanto de pacientes como de donantes normales e incluso de placenta o sangre de cordn.

Clulas madre de sangre perifrica


El impulso para el desarrollo de tecnologas que permitieran la recogida de CMH de sangre pentrica fue su uso potencial para trasplante autlogo, en que el riesgo de contaminacin de la mdula con clulas tumorales es alto. Debido a la relativa facilidad de recogida de mdula sea por hemafresis, las clulas madre obtenidas de sangre perifrica se usan de forma creciente en el entorno alognico. Un rea de gran importancia puede ser la donacin de no familiares o voluntarios, en la que ms individuos pueden prestarse de forma voluntaria para los programas nacionales de donacin de mdula cuando la hemafresis se ofrece como opcin frente a la recogida tradicional de mdula sea. El procedimiento e instrumentacin utilizados para la recogida de clulas madre de sangre perifrica se describen el Capitulo 32. De forma clara, la mayor ventaja de las clulas madre obtenidas de sangre perifrica frente a la mdula sea es el tiempo de injerto de neutrfilos y plaquetas, con una media de 8 a 12 das para las clulas madre de sangre perifrica frente a las dos a cuatro semanas de la mdula sea (Gianm, 1989). Esta rpida recuperacin claramente reduce la morbimortalidad asociada por neutropenia/trombopenia graves, asi como los costes asociados a la estancia hospitalaria, soporte transfusional. tratamiento de complicaciones y dems. Se saba que las CMH estaban presentes en sangre perifrica tras la recuperacin de la quimioterapia (Richman. 1976). pero quedaba pendiente el desarrollo de sistemas de hemafresis que permitieran una recogida segura de un adecuado nmero de estas clulas para proporcionar el injerto al receptor tras la quimioterapia (Kessmger. 1988). En la mayor parte de pacientes para trasplante autlogo. se ha establecido actualmente la recogida de un gran volumen de afresis I14-201/ procedimiento) como un procedimiento eficaz para recoger un nmero adecuado de CMH en un razonable nmero de procedimientos para proporcionar una recuperacin hematopoytica adecuada. Las CMH son morfolgicamente indistinguibles de otras clulas mononucleares de la mdula sea o sangre perifrica, por lo que resulta esencial la recogida de un nmero adecuado de clulas para asegurar el injerto medular en el receptor. El objetivo tradicional para las recogidas de muestras de mdula sea persegua obtener un nmero suficiente de clulas nucleadas que permitiera asegurar un nmero mnimo de clulas madre. Los injertos de mdula sea pueden tambin ser evaluados para la actividad de clulas madre mediante el uso de tcnicas de unidades formadoras de colonias (UFCs) (Iscove. 1971). Una muestra de clulas mononucleares del injerto se cultiva en medio de metilcelulosa con suplementos de factores de crecimiento hematopoyticos y aminocidos esenciales durante 10 a 14 das. Al final de este periodo, se examinan las placas buscando el nmero y caractersticas de las CFU, incluyendo Unidades Formadoras de Colonias Eritroblsticas (BFU-E), Unidades Formadoras de Colonias Granulociticas (CFU-GM) y Unidades Formadoras de Colonias mixtas de granulocitos, eritrocitos, monocitos y megacanocitos (CFU-GEMM). Los grupos celulares que contienen ms de 50 clulas se valoran como una colonia. Las muestras con ms de 1 x 10 UFC por kg de peso del receptor se consideran adecuadas. A medida que la recogida de clulas madre evolucion hacia el uso de procedimientos de hemafresis de sangre perifrica, se hizo necesario desarrollar un mtodo que se
:

pudiera realizar en el mismo da y que determinara el nmero de muestras de hemafresis necesarias. El mtodo ms aceptado para valorar las muestras de clulas madre de sangre perifrica es la cuantificacin del nmero de clulas con antigeno CD34 por citometria de flujo. El antigeno CD34 se encuentra limitado a las clulas primitivas de todas las estirpes (Civin, 1989). La recogida de productos de hemafresis utilizando el recuento de clulas CD34como ndice de la eficacia del injerto se ha mantenido para el injerto hematopoytico (Berenson. 1991). La estandarizacin de la valoracin de las clulas CD34 y la disponibilidad de los anlisis de citometria de flujo han ocasionado que la medida de las clulas CD34+ se utilice por la mayor parte de los programas para determinar el nmero y adecuacin de las muestras de clulas madre de sangre perifrica (Sutherland, 1994). Generalmente, las muestras de clulas madre de sangre perifrica con mas de 3 x 10 clulas CD34+ por kg de peso corporal del receptor se consideraban adecuadas para conseguir el injerto de neutrfilos entre 8 y 10 das.
f

La recogida de CMH en el paciente no "movilizado' o donante requerira mltiples procedimientos de recogida y afresis, dado que el nmero de CMH en sangre perifrica se encuentra entre 1/10 y 1/100 del nmero de clulas en la mdula. En consecuencia, se requieren terapias de "movilizacin" para aumentar el numero de CMH circulantes y mejorar la eficiencia de la recogida por hemafresis. Richman (1976) descubri que mientras hay una cada en el nmero de clulas CD34+ circulantes despus de la quimioterapia, esto era seguido por un aumento entre 4 y 5 veces en el porcentaje de clulas CD34+ a medida que el recuento absoluto de neutrfilos comenzaba a recuperarse, a menudo entre 1 4 y 21 das despus de la terapia. Este aumento en clulas CD34+ circulantes es mayor con agentes quimioterpicos como citoxano y etopisida. Si la recogida por hemafresis se realiza en este periodo ventana, se pueden recuperar grandes nmeros de CMH con un limitado numero de procedimientos, incluso aunque el recuento total de leucocitos sea menor de 10.000'ul. Como el periodo de aumento de clulas CD34+ circulante es breve (dos a tres das), son crticos un estrecho control del recuento de leucocitos y clulas CD34+ circulantes del paciente, as como el control de los tiempos de recogida por hemafresis. Adems, algunos investigadores han sealado que la recogida de CMH en la fase de recuperacin tras quimioterapia reduce la probabilidad de contaminacin por clulas tumorales en el producto de afresis. El uso de factores de crecimiento hematopoytico como el Factor Estimulante de Colonias de Granulocito-Macrfago (GM-CSF) y el Factor Estimulante de Colonias de Granulocito (G-CSF) produce igualmente un aumento significativo en el nmero de clulas CD34+ en sangre perifrica (Siena, 1989). Dosis de 5 a 1 0 ug/kg de peso corporal durante 4 a 5 das causan un aumento de 5 a 10 veces en el nmero de CMH en sangre perifrica. El uso de G-CSF aislado ha probado ser ms eficiente que el cebado con quimioterapia para la recogida de clulas CD34*. L a combinacin de cebado con quimioterapia y el uso de factores de crecimiento (en especial G-CSF) provoca la mxima movilizacin de clulas madre pluripotenciales en sangre perifrica, as como la necesidad de menor nmero de procedimientos de hemafresis para recoger una dosis de CMH para trasplante, una estrategia empleada por la mayor parte de los programas de trasplante autognico. Se ha investigado el uso de G-CSF en el donante alognico sano para movilizar CMH y. salvo efectos leves como dolor seo y cefalea, resulta bien tolerado (Anderlmi. 1997). De forma creciente, los programas de trasplantes

Tabla 33-6 Comparacin de las tuentes y productos de clulas madre hematopoyticas. Lugar de recogida y complicaciones Sangre de cordn (CMSC) Tipo de donante Producto Lugar de recogida Complicacin principal Sangre de cordn umbilical Clula madre de sangre de cordn Cordn umbilical de placenta en el nacimiento Insuficiencia de clulas madre Autlogas (CMMO + CMSP) Paciente Mdula sea o CMSP Mdula intraoperatona o hemafresis Recurrencia de la enfermedad original Alognicas (CMMO + CMSP) Donante compatible familiar o no Mdula sea o CMSP Mdula intraoperatona o hemafresis Enfermedad injerto contra husped
cofdon

CMSP= clulas madre en sangre perifrica; CMMO= clulas madre en medula Osea; CMSC= c l u l a s madre en sangre d e

812

S E C C I N IV

H E M A T O L O G A , C O A G U L A C I N Y M E D I C I N A TRANSFUSIONAL

estn utilizando sangre perifrica como fuente de CMH en lugar de mdula sea, tanto para trasplantes alognicos como autognicos.

Sangre de cordn umbilical


Durante muchos aos, se saba que gran cantidad de unidades formadoras de colonias o clulas madre estaban presentes en la sangre del cordn umbilical, pero no fue hasta 1989 que se realizaron los primeros ensayos para utilizar clulas recuperadas de cordn umbilical de placenta para el trasplante hematopoytico (Gluckman. 1989). El xito aparente de muchos de estos trasplantes precoces de sangre de cordn ha dado lugar a la organizacin de diferentes bancos de clulas de cordn en EE.UU. y en Europa en un intento por proporcionar otra fuente de clulas madre para los pacientes que necesitan un trasplante alognico. Adems, como las clulas madre se obtienen de sangre del cordn, parece haber un mayor grado de tolerancia para algunos tipos de incompatibilidad HLA entre donante y receptor sin que aparezcan los grados 3 4 de la GVH. Como consecuencia, el trasplante podra estar disponible para algunos pacientes que de otra forma no tienen donante HLA compatible (Cairo, 1997). Las clulas madre de cordn umbilical se obtienen por canulacin de los vasos placentarios, con la placenta todava in tero o ms frecuentemente, despus del parto o por expresin directa de la sangre del cordn de la placenta despus del mismo. El nmero de CMH recuperadas es directamente proporcional al volumen de sangre de cordn recogido, lo que depende del tamao del nio/placenta y tambin de la experiencia del personal que recoge la muestra (Wagner. 1992). Volmenes entre 40 y 150 mi son frecuentes en centros con experiencia. Esto permitir obtener, aproximadamente, una muestra de 4 a 11 x 10 clulas nucleadas. Las muestras de volumen insuficiente (<40 mi) se suelen descartar. Generalmente, las muestras de sangre de cordn umbilical no se procesan para reducir el volumen, congelndose directamente en DMSO y almacenndose en nitrgeno lquido. Los trabajadores de banco con entrenamiento especfico no sufren distraccin por el cuidado de la madre y/o el nio en la sala de partos, y reducen el riesgo de contaminacin bacteriana de la sangre del cordn.
6

macin de rosetas para eliminar poblaciones celulares no deseadas, en especial las clulas T. En fecha reciente se han utilizado anticuerpos monoclonales dirigidos a un receptor especfico de clula junto con complemento o ligadas con inmunotoxmas como el ricino para producir una lisis de la poblacin de clulas tumorales contaminantes. Ademas, con la llegada de la tecnologa de esferas inmunomagnticas (immunomagnetic bead technology). los anticuerpos monoclonales se pueden ligar a una de estas esteras. El complejo anticuerpo-esfera-clula tumoral se elimina al pasar la suspensin celular por un campo magntico donde la poblacin de clulas n o deseadas quedar retenida y las CMH son eluidas y recogidas. Las tcnicas de seleccin positiva se dirigen a la presencia selectiva del marcador CD34 en las clulas madre hematopoyticas y la disponibilidad de anticuerpos monoclonales dirigidos al mismo. Mientras la tecnologa original utilizaba una columna a la que se ligaban anticuerpos monoclonales. en el momento actual se utilizan tcnicas de esferas inmunomagnticas. La fraccin de clulas mononucleares obtenidas bien de la mdula sea, bien por hemafresis de clulas madre, se incuba con el monoclonal anti-CD34 u otros monoclonales de inters. Se aade una suspensin de esferas inmunomagnticas marcadas con un segundo anticuerpo. Este ltimo se liga al monoclonal anti-CD34 creando un complejo esfera-clula diana marcado. Cuando la suspensin celular se somete a un campo magntico, el complejo clula CD34-esfera magntica quedar retenido y la suspensin de clulas mononucleares que contiene tanto clulas tumorales no deseadas como clulas T CD3+ ser desechada. Las clulas madre CD34+ son entonces liberadas de las esferas magnticas mediante un agente liberador y las esferas se eliminan mediante un nuevo campo magntico, dejando una suspensin celular que contiene aproximadamente un 90% d e clulas CD34-. La reduccin del numero total de clulas T CD3+ llega hasta una reduccin de 3.5 log,,. La mediana de recuperacin para las clulas CD34+ es de aproximadamente el 50% de la cantidad inicial de clulas CD34+ presentes en el producto obtenido por hemafresis. Aunque todavia est permitido el uso para la seleccin positiva de clulas CD34+. esta tecnologa tambin se encuentra bajo activa investigacin para aplicaciones de seleccin negativa.

Una cuidadosa seleccin de la historia mdica y pruebas a la madre son esenciales para asegurar la calidad del producto de sangre de cordn, asi como la ausencia de enfermedad gentica. Adems de las pruebas de laboratorio habituales para enfermedades de transmisin serolgica, se realizan ms pruebas para enfermedades bacterianas y vricas. Mientras el almacenamiento de la sangre de cordn umbilical resulta una alternativa para grados menores de histocompatibilidad y. en consecuencia, una oferta real para un mayor nmero de pacientes, presenta como limitacin la necesidad de aumentar el nmero de CMH adecuadas para receptores de mayor tamao, asi como la de optimizar los costes de inicio y mantenimiento de bancos de clulas de cordn.

Deplecin de clulas T
Las tcnicas para reducir el nmero de linfocitos CD3+ en los injertos hematopoyticos alognicos, generalmente de mdula, se han dirigido a reducir la incidencia y severidad de la reaccin del injerto contra el husped (GVH). Muchas de las tcnicas descritas para depurar clulas tumorales, como la seleccin positiva de clulas CD34+, han sido tambin aplicadas para la reduccin de clulas T en el injerto (Tabla 33-8). Otras tcnicas especficamente dirigidas a las clulas T han incluido aglutinacin con l e c t m a de soja, formacin de rosetas E. combinaciones de ambas y diluciones a contracorriente. La lectina de soja produce una aglutinina especifica frente al receptor CD2 del linfocito. Aadiendo un paso de formacin de rosetas con eritrocitos de oveja, se consiguen eliminar las clulas T restantes no aglutinadas por la lectina de soja Este mtodo produce una deplecin de clulas T de 2 a 3 log., (Reisner, 1982).

Depuracin
Una vez recogidas las clulas madre hematopoyticas. bien de mdula o de sangre perifrica, a menudo resulta ventajoso realizar un procesado ulterior de las CMH recogidas con el objeto de reducir una posible contaminacin por clulas tumorales o, en los trasplantes alognicos. reducir el nmero de clulas T CD3+. Se han realizado dos aproximaciones no excluyentes entre s. La primera desarrolla tcnicas que persiguen eliminar las clulas tumorales, tambin llamadas tcnicas de depuracin o seleccin negativa. La segunda utiliza mtodos para separar y recoger tan slo las clulas madre hematopoyticas CD34-. descartando la fraccin celular restante que. presumiblemente, contiene clulas tumorales contaminantes: estos mtodos se denominan habitualmente tcnicas de seleccin positiva (Tabla 33-7). Las tcnicas originales de depuracin empleaban una variedad de mtodos especficos e inespeclicos para eliminar la poblacin celular no deseada En aquella poca se utilizaban frmacos citotxicos como la 4-hidroxiperoxiciclofosfamida (4-HC) y etopisida (VP-16) para eliminar las clulas tumorales contaminantes (Yeager, 1986). Estos mtodos son los equivalentes in vitro de altas dosis de quimioterapia, por lo que el mayor efecto negativo es el dao a las CMH. Otras tcnicas incluyen el uso de lectinas y/o for-

Tabla 33-7 Mtodos de depuracin de clulas madre Seleccin positiva Seleccin de clulas CD34. Columnas en fase slida Esteras magnticas Seleccin negativa Farmacolgicos 4-hidroperoxiciclofosfamida (4-HC) Etopsido (VP-16) Inmunolgicos Clulas tumorales + AcMo + toxina" Clulas tumorales + AcMo + lase slida" T o x i n a = complemento ricino, oros '" Fase slida = esleras magnticas.

CAPTULO 33

A L M A C E N A M I E N T O DE TEJIDOS Y CLULAS M A D R E

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Tabla 33-8 Mtodos de deplecin de linfocitos Leclinas Lectina de soja con formacin de rosetas E Centrifugado a contracorriente Inmunolgicos Anticuerpos + complemento Anticuerpos + lase slida Seleccin positiva

dios ms recientes tambin han demostrado un papel de las clulas asesinas naturales (NK) en la reaccin "injerto contra leucemia". Otros han empleado combinaciones de tcnicas como la seleccin de CD34+ y dilucin a contracorriente para crear dos poblaciones celulares, una rica en clulas CD34+ y otra rica clulas N K con deplecin de clulas T, aprovechando el hecho de que las clulas N K parecen tener efecto antitumoral pero no contribuyen a la GVH (Skiera, 1999).

Criopreservacin de injertos hematopoyticos


Los injertos de CMH de origen autognico y muchas muestras alognicas se criopreservan y almacenan antes de su uso. El protocolo ms frecuente utiliza DMSO al 10% como agente protector, congelacin a ritmo controlado y almacenamiento en nitrgeno liquido, tanto en fase liquida como vapor. El uso de DMSO proporciona una importante mejora en la viabilidad tras la descongelacin frente a agentes como el glicerol. Dado que existe una toxicidad asociada con la infusin de productos de clulas madre con DMSO, otros investigadores se han dirigido al uso de bajas concentraciones, adicin de hidroxietilalmidn u otros aditivos, pero el DMSO se sigue usando en la mayora de los programas. Al intentar lavar los productos despus de la descongelacin para reducir la cantidad de DMSO presente, se produjo una prdida significativa de clulas madre. Las estrategias se dirigen en ese momento a reducir el volumen del producto antes de su congelacin, reduciendo de esta forma la cantidad necesaria de DMSO.

La dilucin a contracorriente es un mtodo utilizado para la deplecin de clulas T que utiliza la separacin caracterstica de clulas en un campo de centrifugado, de acuerdo con el tamao y densidad de las diversas poblaciones celulares. Una de las ventajas del sistema es que no se aaden agentes quimioterpicos o anticuerpos a la poblacin de clulas madre hematopoyticas, por lo que no se deteriora su funcin celular. Los concentrados de capa leucoctica a partir de mdula sea se introducen en la centrfuga a diferentes velocidades de giro, permitiendo la recogida de fracciones celulares de diferentes tamaos y densidades. El sistema posee una alta eficiencia en la separacin de la fraccin rica en CFU-GM de la fraccin de linfocitos CD3+. Como no se provocan cambios en las clulas, la fraccin CD3+ puede ser cuantificada y parcialmente aadida de nuevo a la faccin CFU-GM para proporcionar una dosis controlada de clulas CD3+. si se desea clnicamente (Noga, 1990). La recuperacin celular es alta y. como los medios de dilucin son biocompatibles. los productos se pueden redifundir sin etapas de lavado adicional. La principal desventaja del procedimiento es el coste del equipo necesario y la necesidad de personal experimentado. La introduccin de tcnicas con esferas inmunomagnticas para la seleccin positiva de clulas CD34+ ha llevado al uso de estas tcnicas en el trasplante alognico para la deplecin resultante de clulas T CD3+, en especial de muestras obtenidas de clulas madre de sangre perifrica. La tecnologa con esferas inmunomagnticas se aplica con facilidad a las clulas madre obtenidas por hemafresis as como a los productos de mdula sea de gran volumen. Muchos centros han comunicado xitos con estos nuevos mtodos en la reduccin de clulas T CD3+ en trasplantes alognicos. en especial cuando donante y receptor no son totalmente HLA-compatibles (HensleeDowney, 1997). Otra ventaja adicional tanto de las tcnicas de depuracin como de seleccin positiva es que ambas producen un volumen significativamente inferior de clulas madre para congelacin, recuperacin y reinfusin al paciente. Esto reduce de forma importante la toxicidad asociada con la difusin de productos que contienen DMSO, al tiempo que reduce los costes derivados de la congelacin y almacenamiento para el laboratorio de clulas madre. En el momento actual, las tcnicas autorizadas para la depuracin y/o seleccin positiva para reducir la contaminacin por clulas tumorales son costosas, y se necesitan datos adicionales para valorar la eficacia clnica de estos procedimientos en la reduccin de clulas tumorales. Algunos centros han comunicado un mejor pronstico mediante el empleo de una combinacin de ambas, depuracin y tcnicas de seleccin positiva (Clarke, 1998). Las tcnicas de seleccin tanto positiva como negativa producen una prdida concomitante de hasta un 50% en el nmero original de clulas CD34+, tanto por toxicidad de diversos agentes (quimioterpicos, complemento), atrapamiento de complejos en esferas magnticas, o prdida durante etapas necesarias de lavado. Para solucionar este problema, el nmero de clulas CD34+ recogidas en la hemafresis inicial y en la extraccin de mdula sea debe aumentarse para contrarrestar la prdida posterior durante el procesado. Esto puede ser difcil de cumplir en pacientes que son difciles de "movilizar". La principal desventaja de la deplecin de clulas T es el aumento resultante en la incidencia de recidivas. Los pacientes con formas leves de GVH parecen tener una menor incidencia de recidiva que aquellos pacientes que no muestran GVH. La presencia de la poblacin de clulas T del donante parece ser crtica en la reaccin "injerto contra leucemia", en el reconocimiento de los antigenos del husped por las clulas del donante que genera una respuesta inmune que elimina las clulas tumorales de husped. Estu-

Reinfusin de productos de clulas madre


Independientemente de la fuente del injerto de clulas madre, las CMH se infunden al paciente de forma similar a la transfusin de cualquier producto sanguneo. Las clulas madre pluripotenciales. dotadas d e un receptor de membrana nico, se dirigirn al espacio medular, reinjertndose y replicndose. Los productos que han sido criopreservados con DMSO, en su mayor parte son descongelados e inmediatamente remfundidos sin lavar. Las CMH recogidas por hemafresis sin procesado ulterior pueden contener gran cantidad de eritrocitos. La criopreservacin con DMSO no conserva la integridad de la membrana del glbulo rojo, por lo que estos productos contienen una gran cantidad de hemoglobina libre cuando se recuperan. Las reacciones en el receptor oscilan desde leves caracterizadas por nusea, escalofros o cefalea, hasta reacciones ms graves, que pueden incluir hipotensin, sepsis, insuficiencia renal o incluso parada cardaca (Stroncek, 1991). Estas reacciones se muestran en la Tabla 33-9. Los receptores de clulas madre criopreservadas generalmente reciben premedicacin con antihistaminicos y/o antiemticos. Tambin la hidratacin y el uso de diurticos estn indicados para reducir los efectos secundarios producidos por la administracin de hemoglobina libre y el volumen de lquido infundido.

Tabla 33-9 Reacciones adversas observadas en pacientes transfundidos con productos de clulas madre criopreservadas Frecuentes Escalofros Nuseas Vmitos Fiebre Cefalea Disnea Inlrecucntes Insuficiencia renal Parada cardiaca Hipotensin Sepsis Factores asociados Volumen de tejido reinfundido Tipo y cantidad de crioprotector reinlundido Volumen de eritrocitos incompatibles (productos alognicos) Contaminacin bacteriana

814 BIBLIOGRAFA

SECCIN IV

HEMATOLOGA, COAGULACIN Y MEDICINA TRANSFUSIONAL

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S E C C I N

Inmunologa e inmunopatologa
Richard A. McPherson, M.D. John Bernard Henry, M.D.

C A P T U L O

34

" Visin general del sistema inmune y de los trastornos nmunolgicos


RICHARD A. MCPHERSON, M.D. CLULAS LINFOIDES Linfocitos T Linfocitos B Clulas presentadoras de antgeno Clulas NK CLULAS NO LINFOIDES Neutrfilos y eosinfilos Basfilos y mastocitos FACTORES HUMORALES Inmunoglobulinas Complemento Citocmas 819 819 817 ANTGENOS DE HISTOCOMPATIBILIDAD MECANISMOS DE DAO INMUNOLGICO APLICACIONES CLNICAS DEL ANLISIS INMUNOLGICO BIBLIOGRAFA 820 820 820 820

El sistema inmunolgico est estructurado para reconocer, responder y destruir a una amplia variedad de organismos invasores como las bacterias, virus, hongos y parsitos, que de otro modo, seran capaces de promover infecciones dainas para el cuerpo. El descubrimiento de los componentes del sistema inmune a menudo ha venido del estudio de infecciones serias y de las reacciones especficas que emplea el cuerpo para combatir los organismos patgenos. En general, esta funcin inmunolgica se puede resumir como la bsqueda de antigenos extraos que no pertenecen al cuerpo y su destruccin. En este proceso, el sistema inmune mantiene una vigilancia de la aparicin de antgenos nuevos extraos en clulas tumorales y trata de destruirlas dejando ilesos los antgenos normales presentes en clulas sanas. Los estados de enfermedad pueden surgir debido a que diversos aspectos de la funcin inmunolgica se vean afectados. stos incluyen reacciones de hipersensibilidad, varias inmunodeficiencias, trasplantes alognicos de rganos o tejidos, la enfermedad de injerto contra husped: la bsqueda de la tolerancia en los trasplantes contina. Este capitulo resalta los componentes del sistema inmune y sus funciones y algunas de las afecciones clnicas de la inmunidad mas significativas.

Linfocitos T
Los linfocitos T se diferencian en el timo. Tras su origen en la mdula sea, pasan de la corteza a la mdula timica y durante este proceso sufren la maduracin. Este proceso implica una seleccin, de modo que las clulas que reaccionan con antgenos propios se eliminarn, mientras que s e retienen otras clulas capaces de reconocer antgenos mediante interacciones con molculas del complejo de histocompatibilidad (MHC) (von Boehmer, 1994; Nossal. 1994). Los linfocitos T constituyen entre un 60% y un 70% de todos los linfocitos en la sangre, y se encuentran tambin en zonas paracorticales de ganglios linfticos y dentro de las vainas periartenolares del bazo. Durante su maduracin, sufren una programacin gentica, en la cual el gen para el receptor de antgeno de la clula T (TCR) se reordena para dar receptores proteicos que son invariantes en su especificidad antignica, durante toda la vida de ese linfocito y de sus clulas descendientes. La mayora (>95%) de los linfocitos T tienen receptores de antgeno compuestos por subunidades u y |5 unidas por puentes disulluro, formando un heterodmero que se encuentra en la membrana exterior asociado al complejo molecular CD3 (CD3 es un marcador para clulas T). Las subunidades proteicas </. y \i del TCR poseen regiones variables, de unin y constantes (la cadena a tambin contiene una regin de diversidad), con sus correspondientes secuencias en el gen del TCR, el cual sufre un reordenamiento que produce una elevada especificidad en la unin de un determinado antgeno. Las protenas CD3 asisten en la Iransduccin de la seal al interior de la clula cuando un antgeno se une al TCR en la superficie linfocitana (Janeway. 1994; Weiss. 1994). Un pequeo porcentaje de linfocitos T presentan un TCR compuesto por subunidades y y que interaccionan de forma similar con CD3: estas clulas se encuentran generalmente en la superficie de mucosas de los tractos grastrointestinal y respiratorio. Las proliferaciones de clulas T se pueden dividir en neoplsicas (clnales) o benignas (policlonales). segn su ADN muestre de forma predominante una sola forma de reordenamiento

CLULAS LINFOIDES
Las clulas linfoides del cuerpo incluyen las clulas de los ganglios linfticos, bazo, clulas de las superficies mucosas y clulas circulantes de la sangre. Derivan de clulas madre hematopoyticas multipotentes. que se producen progresivamente desde el saco vitelino en el embrin, al hgado en el feto, y la mdula sea en el nio y durante las fases adultas (Weissman, 1994). Las diferentes clulas linfoides se identifican por la presencia de marcadores proteicos nicos presentes en su superficie y que permiten a esas clulas desempear determinadas funciones.

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SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA

gnico de su TCR, o un espectro completo de estos reordenamientos, tal y como ocurre normalmente en una poblacin linfocitaria heterognea. El anlisis de linfocitos T mediante citometria de flujo emplea una variedad de marcadores de superficie. El CD4 se encuentra en un 60% de clulas CD3-; estos son linfocitos T cooperadores/inductores que dirigen la funcin de otras clulas del sistema inmune secretando citocinas que estimulan varias funciones. Existen dos subpoblaciones de clulas CD4+: T 1, que secreta interleucma 2 (IL-2) e interfern-y (IFN-y); y T2. que secreta IL-4 e IL-5. Las clulas T1 facilitan las actividades de los macrfagos como la hipersensibilidad y la produccin de anticuerpos con accin opsonizante; las clulas T,,2 dirigen la sntesis de otros anticuerpos: El marcador CD8 se encuentra en un 30% dlas clulas T (asi, la relacin de clulas CD4 y CD8 en sangre es tpicamente 2:1). Estas clulas T CD8+ presentan actividad citotxica y supresora en la respuesta inmune.
H

clulas B se produce tanto en la mdula sea, donde tiene lugar una seleccin negativa y positiva, como en localizaciones perifricas. La estimulacin antignica de las clulas B desencadena la formacin de clulas plasmticas que secretan inmunoglobulinas como base de la especificidad en la inmunidad humoral. El complejo receptor de antigeno de la clula B utiliza la inmunoglobulina M (IgM) como componente de unin al antgeno. La especificidad antignica de las inmunoglobulinas deriva del proceso de reordenamiento, en el que tanto la cadena pesada como la ligera se reestructuran. La cadena pesada se divide en regin variable, de diversidad, de unin y constante, mientras que el gen de la cadena ligera tiene regiones variables, de unin y constantes. La maduracin de la respuesta mediada por anticuerpos implica el cambio de IgM a otra cadena pesada (normalmente IgG) debido a otro reordenamiento gnico, aunque el tipo de cadena ligera de una clula B permanece fijado. Las clulas B tambin presentan en su superficie receptores para el complemento (CD21. que es tambin el receptor para el virus de Epstein-Barr [EBV] y hace que estas clulas sean susceptibles de una infeccin por EBV) y para la regin Fe de las inmunoglobulinas: tambin presentan COI9 y CD20. que se usan a menudo para la identificacin inmunolgica de las clulas B.

El mecanismo de reconocimiento antignico es diferente entre los dos subtipos de linfocitos T. Las molculas CD4 se unen a las molculas de MHC de clase II presentes en las clulas presentadoras de antigeno, mientras que las molculas de CD8 interaccionan con molculas de MHC de clase I. De acuerdo con esto, las clulas CD4+ reconocen antigenos slo en el contexto de MHC de clase II, y las clulas CD8+ los reconocen slo a travs de MHC de clase I.

Clulas presentadoras de antgeno Linfocitos B


Los linfocitos B constituyen aproximadamente entre un 10% y un 20% de los linfocitos perifricos en sangre, y adems se pueden encontrar en la mdula sea, ganglios linfticos, bazo y otros tejidos linfticos. En el bazo y ganglios se agregan para formar los folculos Imfoides. La diferenciacin de Los macrfagos funcionan como fagocitos mononucleares en procesos de inflamacin, y tambin procesan los antgenos ingeridos y los presentan asociados a molculas de MHC en su superficie (Fig. 34-1). Las clulas T no se activan con antgenos solubles y. por tanto, la presentacin de antgenos de este modo es necesaria para la estimulacin de clulas T y la induccin de la

Figura 34-1. Interacciones celulares del sistema inmune. Las clulas presentadoras de antigeno (APC) procesan antigenos (Ag) extemos o miemos y presentan los fragmentos peptdicos del antgeno, asociados a una molcula de MHC, a las clulas T . En la clula T, un TCR especfico, junto con el correceptor CD4 o CD8. reconoce el complejo antigeno-MHC. La activacin celular tiene lugar a travs del complejo CD3 y la activacin de tirosin-cmasas (TK). El receptor de la clula B est compuesto por una molcula de Ig unida a la m e m b r a n a que se encuentra formando un complejo con otras protenas de membrana, y el correceptor CD19/21. Cuando se produce el reconocimiento antignico. las T K celulares tambin se activan. La activacin coeslimuladora de clulas T o B la proporcionan los receptores celulares al unirse a sus ligandos (los ligandos B7 o B7.2 para la coestimulacin de la clula T a travs de las molculas CD28 y CTLA-4. y el ligando gp39 para la molcula CD40 de la clula B). (Adaptado de Paul W, Seder R: Lymphocytic responses and cytokines. Cell 1994; 76:229; y Weiss A. L i t t m a n D: Signal transduction by lymphocyte antigen receptors. Cell 1994; 76:263, con permiso).

CAPTULO 34

VISIN GENERAL DEL SISTEMA INMUNE Y DE LOS TRASTORNOS I N M U N O L G I C O S

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inmunidad celular (Germain, 1994). Los macrfagos tambin secretan citocinas como la IL-1 para modular los procesos inflamatorios, y pueden lisar directamente clulas tumorales en su papel de inmunovigilancia. y adems, son tambin clulas efectoras en algunos tipos de inmunidad celular (por ej. la hipersensibilidad retardada). Las clulas dendriticas (que se encuentran en tejidos linfoides y regiones intersticiales de otros rganos) y las clulas de Langerhans (presentes en la epidermis) poseen numerosas extensiones citoplasmticas enriquecidas en molculas de MHC de clase II. Por tanto, son muy eficientes en la presentacin antignica (aunque probablemente no sean fagocrticas) y se consideran muy importantes para esta funcin en todo el sistema inmune.

Clulas NK
Las clulas N K (linlocitos citoliticos naturales) constituyen un 10%-15% de los linfocitos en sangre perifrica. No son clulas T ni B y anteriormente se las llam a b a clulas nulas. Las clulas N K tienen la funcin de lisar otras clulas sin necesidad de una previa sensibilizacin. Pueden atacar clulas tumorales. infectas con virus y otras; por tanto, forman la defensa inicial frente a clulas aberrantes. Las clulas N K se caracterizan por los marcadores de superficie CD16 y CD56, los cuales se emplean habitualmente para su identificacin. CD16 es el receptor para la regin Fe de la IgG y por tanto las clulas N K son capaces de lisar selectivamente aquellas clulas que se encuentran recubiertas de anticuerpos (citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos [ADCC: antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity], importante en algunas reacciones de hipersensibilidad). Las clulas N K tambin secretan cilocinas como el IFN-y. Curiosamente, las clulas N K se pueden reconocer en una preparacin de un frotis de sangre tenido, c o m o linfocitos grandes y granulosos.

linas en sangre son la IgM, IgG y la IgA: estos anticuerpos provienen de la exposicin continuada a multitud de antgenos extraos y pueden permanecer durante aos mediante una secrecin continuada para sustituir a aquellas molculas que se pierden mediante la limpieza normal de protenas circulantes. En las superficies mucosas, el principal tipo de anticuerpo es la IgA en una forma dimrica especial que resulta de su secrecin a ese lugar (vase Captulo 37). Las otras inmunoglobulinas son la IgD (que reside en la superficie de clulas B donde puede estar involucrada en la transduccin de la seal inmunolgica. pero no adquiere concentraciones importantes como molculas libres en la sangre) y la IgE (que funciona a travs de su unin a la superficie de basfilos y estimula la secrecin de sustancias vasoactivas de esas clulas en presencia de alrgenos especficos). Las inmunoglobulinas de la sangre funcionan unindose a los antigenos invasores en la superficie de clulas extraas, bacterias, virus, etc. y facilitando su destruccin mediante efectores inespecficos como el complemento y las clulas NK. La monitonzacin de enfermedades mediante el anlisis de inmunoglobulinas incluye un anlisis cualitativo para la deteccin clonal frente a la policlonal (p. ej., para el diagnstico de mieloma mltiple) y anlisis cuantitativo tanto para concentraciones totales de IgM, IgG e IgA (para detectar posibles deficiencias selectivas o combinadas o la sobreproduccin de tipos de inmunoglobulinas) y para ttulos de anticuerpos especficos frente a antigenos individuales (como las isohemaglutininas, neumococos, Haemophilus. ttano, difteria u otros microorganismos)

Complemento
Este conjunto de protenas que interaccionan entre si tiene el papel de destruir enzimticamente las dianas (p. ej.. clulas, bacterias) a las que les dirigen los anticuerpos u otros medios (vase Captulo 38). La medida de los componentes del complemento tiene dos utilidades fundamentales en el diagnstico clnico: detectar deficiencias congnitas (que son relativamente infrecuentes) que pueden suponer una predisposicin a ciertas enfermedades como infecciones o la progresin hacia enfermedades autoinmunes) y para detectar reducciones adquiridas que reflejan una actividad en el momento de anlisis de una enfermedad autoinmune sistmica como puede ser el lupus eritematoso sistmico.

CLULAS NO LINFOIDES
Estas clulas no estn programadas genticamente para reconocer antgenos especficos o interaccionar con clulas linfoides en la induccin de una respuesta inmune. En su lugar, son electores de reacciones inmunes desencadenadas por diversos factores.

Neutrfilos y eosinfilos
Los neutrfilos llegan a las regiones de inflamacin por la accin de quimioatrayentes; entonces vierten sustancias txicas y enzimas de sus granulos que digieren indiscriminadamente estructuras celulares; los neutrfilos tambin ingieren restos celulares al igual que los eosinfilos. retirndolos de los tejidos.

Citocinas
Estas sustancias solubles son el medio por el que se regulan las respuestas inmunes celulares; son mediadores que actan a corto plazo y que son elaborados por algunas clulas y difunden a otras clulas donde actan (Paul, 1994). Muchas citocinas son pleiotrpicas en el sentido de que pueden aduar sobre muchos tipos celulares diferentes. Pueden actuar de forma endocrina estimulando clulas a una cierta distancia; pueden actuar sobre clulas que se encuentran en el espacio inmediato (estimulacin paracrina); tambin pueden estimular a las propias clulas que las han secretado (autocrina). Las acciones especficas de las citocinas incluyen la hematopoyesis mediante los factores estimulantes de colonias (CSFs) que inducen la produccin de granulocitos y macrfagos. respuestas de inmunidad natural (mediante IL-1. factor de necrosis tumoral-i/ [TNF-u], interferones e IL-8), estimulacin de la multiplicacin y activacin de linfocitos (mediante IL-2 y otros), y la activacin inespecifica de clulas inflamatorias (vase Captulo 39). Todava se estn descubriendo nuevas citocinas a medida que van apareciendo ms detalles sobre la comunicacin clulaclula. El uso clnico de las citocinas incluye tanto la supresin de la respuesta inmune en el trasplante de rganos alognico mediante frmacos como la ciclosponna que inhibe la produccin de IL-2, y la estimulacin de la respuesta inmune en terapias frente al cncer o a infecciones. Estos ltimos tratamientos son en su mayora experimentales, aunque trabajos recientes han demostrado que el pretratamiento con anticuerpos frente al TNF-u puede prevenir las reacciones de Jarisch-Herxheimer que resultan del tratamiento con antibiticos de infecciones de Borrelia recurrentis en ovejas (Fekade. 1996). Este modelo probablemente presagia un conjunto de nuevas terapias mediante las cuales las respuestas inmunes se estimularn o inhibirn selectivamente de acuerdo con las necesidades clnicas concretas.

Basfilos y mastocitos
Los basfilos (y su equivalente en los tejidos, los mastocitos) presentan en su superficie receptores que se unen a IgE. La unin de IgE en la membrana de los basfilos no es especfica del antgeno que reconoce la IgE. sino que es el resultado de la suma de la accin de la cantidad total de IgE y los basfilos disponibles. Cuando el antgeno (o alrgeno) entra en contacto con su IgE especifica presente en la superficie del basfilo. la clula se activa y secreta sustancias como las histaminas que median algunas hipersensibilidades. Asi, la especificidad de un basfilo est dirigida por la IgE que tiene unida a su superficie desde la sangre; tericamente, un basfilo podra tener mltiples molculas de IgE diferentes en su superficie y podra, por tanto, reaccionar con muchos alrgenos diferentes.

FACTORES HUMORALES Inmunoglobulinas


Las molculas de anticuerpo pueden estar unidas a la superficie de clulas B para estimular la secrecin de ms inmunoglobulinas: tambin pueden circular por la sangre y aparecer en las superficies mucosas de los tractos respiratorio y gastrointestinal, donde es probable que entren en contacto con microorganismos patognicos. Las principales inmunoglobu-

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SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOIOGA

ANTGENOS DE HISTOCOMPATIBILIDAD
El MHC (tambin denominado complejo antignico leucocitario humano. HLA) se encuentra codificado en el cromosoma 6 e incluye molculas de la Clase I (HLA A, B y C). molculas de la Clase II (HLA DP. DQ. y DR) y las molculas de la Clase III que incluyen algunos componentes del sitema del complemento y el TNF-u y TNF-|i (vase Captulo 40). Las funciones de los antigenos de las clases I y II ya se han analizado brevemente en cuanto a su participacin en la presentacin antignica a clulas T. Estos antgenos fueron descubiertos y su naturaleza altamente polimrfica fue descrita en esludios de tolerancia inmunolgica y en el rechazo de trasplantes de rganos alognicos. En consecuencia, una de las utilidades clnicas ms importantes del tipo HLA reside en el emparejamiento de donantes potenciales de rganos o tejidos con receptores que necesitan dicho trasplante. Otra aplicacin clnica significtiva es el tipo de pacientes afectados y de miembros de sus familias para establecer el riesgo de desarrollar algunas enfermededades que se encuentran asociadas a tipos de HLA concretos (p. ej., la espondilitis anquilosante con HLA B27) (vase Captulo 41). Otra aplicacin ms del tipo HLA es el suministro de plaquetas compatibles a pacientes que se han hecho refractarios a las transfusiones de plaquetas debido a la formacin de anticuerpos anti-HLA tras ser expuestos a mltiples donantes (p. ej., tras las transfusiones de apoyo empleadas en los casos de quimioterapia o trasplantes de clulas progenituras hematopoyticas (HPC) (vase Captulo 31).

te a virus, hongos, protozoos, parsitos y tambin microbios intracelulares como mycobacterias. Los pacientes con el sndrome de la mmunodeficiencia adquirida (sida) son susceptibles a infecciones por estos y otros agentes oportunistas cuando pierden sus clulas T CD4+.

APLICACIONES CLNICAS DEL ANLISIS INMUNOLGICO


Las principales reas de aplicacin clnica de los ensayos inmunolgicos son las enfermedades autoinmunes, el trasplante de rganos/tejidos y su rechazo, las inmunodeficiencias y las alergias La enfermedad autoinmune puede ser sistmica (vase Capitulo 43), estar restringida a rganos especficos (vase Captulo 45) o puede implicar vasculitis (vase Captulo 44). Muchos de los ensayos se basan en tcnicas que emplean anticuerpos antinucleares seguido de un ensayo confirmatorio con autoantigenos especficos como puede ser el ADN de doble hebra. Otros autoanticuerpos se pueden identificar mediante ensayos de inmunofluorescencia indirecta que emplean secciones de rganos para identificar autoanticuerpos especficos como aquellos que se dirigen frente al msculo liso, mitocondnas. clulas parietales y dems. Los avances tecnolgicos han proporcionado fuentes purificadas de muchos autoantgenos importantes que formarn parte de ensayos futuros para autoanticuerpos ms especficos y que permitan una automatizacin ms eficaz. La terapia inmunosupresora para el rechazo de trasplantes alognicos y las mmunodeficiencias se basan en la bsqueda de subpoblaciones linfocitarias con una particular importancia de las clulas T y de las CD4+. Ademas, los estados de inmunodeficiencia congnita requieren un anlisis ms detallado de los elementos celulares y humorales del sistema inmune, comenzando generalmente con una batera de ensayos convencionales para analizar la presencia y (uncin de linfocitos. inmunoglobulinas y complemento, y pasando, cuando es necesario, a ensayos muy esotricos en la bsqueda de desrdenes menos frecuentes (vanse Captulos 36 y 42).

MECANISMOS DE DAO INMUNOLGICO

Las respuestas inmunologas pueden daar tejidos normales adems de los organismos invasores que han desencadenado una respuesta. Estas respuestas se clasifican en cuatro tipos de hipersensibilidad. El tipo I es de naturaleza anafilctica o alrgica: est mediada por la IgE unida a la superficie de basfilos y mastocitos. Cuando antgenos especficos (o alrgenos) se unen a la IgE de superficie, los basfilos se estimulan y liberan la histamina y otras Los trastornos alrgicos se evalan tpicamente a travs de ensayos en la sustancias vasoactivas que son los mediadores inmediatos de las reacciones piel, medida de la concentracin total de IgE en suero, y la cuantificaaon d e alrgicas. Estrategias clnicas para el tratamiento de asma y alergias han la reactividad especfica de la IgE en suero con alrgenos comunes de la empleado distintos aspectos de la secuencia de eventos, desde contrarrestar comida, el polen y otros factores ambientales (vase Capitulo 46). los efectos de la histamina hasta la desensibilizacin. Un estudio reciente A medida que surjan nuevos descubrimientos sobre las funciones inmunoemple con xito un anticuerpo monoclonal humanizado frente a la IgE para lgicas y aparezcan nuevas terapias, los laboratorios de diagnstico clnico el tratamiento de estos individuos (Milgrom, 1999): esta terapia podra, en el probablemente tengan la oportunidad de ofrecer medidas de muchos mas futuro, basarse en parte sobre las medidas de la concentracin de IgE en factores y actividades, para establecer diagnsticos correctos y monitorizar y suero. ajustar los tratamientos. El tipo II ocurre cuando los anticuerpos se unen a antgenos presentes en la superficie celular; el dao puede ocurrir mediante la unin y activacin del complemento (p. ej., hemolisis inmune), mediante la citotoxicdad BIBLIOGRAFA celular dependiente de anticuerpos (p. ej.. la lisis de clulas tumorales o de parsitos) o interferencia con funciones celulares por parte de los antiFekade D. K n o x K. Hussein K, et al: Prevention ol Jansch-Herxheimer reactions Dy treatment with antibodies against t u m o r necrosis lactor c. N Engl J M e d 1996: cuerpos (p. ej., autoanticuerpos frente a los receptores de acetilcolina en la 335:311. miastenia gravis). Germain R: MHC-dependent antigen processing and peptide presentation ProviEl tipo III resulta de la formacin de inmunocomplejos, entre antgenos exding ligands for T lymphocyte activation. Cell 1994. 76:287. J a n e w a y C. Bottomly K: Signis and signs for lymphocytic responses. Cell 1994: genos como bacterias o virus y anticuerpos; o entre autoantgenos endge76:275. nos y autoanticuerpos. El dao tisular tpico ocurre en rganos que contienen Milgrom H. F i c k RB. Su JO, et al. Treatment of allergic a s t h m a with monoclonal antinumerosos vasos sanguneos pequeos donde los inmunocomplejos circuIgE antibody N Engl J M e d 1999. 341:1966 lantes se depositan o en lugares donde se producen de forma natural los anti- Nossal G: Negative selection of lymphocytes Cell 1994; 76:229 Paul W, Seder R. Lymphocyte responses and cytokines. Cell 1994; 76:241 genos endgenos. von B o e h m e r H: Positive selection of lymphocytes Cell 1994: 76:219. El tipo IV est mediado por clulas, tambin se denomina hipersensibilidad Weiss A. Littman D: Signal Iransduction by lymphocyte anligen receptors. Cell 1 9 9 4 ; retardada, y depende del funcionamiento de las clulas T CD4+ o de la cito76:263. toxicidad de clulas T CD8+. El tipo IV es la base de la reaccin inmune frenWeissman I: Developmental switches in the i m m u n es y s t e m Cell 1994; 76:207.

CAPTULO

35

Inmunoensayos e inmunoqumica
Yoshihiro Ashihara, Ph.D. Yasushi Kasahara, Ph.D., D.M.Sc. Robert M. Nakamura, M.D.
INMUNOENSAYOS E INMUNOQUMICA Caractersticas generales de la reaccin antgeno-anticuerpo Caractersticas de los antgenos Caractersticas de los anticuerpos Cintica de la reaccin antigeno-anticuerpo VISIN GLOBAL DE LOS PRINCIPIOS GENERALES DE LOS INMUNOENSAYOS Tipos de inmunoensayos Qumica de conjugacin Caractersticas de la fase slida INMUNOENSAYOS DE PRECIPITINA Y NEFELOMTRICOS Origen y principios de la reaccin de precipitina INMUNOENSAYOS DE PARTCULAS Principio de aglutinacin de partculas Resumen RADIOINMUNOENSAYO Origen Principios y mtodos del ensayo Resumen INMUNOENSAYO ENZIMTICO Origen y clasificacin Inmunoensayos enzimticos heterogneos Inmunoensayos enzimticos homogneos Resumen INMUNOENSAYO FLUORESCENTE Origen y clasificacin Inmunoensayo fluorescente heterogneo Mtodo fluoroinmunomthco 839 833 830 825 824 823 821 Ensayo inmunofluoromtrico por particin radial Fluoroinmunoensayo en tiempo real Inmunoensayo fluorescente homogneo Ensayo de polarizacin de la fluorescencia Inmunoensayo de transferencia de la fluorescencia de excitacin Inmunoensayo de fluorescencia protegida INMUNOENSAYO QUIMIOLUMINISCENTE Origen Inmunoensayo quimioluminiscente usando esteres de acridinio como marcadores Inmunoensayo electroquimioluminiscente AUTOMATIZACIN INSTRUMENTAL Y MODULACIN DE LOS SISTEMAS DE ENSAYO Sistemas de ensayo homogneos Sistemas de inmunoensayo heterogneos Secuencia prctica del inmunoensayo en el sistema analtico Instrumentacin y puntos clave para un inmunoensayo heterogneo Nuevos sistemas para la prxima generacin (sistemas modulares) SISTEMAS DE ENSAYO SIMPLES Y RPIDOS PARA SU USO EN LOS PUNTOS DE ATENCIN AL PACIENTE 845 Origen Instrumentos de ensayo de flujo (instrumentos de ensayo por inmunofiltracin) Tiras reactivas Instrumentos inmunocromatogrficos Resumen BIBLIOGRAFA 848 842 841

INMUNOENSAYOS E INMUNOQUMICA Caractersticas generales de la reaccin antgeno-anticuerpo


Los ligandos inmunolgicos se basan en la afinidad entre molculas, como la enzima y el sustrato, la hormona y su receptor, el antgeno y el anticuerpo, y juegan un papel importante en los seres vivos. Las caractersticas de reconocimiento especfico de los inmunoensayos (reacciones antgeno-anticuerpo) han pasado a ser ampliamente utilizadas c o m o herramientas analticas, a pesar de la amplia gama de mtodos disponibles para el anlisis clinico en un laboratorio.

Los inmunoensayos se pueden utilizar para la deteccin tanto de antigeno como de anticuerpos. Para la deleccin de antigenos, el anticuerpo especfico correspondiente debe prepararse como uno de los reactivos. Lo contrario se aplica para la deteccin de anticuerpos. La sensibilidad de los inmunoensayos se ha mejorado mediante el desarrollo de nuevos tipos de sistemas para la deteccin de la seal y la tecnologa de fase slida. Los inmunoensayos se han optimizado para detectar menos de 0,1 pg.'ml de antgeno presente en la sangre. Se pueden aplicar a la deteccin de haptenos como molculas pequeas: protenas y complejos proteicos como las macromolculas: y tambin para cualquiera de los anticuerpos frente a alrgenos, agentes infecciosos y antigenos autlogos.

822

SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGIA

Caractersticas de los antigenos


Los antgenos se pueden definir como cualquier sustancia que puede representar sitios antignicos (eptopos) para producir los correspondientes anticuerpos, desde molculas pequeas como los haptenos y hormonas, hasta macromolculas como protenas, glcoprotenas, glicolipidos y otros productos naturales. Algunos compuestos qumicos artificiales tambin pueden ser antgenos actuando como haptenos. Los antgenos deben tener al menos un epitopo. Los epitopos que pueden ser reconocidos por anticuerpos incluyen secuencias de aminocidos de peptidos presentes en protenas y estructuras proteicas de grandes dimensiones como los sitios neoantigenicos.

2. La produccin de anticuerpos monoclonales puede producir una cantidad ilimitada de reactivo homogneo con una afinidad y especificidad m u y constante. 3. Los anticuerpos monoclonales se pueden preparar mediante la inmunizacin con un antgeno sin purificar. Los anticuerpos monoclonales presentan ciertas limitaciones para su uso. que son las siguientes: 1. Reactividad insuficiente para la precipitacin o aglutinacin debido a que la formacin del entramado del inmunocomplejo es dbil o no ocurre cuando se emplean anticuerpos monoclonales. 2. Los antigenos con mltiples eptopos heterogneos son ms difciles de caracterizar inmunoqumicamente con un solo anticuerpo monoclonal.

Caractersticas de los anticuerpos


La inmunoglobulma. una protena plasmtica importante, se refiere a anticuerpos en el contexto de funciones biolgicas de inmunoglobulmas especficas de antgeno. Los anticuerpos, por tanto, se producen en respuesta a estimulaciones antignicas. Los anticuerpos se componen de molculas funcionales y heterogneas que unen antgenos mediante un dominio de unin al antigeno. Hay cinco tipos (isotipos) de inmunoglobulina: IgG, IgM. IgA. IgD e IgE. La IgG a su vez se divide en cuatro subtipos, y tanto la IgA como la IgM presentan dos subgrupos. Todas las molculas de anticuerpo conocidas presentan una cadena pesada con una cadena ligera K- O /.. La estructura molecular de los anticuerpos se compone de regiones constantes y regiones variables. El dominio hipervarable (sitio de unin al epitopo) puede ensamblarse para interaccionar con una amplia variedad de eptopos (determinantes antignicos). En un laboratorio de medicina se pueden distinguir dos categoras de anticuerpos: anticuerpos como reactivos o anticuerpos como analitos. Los anticuerpos como analitos a menudo se clasifican por los subtipos IgG. IgM o IgA. Los anticuerpos como reactivos se preparan a partir de antisueros obtenidos a travs de la inmunizacin con un antgeno purificado.

Produccin de anticuerpos mediante tecnologa recombinante


Skerra y cois. (1998) han desarrollado un sistema de expresin para el fragmento F de los dominios variables de un anticuerpo especifico para la tosforilcolina empleando tecnologa recombinante en Escherichia col. Esta tcnica hace posible producir un anticuerpo quimrico fusionado con una enzima. Ha aparecido una tcnica lamada phage display (una traduccin podra ser muestra de fagos) para la produccin de anticuerpos (Wmter. 1994). En este mtodo fragmentos de anticuerpo de una especificidad de unin previamente determinada se construyen de un repertorio de genes V de anticuerpo, eliminando asi la necesidad de inmunizacin y generacin de hibridomas. Los genes V se pueden ensamblar in vilro. El fago seleccionado del repertorio por unin al antgeno y los fragmentos de anticuerpo se expresa en bacterias infectadas Adems, la afinidad de la unin de los anticuerpos se mejora mediante mutacin. En un futuro prximo esta tcnica permitir el uso de anticuerpos especficos de alia avidez.
v

Anticuerpos

policlonales Cintica de la reaccin antigeno-anticuerpo


Determinados aspectos del equilibrio o de la ley de accin de masas de la qumica se pueden aplicar a la reaccin antgeno-anticuerpo. La cintica de una reaccin Ag-Ab reversible es la siguiente (Steward. 1986): K Ag + Ab AgAb K
2

Un anticuerpo policlonal se puede obtener mediante la inmunizacin con un antgeno, que presenta varios eptopos. En otras palabras, se generan anticuerpos especficos frente a cada epitopo. La avidez de un anticuerpo policlonal por un antgeno complejo generalmente es mayor que la de un simple anticuerpo monoclonal. Para la inmunizacin con molculas relativamente pequeas, como los haptenos o las hormonas, pueden ser necesarias protenas transportadoras o carner.

Anticuerpos

monoclonales
Donde Ag representa el antigeno libre, Ab representa los sitios de anticuerpo libres. AgAb representa la concentracin del complejo antigeno-anticuerpo, y K' y K son las constantes de asociacin y disociacin, respectivamente. El ritmo de formacin del complejo antigeno-anlicuerpo se representa de la siguiente forma: K'|Ag][Ab]-K^[AgAb|

Los anticuerpos monoclonales (Kehler. 1975) se han desarrollado empleando las siguientes biotecnologas: fusin somtica de clulas, seleccin del hibridoma resultante y dilucin lmite para obtener monoclonales. Se definen c o m o anticuerpos homogneos uniformes dirigidos a epitopos especficos. Una linea celular establecida permite la secrecin de todas las inmunoglobulinas especificas que reaccionan frente a un solo antgeno. Los anticuerpos monoclonales han permitido el anlisis de molculas, epitopo por epitopo. gracias a su estrecha especificidad. Sin embargo, los anticuerpos monoclonales no tienen la habilidad de reconocer la molcula completa, en comparacin con los anticuerpos policlonales. Para los anticuerpos monoclonales. distintos antgenos con un epitopo comn parecen el mismo antgeno. El anticuerpo CA199 (Magnan, 1983) como marcador tumoral puede detectar las distintas formas y tamaos moleculares que poseen epilopos comunes formados por carbohidratos. Los anticuerpos monoclonales permiten la identificacin de isoenzimas. subtipos, isotipos de proteina y cambios conformacionales de las molculas, puesto que pueden distinguir la mnima diferencia entre molculas. Los anticuerpos monoclonales pueden dar reacciones cruzadas con distintos antgenos. Estas reacciones cruzadas se pueden explicar por la probable existencia de la misma secuencia de aminocidos, hidratos de carbono o lpidos en distintas molculas. La tecnologa de los anticuerpos monoclonales ha permitido el desarrollo de sistemas de inmunoensayo m u y tiles y prcticamente ideales para un laboratorio de diagnstico clnico. Los mtodos de produccin y las aplicaciones de los anticuerpos monoclonales se han analizado exhaustivamente (Nakamura. 1983: Zola, 1987). Las ventajas de los anticuerpos monoclonales son las siguientes: 1. Los anticuerpos monoclonales constituyen un reactivo m u y bien definido.

y en el equilibrio el ritmo neto es cero. Asi. *' _ [AgAb] K ~[Ag][Ab]~


? 11

(constante de asociacin en el equilibrio o constante de afinidad). K es el parmetro limitado a las reacciones de sitio en sitio, a pesar de que los antgenos y los anticuerpos a menudo poseen mltiples dominios de unin en la molcula. La constante de asociacin para mltiples reacciones antgeno-antcuerpo se puede denominar avidez en lugar de afinidad. El valor de K se puede obtener de las siguientes ecuaciones y de datos experimentales:
a a

[Ab] = [Ab],-[AgAb] donde [Ab] es la concentracin del anticuerpo en el equilibrio y [Ab]. representa la concentracin total de anticuerpo inicial.

CAPTULO 35

INMUNOENSAYOS E I N M U N O Q U M I C A

823

"([Ab],-B)F

donde F es el anlgeno libre o analito, y B es el antgeno unido o analito. Una representacin de Scatchard se produce cuando la cantidad de antgeno unido (B) se representa en eje el X y la relacin de los analitos B/F se representa en el eje Y. Dos parmetros que se pueden determinar de una representacin de Scatchard son la constante de disociacin o afinidad, de la pendiente de la lnea, y la concentracin de los sitios de unin al anticuerpo por el punto de corte de la recta con el eje X (Scatchard. 1949).

VISIN GLOBAL DE LOS PRINCIPIOS GENERALES DE LOS INMUNOENSAYOS

puestos cromforos, fluorforos. y ms tarde, compuestos quimioluminiscentes. Dependiendo del sustrato elegido, el mtodo de ensayo se puede definir como un inmunoensayo enzimtico fluorescente o quimioluminiscente (Thorpe. 1984). Los inmunoensayos fluorescentes (FIA) emplean fluorforos como sondas. Los fluorforos requieren de una longitud de onda ptima para que su excitacin produzca una emisin de luz detectable. La sensibilidad del FIA normalmente desciende debido al fondo inespecfico presente en las muestras biolgicas. Existen fluorforos que poseen un retraso en la emisin de fluorescencia de 100 ns (nanosegundos) y son apropiados para el uso en un FIA en tiempo real. El empleo de un nuevo tipo de compuestos fluorescentes ha resultado en una mejora del FIA, como puede ser la eliminacin del ruido de fondo. Se han introducido instrumentos sofisticados de modo que se pueden detectar concentraciones bajas de analitos (10 M) mediante FIA.
1 5

Tipos de inmunoensayos
Una breve clasificacin y una lista de las caractersticas de vanos inmunoensayos aparecen en la Tabla 35-1. Los inmunoensayos de precipitacin proporcionan el mtodo ms sencillo por el que los antgenos y anticuerpos reaccionan entre ellos sin necesidad de una seal de deteccin. El complejo antigeno-anticuerpo en un gel o en fase lquida puede observarse cualitativamente c o m o un precipitado a simple vista, y cuantitativamente mediante un detector. El inmunoensayo de aglutinacin de partculas (Kasahara, 1992b) emplea partculas inertes como sonda, en lugar de la precipitacin directa de los complejos antgeno-anticuerpo. Los anticuerpos o antgenos unidos a partculas c o m o eritrocitos, ltex o un sol metlico reaccionan con el analito de la muestra. Como resultado de esta reaccin inmune, las partculas grandes presentan un patrn de aglutinacin significativo que puede verse a simple vista. Y a l o w (1959) describi el desarrollo de un RA empleando istopos radiactivos como sonda. Este avance permiti la deteccin cuantitativa de niveles residuales de analitos y contribuy al avance de la investigacin bsica y la medicina clnica. L a insulina, por ejemplo, se cuantific mediante un RA, y sustituy al inmunoensayo de la insulina. El RA se puede preparar como un procedimiento en fase slida para una separacin fcil de la sonda libre de la unida. Desde el desarrollo de los RA, la bsqueda de sondas alternativas a los istopos radiactivos se ha intensificado, con el objetivo de desarrollar inmunoensayos no isotpicos empleando enzimas, sondas fluorescentes y otros grupos de respuesta. El inmunoensayo enzimtico (EIA), que emplea enzimas como sondas, se desarroll al principio de la dcada 70 (Engvall. 1971; Van Weeman. 1971) y rpidamente obtuvo una gran popularidad. Las enzimas pueden amplificar las seales dependiendo de la actividad cataltica de la enzima. En un intento de mejorar los sustratos y aumentar la sensibilidad, se han introducido com-

Los inmunoensayos quimioluminiscentes emplean compuestos quimioluminiscentes como sonda. Los compuestos quimioluminiscentes incluyen molculas sintetizadas qumicamente y productos naturales como la aequorina. A diferencia de los fluorforos. la mayora de los compuestos quimioluminiscentes requieren una estimulacin qumica, en lugar de energa lumnica, para generar la emisin de luz. La reaccin de reduccin-oxidacin es un proceso comn a todos los ensayos quimioluminiscentes. La amplificacin de la seal no se espera de las sondas quimioluminiscentes porque las molculas quimioluminiscentes generan un solo fotn por descomposicin molecular. Han aparecido una serie de compuestos innovadores para la quimioluminiscencia que han resultado tiles para su aplicacin en inmunoensayos. Un metal quelado con grupos tri-bifenilo emite luz a travs de una reaccin continua de reduccin-oxidacin en la superficie de los electrodos (Blackburn, 1991). En los diversos tipos de ensayos mencionados anteriormente, los principales factores que afectan a la sensibilidad de un ensayo son la constante de asociacin (afinidad o avidez) del reactivo, la intensidad de la seal de las sondas y la relacin seal/fondo de la seal de deteccin reducida por el fondo de la propia reaccin o por una reaccin inespecifica. Los istopos de yodo 1 2 5 ( l) requieren unos 7 millones de molculas para generar 1 fotn/segundo, basado en el clculo de la vida media de istopos radiactivos (Bounaud. 1987). Los sustratos quimioluminiscentes de enzimas pueden incrementar el nmero de eventos en una orden de magnitud 6 veces mayor que el l. Esto se atribuye a la capacidad de amplificacin cataltica que poseen las enzimas.
,25 l2S

Qumica de conjugacin
En funcin del ensayo elegido, el mtodo de conjugacin que une una molcula con otras, como enzimas (o cofactores) a antgenos (o anticuerpos) o antgenos (anticuerpos) a una fase slida puede variar. La reaccin de acopla-

Tabla 35-1 Clasificacin de los inmunoensayos y sus caractersticas Seal de deteccin Inmunoensayos de precipitacin Inmunoensayos de partculas No necesarias Clulas sanguneas. partculas artificiales (gelatina. partculas de ltex, etc.) Radioistopos ('1, H) Enzimas
3

Separacin B/F* No necesaria No necesaria

Deteccin de la seal A simple vista, turbidez. nefelometra A simple vista, analizador de patrones, espectrofotometra. cmputo de de partculas Cmputo de fotones Espectrofotometra. fluorimetria. cmputo de fotones Cmputo de fotones Cmputo de fotones

Sensibilidad ~10 |jg/m |t -5 ng/mM

Radiommunoensayos Inmunoensayos enzimticos Inmunoensayos fluorescentes Inmunoensayos quimioluminiscentes

Necesaria Necesaria Necesaria Necesaria

-5 pg/ml -0,1 pg/m|6(CL-EIA) -5 pg/ml


1 1

Fluorforos Compuestos quimioluminiscentes

-5 pg/ml

libre Los ensayos homogneos que se incluyen no requieren la 'Paso de lavado para la separacin do la sonda unida en el inmunocompleo de la sonda que queda separacin B/F. Dalos de Ritchie (1978) Datos de A u x (1988). 'Oatos de Isomura (1994) 'Datos de Sgoulas (1989)
:

824

SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA

cuerpos conjugados con una sonda. Las placas de microtiter o de tiras pueden causar un "efecto de borde". Este efecto puede explicarse por las distintas cinticas de la reaccin inmune o la actividad enzimtica con las vanado nes de la temperatura. Puede existir una diferencia en la temperatura entre los pocilios que se encuentran en el borde de la placa y los que se encuentran en el centro. Una diferencia de unos 2 C puede observarse con un termmetro infrarrojo entre los pocilios del borde y los centrales a temperatura ambiente. La forma y tamao de la fase slida son factores crticos que afectan a la cintica de la inmunorreaccin y a la capacidad de unin del anticuerpo o antgeno de la fase slida. Partculas esfricas magnticas o de ltex de 3.000 A de dimetro, poseen una superficie total mayor para la inmunoabsorcin de lo que se obtiene normalmente con otras lases slidas. L a mayor superficie total ayuda a reducir la duracin de la reaccin inmunolgica (Nishizono. 1991). miento aplicada se debera llevar a cabo en condiciones que eviten la reduccin de las propiedades biolgicas de la protena. En el mtodo del glutarakJehido (Avrameas, 1978). el glutaraldehido, con dos (o posiblemente ms) grupos aldehido como agente de acoplamiento, se ha empleado para la conjugacin de grupos amino proteicos. Este mtodo se basa en reacciones mixtas, incluida la condensacin aldlica a elevado pH (la pKa del residuo NH es de 8.6 a 10.8). En este mtodo, mostrado en la Figura 35-1. el conjugado resultante presenta formas diferentes por la existencia de mltiples dianas de unin. El mtodo de la oxidacin con periodato (Nakane. 1966) para la conjugacin de anticuerpos, emplea la peroxidasa de rbano, que contiene grupos de hidratos de carbono en su molcula. Los mtodos mencionados anteriormente no son apropiados para la regulacin de reacciones especificas de diana, como ocurre cuando se requiere la estereoespecificidad configuracional del conjugado. Como se muestra en la Figura 35-2, se han desarrollado mtodos de conjugacin nuevos (Kato. 1975; Kitagawa. 1978) empleando un reactivo de conjugacin sofisticado, el ster de m-maleimidobenzil-N-hidroxisuccinimda (MBS). El MBS es un reactivo bivalente que consiste en un ster activo y la maleimida. que pueden reaccionar con un grupo NH, y un grupo SH, respectivamente. El grupo carboxilo tambin puede ser utilizado como una diana especfica para la conjugacin con un residuo a- o i-NH presentes en una proteina empleando N-hidroxisuccinimida (NHS) como reactivo de conjugacin. El reactivo NHS tambin conjuga protenas o el grupo carboxilo introducido en una fase slida. Las partculas que se emplean en los ensayos de aglutinacin de partculas se enumeran en la Tabla 35-2 El fenmeno de la aglutinacin de partculas (aglutinacin directa) causado por una reaccin inmune, se observ por primera vez en un ensayo para detectar la presencia de antigeno tras la incubacin con el suero de un paciente infectado. La aglutinacin de eritrocitos tras la incubacin con el suero dio lugar al descubrimiento de los grupos sanguneos ABO. Los inmunoensayos de partcula se basan en el principio de aglutinacin y emplean como reactivo un anticuerpo o un antigeno unido a una partcula inerte, en lugar de la precipitacin directa de un complejo antigeno-anticuerpo. Como sonda, la partcula puede aumentar significativamente la sensibilidad del inmunoensayo. independientemente de si la aglutinacin resultante se detecta a simple vista o mediante instrumentos espectrofotomtricos para su cuantificacin. Los entreoos, partculas de gelatina. Iiposomas. soles de metal, y varios tipos de partculas de ltex, incluyendo el ltex modificado con xido de nierro o tintes, funcionan c o m o fases slidas tiles en estos ensayos. El dimetro de las partculas empleadas en reacciones de aglutinacin vara entre 7 pm y 0,01 pm. N o existe una nica teora que explique las reacciones de aglutinacin (Kasahara, 1992a) debido a la gran variedad de lamao de las partculas empleadas. Para partculas mayores de 3 pm a 5 pm de dimetro, no se observa a temperatura ambiente el movimiento browniano de partculas dispersas actuando de acuerdo con el coeficiente de difusin. Sin embargo, la teora de la energa potencial de la interaccin entre partculas, o la teoria de la reaccin de coagulacin de coloides, se pueden aplicar a partculas pequeas c o m o pueden ser las micropartculas de ltex. La IgM, por ser multjvalente, se estima que es unas 750 veces ms eficiente en una reaccin de aglutinacin que una molcula bivalente de IgG. La distancia entre partculas en una floculacin debe ser m e n o ro igual a 120 Adebido a la longitud de la molcula de anticuerpo. En resumen, los factores importantes a tener en cuenta en una inmunorreaccin de fase slida son las propiedades de la superficie de las partculas, como su carga e hidrofobicdad, y la estabilidad de la dispersin.

Caractersticas de la fase slida


Todos los inmunoensayos heterogneos que emplean conjugados con sondas, incluidos los radioistopos, requieren al menos un paso para diferenciar el anligeno que ha reaccionado para formar un inmunocomplejo (unido), del que permanece sin reaccionar (libre). La inmovilizacin de antigenos o anticuerpos en una fase slida se realiza mediante uniones covalentes o mediante adsorcin tsica a travs de interacciones no covalentes. Se han empleado como lase slida, partculas de gel hechas de agarosa. poliacrilamida. cuentas de plstico o placas de poliestireno. y tambin partculas recubiertas de oxido de hierro que pueden separarse en un campo magntico. A menudo se utiliza la cara interna de un tubo o un pocilio de microtiter. como fase slida. Con estas fases slidas relativamente grandes, puede ser necesaria la agitacin de la mezcla de reaccin para acortar el tiempo necesario para que tenga lugar la reaccin inmune. El fenmeno prozonal o efecto de gancho, se debe a una elevada concentracin de analito, y es probable que se observe en un inmunoensayo de un solo paso cuando se emplean cantidades limitadas de anticuerpo en fase slida, o cuando se usan anti-

INMUNOENSAYOS DE PRECIPITINA Y NEFELOMTRICOS Origen y principios de la reaccin de precipitina


El precipitado que se forma cuando grandes complejos de antigeno se combinan con anticuerpos para formar un entramado insoluble se ha utilizado ampliamente en la identificacin y cuantificacin de las reacciones de precipitina. La aplicacin de las tcnicas de precipitina posee las ventajas de la sensibilidad, especificidad y sencillez. La limitacin que supone la sensibilidao de estos ensayos requiere de una importante consideracin. Incluso en las

CAPTULO 35

INMUNOENSAYOS E INMUNOQUMICA

825

Tabla 35-2 Partculas empleadas como sonda en el inmunoensayo de aglutinacin de partculas Mtodo de ensayo Eritrocitos humanos humana (VIH) Eritrocitos de ave Mezcla de eritrocitos animales (HBV) Ltex Ltex (color) Microcpsulas Parliculas de gelatina Parliculas pohpeptdicas Partculas de silicato Partculas de oro Soles de metal Hemaglutinacin directa (Landsteiner) I lemaglutinacin eritrocito-anticuerpo: placa de microtiter/portaobietos Hemaglutinacin directa Hemaglutinacin pasiva: placa de microtitor Hemaglutinacin pasiva indirecta: placa de microtiter Aglutinacin pasiva indirecta: portaobjetos Aglutinacin pasiva indirecta: turbidimetra Aglutinacin pasiva indirecta Inmunocromatografa Aglutinacin pasiva: placa de microtiter Aglutinacin pasiva: placa de microtiter Aglutinacin pasiva indirecta: cmara CCD Aglutinacin pasiva e indirecta Aglutinacin pasiva: placa de microtiter/cmara CCD Fotometria mejorada con aglutinacin indirecta Aglutinacin indirecta Suministro Grupo sanguneo ABO Anticuerpo para el virus de la Anticuerpo Irenle virus de la gripe humano Anticuerpos de T allldum Antigeno de superficit del virus de la Hepatitis I Gonadotropma corinica Ferriti na Gonadotropma corinica humana (hCG) Anticuerpo para T pallidum Anticuerpos para HIV. T. pallidum Hemoglobina humana (hHb) Anticuerpo para T pallidum, y para HBs Anticuerpo para T pallidum Estrgeno total hCG. hHb id Biosensor

De Kasahara Y Principles and applications ot particle immunoassay En Nakamura RM Kasahara Y. Rechnitz GA (ed ). Imnu Technology lor the 1990s Washington DC American Society lor Microbiology. 1992b. pags. 127-147. con permiso

mejores condiciones de mejora de la sensibilidad que ofrecen nuevas tcnicas de difusin de luz. el lmite inferior de sensibilidad de ensayos de inmunoprecipitina se mantiene en el orden de 0.1 a 0.5 mg/dl. Este umbral de sensibilidad es suficiente para la cuantificacin de las principales protenas sricas. La reaccin de precipitma forma la base de muchas tcnicas inmunoquimicas cuantitativas y cualitativas que se emplean en los laboratorios clnicos (Kabat. 1961). Los factores que afectan a la reaccin de precipitina fueron investigados detalladamente por Heidelberg en 1935, quien encontr que las proporciones relativas entre reactivos, condiciones de temperatura, pH y fuerza inica del medio, y las caractersticas de avidez y afinidad del anticuerpo, son todas de igual importancia para la formacin del precipitado inmune. En cuanto al patrn de formacin de precipitma cabe notar que existe un punto en que la precipitacin es mxima u ptima, denominado punto de equivalencia. La adicin continuada de antgeno una vez que se ha alcanzado el punto de equivalencia produce un efecto solubilizador del precipitado. El rango apropiado para la determinacin de analitos debera de llegar hasta la zona de equivalencia. La optimizacin de la concentracin del anticuerpo que se va a emplear como reactivo es necesaria, al igual que la optimizacin de las soluciones tamponadas. Los mtodos de precipitacin ms tpicos son los siguientes:

INMUNOENSAYOS DE PARTCULAS Principio de aglutinacin de partculas


La reaccin de aglutinacin se puede emplear para detectar anticuerpos presentes en individuos que han sido sensibilizados con antigenos especficos (aglutinacin directa o pasiva) (Figura 35-3B). La aglutinacin inversa emplea un anticuerpo especfico que se emplea para detectar antgenos solubles en el individuo (Figura 35-3A). Un dominio de unin a haptenos (para drogas, hormonas o partculas pequeas) no forma una estructura entrecruzada, y por tanto no se aglutina a no ser que se inmovilice en una fase slida. Como se muestra en los paneles A y 6 de la Figura 35-4. cuando se emplea una partcula o un transportador inmovilizado con un hapteno como reactivos, puede darse una inhibicin de la reaccin de aglutinacin que permite la deteccin del hapteno. Este ensayo se basa en el principio de competitividad, en el que la aglutinacin de partculas de hapteno con una cantidad limitada de anticuerpo, libre o unido a partculas, se inhibe debido a la presencia de hapteno libre presente en la muestra. Adems, partculas marcadas pueden reaccionar con reactivos fijados a una fase slida de la membrana. Este tipo de ensayo ha sido m u y popular como un mtodo sencillo para la deteccin cualitativa de gonadotropma corinica humana (hCG) y otros analitos.

Mtodos cualitativos del ensayo de precipitacin


Inmunodifusin sencilla (Williams. 1970) Inmunodifusin doble (Garvey, 1977) Inmunodifusin doble en dos dimensiones (Williams, 1970) Reaccin de electroinmunodifusin (Ritzmann, 1975) Inmunoelectroforesis (Rose. 1973)

Hemaglutinacin
Las pruebas de hemaglutinacin (Boyden, 1951) son sencillas en su realizacin y no requieren un equipamiento especial. Por este motivo, tanto los pases desarrollados como los que se encuentran en vas de desarrollo, han adoptado una variedad de ensayos de hemaglutinacin. Una de las pruebas de hemaglutinacin ms extendidas es la que se emplea para la deteccin de anticuerpos contra Treponema pallidum. comercializado como Serodia-TP por Fujirebio, Inc (Tokio. Japn). En Estados Unidos, el ensayo de hemaglutinacin para Treponema pallidum se aprob en 1981 por el Center for Disease Control (CDC). Tambin fue recomendado por la Organizacin Mundial de la Salud (OMS) gracias a su superioridad Irente a otros tipos de ensayo en cuanto a su especificidad y sensibilidad (Kasahara. 1992b). En el ensayo de aglutinacin de Treponema pallidum. el reactivo consiste en eritrocitos sensibilizados y desensibihzados de oveja, y una solucin diluyeme del suero para la reconstitucin de clulas sensibilizadas liofilizadas como control positivo Se pueden llevar a cabo ensayos cualitativos y semicuantitativos mediante el uso del siguiente protocolo de dilucin del suero, empleando una placa de titer como recipiente de la reaccin: empleando una

Mtodos semicuantitativos del ensayo de precipitacin


Inmunodifusin radial sencilla (Manzini. 1965: Fahey, 1965) Electroinmunodifusin en una sola dimensin (Axelsen. 1975) (electroforesis 'cohete")

Inmunoensayos

nefelomtricos

Se han desarrollado vanas tcnicas de anlisis por inmunoprecipitina que emplean sistemas de dispersin de la luz (Ritchie. 1978). La formacin de los complejos inmunolgicos se ha asociado a la cantidad de dispersin de luz y se ha empleado como la base para la cuantificaon del antgeno Se han diseado instrumentos sofisticados que rpidamente miden la dispersin de la luz. Las medidas de dispersin de la luz generalmente se denominan turbidimetrias o nefelometras.

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SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA

A n t g e n o o haptcno conjugado en una p a r t c u l a

Anticuerpo en la muestra

Figura 35-3. Principios del inmunoensayo de aglutinacin pasiva de partculas para la deteccin de antgenos de mltiples eptopos [A) o de anticuerpos (B). (De Nakamura RM, Kasahara Y, Rechnitz GA [eds]: Immunochemical Assays and Biosensor Technology for 1990s. Washington. DC, American Society for Microbiology, ASM Press, 1992. con permiso.)

pipeta de 25 uj, poner cuatro gotas (100 ul) del diluyeme de suero en el pocilio 1 (Fig. 35-5) y una gota en los pocilios 2 y 4 del ensayo cualitativo (los pocilios del 2 al 8 se van a utilizar para el ensayo cuantitativo). Los patrones de aglutinacin resultantes se muestran en la Fig. 35-6. Los patrones negativos, que indican que la reaccin inmune no ha tenido lugar, muestran partculas en floculacin condensadas con una estructura entrecruzada en el fondo del pocilio. Por el otro lado, los patrones positivos indican que la reaccin inmune ha tenido lugar, y muestran un patrn de aglutinacin de partculas extendido. Las partculas aglutinadas no se pueden sedimentar ms para obtener una condensacin como en los patrones negativos, porque se pierde su forma global en la aglutinacin. En las filas primera y segunda, se emplearon el suero y las clulas no sensibilizadas (control negativo), respectivamente. Los individuos 1 y 2 muestran resultados negativos. Los individuos 3 a 8 muestran resultados negativos o positivos, dependiendo de la dilucin de la muestra. Se obtiene un resultado positivo para los individuos 7 y 8 hasta una dilucin de 1:2.560 (filas 3 a 8). Existen tote de hemaglutinacin para la deteccin de anticuerpos frente al virus de la hepatitis (HBV), hepatitis tipo (HCV), el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH-1/2), la tiroglobulina, microsomas tiroideos y otras sustancias. Ensayos de hemaglutinacin inversa se emplean para la deteccin del antgeno de superficie de HBV. la a-fetoprotena (AFP), hemoglobina humana, etc. La sensibilidad de las pruebas de hemaglutinacin es de aproximadamente 50 ng/ml para la deteccin de antgeno (analito). Kemp (1988) desarroll un nuevo ensayo de hemaglutinacin que emplea un anticuerpo monoclonal especfico para el antgeno de superficie de los eritrocitos humanos. Este anticuerpo puede reconocer un eptopo comn a diferentes tipos de eritrocitos y a clulas anormales, como las que se encuentran en casos de anemia falciforme. Tal y como se muestra en la Figura 35-7, los eritrocitos de las muestras se emplean como partculas de fase slida, y la aglutinacin resultante puede observarse a simple vista. Los anticuerpos bivalentes se

conjugan qumicamente para que un anticuerpo reaccione especficamente con los eptopos de superficie del eritrocito, y el otro es especfico para el antigeno diana o analito. El ensayo se aplica para la deteccin de anticuerpos frente a VIH, adems de para la deteccin de varios antigenos. A diferencia de otras formas de aglutinacin convencionales, no requiere la separacin de plasma o suero. Este ensayo es simple y ahorra tiempo, y adems, presenta ventajas en cuanto a la seguridad, porque elimina la necesidad de la separacin del suero en el caso de muestras peligrosas positivas para VIH o HBV.

Aglutinacin de partculas de gelatina


El desarrollo de una partcula especial de gelatina con una superficie muy hidroflica que es capaz de evitar la unin inespecfica de materiales presentes en la muestra ha supuesto una alternativa a los eritrocitos (Ikeda, 1984). La partcula se prepara por separacin de fases y entrecruzamiento tridimensional a 40'C y pH ptimo. La partcula resultante se tija con formaldehdo o glutaraldehido, y su dimetro es de unas 3 um. Las propiedades fsicas de las partculas de gelatina en comparacin con las de los eritrocitos se muestran en la Figura 35-8. Una partcula de gelatina carece de antigenicidad y est, por tanto, libre de los problemas asociados con el empleo de anticuerpos heteroflicos cuando se emplean eritrocitos como partculas. Este tipo de partcula artificial requiere una menor dilucin del suero para evitar las uniones inespecificas y garantiza una deteccin ms sensible que en el caso de los glbulos rojos. Otras partculas sintticas (Hirayama, 1991) compuestas de cido L-glutmico y sus derivados han sido desarrolladas por Mirayama (1991) como alternativa a las partculas de gelatina. Estas partculas sintticas se pueden teir de cualquier color porque las partculas son incoloras, al igual que las de gelatina. El ensayo de aglutinacin de partculas de gelatina se emple inicialmente para la deteccin de anticuerpos frente al virus linfotrpico humano de tipo I (HTLV-1), que se descubri inicialmente c o m o un
f

CAPTULO 35

INMUNOENSAYOS E INMUNOQUMICA

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Menos agregados y de menor tamao

Figura 35-4. Principios del inmunoensayo de inhibicin de partculas para la deteccin de antgenos con un solo epitopo (haptenos), empleando partculas de antigeno con anticuerpos libres (A) o fijados (8). (De N a k a m u r a RM, Kasahara Y. Rechnitz GA |eds): Immunochemical Assays and Biosensor Technology for the 1990s. Washington, DC, American Society lor Microbiology. ASM Press, 1992, con permiso.)

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SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOIOGA

Figura 35-5. Ensayo de hemaglutinacidn para la deleccidn del antigeno de T. pallidum (Serodia-TP, Fujireblo, Inc, Tokio, Japon) basado en prolocolos de ensayos semicuantitativos (De Nakamura RM. Kasahara Y, Rechnitz GA [eds]: Immunochemical Assays and Biosensor Technology for the 1 9 9 0 s Washington. DC. American Society for Microbiology. ASM Press. 1992. con permiso)

retrovirus humano. Este ensayo de aglutinacin (Ikeda, 1984) rpidamente se hizo muy popular para la deteccin de VIH. HBV y HCV gracias a su alta sensibilidad y especificidad, a su sencillez y a que no es necesario un control m u y estricto de la temperatura. L a aglutinacin de partculas de gelatina puede sustituir cualquier ensayo basado en la hemaglulmacin, con la excepcin de ensayos que emplean los eritrocitos de la muestra como partculas.

Aglutinacin con ltex


La aglutinacin con ltex (Galvin. 1984). utilizando partculas de ltex, se ha utilizado para la deteccin de vanos analitos. como la hCG para las pruebas de embarazo, y la deteccin cuantitativa de otras protenas plasmticas con o sin instrumentacin. El procedimiento de este ensayo cualitativo es sencillo. Por ejemplo, es posible que uno solo tenga que mezclar unas gotas del ltex sensibilizado con el reactivo y la muestra empleando un palito, sobre un cubre negro. Dos o tres minutos ms larde, se puede detectar a simple vista la aglutinacin de fase invertida, como resultado de la inmunoreaccin. La aglutinacin con ltex se adapt para ensayos cuantitativos empleando mtodos de deteccin lumnica basados en la turbidimetria (absorcin de la luz) o nefelometra (dispersin de la luz). Con eslas tcnicas, la aglutinacin de ltex adquiere una mayor sensibilidad de subnanogramos por mililitro, mientras que la sensibilidad del ensayo midiendo la precipitacin intacta del complejo antgeno-anticuerpo es menor de 0.5 ug'ml.

longitud de onda empleada. La mayora de los reactivos de ltex disponibles de forma comercial con un dimetro inferior a 1 pm. se aplican a analizadores qumicos automticos empleando principios de medida fotomtncos. Para mejorar todava ms la sensibilidad, se trat de mejorar los reactivos y la instrumentacin, as como optimizar el tamao de la partcula, seleccionar la longitud de onda apropiada, y mejorar el software del sistema informtico que integra los datos. Ahora existen sistemas automatizados que emplean partculas de ltex, y pueden procesar unas 200 muestras por hora con una sensibilidad de subnanogramos por mililitro.

Inmunoensayo por contaje de partculas


El inmunoensayo por cmputo de partculas (PACA: parde-counting immunoassay) (Masson. 1986) emplea el contaje celular ptico para obtener el descenso en partculas libres despus de la inmunoreaccin. En el formato PACA, se puede medir tanto el ritmo del ensayo, es decir, el ritmo en el que decrece el nmero de partculas libres, o el valor final cuando ha finalizado la reaccin. La medida del ensayo al final de la reaccin puede emplearse para obtener una sensibilidad del nivel de nanogramos por mililitro; sin embargo, se requiere un mayor tiempo de incubacin.

Inmunoensayos con otras partculas


Se han desarrollado inmunoensayos de dispersin cuasi-elstica empleando la medida del cambio en la respuesta a la distribucin del tamao de la partcula (Yarmush. 1987). Esla tcnica utiliza un haz de lser para medir la reduccin en la media del coeficiente de difusin de las partculas como resultado de la reaccin inmune. Otros mtodos miden la variacin de anisotropa angular de la luz dispersada con el incremento del tamao medio de la partcula.

Ensayo de turbidimetha con ltex


La absorcin de luz (prdida de luz mediante su dispersion en la superficie de una partcula) es proporcional al dimetro de la partcula y depende de la

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INMUNOENSAYOS E I N M U N O Q U M I C A

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Figura 35-6. Patrones de hemaglutinacin para detectar anticuerpos anti-I pallidum (A) e interpretacin c o m o positivo o negativo a la dilucin linal del suero (6). (De Nakamura RM, Kasahara Y. Rechnitz GA [eds]: Immunochemical Assays and Biosensor Technology for the 1990s. Washington, DC. American Society for Microbiology, ASM Press, 1992. con permiso.]

Glbulos rojos del dolanle

Reactivos bivalentes

Unin pero un aglutinacin

Figura 35-7. Representacin esquemtica de un ensayo basado en la aglutinacin autloga de eritrocitos, empleando eritrocitos presentes en la muestra como partculas. (De N a k a m u r a RM, Kasahara Y, Rechnitz GA [eds]: Immunochemical Assays and Biosensor Technology for the 1990s. Washington, DC American Society for Microbiology. ASM Press, 1992, con permiso.)

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SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA

Panculas ,ic

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inirocitosdco\cia

Figura 35-8. Micrograta electrnica (x25.000) y propiedades tsicas de las partculas de gelatina en comparacin con los eritrocitos de oveja. (De Nakamura RM. Kasahara Y. Rechnitz GA[eds]: Immunochemical Assays and Biosensor T e c h n o l o g y lor the 1990s. Washington. DC. American Society (or Microbiology. ASM Press. 1992. pg. 139, con permiso. |

Las partculas con dimetros parecidos a la longitud de onda consiguen una variacin angular de la dispersin de la luz dependiente del tamao.

se ha descrito en el apartado Cintica de la reaccin de antigeno-anticuerpo, de la siguiente ecuacin. B/F = K([Ab].-B)


a

Resumen
La hemaglutinacin indirecta y la aglutinacin de partculas de gelatina son ensayos que, realizados en placas de microtiter, han sido m u y populares en procesos de determinacin cuantitativa y cualitativa de diversos analitos. Estos ensayos no requieren instrumentos adicionales ni un control estricto de la temperatura. Lo ms importante es que estos ensayos garantizan una sensibilidad igual o mayor que la del inmunoensayo enzimtico convencional en lo que se reliere a la deteccin de anticuerpos frente a agentes infecciosos. El ltex como fase slida proporciona unas importantes ventajas cinticas, como un menor tiempo de nmunorreaccin. Por este motivo, ha sido posible adaptar el ltex para su uso en instrumentos sofisticados, aplicando principios diferentes y dando como resultado un ensayo con una sensibilidad de unos 3 rdenes de magnitud mayor que en los ensayos de inmunoprecipitacin convencionales. El ltex es susceptible de presentar interferencias de factores desconocidos en las muestras. Para eliminar este problema, se han utilizado varios absorbentes tanto en el reactivo como en el medio de incubacin. La gran ventaja del inmunoensayo de partculas es su simplicidad, ya que no requiere la separacin de los reactivos libres de los unidos.

el eje Y es la relacin B.'F. que es proporcional a la cantidad de anticuerpo libre [Abj de [Ab],-B, igual al antgeno libre [Ag). As. la K, representa la pendiente de la representacin. En esta figura, la constante de afinidad K, es 8.1 x 10 L'M para el anticuerpo especifico para la ciclosponna. Las emisiones radiactivas, como los rayos gamma del l, se pueden medir en trminos de cuentas por minuto (CPM) utilizando un contador de centelleo gamma. Los radioistopos ms frecuentes y sus propiedades se muestran en la Tabla 35-3. La eleccin de la sonda afecta considerablemente al protocolo del ensayo. Por ejemplo, una de las sondas ms utilizadas, el l , necesita un tiempo relativamente corto para el conteo. pero no puede almacenarse mucho tiempo debido a que tiene una vida media corta. Sin embargo, el tritio ( H) requiere un tiempo mayor para el conteo. y por tanto incrementa la duracin del ensayo. La mayo9 ;: Ia 1

RADIOINMUNOENSAYO Origen
Desde que apareci la tcnica del RA. el uso de radioistopos como sonda, que se desarroll en primer lugar por Yalow y Berson (1959]. se ha mejorado de una forma espectacular en cuanto a sensibilidad y precisin. Se han introducido diversas variaciones del mtodo en el laboratorio clnico. Hay dos tipos principales de RIAs, competitivos y no-competitivos, que requieren pasos de lavado para separar la sonda unida de la que permanece libre (conjugados). El ensayo competitivo sigue la ley de accin de masas, que especifica la reaccin entre analitos y protenas de unin, receptores y anticuerpo. El tactor clave en la optimizacin del ensayo es la afinidad de unin del anticuerpo. La representacin de Scatchard de la relacin entre anticuerpo unido y libre, frente a la concentracin del analito, se emplea frecuentemente para evaluar la funcin del anticuerpo. La Figura 35-9 muestra la representacin de Scatchard para la determinacin de la ciclosponna. Tal y como

Ciclosponna (pg/ml) Figura 35-9. Representacin de Scatchard de las caractersticas de unin de anticuerpos a la ciclosporina (K = 8,1 x 10 L'M).
a 9

CAPTULO 35

INMUNOENSAYOS E I N M U N O Q U M I C A

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Tabla 35-3 Propiedades de los radioistopos empleados como sonda en los radioinmunoensayos Actividad especifica

da de los RA actualmente emplean el l para realizar el proceso de conjugacin y mantener la actividad biolgica de los reactivos. Un mtodo muy utilizado de conjugacin de protenas con l es el mtodo de la cloramma-T (Hunter. 1962). La lirosina. en particular, posee una mayor reactividad con el yodato debido a la presencia de un grupo hidroxi en la posicin para del anillo aromtico. L a seal puede medirse en trminos de CPM como emisiones de radiacin gamma. A diferencia de las enzimas, el empleo de istopos como sonda, con un radio de Stokes pequeo, no suele afectar a la actividad antignica, debido a la falta de alteraciones alostricas cuando se conjugan istopos con antgenos pequeos (haptenos).
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na competitivamente tanto con el conjugado c o m o con el antigeno. Entonces, el complejo inmunolgico es capturado por un segundo anticuerpo especfico para el primer anticuerpo, asociado a una fase slida. Cuando el segundo anticuerpo se asocia a una fase slida fina, el complejo inmunolgico de la segunda reaccin puede separarse como un precipitado, del resto de las molculas que no han reaccionado. Para la determinacin de un anticuerpo, el anticuerpo unido a una sonda y el anticuerpo de la muestra reaccionan competitivamente con el antgeno (analito) fijado a la fase slida. Cuanto mayor sea la pendiente de la curva estndar, ms precisos son los datos que aporta. Los mtodos competitivos requieren cantidades menores de anticuerpo o antgeno (analito) que los ensayos de tipo sandwich descritos ms adelante. Los ensayos no competitivos, originalmente demostrados por Miles (1968), han cobrado mayor popularidad en los ltimos tiempos. Los ensayos radioinmunomtricos (IRMA) o ensayos de sandwich (Fig. 35-12), tienen una relacin alternativa entre el analito y el anticuerpo. El ensayo competitivo clsico consigue una respuesta inmunolgica con una mnima cantidad d e anticuerpo, y el ensayo de sandwich emplea una gran cantidad de anticuerpo en la fase slida. La tecnologa de los anticuerpos monoclonales ha hecho posible la elaboracin de grandes cantidades de anticuerpos especficos a un coste moderado, permitiendo la explotacin del ensayo de sandwich. El ensayo d e sandwich emplea un exceso estequiomtrico de anticuerpo y es ms sensible que un ensayo competitivo. Cuando se elimina por completo el fondo, la sensibilidad terica ltima del ensayo de sandwich es de una molcula de analito, lo cual es posible cuando la cantidad de anticuerpo utilizada en el ensayo se acerca al infinito. Como se muestra en la Figura 35-12, el anticuerpo en la fase slida primero se une al antgeno (analito) de la muestra. Despus de la separacin B'F, el conjugado reacciona con el antgeno (analito) fijado a la fase slida, y la seal se puede medir despus de la eliminacin de los conjugados libres mediante un paso de lavado. Este ensayo requiere antgenos con ms de dos determinantes antignicos. Cuando se emplean dos anticuerpos diferentes (es decir, un anticuerpo asociado a la fase slida especfico para un determinante antignco, y un anticuerpo conjugado especfico para otro determinante antignico), el protocolo de ensayo puede simplificarse haciendo el sandwich en un solo paso. As, la fase slida puede mezclarse con el antgeno de la muestra y con el conjugado simultneamente. No se produce interferencia porque ambos anticuerpos, tanto el de la fase slida como el conjugado, son capaces de reconocer distintos determinantes antignicos. En este ensayo la seal generada es proporcional a la concentracin del analito presente en la muestra, al igual que en el ensayo de sandwich en dos pasos. Este mtodo de ensayo se puede aplicar a la deteccin de anticuerpos con un formato de ensayo que emplea antgeno en la fase slida y antgeno aco-

Principios y mtodos del ensayo


Se han desarrollado varios mtodos (exceso de antigeno) basados en la unin competitiva (Ekins, 1960) a anticuerpos, entre antgenos con y sin sonda (analitos presentes en la muestra), para una amplia gama de analitos. Un mtodo competitivo convencional se muestra en la Figura 35-10. En un principio, una cantidad conocida de antigeno acoplado a una sonda y el antgeno de la muestra se mezclan y reaccionan con una cantidad constante de anticuerpo unido a una fase slida, como puede ser partculas de sefarosa o la cara interna de tubos de plstico. Despus de que la reaccin inmune alcance el equilibrio, la mezcla se lava para eliminar los conjugados que no han reaccionado y se separan los antgenos del complejo inmunolgico que permanece atrapado en la fase slida. El paso de lavado aparece como separacin B/F {bound: unido/free: libre). Aplicando el principio de la competilividad, la representacin del porcentaje de antigeno unido frente a la concentracin logartmica del analito produce la curva estndar que muestra la Figura 35-10. La representacin de CPM sobre la curva estndar nos da la concentracin del analito. Otro mtodo que emplea anticuerpos se muestra en la Figura 35-11. El primer anticuerpo es especfico para un determinado antgeno (analito) y reaccio-

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SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA

->Conccnir;icit>ii de analto

Figura 35-11. Principio de un ensayo de RA competitivo empleando un segundo anticuerpo para la separacin B'F (unido/libre). piado a una sonda. Para un formato en dos pasos, se puede emplear el antgeno en la fase slida y un anticuerpo especfico para el anticuerpo diana acoplado a una sonda. Empleando el formato de sandwich, la sensibilidad del ensayo es elevada (Espinosa. 1987). Un ejemplo es utilizar IRMA para la determinacin de la hormona estimulante del tiroides (TSH): el nivel de sensibilidad del ensayo es inferior a 0.07 pU/ml de TSH, en comparacin con unas 0,7 iiU/ml de un ensayo competitivo convencional de antgeno asociado a una sonda.

Resumen
Comparado con otros inmunoensayos, los RIAs resultan ventajosos p o r varios motivos: 1) precisin y elevada sensibilidad, 2) facilidad en la conjugacin del istopo, 3) deteccin de la seal sin optimizacin y 4) estabilidad frente a la interferencia ambiental del ensayo, entre otros. Las desventajas del RA son la corta vida en almacn de los reactivos y la necesidad de proteccin frente a la radiactividad nociva. Adems, como se discute ms adelante,

Figura 35-12. Principio de un ensayo de RA de tipo sandwich empleando la fase slida, tambin conocido c o m o ensayo inmunorradiomtrico (IRMA).

CAPTULO 35

INMUNOENSAYOS E I N M U N O Q U M I C A

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Tabla 35-4

Comparacin del radioinmunoensayo. el nmunoensayo enzimtico heterogneo y el inmunoensayo enzimtico homogneo Pasos de la reaccin inmune Pasos de la reaccin enzimtica Pasos para la deteccin de la seal

Ensayo Radioinmunoensayo Muestra* Analito o Ab marcado Inmunoensayo enzimtico heterogneo Muestra+ Analito o Ab -Enzima marcado Inmunoensayo enzimatico homogneo Muestra* Analito o Ab Enzima o coladores marcado

Reaccin inmune con pasos de lavado para la separacin

No necesarios

Emisin radiactiva (rayos y)

Reaccin inmune con pasos de lavado para la separacin

Reaccin enzimtica con reactivos adicinalos

Densidad ptica Fluorescencia Luminiscencia

La reaccin inmune y/o sistmica se desarrolla en una sola solucin, que incluye el reactivo para el revelado de la serial enzimtica

La reaccin inmune y/o sistmica se desarrolla en una nica solucin que incluye el reactivo para el revelado de la seal enzimtica

Densidad ptica Fluorescencia Luminiscencia

los RA no pueden aplicarse a inmunoensayos homogneos, debido a que las seales de los istopos no pueden modular las reacciones antgeno-anticuerpo.

INMUNOENSAYO ENZIMTICO Origen y clasificacin


Los inmunoensayos cuantitativos que emplean enzimas como sonda se desarrollaron como una alternativa a los radioistopos (Engvall. 1971: Van Weeman. 1971; Avrameas. 1971). Los ms utilizados son el ensayo inmunoabsorbente enzimtico (ELISA: enzyme-linked immunosorbent assay), el EIA y la tcnica del inmunoensayo de multiplicacin enzimtica (EMIT: enzyme-multiplied immunoassay technique), que es una marca registrada de SYVACo. (D. Behring Inc., Cupertino, CA 95041) (Rubenstein, 1972). Esencialmente, los EIA heterogneos son similares a los RA, excepto que emplean enzimas como sonda. Las enzimas hacen posible desarrollar EIA homogneos, eliminando los pasos de lavado para la separacin B/F que de otro modo son necesarios. La Tabla 35-4 compara las caractersticas de los EIA homo y heterogneos con los RA. Mejoras en los EIA han aportado muchos formatos innovadores con diferentes grados de rapidez, sensibilidad, simplicidad y precisin. Las ventajas y desventajas de los EIA se listan en la Tabla 35-5 (Nakamura, 1992).

ma y por la seleccin de la medida de la seal, entre los que la quimioluminiscencia es el mtodo ms sensible. El lormato del ensayo de los EIA heterogneos, al igual que los RA. se puede dividir entre ensayos competitivos y no competitivos (vase Fig. 35-14). Los ensayos competitivos (exceso de analito) usan conjugados de antigenoenzima (Fig. 35-13A). mientras que los ensayos no competitivos (exceso de reactivo) incluyen los ensayos inmunomtricos de sandwich de dos dianas y los ensayos indirectos para medir anticuerpos (Figs. 35-13Sy Q. Los ensayos inmunomtricos de sandwich han aumentado su popularidad para la determinacin de antigenos como hormonas, marcadores tumorales. protenas plasmticas y agentes infecciosos. Los ensayos indirectos para la medida de anticuerpos (Fig. 35-13C) se han adoptado para la deteccin de anticuerpos frente a agentes infecciosos (p. ej., VIH. HBV. HCV) y autoanticuerpos

Tabla 35-5 Ventajas y desventajas de un inmunoensayo enzimtico A. Ventajas t Se pueden desarrollar ensayos sensibles gracias al efecto de amplificacin de las enzimas. 2 Los reactivos son relativamente baratos y pueden tener una larga vida de almacenaje 3. Se pueden desarrollar mltiples ensayos simultneamente. 4 Se puede desarrollar una amplia variedad de configuraciones del ensayo 5. El equipamiento no es necesariamente caro y est ampliamente disponible. 6 No existen riesgos radiactivos durante el mareaje ni el desecho de los residuos. B. Desventajas 1. La medida de la actividad enzimtica puede ser ms compleja que la medida de la actividad de algunos tipos de radioistopos 2. La actividad enzimtica se puede ver afectada por algunos componentes del plasma 3. Los ensayos homogneos, actualmente, poseen una sensibilidad de 10' M y no son tan sensibles como los radiommunoensayos. 4. Los EIA homogneos para molculas proteicas grandes se han desarrollado, pero requieren reaclivos inmunoqumicos compiojos
J

Inmunoensayos enzimticos heterogneos


El principio de los ensayos de EIA heterogneos es similar al de los RA. excepto que es la actividad enzimtica, no la radiactividad, la que se mide. Los EIA requieren un proceso secundario para obtener seales mediante la reaccin cataltica de las enzimas. Como fase slida para separar los conjugados libres de los unidos, pueden utilizarse placas de microliter, partculas de plstico, tubos de plstico, partculas magnticas y ltex con filtros, entre otros. El uso de pequeas partculas magnticas y de ltex permite acortar el tiempo de mmunorreaccin, reduciendo asi el tiempo total que requiere el ensayo. El desarrollo de sustratos que escindan las enzimas, estuvo marcado por la introduccin de sustratos colorimtricos y fluoromtncos, y ms tarde de suslralos quimioluminiscentes. que incrementan la sensibilidad de la seal. Algunas de las enzimas ms utilizadas en vanos EIA heterogneos son la peroxidasa de rbano, la fosfatasa alcalina, la (5-galactosidasa, la glucosa oxidasa. la ureasa y la catalasa. Las enzimas ms utilizadas junto con sus caractersticas aparecen en la Tabla 35-6. La sensibilidad del ensayo cuando se utilizan enzimas puede determinarse por la tasa de recambio de cada enzi-

EIA = inmunoensayo enzimtico De Nakamura RM Kasahara Y Heterogeneous enzyme immunoassays En Nakamura RM. Kasahara Y Rechnitz GA (eds): Immunochemical Assays and Biosensor Technology lor the 1990s. Washington, DC. American Society lor Microbiology. 199?. pags 149-167, con permiso

834

SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA

Tabla 35-6 Caractersticas de las enzimas tpicas empleadas como sonda en los inmunoensayos enzimticos Caractersticas Fuente Tamao molecular (daltons) Actividad especfica Tasa de renovacin" Medida de la enzima Medida de alta sensibilidad Mtodo de mareaje de la enzima Peroxidasa (EC 1.11.1.7) Rbano ca. 40.000 250 U/mg 10 000 Colorimetria, fluorimetria. luminometria Luminometra Oxidacin del periodato (mtodo de Nakane) Enzima f5-galactosidasa (EC 3.2.1.23) E. coli ca. 530.000 600 U/mg 318000 Colorimetria, fluorimetria, luminometra Fluorimetria Mtodo de la dimaleimida, reactivo de entrecruzamiento' Fosfatasa alcalina (EC 3.1.3.1) Intestino bovino 140 000 1.000 U/mg 250 000 Colorimetria, fluorimetria, luminomelria Luminometria Mtodo del glutaraldohdo, reactivo de enlrecruzamiento

' Nmero de molculas del sustrato producidas por una molcula de enzima en una reaccin de un minuto; nmero de molculas/MU El reactivo contiene grupos qumicamente reactivos c o m o el maleimida y el succinimida.
1

>

Un EIA heterogneo (Fig. 35-13) consta de los siguientes pasos: 1. La fase slida unida a los reactivos se mezcla con el analito. independientemente de si el ensayo se basa en el formato competitivo o no competitivo. 2. Despus de la adicin del conjugado y la incubacin, hay unos pasos de lavado con una solucin tamponada que contiene un detergente, uno o dos pasos despus de la inmunorreaccin. La reaccin inmunolgica debe alcanzar determinados niveles para obtener un ensayo preciso y estable.

3. La fase slida, con el complejo inmune que contiene el antgeno conjugado a una enzima o un anticuerpo, se incuba a temperatura constante con la solucin de sustrato enzimtico. 4. La reaccin enzimtica se detiene (no es necesario en el ensayo de tasas) y el producto de la reaccin se mide con varios detectores dependiendo del sustrato empleado.

Ensayo

enzimtico

colorimtrico

En este ensayo, la reaccin enzimtica se realiza utilizando sustratos cromognicos para desarrollar un color mediante la reaccin cataltica principal. Por ejemplo, la peroxidasa de rbano, catalizando el ABTS [sal de diamonio de 2,2'-azino-di(3-etil-benzotiazolina-6-sulfonato)] con H 0 para dar un color verde, y la fosfatasa alcalina, especifica para el p-nitrofenil fosfato para dar un color amarillo. Ambas enzimas son los tipos ms utilizados en los inmunoensayos enzimticos colorimtricos. Un espectrofotmetro se utiliza para medir la densidad ptima del cromgeno resultante. Existen diversos instrumentos posibles que permiten medir la densidad ptica en tubos o placas de microtiter pasando desde un sistema completamente automatizado que hace desde el pipeteo de la muestra hasta la impresin de los resultados, hasta instrumentos manuales ms sencillos. Cuando la reaccin EIA se hace sobre una membrana de nitrocelulosa (mtodo de transferencia Western) u otras membranas, se emplean sustratos que generan tintes insolubles. Un test de embarazo para la hCG en un formato de inmunoensayo que se vende sin receta, a menudo utiliza derivados de la benzidina que reaccionan con la peroxidasa, o derivados del indoxil fosfato que reaccionan con la fosfatasa alcalina para generar precipitados coloreados. El precipitado de color que se acumula en la fase slida por la accin de la enzima puede detectarse a simple vista. Tericamente, la medida de la densidad ptima est limitada por un rango de entre O y 2.0. Asi, la determinacin de la densidad ptica de analitos que requieren un amplio rango puede resultar problemtica, incluso cuando se emplean un exceso de conjugado y fase slida con suficiente capacidad de captura en un ensayo de tipo sandwich.
2 2

Los esfuerzos para mejorar los EIA, un punto clave en el desarrollo de los inmunoensayos no isotpicos, han sacado a la luz diversas desventajas de los RIAs, como son los residuos radiactivos, radilisis de los analitos marcados, y la corta vida media del l. Ishikawa (1989) desarroll un EIA ultrasensible que puede detectar 3 fmoles de una IgG especfica. Para alcanzar este nivel de sensibilidad, se requieren varios pasos tediosos, c o m o la transferencia del inmunocomplejo de una primera fase slida a otra distinta para reducir las seales de fondo.
l25

Inmunoensayo

enzimtico

fluorescente

L-

E N S A Y O de anticuerpo

Figura 35-13. Principios del inmunoensayo enzimtico (EIA) empleando la fase slida: (A) ensayo de sandwich competitivo y (S y C) no compe'itivo.

Los EIA fluorescentes son idnticos a otros EIA excepto en que utilizan sustratos fluorescentes. En un EIA fluorescente, el fluorforo se genera por la reaccin enzimtica. Despus de la excitacin del fluorforo a su longitud de onda de excitacin ptima, se emite luz a una longitud de onda caracterstica. Instrumentos como un fluormetro requieren una fuente de suministro de la luz de excitacin y un fotomultiplicador como detector de la emisin de flores-

CAPTULO

35

INMUNOENSAYOS E I N M U N O Q U M I C A

835

AMI'I'I)

AMIM)

Interim diario ( I

ESTADIO SI

Figura 35-14. Adamaniil 1,2-dioxetano tenil fosfato (AMPPD): un sustrato quimioluminiscente para la deteccin de la fosfatasa alcalina (ALP). La eliminacin hidroltica del grupo fosfato por la ALP genera una luminiscencia por intercambio electrnico iniciada qumicamente (CIEFL: chemically initiated electron exchange lummiscence) con la descomposicin del AMPPD mediante la liberacin de dioxetano fenolato (AMPD) rico en electrones. La transferencia de carga del fenolato al anillo de dioxetano tiene lugar mediante la formacin del intermediario de transferencia de carga (CT) y la consiguiente rotura del perxido cclico. Tiene lugar una liberacin de energa con emisin de luz.

cenca. Pueden existir sustancias que emitan fluorescencia ya presentes en la muestra. Estas sustancias aumentaran la seal de fondo, lo cual puede interferir en la sensibilidad del ensayo. As. se debe prestar atencin a la eleccin de sustratos para los EIA para evitar estos factores. Comparado con los EIA colorimtricos, los ensayos fluorescentes generan una intensidad de seal que es al menos de un orden de magnitud mayor.

Inmunoensayo

enzimtico

quimioluminiscente

Los inmunoensayos enzimticos quimioluminiscentes (CL-EIA) emplean sustratos quimioluminiscentes que reaccionan con varias enzimas que se emplean c o m o sonda La reaccin enzimtica quimioluminiscente genera luz. similar a la bioluminiscencia. e implica el uso de sustratos naturales como la luciferin-adenosina trifosfato (ATP). Durante los ltimos 20 aos, se ha prestado mucha atencin a la aplicacin de la quimioluminiscencia en los inmunoensayos. y se ha desarrollado una variedad de sistemas que combinan enzimas y sustratos. Sistemas actuales que emplean derivados del luminol con un potenciador para la peroxidasa. o derivados del dioxetano para la fosfatasa alcalina, consiguen inmunoensayos m u y sensibles. Estos ensayos son efectivos como herramientas en el diagnstico prctico. La reaccin de oxidacin enzimtica de anlogos del luminol se ha utilizado desde hace mucho en los CL-EIA. El empleo de peroxidasa con H,0- es un mtodo frecuente que se puede cambiar por una enzima productora de H.O, como la glucosa oxidasa o la uncasa. El descubrimiento de los potenciadores por parte de Thorpe (1985) para la quimioluminiscencia basada en luminol mejora notablemente la sensibilidad del ensayo. Los potenciadores incluyen derivados del fenol y compuestos aromticos. Por ejemplo, la luminol-peroxidasa con p-iodofenol c o m o potenciador consigue un incremento de la emisin de luz de unas 2.800 veces en una mezcla de reaccin optimizada. Este ensayo puede detectar la TSH a 0.04 mU/iil utilizando suero como muestra. Sin embargo, las reacciones oxidativas. como para el luminol. pueden tener interferencias por mltiples factores que causan un aumento de las seales inespecficas de fondo (ruido). Bronstein (1989a) desarroll un sustrato quimioluminiscente para la fosfatasa alcalina que difiere considerablemente de otros compuestos. Este nuevo sustrato se conoce como AMPPD (disodio 3-(4-metilespiro-[1,2-dioxetano3,2'-triciclo-[3.3.1.1]decano]-4-yl)fenil fosfato), un derivado del dioxetano de adamantilo. No requiere molculas adicionales para la emisin de luz quimioluminiscente, a diferencia del luminol, que requiere compuestos oxidativos externos a las molculas de luminol. AMPPD es una molcula nueva que constituye un sustrato completo porque est compuesta por un grupo adamantilo c o m o estabilizador de toda la molcula, la unin de dioxetano como fuente de energa, el ster de fosfonlo como diana de escisin para la enzima, y un grupo fenilo para la quimioluminiscencia. todos incluidos en una sola molcula. La estructura de la molcula y el proceso de reaccin para la generacin de luz se muestran en la Figura 35-14. La escisin del enlace fosfoestrico del AMPPD por la fosfatasa alcalina desencadena la luminiscencia por

intercambio de electrones iniciado quimicamente (CIEEL: chemically nitiated electrn exchange luminiscence). mediante la liberacin del grupo dioxetano rico en electrones. Una quimioluminiscencia con una longitud de onda mxima de 477 nm se puede detectar desde unos pocos minutos hasta unas cuantas horas, dependiendo de la concentracin de sustrato. El sistema de ensayo de la fosfatasa alcalina con el AMPPD tiene una sensibilidad de menos de 10 ' moles (Bronstein, 1989b. 1991: Kricka. 1991). El CL-EIA utiliza el AMPPD como sustrato para la fosfatasa alcalina, que se usa como sonda enzimtica. El CL-EIA se puede llevar a cabo en un instrumento totalmente automatizado. Este nuevo sustrato hizo posible el desarrollo de sistemas de inmunoensayo quimioluminiscentes extremadamente sensibles. Se usan partculas frricas de 0.3 pm de dimetro c o m o tase slida para acortar el tiempo de mmunorreaccin a unos 30 minutos y para proporcionar una mayor superficie de inmunoabsorcon. L a relacin entre la seal quimioluminiscente y la concentracin de analitos es lineal hasta unos siete rdenes de rango dinmico. La sensibilidad del CL-EIA (Nishizono, 1991) era 10 veces mayor que la de un RA convencional cuando se ensay la AFP; se detect un nivel de 30 pg/ml de AFP en un tiempo de ensayo de 30 minutos. As. los nuevos sistemas de EIA quimioluminiscentes son una definitiva mejora sobre los RA en trminos de sensibilidad, eficiencia temporal y simpleza del proceso y estn ganando en popularidad en el mercado.
2

Inmunoensayos enzimticos homogneos Origen


Existen dos opciones para evitar procesos tediosos en el ensayo. Uno es disear instrumentos totalmente automatizados con acceso a tipos heterogneos de reactivos, y el otro es desarrollar reactivos innovadores que no requieren pasos de lavado complicados, como los que requieren los EIA heterogneos. Las enzimas y sus cofactores son sondas ventajosas en los E I A homogneos porque la actividad enzimtica se puede modular fcilmente cambiando los factores presentes en el microambiente de la reaccin Ag-Ab. Este no es el caso cuando se utiliza el decaimiento de un radioistopo como seal. Actualmente, los EIA homogneos son menos sensibles que sus equivalentes heterogneos. Los EIA heterogneos convencionales tienen una sensibilidad equivalente a la de los RA en muchas aplicaciones, mientras que los EIA homogneos (Nakamura, 1998) mantienen una sensibilidad de uno o dos rdenes de magnitud inferior. Los EIA homogneos pueden necesitar reactivos inmunoqumicos complejos, pero los sistemas de ensayo son rpidos y sencillos, y se pueden adaptar a instrumentos convencionales. H a y varios tipos de EIA homogneos En cada uno de estos ensayos, la interaccin antigeno-anticuerpo modula la actividad de la enzima o de la sonda acoplada a la enzima en presencia de sustrato. La modulacin de la actividad enzimtica refleja el grado de reaccin inmunoqumica. En la Tabla 35-7 aparece una lista de las caractersticas de los EIA homogneos tpicos. Los EIA homogneos se pueden clasificar en ensayos de unin competitivos o no

836

SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOIOGA

Tabla 35-7 Clasificacin y caractersticas de un inmunoensayo enzimtico homogneo tpico Nombre y tipo de ensayo Competitivo' EMIT SLFIA ARIS Inmunoensayo de canalizacin enzimtica Inmunoensayo de enzima biolmilada y avidina CEDA No competitivo' Inmunoensayo de anticuerpo hbrido Conjugado Antigeno con hsozima. G6PD Antigeno con sustrato Anigeno con grupo prosttico Antigeno con G6PD y hexocinasa Antigeno con avidina Antigeno con fragmentos de p-galaclosidasa Tipo de modulacin Inhibicin alostnca Inhibicin alostnca Inhibicin alostnca Facilitacin mediante proximidad Inhibicin alostrica Inhibicin aloslrica

Anticuerpos hbridos especficos para el Inhibicin alostrica antgeno y el inhibidor Inmunoensayo de unin proximal Anticuerpo con G6PD y hexocinasa Cascada de suslratos por proximidad Anticuerpo con amilasa Inhibicin alostrica EIHIA Anticuerpo con |J-galactosidasa y anticuerpo Electo de cargas Inmunoensayo enzimtico mejorado frente al succinil Anticuerpo con peroxidasa Estabilizacin AEST La negrita indica que el nombre de la enzima est escrito y la enzima descrita en detalle en el texto G6PD-glucosa-6-fosfato deshidrogenasa. De Kasahara Y: Homogeneous enzyme immunoassays En Nakamura RM. Kasahara Y. Rechnitz GA (eds). Immunochemical Assays and Biosensor Technology for the 1990s Washington, DC, American Society lor Microbiology. 1992a. pags. 169-82. con permiso.

competitivos. Los ensayos competitivos generalmente consisten en antigenos sin embargo, la unin de anticuerpos especficos para haptenos a su ligando acoplados a una enzima que funciona como sonda. Sin embargo, en otros for- causa la inhibicin de la actividad enzimtica. Los haptenos libres presentes matos de ensayo, el antgeno (analito) se puede conjugar al sustrato o a un en la muestra o en el estndar liberan esta inhibicin compitiendo por la unin grupo prosttico de la enzima. Por el contrario, los ensayos de unin no coma los anticuerpos. Asi, la actividad enzimtica es proporcional a la concentrapetitivos emplean un conjugado compuesto por un anticuerpo acoplado a una cin de haptenos libres. Como regla general, el anticuerpo inhibe a la enzima enzima. De entre los distintos tipos de mtodos mencionados, se presta espeinduciendo o impidiendo cambios conformacionales necesarios para la activicial atencin a cinco EIA homogneos. dad enzimtica (Rowley, 1975). La excepcin al mecanismo de inhibicin es el ensayo EMIT para la troxina, que emplea la malato deshidrogenasa. En este ensayo, el conjugado de tiroxina-malato deshidrogenasa es inactivo enziInmunoensayo de multiplicacin enzimtica mticamente, pero pasa a una conformacin activa cuando se une al anticuerpo anti-tiroxina (Ullman, 1979). Se cree que la tiroxina conjugada inhibe EMIT, el primer EIA homogneo, fue desarrollado por Rubenstein (1972). la enzima mediante su unin al dominio cataltico, aumentando asi la K "apaEl sistema de EMIT est esquematizado en la Figura 3 5 - 1 5 . En el EMIT, la rente" del sustrato. El anticuerpo reactiva a la enzima sacando a la tiroxina del conjugacin de las enzimas a haptenos no afecta a la actividad enzimtica;

Forma inactiva del compi ej o enzimtico

Enzima

Forma activa del con jugado enzima-analito Figura 35-15. Diagrama del sistema de inmunoensayo por multiplicacin enzimtica (EMIT) La actividad de una enzima que acta c o m o sonda est inhibida por la unin del anticuerpo con el antigeno (analito) conjugado con la enzima. El analito normalmente es un hapteno. Como enzimas se suelen usar la glucosa-6-fosfato deshidrogenasa (G6PD) y la lisozima. En el ensayo, la actividad enzimtica es proporcional a la concentracin de analito. (De Nakamura RM, Kasahara Y, Rechnitz GA [eds]; Immunochemical Assays and Biosensor Technology for the 1990s. Washington, DC, American Society for Microbiology. ASM Press, 1992, con permiso.)

CAPTULO 35

INMUNOENSAYOS E INMUNOQUMICA

837

Haz de excitacin
Figura 35-16. Inmunoensayo con el sustrato marcado con una sonda fluorescente (SLFIA: substrate-labeled fluorescent immunoassay). El sustrato, la |>galactosilumbeliferona. se conjuga con el antigeno (analito) y forma un sustrato no fluorescente El sustrato puede ser escindido por la enzima (1 gaiactosidasa para formar un producto fluorescente. Sin embargo, cuando el conjugado sustrato-antigeno reacciona c o n un anticuerpo especifico para el antigeno, no se produce la escisin del complejo con la enzima (J-galactosidasa En este ensayo, la concentracin del antigeno (analito) es directamente proporcional a la medida de la intensidad de lluorescencia. (De N a k a m u r a RM. Kasahara Y. Rechnitz GA [eds]: Immunochemical Assays and Biosensor Technology lor Ihe 1990s. Washington. DC. American Society tor Microbiology A S M Press, 1992. con permiso.)

dominio cataltico. En el ensayo EMIT, la malato deshidrogenasa y la glucosa6-fosfato deshidrogenasa (G6PD) han resultado las ms tiles porque tienen menos probabilidad de verse afectadas por componentes del suero. Estos ensayos generalmente miden drogas a concentraciones de miligramos por litro. Sin embargo, el ensayo de la digoxina posee un limite de sensibilidad m u y inferior, en un rango de 0,8 a 2 ug'l.

Inmunoensayo fluorescente con un sustrato marcado


El inmunoensayo fluorescente con un sustrato marcado (SLFIA: substratelabeled tluorescent immunoassay) (Burd. 1977) emplea como conjugado un sustrato fluorognico caracterstico, el umbeliferil (i-galactsido, unido a un antigeno (analito). El producto fluorescente que se produce por la accin de la |Vgalactosidasa es la umbelilerona. La enzima fi-galactosidasa no puede actuar sobre el complejo sustrato-antigeno cuando reacciona con un anticuerpo especifico. El antigeno libre (analito) presente en la muestra compite con el antigeno conjugado con el sustrato para formar el complejo inmunologa) (Fig. 35-16). La concentracin del antigeno en la muestra es proporcional a la intensidad de fluorescencia del producto fluorescente resultante. Se puede emplear el SLFIA para detectar drogas y haptenos, y tambin para protenas c o m o la IgG y la IgM. Una desventaja de este mtodo es que no se utilizan las propiedades de amplificacin de la enzima, y por tanto, el sistema de ensayo tiene una sensibilidad limitada en un rango de concentracin molar de analito de 10"' a 10 .
,c

piten por una cantidad limitada del anticuerpo especfico. En el equilibrio, el nivel de conjugado libre es proporcional a la cantidad de antigeno (analito) presente en la muestra. La apoenzima se combina con la forma libre del conjugado, pero no con la que est unida al anticuerpo, para reactivar la actividad de la glucosa oxidasa de forma proporcional a la cantidad de conjugado libre en la mezcla. La enzima activa se genera en este proceso, y adems, se ha incluido un mecanismo de amplificacin dentro de este ensayo. Se ha utilizado el ARIS para analizar la presencia de leolilma y de IgG (Morris. 1981. 1985). Este ensayo, que emplea el conjugado de FAD. se ha adaptado rpidamente a la medida de protenas de elevado peso molecular (p. ej., tiroglobulma [TBG]) (Schroeder. 1985). y para otros haptenos c o m o la fenitoma o diversas hormonas.

Inmunoensayo homogneo de inhibicin enzimtica


El inmunoensayo homogneo de inhibicin enzimtica (EIHIA). desarrollado por Ashihara (1988), consiste en un anticuerpo conjugado con una enzima y un sustrato insoluole. Este ensayo es el ms apropiado para la determinacin d e antgenos (analitos) grandes. El EIHIA puede ser homogneo porque el complejo inmunolgico del conjugado con un antgeno grande bloquea la reaccin enzimtica con el sustrato slido (Fig. 35-18). La u-amilasa se h a utilizado como sonda enzimtica para la deteccin de ferritna y AFP. La reaccin inmune del analito con el anticuerpo conjugado con enzima puede alcanzar su mximo en unos 10 minutos: asi. el EIHIA basado en un ensayo de unin n o competitiva requiere un tiempo de incubacin menor para alcanzar un nivel de deteccin sensible. Empleando este mtodo, el rango de medida de la femtina en suero es de 10 a 800 ng/ml y para la AFP es de 5 a 200 ng.ml. Se ha utilizado la dextranasa como enzima alternativa (Nishizono, 1988). Tambin se h a aplicado el EIHIA en un formato sobre pelcula seca (Ashihara. 1991). La pelcula seca consiste en tres capas principales, cada una de ellas con una zona de revelado para la reaccin inmunolgica y enzimtica. una zona de barrera, y una zona de revelado de color. Se utiliza un inhibidor especifico de la amilasa h u m a n a presente

Inmunoensayo de reactivacin de la apoenzima


El inmunoensayo de reactivacin de la apoenzima (ARIS) es un ensayo homogneo desabollado por Morris (1981) empleando el grupo prosttico, que consiste en un dinucletido de flavm adenna (FAD), conjugado al antigeno (analito) y la apoenzima glucosa oxidasa. Tal y como se muestra en la Figura 35-17, el antigeno (analito) y una cantidad constante del conjugado analito-FAD. com-

838

SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA

Forma activa Figura 35-17. Inmunoensayo de reactivacin apoenzimtica (ARIS). Se emplea el antigeno unido al dinucletido de tlavin adenina (FAD). La apoenzima es la apoglucosa oxidasa, que requiere FAD c o m o cofactor para su actividad. En el ensayo, la concentracin de antigeno (analito) es proporcional a la actividad enzimtica generada. (De Nakamura RM, Kasahara Y. Rechnitz G A [eds]: Immunochemical Assays and Biosensor Technology lor the 1990s. Washington, DC, American Society lor Microbiology. ASM Press, 1992, con permiso.) en suero para prevenir el londo que puede dar el suero. El ensayo para la deteccin de la protena C reactiva del suero (CRP) se completa en 6 minutos, simplemente aplicando la muestra sobre la superficie empleando instrumental qumico seco. Sin embargo, la sensibilidad del sistema sigue siendo inadecuada para su aplicacin en analitos como pueden ser los marcadores tumorales. aplicacin de la tecnologa de ADN recombinante a los inmunoensayos homogneos por Henderson (1986). Microgenics Corp. (Concord, CA) fue capaz de sintetizar una protena de p-galactosidasa dentro de un polipptido de gran tamao (una enzima aceptora [EA]) y de un polipptido pequeo (una enzima donante [ED]). Las EA y las ED se reconstruyen para formar tetrmeros con actividad enzimtica. En el ensayo (Fig. 35-19), un hapteno antgeno (analito) est unido a la ED. y el anticuerpo especfico para ese analito se usa para inhibir el ensamblaje espontneo de la enzima activa. Los antgenos (analitos) presentes en el suero del paciente compiten con los analitos en el conjugado de analito-ED por la unin al anticuerpo, modulando la cantidad de |-galactosidasa activa que se forma. La seal generada por los sustratos de la enzima es

Inmunoensayo mediante clonacin de donadores de enzimas


El inmunoensayo mediante clonacin de donadores de enzimas (CEDA: cloned enzyme donor immunoassay) se consigui por primera vez mediante la

Forma activa

Forma inactiva Figura 35-18. Inmunoensayo homogneo de inhibicin enzimtica (EIHIA). La enzima es la a-amilasa de Bacillus subtilis o la dextranasa de Chaetomium gracile. conjugada con el anticuerpo especfico para un antgeno de alto peso molecular. El antgeno de elevado peso molecular puede ser la ferritina o la a-fetoproteina. La enzima ct-amilasa es inactiva cuando el conjugado enzima-anticuerpo ha reaccionado c o n el antgeno especifico. L a forma activa de la enzima puede reaccionar con un sustrato insoluble. La concentracin de antigeno es directamente proporcional a la actividad enzimtica de la reaccin del ensayo. (De Nakamura RM, Kasahara Y, Rechnitz GA [eds]: I m m u n o c h e m i c a l Assays and Biosensor Technology for the 1990s. Washington, DC, American Society for Microbiology. A S M Press. 1992, c o n permiso.)

CAPTULO 35

INMUNOENSAYOS E I N M U N O Q U M I C A

839

Figura 35-19. Inmunoensayo de donadores enzimticos clonados (CEDA). Los aceptores de enzimas se asocian con los donadores de enzimas para formar un tetrmero de p-galactosidasa activa. El anticuerpo inhibe la asociacin del aceptor enzimtico con el conjugado de antigeno-donador enzimtico. (De Nakamura RM, Kasahara Y, Rechnitz GA [eds): Immunochemical Assays and Biosensor Technology for the 1990s. Washington. DC, American Society for Microbiology, ASM Press. 1992, con permiso.)

directamente proporcional a la concentracin de analito presente en el suero del paciente. El ensayo de la digoxina es un ensayo colorimtrico que no requiere pretratamiento ni prediluciones del suero. El sistema de ensayo es apropiado para su uso en analizadores qumicos automatizados.

Resumen
Los EIA pueden aplicarse a todos los sistemas antgeno-anticuerpo, incluyendo aquellos que implican a protenas sricas, hormonas, drogas, otros antgenos y anticuerpos dirigidos frente a patgenos. Los EIA heterogneos que emplean sustratos cromognicos pueden tener una sensibilidad comparable a la de los RA, y han ganado en aceptacin para su aplicacin en varios inmunoensayos. Algunos EIA heterogneos emplean sustratos sofisticados que generan luz quimioluminiscente y pequeas partculas c o m o fase slida, y son lo suficientemente sensibles para detectar menos de 1 pg'ml de analito. Su sensibilidad es, pues, mucho mayor que la de los RA. Adems, la manipulacin del ensayo se encuentra muy simplificada en los instrumentos totalmente automatizados. En comparacin con los EIA heterogneos, los EIA homogneos poseen ciertas limitaciones en cuanto a sensibilidad, rango de aplicacin y su aplicacin en analitos de gran tamao. Adems, la elevada seal de fondo (ruido) y la relativamente baja seal del ensayo son inevitables debido a la eliminacin de los pasos de lavado para separar conjugados unidos de los libres. Los EIA homogneos son ventajosos porque estn basados en un formato sencillo de ensayo y se pueden adaptar a la instrumentacin automtica preexistente. En este momento, los EIA heterogneos con instrumentos totalmente automatizados, siguen siendo la mejor eleccin en cuanto a sensibilidad y simplicidad, y en cuanto a motivos de seguridad, debido a que no requieren el uso de radioistopos.

tisulares. Los ensayos inmunofluorescent.es en secciones tisulares se encuentran ahora muy establecidos en los laboratorios de anatoma patolgica. Durante los ltimos aos, se han desarrollados muchos procedimientos de FIA para detectar concentraciones de drogas, hormonas y una amplia variedad de protenas y polipptidos (Nakamura. 1992a). Al principio de su desarrollo, los FIAs analticos se vieron dificultados por el descenso de la sensibilidad debido a la fluorescencia de fondo presente en las muestras biolgicas. Gradualmente, la sensibilidad de los mtodos fluorimtricos fue mejorando, y se hizo posible la deteccin de analitos a concentraciones de 10 M. Tambin se consiguieron avances gracias a la mejora de la instrumentacin y la introduccin de sustratos nicos con unas reacciones inmunoqumicas y enzimticas ms ptimas.
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La seleccin del fluorocromo que se va a emplear c o m o sonda es importante. La sonda debera ser estable y debera poseer un coeficiente de extincin molar y rendimiento cuntico elevados. Tambin debera emitir en longitudes de onda apropiadas sin interferir con las reacciones del ligando con su anticuerpo. Cuando se irradian la mayora de los fluorforos o molculas fluorescentes con una longitud de onda apropiada, un electrn de la molcula sulre una transicin al estado excitado. A medida que el electrn vuelve a su situacin inicial, se libera energa fsica en forma de un fotn de menor energa (mayor longitud de onda) que el de la luz excitadora. El espectro de fluorescencia muestra una longitud de onda de mxima emisin, caracterstica de un determinado compuesto fluorescente. Una de las sondas tpicas, el isotiocianato de fluorescena (FITC), tiene un intervalo de tiempo inferior a 1 ns entre excitacin y emisin, mientras que otros compuestos (p. ej., el europio) presentan una fluorescencia retardada con un intervalo de varios cientos de nanosegundos. Los diversos FIA se pueden clasificar en: 1) heterogneos y homogneos: 2) de ligando o anticuerpo marcado; 3) competitivos o no competitivos, y 4) de fase slida o no slida. Se discutirn los mtodos ms empleados.

INMUNOENSAYO FLUORESCENTE Inmunoensayo fluorescente heterogneo Origen y clasificacin


Coons (1941) fue el primero en introducir el uso de compuestos fluorescentes como sondas inmunoqumicas para detectar antigenos en secciones Los protocolos de FIA heterogneos incluyen un paso de lavado para separar las sondas fluorescentes unidas de las libres. El procedimiento de este ensayo es similar al de los inmunoensayos enzimticos heterogneos y los

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SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOIOGA

radioinmunoensayos. La mayora de los ensayos comerciales disponibles emplean un sistema con el antgeno unido a una lase slida o un anticuerpo. El ensayo puede o no ser competitivo, una propiedad que comparte con los RIAylosEIA.

Mtodo fluoroinmunomtrico
El analito reacciona en solucin con un exceso de anticuerpos marcados. Los anticuerpos marcados residuales se unen al exceso de antgeno unido a una tase slida. La matriz de tase slida se lava y la intensidad de fluorescencia se relaciona inversamente con la concentracin de analito. Este mtodo es adaptable para el ensayo de haptenos y protenas complejas. El FIA en fase slida se desarroll para el anlisis serolgico de anticuerpos trente a la rubola, toxoplasmosis, antgenos vricos y anticuerpos antinucleares. Los mtodos de FIA heterogneos para la determinacin de antigeno se desarrollaron para protenas sricas y hormonas, incluyendo inmunoglobulinas. Cortisol, progesterona y tiroxina. La principal ventaja de los FIA heterogneos es la reduccin significativa de la interferencia de sustancias fluorescentes presentes de forma natural en muestras de pacientes, debido a la eliminacin fsica de los tactores de interferencia en el paso de separacin.

de excitacin de luz polarizada vertical, los compuestos fluorescentes en solucin emiten fluorescencia parcialmente polarizada. El principio de polarizacin de la fluorescencia fue aplicado por primera vez a los procedimientos de inmunoensayo por Dandliker (1970. 1973). La luz polarizada que se transmite a travs de la muestra puede excitar la sonda fluorescente independientemente de su unin al anticuerpo. Sin embargo, como se muestra en la Figura 35-20. el movimiento trmico aleatorio da lugar a que pequeas molculas que contienen un hapteno se muevan libremente en la solucin perdiendo su orientacin polarizada. Cuando el antgeno sondado se une a un anticuerpo con una masa molecular superior a los 160 kDa, el movimiento molecular se reduce lo suficiente como para aumentar la seal polarizada. Estudios que emplean anticuerpos marcados o fragmentos de anticuerpos no detectaron cambios en la polarizacin al mezclar antgeno y anticuerpo marcado, aunque la reaccin inmune hubiese tenido lugar. Este mtodo es el ms til para la medida de antigenos pequeos y haptenos (Jolley, 1981). Abbott Laboratories ha adaptado este enfoque para el ensayo de muchas drogas y frmacos en el TDx (Abbott Diagnostics, Abbott Park. IL). Desarrollaron un analizador de nueva generacin, el IMx. para medir molculas de gran tamao molecular como los marcadores tumorales. hormonas y antgenos relacionados con infecciones o anticuerpos (Fiore. 1988). Combinaron dos principios en el ensayo, la polarizacin de la fluorescencia y el inmunoensayo enzimlico con microparticulas (MEIA). La demanda de capacidades de acceso directo impuls a Abbott a desarrollar un analizador de acceso directo, de alto rendimiento y totalmente automatizado, denominado AxSYM. Este sistema es ampliamente utilizado en laboratorios clnicos (Smith, 1993).

Ensayo inmunofluorimtrico por particin radial


En los mmunoensayos por particin radial, se emplea una cromatografa radial y el ensayo se realiza sobre unos filtros de fibra de vidrio (Giegel. 1982). El procedimiento se ha automatizado para el ensayo de hCG y otros diversos analitos presentes en el suero (Rogers, 1986).

Fluoroinmunoensayo en tiempo real


Esta metodologa hace uso de una instrumentacin especial y de sondas fluorescentes especiales para aumentar la sensibilidad del ensayo. Implica el uso de sondas fluorescentes que presentan una fluorescencia retardada con un perodo de tiempo de unos 100 ns o ms entre la excitacin y la emisin. Debido a que la mayora de las sustancias responsables de la fluorescencia de fondo poseen un periodo de decaimiento corto, la medida de la fluorescencia retardada reduce significativamente los efectos de la fluorescencia de fondo. Esto se consigue con un fluorimetro en tiempo real, un instrumento especial que produce pulsos rpidos de luz que excitan al fluorforo. La fluorescencia se mide un poco despus de la excitacin. As, el efecto del fondo inespecfico, que generalmente decae en menos de 10 ns. puede descartarse (Halonen, 1973: Soini, 1983). Los fluorforos que presentan fluorescencia retardada y que se han empleado en estos ensayos (Soini. 1979) incluyen los siguientes: 1. Derivados pirnicos con un periodo de decaimiento de casi 100 ns. 2 Algunos metales raros quelados que poseen un periodo de decaimiento m u y largo de casi 50 ps a 100 ps. Incluyen el europio (Eu '), samario (Sm ') y terbio (Tb ).
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Inmunoensayo de transferencia de la fluorescencia de excitacin


El mtodo de transferencia de la fluorescencia de excitacin (FETI) (UHman, 1976) emplea dos sondas, la fluorescena como donador de fluorescencia y la rodamina como aceptor. El sotiocianato de fluorescena (FITC) tiene un mximo de emisin de 525 n m y la tetraetilrodamma posee un fuerte pico de absorcin a 525 nm. Asi. cuando el antigeno marcado con FITC y el anticuerpo marcado con rodamina se unen, se produce un apagamiento (quenching) de la lluorescenca del FITC. Este fenmeno implica una transferencia de energa de una sonda electrnicamente excitada a una sonda aceptora. La tasa de transferencia de la energa es inversamente proporcional a la sexta potencia de la distancia entre las molculas donadora y aceptora. Para que se produzca una reduccin apropiada de la fluorescencia con el apagamiento, la distancia entre donador y aceptor debe ser de unos 50 a 70 A. Este mtodo resulta til para el ensayo de antigenos con determinantes antigenicos multivalentes. Porciones separadas de un anticuerpo especifico se marcan con fluorescena y rodamina. La mezcla de anticuerpos marcados con fluorescena y rodamina reduce la intensidad de seal de la fluorescena ajustando la proporcin y la cantidad de donador y aceptor para que puedan reaccionar en proximidad para permitir la transferencia de energa. Estos problemas se han superado empleando nuevos compuestos fluorescentes. Se han conseguido mejoras en el mtodo FETI usando un marcador fluorescente como el criptato trisbipiridnico de europio (III) [Eu ] como donador y un fluorforo como la aloficocianina como aceptor (Alpha. 1987: Malhis. 1995). Estos compuestos transitorios poseen un elevado desplazamiento de Stokes en el que el Eu excitado a 337 nm transfiere energa a travs de una molcula aceptora a una excitacin de 620 nm y finalmente emite luz fluorescente a 665 nm en un formato en tiempo real. Mathis (1993) ha desarrollado la transferencia de energa mediante la resonancia de fluorescencia (FRET) empleando un metal quelante de criptatos y lo ha aplicado a la deteccin de AFP y del antgeno carcinoembrinico (CEA) en el suero. CIS Bio International (Cedox. Francia) desarroll un inmunoensayo homogneo automatizado, KRYPTOR. para la deteccin de marcadores tumorales como el CEA. CA 19-9. CA 125 y AFP empleando la emisin del criptato amplificada en tiempo real (TRACE). La sensibilidad para la AFP era de 0.25 ng.'ml con nueve minutos de incubacin
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Los fluoroinmunoensayos en tiempo real se han desarrollado para medir muchos analitos, incluyendo la hCG, IgG, Cortisol, insulina y otros.

Inmunoensayo fluorescente homogneo


Por definicin, estos inmunoensayos se hacen en muestras homogneas. No requieren la separacin de los conjugados unidos y libres y. normalmente, no son sensibles a las interferencias de fondo de las muestras. Los FIA homogneos tambin poseen la ventaja de ser rpidos Sin embargo, cuando se comparan con los ensayos heterogneos, presentan ciertas desventajas. Los FIA homogneos tienen una sensibilidad limitada de aproximadamente 10 molar con una instrumentacin estndar. Pueden existir impurezas marcadas que aumenten las interferencias de fondo. Los ensayos requieren un antigeno marcado o anticuerpo especifico relativamente puros, y una instrumentacin especial para alcanzar una mayor sensibilidad.
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Ensayo de polarizacin de la fluorescencia


Una lente polarizante o un prisma pueden resolver la luz en rayos de un solo plano. Cuando se observa desde un ngulo recto con respecto al haz

CAPTULO 35

INMUNOENSAYOS E I N M U N O Q U M I C A

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Baja p o l a r i z a c i n Figura 35-20. Principio del inmunoensayo de lluorescencia polarizada (FPIA). A. en la ausencia de anlgeno, el conjugado marcado con una molcula fluorescente (F) se une al anticuerpo. Debido a su gran tamao molecular de ms de 160 kDa. la rotacin molecular del F unido se ve reducida y se mantiene la polarizacin 8. en la presencia de antgeno. hay menos conjugado unido ai anticuerpo, de m o d o que puede rotar libremente en la solucin, dando lugar a una disminucin de la seal polarizada.

Inmunoensayo de fluorescencia protegida


En este ensayo (Nargessi. 1979). el antgeno proteico se marca con fluorescena y a continuacin se hace reaccionar con un anticuerpo especfico para el antgeno. El anticuerpo especifico inhibir estricamente la reaccin de un segundo anticuerpo especfico para la fluorescena. que funciona absorbiendo la fluorescencia de la fluorescena cuando se une al fluorforo. La habilidad del anticuerpo especfico para la fluorescena de interaccionar con la fluoresceina cuando est unida a la superficie del antigeno se ve disminuida. El procedimiento se puede emplear para el ensayo de concentracin de anticuerpos o de antgenos (analtos) en un sistema homogneo.

tro-CLIA. se pueden aplicar para los ensayos de diagnstico prctico, y sus caractersticas se describen a continuacin

Ensayo quimioluminiscente usando esteres de acridinio como marcadores


En este mtodo (Weeks. 1983). los esteres de acridinio (Fig. 35-21) se conjugan directamente con molculas proteicas. Los esteres de acridinio pueden reaccionar oxidativamente con el H-0 en condiciones alcalinas, para producir intermediarios muy energticos que se descomponen en el fragmento excitado, generando luz. La emisin de luz por parte de los esteres de acridinio es muy rpida, en unos 5 a 10 segundos despus del inicio de la reaccin de oxidacin. La quimioluminiscencia de tipo flash, como se conoce este proceso, posee una relacin entre el espectro de emisin y el tiempo de reaccin con una pendiente mucho ms acusada que la quimioluminiscencia de tipo resplandor generada mediante enzimas. La sensibilidad de este ensayo es mayor que la de un RA, y lleva menos tiempo. La solubilidad de los esteres de acridinio y la estabilidad de los conjugados con protenas durante periodos de almacenaje se han mejorado mediante la modificacin de la molcula y la qumica de la conjugacin. Esta tecnologa probablemente aporte mejoras para los ensayos de algunos haptenos y de hormonas.

INMUNOENSAYO QUIMIOLUMINISCENTE Origen


Los inmunoensayos quimioluminiscentes emplean como sonda molculas que generan quimioluminiscencia, como pueden ser derivados del luminol. esteres de acridinio, o derivados del nitrofenil oxalato y tri-bipridil rutenio [Ru(bpy).'i con tripropilamina (TPH) para la electroquimioluminiscenca. Bsicamente, el mtodo del ensayo no difiere del de los inmunoensayos heterogneos. RA y FIA. La generacin de luz por derivados del luminol requiere OH iHfi. como iniciador qumico, o H,0 con la peroxidasa como iniciadores de la quimioluminiscencia potenciada. Los esteres de acridinio estimulados qumicamente con OH H O muestran un rendimiento cuntico quimioluminiscente relativamente elevado comparado con el luminol. Otras molculas quimioluminiscentes incluyen la acuorina. un compuesto natural (Ador. 1998). Las sondas de compuestos quimioluminiscentes producen luz elelroquimicam e n t e en la superficie de electrodos y se pueden aplicar en formatos de ensayo homogneos. Tanto los CLIA que usan esteres de acridinio. como los elec; ;

Inmunoensayo electroquimioluminiscente
El ECLIA emplea compuestos electroqumicos como sondas que generan luz electroqumicamente, asociada al ciclo reactivo de la reaccin de oxidacin-reduccin. Con la optimizacin de las soluciones de reaccin, la seleccin del mtodo de conjugacin apropiado y el desarrollo de compuestos como el Ru(bpy), y el TPA, se hizo posible aplicar la tecnologa quimioluminiscente a los inmunoensayos (Blackburn, 1991).
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INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA

Protena Figura 35-21. Mecanismo del inmunoensayo quimioluminiscente con un ster de acridinio basado en la descomposicin oxidativa.

El Ru(bpy), * tiene un sitio de reaccin para la conjugacin de analitos usando un reactivo de activacin como el NHS. El Ru(bpy), -, conjugado con los anticuerpos, se puede aplicar a ensayos de tipo sandwich para molculas grandes. El conjugado genera luz en la superficie de electrodos de oro. El Ru(bpy), - en una fase slida y el TPA se oxidan en la superficie de los electrodos para formar Ru(bpy)/' y TPA ', respectivamente. El TPA-' pierde electrones de forma espontnea. El Ru(bpy) - puede generar una emisin de luz de 620 nm cuando vuelve a Ru(bpy)., - como estado basal a travs de una reduccin con TPA'. La eficacia de generacin de la luz (rendimiento cuntico) depende de la proximidad entre el electrodo y el conjugado, y por tanto, de la difusin del conjugado. Los conjugados libres pueden generar ms luz que los conjugados fijados a una fase slida como resultado de una reaccin inmune. Esto permite un acceso fcil al formato de ensayo homogneo, pero un ruido de fondo relativamente alto interfiere con la sensibilidad del ensayo, al igual que en otros ensayos homogneos. El protocolo de ensayo para la determinacin de analitos es el siguiente: microparticulas magnticas cubiertas de anticuerpo como fase slida se mezclan con la muestra para permitir la reaccin inmune. Despus de lavar para separar los conjugados libres de los unidos, una solucin con la fase slida se introduce en un detector que posee un electrodo para medir la quimioluminiscencia. El limite de deteccin de un ECLIA se ha descrito de 0,2 ng/ml a 0,4 ng/ml para el CEA y de 0,4 ng/ml para la AFP. Este ensayo no requiere instrumentos complicados. Otra ventaja es que el ECLIA requiere menos tiempo para la deteccin de la seal que los FIA y otros CLIA.
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eran de alto rendimiento, sensibles y de acceso directo. Los antgenos asociados con el inicio de una enfermedad infecciosa, citocinas y factores de crecimiento como la calcitonina, existen en concentraciones m u y bajas en el suero, necesitando as un sistema de deteccin m u y sensible para poder medir estos analitos (Nishizono, 1991: Isomura. 1994, 1999). De entre los muchos mtodos, los ensayos quimioluminiscentes y sus enzimas son los sistemas de ensayo ms sensibles capaces de detectar analitos presentes en concentraciones m u y bajas. Los instrumentos totalmente automatizados de los que se dispone ahora son tambin capaces de utilizar inmunoensayos enzimticos fluorescentes. Estos sistemas de ensayo se clasifican en varios grupos basndose en la generacin y deteccin de las seales y el tipo de fase slida. Con respecto a la deteccin de la seal, el AIA1200, 600 (Toso, Tokio. Japn) y el AxSYM (Abbott, Abbott Park, IL) emplean un mtodo de fluorescencia del inmunoensayo enzimtico que usa la fosfatasa alcalina con un sustrato especifico, el 4-metilumbeliferil fosfato. Hay tres tipos de sistemas disponibles para los inmunoensayos enzimticos de quimioluminiscencia. Lumipulse (Fujirebio. Tokio, Japn). Access (Sanofi Diagnostics Pasteur. Caska, MN) y IMMULITE (Diagnostic Products Corp.. Los Angeles, CA) han utilizado un sustrato quimioluiminiscente estable, el fenilfosforiladamantildioxetano, para la fosfatasa alcalina (Nishizono, 1991; Patterson, 1994: Babson, 1991). El ster de acridinio como sonda quimioluminiscente se ha aplicado en el ACS 180 (Bayer Diagnostics, Tarrytown, NY). En el ELECSYS 2010 (Roche Diagnostics. Indianapols. IN), se usa el Rufbpy)/' como sonda quimioluminiscente (Erler, 1998).

AUTOMATIZACIN INSTRUMENTAL Y MODULACIN DE LOS SISTEMAS DE ENSAYO Sistemas de ensayo homogneos


A pesar de que muchos inmunoensayos homogneos se han desarrollado para protocolos manuales descritos en este captulo, la mayora de ellos no han sido automatizados todava. Para el mtodo EMIT, se pueden adaptar analizadores qumicos genricos automatizados (Boyd, 1985). Algunos instrumentos estn disponibles para los inmunoensayos fluorescentes homogneos, pero estos sistemas no son intercambiables entre s. El sistema CIS Bio KRYPTOR se ha desarrollado con caractersticas especiales, incluyendo el uso de un detector de fluorescencia en tiempo real, y usa un mtodo de dos longitudes de onda para la correccin interna del estndar de intensidad de fluorescencia a 620 nm y 665 nm, haciendo posible que se aumente la sensibilidad del lmite de deteccin.

Secuencia prctica del inmunoensayo en el sistema analtico


La demanda de mercado esperaba una instrumentacin capaz de realizar un gran nmero de ensayos con capacidad de acceso directo. Para cumplir estas necesidades, es necesario mejorar los reactivos y evitar el tedio que implican los inmunoensayos heterogneos. Para simplificar el sistema para su posterior aplicacin en un sistema de ensayo totalmente automatizado, se disearon cartuchos individuales de reactivos previamente empaquetados, o reactivos ya dispensados en cubetas de reaccin. Un sistema genrico para los inmunoensayos con sondas heterogneas est esquematizado en la Figura 35-22. El operador selecciona los componentes del ensayo mediante un programa de ordenador y carga los cartuchos de reactivos o las botellas para cada ensayo. Para un analito concreto, los cartuchos y la cubeta de reaccin se introducen de forma automtica en el instrumento. Las muestras se transportan a la posicin apropiada para la dispensacin. El ensayo est diseado para emplear bandejas de reaccin o rotores que automatizan los pasos de mezclado y separacin, que dependen del funcionamiento de la primera y segunda inmunoreaccin, y la reaccin de generacin de la seal. Todos los pasos de la reaccin tienen lugar de forma secuencial en la lnea de reaccin y las seales generadas se miden mediante un detector. Los resultados del ensayo se imprimen en los siguientes 20 a 40 minutos y se envan automticamente a travs de la red al ordenador pertinente. El sistema puede tratar entre 60 y 200 ensayos por hora, procesando de 10 a 20 analitos en cada muestra en este sistema de acceso directo.

Sistemas de inmunoensayo heterogneos


Hasta el principio de los aos 80, la mayora de los inmunoensayos heterogneos se hacian de forma manual. Entonces Boehnger-Mannheim (que se fusion con Roche Diagnostics en 1998) desarroll un analizador de acceso directo totalmente automatizado, el ES-600, basado en los inmunoensayos enzimticos colorimtricos que empleaban la peroxdasa de rbano como enzima (Wu. 1987). Al final de los 80, muchas compaas trataron de desarrollar sistemas de inmunoensayo enzimtico totalmente automatizados, que

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INMUNOENSAYOS E I N M U N O Q U M I C A

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Instrumentacin y puntos clave para un inmunoensayo heterogneo


Aunque el principio del ensayo es bastante similar en muchos instrumentos, pueden existir grandes diferencias entre los instrumentos con respecto al formato de la loma de muestras, control de la temperatura, la separacin BF, el arrastre, flujo de los desechos y dems. Asi. debemos prestar atencin a lo bien que funciona el instrumento despus de su puesta en marcha.

Cubeta de reaccin
En un sistema de inmunoensayo. es muy importante disear las caractersticas de la cubeta con cuidado para obtener datos reproducbles. Los fabricantes emplean estas cubetas para posibilitar un maneto rpido de los reactivos y del acceso directo. Se ha introducido un tipo de cubeta en un solo paso que contiene los reactivos y la unidad de reaccin en el sistema Lumipulse. El sistema Immulite emplea una unidad de reaccin para la separacin B.'F. El

Figura 35-22. Breve diagrama de un sistema de inmunoensayo totalmente automatizado en un laboratorio clinico de automatizacin.

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INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA

Tabla 35-8 Nueva generacin de sistemas de inmunoensayo heterogneos AIA-21 (TOSOH) Paquele de reactivos Cubeta de reaccin Principio de la reaccin Sustancia marcada Sustrato enzimtico Detector de la seal Formato del ensayo Pretratamiento Flujo de la reaccin Duracin del ciclo (seg) Duracin de la reaccin (min) Temperatura de la reaccin Numero mximo de analitos Capacidad (ensayos/hora) Fase shda Tiempo del primer resultado (min) Separacin B/F Mtodo de muestreo Aulodilucin de la muestra Liotilizado y empaquetado en porciones Recipiente de reaccin Inmunoensayo enzimtico fluorescente Fosfatasa alcalina 4-metilumbeliterl tosalo Fluorescencia S-1. S-2, competitivo Si Rotatoria 30 10 o 40 min 37C 20 120 Partcula magntica (bcad> 50 Campo magntico Pipeteando la sonda S ACS:CENTAUR ARCHITECT (ABBOTT) (BAYER DIAGNOSTIC) Paquete de reactivos (en solucin) Cubeta desechable Inmunoensayo quimioluminiscente Ester de acndinio Ninguno Quimioluminiscencia S-1, S-2, competitivo S Rotalona 15 7 5-36 37"C 30 240 Partcula magntica 8-40 Campo magntico Chip desechable Si Solucin en una botella Cubeta desechable Inmunoensayo quimoluminiscente Ester de acndinio Ninguno Quimioluminiscencia S-1, S-2, competitivo S Rotalona 18 29 37"C 25 200 Partcula magntica 30? Campo magntico Sonda fija Si ADVIA IMS (BAYER DIAGNOSTICS) Particulas secas en la cubeta de reaccin Recipiente de reaccin Inmunoensayo quimioluminiscente Fosfatasa alcalina? Foslato de dioxelano? Quimioluminiscencia S-1, S-2, competitivo ? Rotatoria 36 20 37"C 36 100 Partcula magntica
?

Campo magntico Pipeteando la sonda (tcnica del aceite) Si

AxSYM (Abbott Laboratories) emplea otra unidad de reaccin nica que consiste en pocilios para el reactivo, la incubacin y para la muestra dentro de una misma cubeta. El programa combina el contenido de esta cubeta en una unidad rnatricial. Esta ltima puede emplearse para captar la fase slida de ltex, seguida de una separacin B'F y de una segunda reaccin inmune de anticuerpo marcado con la fase slida.

Tipo de toma de muestra y dispensacin de fluido


En general, el sistema por el que se dispensan los fluidos puede ser de dos tipos diferentes, un chip desechable o una punta fija. La contaminacin entrecruzada de muestras debe evitarse en todos los sistemas de ensayo. Con el chip desechable se pueden prevenir por completo estas contaminaciones. En el caso del sistema con punta fija, aunque la muestra original se divida en varias alcuotas pequeas, la contaminacin entrecruzada sigue ocurriendo. As, el sistema del chip desechable es la mejor forma de evitar la contaminacin y de minimizar los desechos biopeligrosos. Por otro lado, el coste de emplear estos chips para el ensayo es superior al del sistema de punta fija. Tambin deben tomarse en consideracin las consecuencias medioambientales de los chips desechables.

fase slida. Los sistemas I M x y AxSYM emplean micropartculas de ltex como fase slida y emplean una membrana porosa para atrapar el ltex para la separacin de particulas de la fase slida de la lquida. Diagnostics Product Corp.. Los Angeles. CA ha desarrollado una unidad para los sistemas de separacin B/F, en la que la solucin de reaccin sale de una unidad interior a una exterior de desechos, mientras que la fase unida permanece en un lecho de fase slida (0,5 cm). Una ventaja de estos formatos, es que evitan la contaminacin entrecruzada y el arrastre de una mezcla de reaccin a la siguiente, y no requieren un proceso excesivo de lavado. Todos los dems sistemas emplean particulas magnticas (magnette partiles y magnelic beads) en las que se puede conseguir una separacin rpida y fcil, mediante la aplicacin de un campo magntico.

Nuevos sistemas para la prxima generacin (sistemas modulares)


La Tabla 35-8 compara varios sistemas de inmunoensayo de alto rendimiento comercial que se han introducido en los ltimos aos. Muestra las especificaciones instrumentales de cada analizador. Reduciendo los tiempos de incubacin y de reaccin, se puede obtener un resultado rpido en unos 1 0 a 25 minutos. As, es posible una mquina de alto rendimiento que realiza de 120 a 200 ensayos por hora. Adems, varios fabricantes han demostrado un nuevo concepto de sistema, que alinea los distintos sistemas analticos que se necesitan en un laboratorio clnico. Muchos laboratorios clnicos han introducido un sistema de transporte de muestras que se conecta con distintos instrumentos analticos controlados de forma independiente. Sin embargo, algunos analizadores no son aplicables a este sistema porque la velocidad del instrumento o la duracin de su ciclo no se puede armonizar fcilmente con el resto de software y hardware. Para solucionar estos problemas. ARCHITECT (Abbott Laboratories) es un ejemplo de una mquina de nuevo concepto, en el que un sistema de ordenadores puede controlar varios analizadores de inmunoensayo conectados a un analizador qumico. El ADVIA IMS. basado en un concepto similar, ha sido introducido por Bayer Diagnostics (Tarrytown. NY), que puede realizar qumica clnica e inmunoensayos en una misma plataforma. Hay otras combinaciones basadas en este concepto todava en desarrollo, que harn posible la simplificacin del laboratorio clnico a un coste final inferior.

Arrastre
El arrastre de una muestra a la siguiente de un analito a una concentracin extremadamente alta, puede a veces dar lugar a diagnsticos clnicos errneos. Un tubo de plstico desechable para la muestra es la forma ms sencilla de evitar este problema. Por el contrario, el sistema de punta fija tiene varias ventajas econmicas c o m o se ha mencionado antes. Asi, la mayora de las tcnicas que conciernen a la ingeniera de las muestras se han concentrado en minimizar el arrastre de la muestra mediante pasos de lavado y mantenimiento de la punta. Ahora, hay varias puntas fijas que permiten limitar el arrastre a menos de un orden de 10'. Incluso con un arrastre tan bajo, algunas muestras todava crean problemas (p, ej., una muestra fuertemente positiva para un antgeno de superficie de la Hepatitis B [HBsAg]. seguida de una muestra negativa). En este caso, se puede emplear un sistema de software para comprobar dicho resultado, mediante un reanlisis automtico de los valores positivos semanales que han seguido a resultados fuertemente positivos.

Separacin B/F y sistemas de lavado


En un inmunoensayo heterogneo, el conjugado unido debe separarse de la sonda libre. Esta separacin B'F depende de las caractersticas de la

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INMUNOENSAYOS E I N M U N O Q U M I C A

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SISTEMAS DE ENSAYO SIMPLES Y RPIDOS PARA SU USO EN LOS PUNTOS DE ATENCIN AL PACIENTE Origen
Una fuerte demanda para un ensayo que pueda realizarse en casa (p. ej., hCG para el diagnstico del embarazo) ha simplificado el formato de los inmunoensayos: el ensayo debe ser sencillo, rpido y reproducible. Teniendo en cuenta estas metas, se han desarrollado muchos ensayos de hCG y esto h a dado como resultado una primera generacin de formato de ensayo de inmunoensayo enzimtico de flujo.

Instrumentos de ensayo de flujo (instrumentos de ensayo por inmunofiltracin)


La Figura 35-23 ilustra esquemticamente un instrumento tpico de inmunoensayo de flujo, el ICON hCG (Hybritech Incorporated, San Diego. CA), que consiste en una membrana porosa con anticuerpo anti-hCG inmovilizado y un parche absorbente bajo la membrana (Valkirs. 1985). El principio del ensayo y el procedimiento se describen a continuacin. Varias gotas de la muestra de orina se aplican sobre la membrana. La orina es absorbida por el parche y entonces se aade el tampn de lavado por goteo y a continuacin una solucin con un anticuerpo anti-hCG conjugado con la loslatasa alcalina.

Tiras reactivas
Tambin se h a desarrollado un formato en tiras reactivas que reduce el coste de los materiales en comparacin con el formato del ensayo de flujo En este formato, la tira del ensayo contiene un rea con un punteado de anticuerpo en la punta de la tira. El ensayo puede llevarse a cabo de la siguiente manera: 1) se introduce la tira en un recipiente que contiene la muestra; 2) se introduce la tira en un recipiente de lavado: 3) a continuacin se introduce la tira en una solucin de marcado: y 4) finalmente se introduce la tira en un revelador de color si es necesario.

La inmunocromatografa consiste en la separacin B. F y generacin de la seal simultneas, seguidas de un flujo lateral sobre un material poroso, como una membrana de nitrocelulosa o una lmina de libra de vidrio. A travs de la accin capilar de la membrana, el analito de la muestra puede migrar del extremo proximal al distal. donde existe un parche absorbente para mantener una velocidad de flujo capilar constante. La zona de carga de muestra, la de mareaje y la de deteccin se encuentran entre los dos extremos. El mtodo inmunocromatogrfico se clasifica en varios formatos. La Figura 35-24 muestra los formatos inmunocromatogrficos tpicos El extremo proximal se usa como puerto de carga de la muestra, y est conectado a un parche que contiene el antigeno o anticuerpo marcado, debajo del cual hay una membrana de nitrocelulosa en contacto con el parche que funciona como una zona de deteccin. El extremo distal de la membrana se encuentra unido a un parche absorbente que funciona como una fuente de fuerza capilar. La muestra, cargada por goteo, reconstituye el anticuerpo o antigeno conjugado con un coloide de oro o ltex coloreado, que forma un inmunocomplejo con el analito que se detecta, y este complejo migra a la zona de deteccin. El anticuerpo o el antigeno inmovilizado en la zona de deteccin puede captar el complejo y formar una linea roja o azul positiva. El exceso de sustancia de mareaje migra hasta el parche absorbente. La fase mvil en una migracin es la propia muestra. Muestras muy coloreadas debido a una elevada concentracin de bihrrubina o hemoglobina, por tanto, pueden interferir en la lectura de los resultados a simple vista. En este formato, la seal que debe detectarse se produce en la zona de deteccin con una zona donde se concentran partculas coloreadas. Yamauchi y sus colaboradores (1997) han establecido un nuevo formato en plataforma en el que se puede llevar a cabo el EIA de forma automtica, incluyendo un paso de lavado. El instrumento aparece de forma esquemtica en la Figura 35-25. En este formato, la posicin de cada una de las zonas es completamente diferente a la del resto de las mmunocromalografas mencionadas anteriormente. El extremo proximal tiene una solucin de revelado, que hace posible que se lleve a cabo el proceso de lavado espontneamente mediante el flujo capilar. La muestra se aplica sobre un parche que est en el centro del instrumento y contiene un conjugado marcado seco. El extremo distal se conecta a un parche absorbente. Se aaden dos gotas de la muestra al parche para que reaccione con el conjugado despus de su reconstitucin. La mezcla de reaccin que contiene el inmunocomplejo formado por el analito y el anticuerpo marcado puede extenderse a ambos extremos. Cuando se abre el recipiente que contiene la solucin de revelado, el sustrato deshidratado se reconstituye y pasa a ser el sustrato de la enzima soluble en la zona de deteccin. En este momento, el flujo se dirige hacia el extremo distal. Los componentes del suero y el exceso de conjugado que no ha reaccionado se lavarn hacia el parche absorbente. Si la muestra contiene el analito, el anticuerpo inmovilizado captura el complejo en la zona de deteccin para formar una linea coloreada. Este mtodo presenta algunas ventajas que difieren de otros instrumentos inmunocromatogrficos que se revelan con la muestra. En estos instrumentos, un suero hemolitico o lipmico puede interferir en la evaluacin del resultado del ensayo a simple vista debido a un elevado color de fondo. Sin embargo, el tipo de instrumento anterior con un reservorio conectado puede no tener interferencias de estos componentes coloreados. Este instrumento ha sido til en la deteccin de HBsAg. anticuerpos anti-HB (Yamauchi. 1997) y anticuerpos frente a T. pallidum (Hasegawa, 1995). La mayora de los componentes, como la membrana, el parche absorbente y el compartimento para la muestra tienen su sitio dentro de un molde de plstico.

Instrumentos inmunocromatogrficos
Con el fin de eliminar pasos de adicin de reactivos en estos dos formatos, se han conseguido importantes mejoras empleando tcnicas inmunocromatogrficas. que han dado lugar a un inmunoensayo simple y rpido.

Membrana de nylon

Resumen
Los instrumentos de inmunoensayo rpidos y sencillos se resumen en la Tabla 35-9. Estos instrumentos se pueden clasificar en tres tipos principales (de flujo, Figura 35-23. Inmunoensayo de flujo, Seccin transversal de un Hybritech ICN de impregnacin o tiras reactivas y de inmunocromatografia) y combinaciones y vista superior del instrumento. Los anticuerpos de captacin se encuentran inmovilizados en el centro de una m e m b r a n a de nylon que posee un parche absorben- de estos tres formatos. La mayora de los instrumentos inmunocromatogrficos te para absorber el fluido de la muestra que no ha reaccionado, el conjugado mar- emplean conjugados marcados directamente, coloides de metal o ltex coloreado. Estos tipos de formato resultan apropiados para la migracin del inmunoc a d o y el tampn de lavado. El ensayo puede llevarse a cabo de forma secuencial. complejo, junto con la migracin de la solucin de muestra. Sin embargo, muparecido a un inmunoensayo enzimtico en dos pasos.

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SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA

Figura 35-24. Tira reactiva para un ensayo inmunocromatogrfico tpico mediante adicin de la muestra. El desarrollo del ensayo se muestra en la parte inferior de esta ligura. Generalmente, el extremo proximal funciona c o m o porcin de carga de la muestra y consiste en un parche que contiene el anticuerpo o antgeno marcado con ltex coloreado o coloides de oro. El analto de la muestra forma un complejo con el conjugado y migra a la zona de deteccin, inmovilizando asi el anticuerpo de captura para forma una linea coloreada positiva. El conjugado y la muestra sobrante migran al extremo distal de la tira.

chos de estos instrumentos requieren un gran volumen de muestra, de 100 iil a 200 ul. Por otra parte, aunque se necesita revelador, el instrumento de tipo EIA permite que el ensayo se desarrolle empleando una menor cantidad de muestra, 25 ul. La corriente actual de ensayos rpidos para POCT se orienta hacia ensa-

yos que emplean instrumentos de inmunocromatografa porque una persona con prctica, como puede ser un usuario en su propia casa o una enfermera, puede realizar el ensayo correctamente de acuerdo con las instrucciones del fabricante, a diferencia de otros instrumentos de inmunoensayo (Kasahara, 1997).

Figura 35-25. Instrumento inmunocromatogrfico que emplea EIA. Se aplica un mtodo de amplificacin sensible a la inmunocromatografa empleando una enzima. La muestra se aade en la zona de carga de la muestra en el centro de la tira. En este mtodo, se emplea una solucin de revelado como fase mvil, que puede servir como tampn de lavado. El dibujo de la derecha de la figura muestra una carcasa de plstico y los resultados de un ensayo para anticuerpos TP.

Tabla 3 5 - 9 Especificaciones sencillas y rpidas para los instrumentos de inmunoensayo Principio del ensayo Nombre del kit ... . (analito) _. Tipo de muestra Volumen de muestra (ul) 5C 150-200 Fase mvil Tiempo de reaccin (min) 5 15 5 3 5-10 5-15 15 5-10 15-20 5-20 -15 15 Sensiblilidad Alojamiento Fabricante

Formato inmunocromatogrfico Un paso Helisal One Step (Helicobacter pylori) (todo en uno) Biocard Troponin I test Clearview hCG II QuickVue One-Step hCG CARD-I-KIT Troponin I TROPT Troponin T Determine HBsAg BioSign Tumor HBs Insta test EASY-SURE HBsAg
Toot

Sangre Suero Orina Orina Suero Sangre Sangre/suero Sangre/suero Sangre/suero Suero Sangre Sangre

Plasma Suero Orina Orina Suero Plasma Plasma/suero Revelador Plasma/suero Suero Revelador Plasma

Igual que ELISA 0.1 ng/ml 25 mlU/ml 25 mlU/ml 0,1 ng/ml 0.1 ng/ml 1 ng/ml?

MP"' MP MP MP MP MP TS' 'IF MF TC' MP MP


1

?
3 gotas (75?) 4 gotas (100?) 150 50 50 200 100-150 1 gota colgante

Cortecs Diagnostics Ltd. ANI Biotech oy Unipath Limited QU1DEL AboaTech Ltd. Roche Diagnostics' Abbott Princeton BioMeditech Corp. Morningstar Diagnostics West Wind Plus, Inc. Craig Medical Distribution. Inc. Biosite Diagnosticst

0.5 ng/ml 1 ng/ml >4 ng/ml

PSA RapidScreen Test Triage Cardiac (Myoglobin CK-MB Troponin-I) AMRAD ICT Hepatitis B Espline HBs-Ag TestPack PLUS hcG EASY-SURE HIV 1/2

Sangre/suero Plasma/suero Suero/orina Plasma/suero

?
25 25 40

Sangre/suero Revelador Suero/orina Revelador

5-15 15 5 10

2 ng/ml 0.5 ng/ml 50 mlU/ml

ccMP MP CC

Dos pasos

Amrad Corporation Ltd. Fujirebio Inc. Abbott West Wind Plus. Inc.

Mtodo inmunocromatogrfico de tiras reactivas AimStick PBD Orina

Volumen de la inmersin
22

Orina

20 mlU/ml

Craig Medical Distribution Dainabot Hybritech, Inc. Nyco Diagnostic Morningstar Diagnostic Orgenics

Dainascreen HBsAg Formato de flujo ICON-II hCG NycoCard CRP Chagas dobule-spot test Combinacin de inmunocromatografia y flujo DoubleCheck HBsAg

Plasma/suero Suero Plasma de sangre completa Suero/plasma

Plasma/suero + solucin del conjugado Tampn, etc. Tampn, etc.

15

3,1 ng/ml

rs
TC MP

50 1 gota

2 10

10 ug/'ml 1

Suero/plasma

Tampn. etc.

15

2 ng/ml

MP

MP = reprsense moldes de plstico (moling plstic): TS = representa tiras reactivas {test strip): TC = representa una tapeta de reaccin ((es cara). CC = epresenta un tariete'o (cara case) Datos de T o w t (1995) t Datos de Bruni (1999)

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BIBLIOGRAFIA

SECCIN V

INMUNOIOGI'A E INMUNOPATOLOGIA

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CAPTULO 35

INMUNOENSAYOS E I N M U N O Q U M I C A

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C A P T U L O

36

Examen de laboratorio del sistema inmune celular


Helene M.A. Paxton, M.S., MT(ASCP) Susana Cunningham-Rundles, Ph.D. Maurice R.G. O'Gorman, M.Sc, Ph. D., D(ABMLI)
CRITERIOS CLNICOS PARA LA EVALUACIN DE LA INMUNIDAD CELULAR: IMPLICACIONES PARA LA INTERPRETACIN Decisin de analizar Inmunodeficiencia primaria frente a la secundaria Significado clnico de las pruebas de inmunodeficiencia Efecto de la edad en la respuesta inmune Malnutricin y respuesta inmune Cncer APROXIMACIN METODOLGICA A LAS PRUEBAS DE INMUNIDAD CELULAR 853 Fases de estudio: fase de exploracin Fases de estudio: fase de confirmacin Fases de estudio: estudios analticos de la inmunidad PROLIFERACIN LINFOCTICA COMO MTODO IN VITRO DE EVALUACIN DE LA INMUNIDAD CELULAR Inmunologa celular Metodologa: determinacin de la activacin y la proliferacin linfoctica en la evaluacin de la inmunodeficiencia celular El conocimiento dei sistema inmune se ha mejorado enormemente gracias a la deteccin de determinadas anomalas en pacientes con sospecha de dficit inmunitario. Estos avances han surgido de estudios de la diferenciacin y funcin de las clulas inmunes normales, de la delecin experimental de genes, y de anlisis detallados de sndromes de inmunodeficiencia humanos. Los nuevos abordajes experimentales han ayudado a dilucidar los mecanismos y las bases funcionales de la desregulacin inmune en pacientes con mutaciones genticas primarias (congnitas) del sistema inmune o de infecciones congnitas secundarias (adquiridas). Por ello, en general, las deficiencias inmunes no se pueden distinguir por la presentacin clnica de las infecciones: la informacin gentica est convirtindose en un importante componente para las pruebas e interpretacin diagnstica. La misin de la inmunologa clnica de laboratorio es transformar las nuevas lneas de investigacin en pruebas altamente estandarizadas y clnicamente relevantes para cada paciente en concreto. Los estudios del sistema inmune celular humano se han centrado principalmente en tres reas: 1) deficiencia inmune primaria, que muestra el impacto de los defectos congnitos inmunes sobre la defensa del husped; 2) enfermedades autoinmunes, donde es indudable el efecto de una actividad inmune excesiva o inapropiada; y 3) deficiencias inmunolgicas adquiridas, en las cuales la infeccin daa directamente el sistema inmune, como en la infeccin por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). Adems, los defectos inmunes celulares de enfermedades con caractersticas de mala funcin inmunolgica, como las infecciones crnicas, el cncer, la malnutricin o las lesiones traumticas, proporcionan informacin esencial en la defensa del husped mediada por la inmunidad. El concepto general de inmunidad" a menudo se ha confundido con el de inmunidad humoral; esto es. la presencia de anticuerpos potencialmente protectores frente a un agente infeccioso introducido por una infeccin natural o por una inmunizacin. Debido a que la inmunologa, como actualmente se utiliza en un laboratorio clnico, es una ciencia relativamente nueva (Moulin. 1989,1991), se ha tomado la epidemia del VIH para demostrar el impacto real de este poderosa y cambiante rama del sistema inmune. A diferencia de la inmunidad humoral, la funcin inmune celular es fundamentalmente compleja y difcil de medir. Las pruebas de inmunidad humoral bsicas miden la produccin de anticuerpos especficos elaborados en cierto momento c o m o respuesta a una infeccin por un virus o microbio especfico; en contraste, los anlisis de la inmunidad celular miden las respuestas actuales. En la historia de los esfuerzos para diagnosticar las alteraciones inmunes primarias, como las deficiencias de los complejos principales de histocompatibilidad (MHC) clase I y II, o el sndrome del linfocito desnudo (BLS) (Tourame. 1979; Villard. 1997; Peijnenburg. 1999), se ha demostrado la importancia de la evaluacin estandarizada en el laboratorio clnico de las deficiencias inmunes. El descubrimiento y el estudio de nios con trastornos relativamente raros pero m u y importantes, como el dficit de adhesin leucocitario (LAD) (Springer. 1984: Etizoni, 1994) han llevado a desarrollar procedimientos metodolgicos, a medida que se iba demostrando en estudios recientes cmo se presentan estos defectos de adhesin (Phillips. 1995; Marquardt, 1999). Nuevos estudios desde la identificacin de la enfermedad granulomatosa crnica (CGD) (Barnes, 1970), muestran que este es un grupo de enfermedades heterogneas con alteracin en la actividad de la cadena respiratoria fagoci855 RECEPCIN Y ANLISIS Inmunofenotipificacin: aplicacin a las muestras de rutina y leucmicas Anlisis del ADN Citometra de flujo cuantitativa: mediciones de intensidad de fluorescencia CONTROL DE CALIDAD Y GARANTA DE CALIDAD EN EL LABORATORIO CELULAR BIBLIOGRAFA 865 FUNCIN GRANULOCITICA EN LA INMUNIDAD MEDIADA POR CLULAS 851 METODOLOGA: CITOMETRIA DE FLUJO Y DE IMAGEN Hardware y otras herramientas

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EXAMEN DE L A B O R A T O R I O DEL SISTEMA I N M U N E CELULAR

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tica. Los estudios de citometria de flujo introducidos por O'Gorman (1993) han sido tiles en la identificacin del fenotipo de las familias (Atkinson, 1997). Actualmente, los pacientes con estos trastornos inmunitarios congnitos pueden ser candidatos al transplante (Godthelp. 1999; Stary, 1996; Leung, 1999) o, en el futuro, a la terapia gnica (Malech, 1999). Como la mayora de los linfocitos en sangre perifrica son clulas en reposo, la reaccin inmune celular debe reproducirse o generarse en el sistema de anlisis. El sistema debe ser capaz de provocar la respuesta, mantener la reaccin proporcionando todos los elementos disponibles in vivo asi c o m o de conseguir un punto final medible. El campo de la inmunologa clnica cambi radicalmente durante los aos 80, debido al impacto de los importantes esfuerzos de investigacin, incluyendo el uso de anticuerpos monoclonales para identificar clulas inmunes, el descubrimiento de la regulacin de las citocinas de la respuesta inmune, y sobre todo por la tremenda necesidad de comprender y controlar la aparicin epidmica del VIH. La aparicin del VIH ocurri casi de forma paralela a la posibilidad de identificar las clulas T CD4+. Los primeros anlisis de la inmunodeficienca funcional celular en el sndrome de inmunodeficiencia adquirida (sida) estaban basados inicialmente en el anlisis de la respuesta prolilerativa de los linfocitos (Siegal, 1981; Masur, 1981) y, desde entonces, han evolucionado en abordajes funcionales (Perfetto, 1997; Rosenberg, 1977; Zhou. 1998). En este capitulo se presentan las pruebas inmunolgicas celulares actuales a la luz de tendencias futuras. La evaluacin de la inmunidad celular est cambiando desde los anlisis simples y puntos finales fijos hacia un anlisis integrado de la funcin celular en varios niveles que reflejen las interacciones celulares como un proceso dinmico.

teriormente. esto puede hacer pasar por alto el diagnstico de una enfermedad inmune primaria. Los cambios inmunolgicos pueden acompaar a muchas entidades clnicas incluyendo los tumores malignos y el tratamiento de la hemofilia, de neoplasias, de enfermedades hematolgicas como la anemia de Fanconi, la hemofilia, la trombocitopenia inmune, los trastornos linfoproliferativos c o m o la histiocitosis, y las hemoglobinopatas como la anemia de clulas falciformes. la talasemia, adems de un amplio grupo de anomalas cromosmicas c o m o el sndrome de DiGeorge. el sndrome de Down, el sndrome de Bloom, la disqueratosis congenita de William, la epidermlisis ampollosa, y el sndrome de Duncan (trastorno linfoproliferativo ligado al cromosoma X). Las enfermedades autoinmunes como las enfermedades reumticas, la enfermedad mixta del tejido conectivo, la diabetes tipo 1, el lupus eritematoso sistmico, la esclerosis lateral amiotrfica, la esclerosis mltiple y la miastenia gravis pueden asociarse con cambios inmunes celulares y se tratan ms adelante en los Captulos 43 y 45.

Inmunodeficiencia primaria frente a la secundaria


Las caractersticas principales de la inmunodeficiencia primaria, o inmunodeficiencia supuestamente adquirida por infeccin con VIH. debe distinguirse de los cambios inmunes asociados a otras condiciones clnicas descritas. Incluso a menudo las lesiones traumticas como las quemaduras o los accidentes que originan una gran prdida de sangre o un dao visceral producen un periodo de vulnerabilidad a las infecciones. Adems, otras situaciones como las enfermedades premalignas o las infecciones subyacentes no diagnosticadas pueden producir cambios inmunes que pueden parecer fenotipicamente idnticos a la inmunodeficiencia primaria. Mientras que la infeccin por el VIH puede diagnosticarse rpidamente mediante una determinacin directa, el laboratorio de inmunologa clnica se emplea frecuentemente como un campo de pruebas antes de obtener del paciente o del tutor legal el consentimiento informado para el anlisis del VIH. Esto se basa en la observacin de que entre los adultos VIH-positivos. casi siempre se observa un cociente CD4/CD8 invertido. Por lo tanto, c o m o resultado de la epidemia actual de sida, el cociente CD4'CD8 invertido ha llegado a considerarse como un marcador de la infeccin por el VIH. Sin embargo, hay un cierto nmero de enfermedades que afectan al sistema inmune que pueden producir un cociente CD4,'CD8 invertido o un nmero de clulas CD4 tan extremadamente bajo como el VIH. stas incluyen, aunque no slo estn limitadas a estos, al sndrome de DiGeorge, el timoma benigno, el comienzo de la infeccin por el virus de la hepatitis C (VHC), la enfermedad de Kawasaki, la malnutricin calrico-proteica y las neoplasias. En la Tabla 36-2 se muestran algunos ejemplos de inversin del cociente CD4'CD8 no relacionados con el VIH y con un nmero bajo de CD4. El lactante del caso n." 3 presentaba mltiples abscesos spticos del tracto gastrointestinal (Gl) y se crea que tena un trastorno de la inmunodeficiencia primaria. Sin embargo, esta evaluacin se hizo despus de un episodio de casi ahogamiento en una baera en la que se encontraron indicios de un destapacaos. Las lesiones del tracto Gl por custicos produjeron lesiones mltiples e inusuales y un desequilibrio del conjunto de linfocitos T perifricos. El desequilibrio del conjunto de linfocitos T perifricos, pero no el dao del tracto Gl. se resolvi rpidamente. Esle caso tambin muestra la necesidad de llevar a cabo una prueba de confirmacin tan pronto como sea posible cuando el paciente est estable. Los trastornos de la inmunidad primaria casi siempre se presentan en el contexto de una infeccin o de cambios hematolgicos. Los trastornos p o r inmunodeficiencia se tratan con detalle en el Captulo 42. La evaluacin de laboratorio a menudo requiere de una valoracin por etapas, no solo para minimizar la extraccin de sangre, sino para elegir adecuadamente entre las pruebas disponibles con vistas a un diagnstico diferencial. Puede parecer que determinados diagnsticos de presuncin se sospechan con demasiada frecuencia, por ejemplo, el sndrome de Wiskott-Aldrich, aunque ste necesita descartarse en casos de trombocitopenia inexplicada. Sin embargo, un sndrome de Wiskott-Aldrich puede pasarse por alto si slo se valora la respuesta a mitgenos en lugar de la respuesta frente a antgenos. y con el tiempo el defecto inmune puede llegar a ser ms importante, de forma que sean necesarias pruebas de seguimiento.

CRITERIOS CLNICOS PARA LA EVALUACIN DE LA INMUNIDAD CELULAR: IMPLICACIONES PARA LA INTERPRETACIN Decisin de analizar
Aunque en teora la interpretacin de las pruebas inmunolgicas comprende desde el abordaje diferencial minucioso hasta el cribado, en trminos prcticos, la respuesta inmune del paciente se estudia en el contexto de la presentacin clnica. Sin embargo, como las pruebas inmunolgicas pueden ser caras y lentas, la eleccin de la prueba a menudo depende de la sospecha clnica. C o m o hay pocas pruebas de la inmunidad celular, si es que existe alguna, que sean total y especficamente diagnsticas, la interpretacin debera realizarse con precaucin. La responsabilidad del laboratorio de inmunologa clnica es establecer un nmero suficiente de pruebas, realizarlas de forma sensata para conocer la naturaleza y la extensin de la alteracin inmune y considerar un rango de posibles causas cuando se realice su interpretacin. Normalmente, la decisin de analizar la respuesta inmune en un paciente surge por una de las razones descritas en la Tabla 36-1. El aumento o la inexplicable susceptibilidad a la infeccin, el aumento de la gravedad de infecciones habituales, o la reaccin inusual a la inmunizacin son motivos para realizar una valoracin inmune. Las infecciones inusuales, especialmente por agentes oportunistas o las infecciones graves que no responden al tratamiento, y ciertos estados alrgicos o atpicos tambin pueden requerir un anlisis inmunolgico. En estos ltimos aos, la posibilidad de la infeccin por el VIH ha reemplazado a la posible deficiencia inmune primaria como principal diagnstico de presuncin. Sin embargo, como se tratar pos-

Tabla 36-1 Presentacin de una posible inmunodeficiencia Infecciones bacterianas frecuentes Reaccin sistmica a virus inusualmente grave Desarrollo de la infeccin debida a un organismo inusual como hongos o protozoos Reaccin sistmica despus de la vacunacin con virus vivos Historia familiar de infecciones recurrentes Exposicin al virus de la inmunodeficiencia humana

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SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA

Tabla 36-2 Cociente invertido CD4/CD8 y CD4 bajo en inmunodeficiencia no VIH Conjunto de linfocitos Caso estudio 1. Inicial 2. Inicial 3. Inicial 1 semana 4. Inicial 3 anos 5. Inicial a los 5 meses 6. Inicial al ao 7. Inicial 8. Inicial 9. Inicial 10. Inicial al da Edad 3 aos 6 aos 3 meses %CD3 56 73 29 43 89 93 83 76 36 51 0 64 65 72 %CD4 26 18 15 25 62 36 51 18 25 42 0 20 26 1 8 45 %CD8 29
L'-

ABS # 209 330 762 2.846 B74 272 2.734 96 304 2.794 0 No hay dalos No hay datos No hay datos No hay datos

Diagnstico Deficiencia idiopatica de CD4 Disqueratosis Inmunodeficiencia congnita R/0 Lesin caustica gastrointestinal Aplasia de glbulos rojos Sndrome de Noonan Sindrome de Williams Sindrome de DiGeorge Talasemia Neutropenia inmune Melanoma uveal Posthipertermia

6 aos 3 meses 4 meses 1 semana 12 aos 8 aos 50 aos

IO 15 32 57 31 48 7 12 24 33 47 51 35

ABS * = Numera absoluto de linfocitos T CD4.

Significado clnico de las pruebas de inmunodeficiencia


Un tema al que a menudo se enfrenta el director del laboratorio clnico es cmo evaluar el significado clnico potencial de la respuesta inmune alterada in vitro. Los estudios de trastornos relativamente bien definidos han demostrado que hay muchas diferencias significativas en el impacto clnico. Sin embargo, el uso de nuevas estrategias de pruebas puede ayudar en la clasificacin de los pacientes segn el nivel y extensin del defecto. Por ejemplo, los estudios del sndrome de DiGeorge (DiGeorge, 1974), clsicamente una trada de aplasia tmica y paratiroidea y defectos conotruncales. mostraban que existan diferencias importantes en la gravedad de las infecciones que se asociaban con hallazgos relativamente similares de reduccin del nmero de linfocitos T maduros y una pobre respuesta a mitgenos originada por la hipoplasia tmica. Inicialmente. se observ un alto grado de muertes asociadas a este sndrome, pero con las nuevas tcnicas quirrgicas y mtodos anestsicos, se ha visto que un nmero significativo de nios parecen desarrollarse normalmente sin infecciones graves (Bastan, 1989). Sin embargo, algunos nios desarrollaron infecciones que no respondan al tratamiento y, finalmente, mortales y n o hubo ningn modo de predecir la evolucin. Recientemente, ha sido posible utilizar anlisis del fenotipo linfoctico ms exacto y analizar los niveles de los defectos inmunes en el sndrome de DiGeorge. Utilizando anlisis longitudinales durante muchos meses y una aproximacin paramtrica mltiple, parece que la gravedad puede predecirse mediante un bajo y consistente nmero de clulas T CD4, por la inversin del cociente CD4/CD8, y por la produccin disminuida de la linlocina interleucina-2 (IL-2) (Cunninghan-Rundles. 1994). La investigacin del significado de las deleciones monosmicas del cromosoma 22q11.2, que son la principal causa del sndrome de DiGeorge, del sndrome velocardiofacial y del sndrome de la anomala conotruncal de la cara, ilustran la importancia de la nueva informacin gentica. Slo el sndrome de DiGeorge fue descrito originalmente como un trastorno de inmunodeficiencia. Los nuevos estudios orientados a la frecuencia de la inmunodeficiencia en los otros sndromes clnicos asociados con la microdelecin del cromosoma 22q 11.2 han mostrado que en ms del 75% de los pacientes existe evidencia de compromiso inmune (Sullivan, 1998). La gravedad de la inmunodeficiencia no se correlaciona con ninguna caracteristica fenotpica particular. La funcin de las clulas T puede ser tan importante o ms importante en la infeccin por el VIH que la prdida de las clulas CD4^ o la tasa de prdida. En algunas enfermedades asociadas con virus, hay una considerable incertidumbre sobre lo estrecha que es la asociacin entre el dlicit inmune detectado ex vivo y la funcin inmune in vivo (Landay. 1991; Lloyd. 1992). Mientras que los estudios recientes sugieren que la respuesta ortosttica alterada (Rowe. 1999) puede explicar algunas formas del sndrome de fatiga crnica o que un aumento de las concentraciones plasmticas del factor de necrosis tumoral a (TNF-a) pueden ser un marcador de enfermedad (Moss. 1999), no existe un conocimiento claro de la causa y el efecto.

Efecto de la edad en la respuesta inmune


Los estudios recientes demuestran que el sistema inmune cambia durante proceso de envejecimiento (Gillis, 1981; Inkeles. 1977: Bogdan. 1994). Aunque hay una considerable variacin en esto y muchas veces es una consecuencia del estado nutricional alterado (Mazari. 1998), es esencial que el laboratorio clnico proporcione resultados considerando distintos grupos de edad. El estudio de pacientes peditricos presenta hallazgos particulares para el diagnstico de laboratorio en la inmunodeficiencia. El desarrollo del sistema inmune en el nio no est completo al nacer y, adems, los nios n o han estado expuestos a una amplia variedad de agentes ambientales anormales y pueden ser vulnerables a las infecciones (Zola. 1996). La exposicin congnita a un virus o la prematuridad aislada pueden asociarse con anomalas inmunes. Diferencias claves en la respuesta inmune peditrica incluyen una marcada linfocitosis al nacimiento, una elevacin de las clulas B, un aumento del cociente CD4+/CD8+, y la existencia de pocas clulas asesinas naturales (NK) (Fletcher, 1992: Yabuhara, 1990: Cunningham-Rundles. 1993). Estas diferencias se reflejan en las claras diferencias en el intervalo de normalidad de las subpoblaciones linfocitarias y deben tenerse en cuenta a la hora de evaluar los resultados (Denny, 1994). Tambin, hay una importante diferencia en la respuesta a varios activadores comparado con los adultos. La respuesta neonatal de los nios prematuros a ciertos activadores microbianos puede ser ms potente que la de los adultos o que la de los nios nacidos a trmino debido a los rpidos cambios en la regulacin inmune (Veber, 1991: Cunningham-Rundles, 2000) o debido a diferencias fundamentales en la programacin perinatal (Prescott, 1998).

Malnutricin y respuesta inmune


Aunque generalmente se cree que la malnutricin es relativamente rara en los pases desarrollados, aumenta la evidencia que sugiere que la malnutricin es relativamente frecuente, especialmente en ciertos grupos de edad (Pennington. 1996). La malnutricin se asocia con la inmunodeficiencia y origina una vulnerabilidad importante a las infecciones (Chandra. 1993; Cunningham-Rundles, 1996). Por ejemplo, el dficit de zinc puede presentarse como una inmunodeficiencia marcada que puede relacionarse con el dficit primario de la captacin de zinc en el tracto Gl, con una acrodermatitis enteroptica o con un dficit del zinc de la dieta (Moynalhan, 1974; Prasad. 1963). Las personas con hipogammaglobulinemia y malabsorcin asociada que alecta a las concentraciones de zinc pueden mostrar una respuesta proliferativa in vitro pobre e infecciones que se resuelven con el aporte del zinc (Cunningham-Rundles, 1981). Esto est asociado con el hecho de que el zinc es necesario para la actividad biolgica de la hormona tmica, necesaria en la produccin de las clulas T luncionalmente maduras (Dardenne, 1982) y para la activacin de las clulas T (Cunningham-Rundles, 1996. 1998). Hay una

CAPTULO 36

EXAMEN DE L A B O R A T O R I O DEL SISTEMA INMUNE CELULAR

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evidencia creciente de que el desequilibrio de los micronutrientes altera la respuesta inmune (Cunningham-Rundles. 1998. 2000) por efectos especficos en la respuesta inmune. La malnutricin puede ser un factor que aumente la complejidad de muchos casos clnicos. La interaccin de las infecciones con el metabolismo alterado secundariamente a la respuesta de fase aguda puede provocar cambios transitorios en los oligoelementos que produzcan la supresin transitoria de la respuesta inmune. El estrs fsico puede tener efectos similares y provocar un aumento de la vulnerabilidad a las infecciones en el contexto de la inmunosupresin (Cunningham-Rundles, 1999). sle es un proceso bidireccional. La alteracin del crecimienlo puede ser el primer signo de la infeccin por el VIH en un nio VIH+ (Peters, 1998). Por ello, como por otras razones, la evaluacin inmune debe ser un proceso continuo en el contexto del tratamiento o de otros anlisis.

un tipo especial de linfocito T de memoria con capacidad de proliferacin reducida capaz de ayudar a la clula B (Kagnotf, 1993; Marsh. 1993). Tanto los linfocitos T de la lmina propia como los linfocitos T mtraepiteliales se desarrollan de forma relativamente independiente del timo y funconan de forma diferente a las clulas T de sangre perifrica en el uso de la va de transduccin del CD2 en lugar de la va del receptor de clulas T/CD3. Actualmente, las pruebas de la inmunidad mucosa no se realizan habitualmente en los laboratorios de inmunologa clnica y. con raras excepciones, las clulas inmunes a estudiar corresponden al compartimiento de sangre perifrica. Por esta razn, el uso de pruebas cutneas in vivo y el examen de la respuesta inmune humoral en las vacunas halladas previamente es til para el inmunlogo celular, ya que proporcionan otra forma de evaluacin. En cualquier caso, la utilizacin de aproximaciones sucesivas y la repeticin de anlisis son muy informativas.

Cncer
La inmunodeficiencia primaria est asociada con el aumento de la incidencia de cncer (Cunningham-Rundles. 1987), y cada vez est ms claro que hay tumores que se desarrollan asociados a la infeccin por VIH (Davis. 1984; Chintu, 1995; Krown. 1996). En el paciente con cncer, la inmunodeficiencia generalizada o la reduccin en la respuesta ante un estmulo antignco puede asociarse al desarrollo de una neoplasia primaria, ocurrir durante las metstasis o estar causada por los efectos secundarios del tratamiento. La reduccin en la respuesta inmune frente a los activadores no especficos estudiados ex vivo en ensayos de proliferacin se correlaciona con el estado de la entermedad y tiene un significado pronstico en la supervivencia (Heimdal. 1999). A menudo se observa en los pacientes con cncer no tratado un cociente CD4/CD8 invertido y un aumento de la actividad celular supresora (Livisnton. 1987). Los estudios experimentales han demostrado que los tumores pueden suprimirse inmunolgicamente pero conducen la respuesta inmune hacia una respuesta no protectora (Lee. 1997). El desarrollo de nuevos mtodos nmunoterapeticos est aumentando, sugiriendo que la respuesta a antgenos especficos del tumor ser ms utilizada en el futuro (Stockert, 1998). Los ensayos sobre la respuesta inmune tambin pueden utilizarse en el seguimiento y evaluacin de la respuesta a los tratamientos como la IL-2 (Lissoni, 1999) y las vacunas contra el cncer (Hsueh, 1998). En general, la quimioterapia producir una supresin transitoria de la respuesta inmune que se resolver en un corto periodo de tiempo, mientras que la radiacin puede tener efectos a largo plazo (Katz. 1993). La evaluacin de la respuesta inmune en el paciente con cncer requiere de la utilizacin de pruebas muy seleccionadas y el uso discriminante de pruebas y activadores, que refleje los procesos relevantes, as como especificidad en la respuesta.

Fases de estudio: fase de exploracin


La evaluacin de la funcin inmune en un paciente con una posible inmunodeficiencia habitualmente se lleva a cabo en etapas. La primera consiste en una exploracin de las posibles reas de deficiencia y se resume en la Tabla 36-3. Estos estudios de exploracin deben acompaarse de un anlisis de citometria de fluyo apropiada de las subpoblaciones de linfocitos y, en nios, debe incluir del uso de marcadores de clulas B para evaluar posibles cambios en estas, que pueden aparecer transitoriamente en los neonatos y reflejarse con una baja poblacin de clulas T. Tambin se recomienda el empleo de un marcador de clulas NK en nios de ms de 3 meses de edad, ya que los niveles de esta poblacin pueden estar disminuidos o ausentes al nacimiento (Zola. 1983). Como existe frecuentemente una limitacin en la sangre que va a ser extrada para estos estudios es esencial que la primera evaluacin incluya paralelamente un recuento sanguneo completo (CBC), en la muestra de sangre. Es esencial que se lleve a cabo el recuento diferencial. La etapa de exploracin incluir un panel de pruebas para evaluar la respuesta mitognica y frente a anligenos proliferativos. La respuesta proliferativa de linfocitos frente a un grupo de activadores contina siendo una de las herramientas ms sensibles para evaluar la funcin normal, y cuando esta incluye un activador apropiado de clulas T y B puede ser utilizado especficamente para definir las reas defectuosas. Aunque esto no se hace siempre, se recomienda la utilizacin de distintas concenlraciones de cada activador. Adems, el tipo de tubo elegido para extraer la sangre es importante. El uso de tubos que contienen heparina de litio o cido etilenediamintetraactico (EDTA) no se recomienda para ningn estudio de funcionalidad de linfocitos. Deben utilizarse tubos con heparina sdica (sin conservante) o con citrato dextrosa (ACD). La sangre extrada en tubos heparinizados tambin puede emplearse para el anlisis por citometria de flujo, aunque el tiempo para la preparacin de la muestra y su anlisis es critico (Nicholson, 1993). La pregunta sobre cundo debe extraerse la sangre es importante. En general, la mayora de los datos se han obtenido con sangre extrada por la maana y hay efectos circadianos que pueden influir en los resultados. Cuando esto no puede hacerse, es m u y til continuar manteniendo la uniformidad del tiempo de extraccin para cada paciente individual. Este hecho es ms crtico cuando se mide el nmero absoluto de los distintos linfocitos T en la monitonzacin de la enfermedad por VIH o como parte de un ensayo clnico (Malone. 1990). Los estudios funcionales necesitan llevarse a cabo en sangre fresca anticoagulada siempre que sea posible (o sangre almacenada a temperatura ambiente en oscuridad durante menos de 24 horas) antes de que las clulas Tabla 36-3 Exploracin bsica en los estudios inmunolgicos Recuento sanguneo completo y anlisis dilerencial Anlisis de las subpoblaciones linlocitanas (numero y porcentaje de clulas B y T) por citometria de flujo Activacin de linfocitos in vitro frente a mitgenos y activadores microbianos Inmunoglobulinas sricas, incluyendo subtipos de inrnunoglobulinas si hay evidencia de infecciones clnicas por bacterias encapsuladas En algunos casos, los niveles de inmunoglobulinas son normales pero se producen anticuerpos no fijadores heterogneos, por tanto, se necesitan estudios adicionales

APROXIMACIN METODOLGICA A LAS PRUEBAS DE INMUNIDAD CELULAR


Los estudios en humanos se han basado en la observacin de las clulas inmunes de sangre perifrica ya que el compartimento perifrico es ms accesible y ms fcil de medir, pero esta aproximacin puede no reflejar los sucesos regionales (Cunningham-Rundles, 1994a). Los conocimienlos sobre las diferencias entre la respuesta inmune sistmica y mucosa pueden explicar finalmente muchas paradojas actuales que surgen cuando se compara la respuesta inmune medida in vitro o ex vivo con la defensa del husped in vivo (Xu-Amano, 1993). La funcin de la inmunidad sistmica celular parece estar regulada a travs de los distintos patrones de funcionalidad de las citocinas tipo T coadyuvantes, de modo que cuando se producen las cilocinas T coadyuvantes tipo 1 (Th1), IL-2, e interfern-y (IFN-y). se favorece la defensa inmune celular del husped. Cuando se producen las citocinas T coadyuvantes tipo 2 (Th2), IL-4, IL-5, IL-6, e IL-10, se induce la respuesta de los Imfocitos B (Barnes, 1993; Yamamura, 1991). En contraste con la inmunidad sistmica, la actividad primaria de la respuesta inmune mucosa es proteger la mucosa bloqueando la entrada de microorganismos, toxinas y antigenos a travs de la secrecin y el transporte de la inmunoglobulina A (Ig A) a la luz del intestino, un proceso mediado por

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SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA

mononucleares se destruyan. Cuando la sangre se enva por avin u otro transporte a un laboratorio en otro lugar es extremadamente importante incluir un control paralelo de la muestra extrada de una persona sana que sirva como un estndar interno en el proceso de evaluacin.

Tabla 36-5 Causas de anergia en la prueba cutnea Falta de historia antignica apropiada cuando el panel no incluye activadores ubicuos Inmunodeficiencia primaria inlecciones vricas Malnutricin Enfermedades granulomatosas Neoplasias

Fases de estudio: fase de confirmacin Aspectos generales

Una vez que se ha llevado a cabo el cribado de cada individuo y se observen evidencias de posibles lagunas, estas pruebas deben confirmarse repitiendo pruebas sobre aspectos especficos de las primeras series. Como poco, debe realizarse un prueba positiva o negativa (rango normal y rango anormal). Pueden aadirse pruebas adicionales que proporcionen el punto de partida de estudios analticos. Es importante organizar apropiadamente la extraccin de sangre cuando el paciente se encuentre en el estado ms estable clnicamente. Se recomienda realizar por duplicado los estudios bsales antes de llevar a cabo una intervencin, o incluso en la fase de confirmacin. En algunos casos de posible inmunodeficiencia puede haber un secuestro de clulas inmunes, que se refleja en porcentajes bajos de linfocitos T en el compartimento perifrico, como se muestra en la Tabla 36-2. Caso #3. La etapa de confirmacin tambin debe incluir una cuidadosa reevaluacin de la historia mdica de los pacientes y de la historia familiar. Los estudios que se deben utilizar en esta etapa de confirmacin se muestran en la tabla 36-4.

Persistencia

timica

El roentgenograma de la silueta trmca puede no ser suficiente, ya que el timo tiende a la deplecin por estrs (Haynes, 1998). Aunque es difcil determinarlo con seguridad, se ha visto que el tamao real del timo evaluado por resonancia magntica nuclear (MRI) se correlaciona con el nmero de linfocitos CD4+ en la infeccin por VIH (Vigano' A, 1999). Estudios recientes sugieren que el timo humano puede considerarse como un rgano compuesto por tejido linfoide central y perifrico. Haynes (1998) ha postulado que la atrofia epitelial del timo puede resultar en parte de las atocinas o de otros tactores producidos por las clulas inmunes perifricas del espacio tmico penvascular. Como se describe en la seccin especfica sobre la evaluacin por citometria de flujo de las subpoblaciones de linfocitos T. la expresin de antgenos de maduracin normales adquiridos durante el desarrollo tmico ser suficiente para identificar la presencia de un timo funcionante.

neas de hipersensibihdad retardada ha mostrado una buena correlacin global entre la falta de reactividad, llamada anergia, y la inmunodeficiencia (Mass. 1998) pero no ha sido til como herramienta analtica para determinar la razn de la falta de respuesta. La prueba cutnea no es muy cuantificable. El empleo de la prueba cutnea con derivados proteicos purificados (PPD) para evaluar la posible presencia de Mycobactenum tuberculosis es una excepcin, aunque los individuos anrgicos no responden y. adems, hay falsos positivos en las personas que han sido vacunadas con el bacilo de Calmette-Gurin (BCG). Las causas de falta de respuesta en la prueba cutnea se muestran en la Tabla 36-5. Algunos estudios se han basado en una prueba cutnea con inmunizacin de novo utilizando dinitrofluorobenceno (DNFB) que se lleg a utilizar ampliamente pero ya no se considera de utilidad debido a la ambigedad del mecanismo de respuesta subyacente. La introduccin del prueba de la ventana cutnea" proporciona una medida ms cuantitativa e informativa de la respuesta inmune in vivo debido a que la reaccin puede emplearse para determinar una respuesta tumoral autloga (Black. 1998). Sin embargo, aunque con algunas reservas, la importancia de las pruebas cutneas c o m o demostracin convincente de que los defectos inmunes que suceden in vitro pueden tener un significado pronstico in vivo, no debe ser infravalorada.

Fases de estudio: estudios analticos de la inmunidad


Los estudios analticos se resumen, de forma general, en la Tabla 36-6. Aunque la descripcin completa de estos abordajes no se encuentra entre los objetivos de este anlisis, en general estos estudios son vlidos para definir el mecanismo subyacente del defecto inmune y proceder en una serie de etapas. Aunque hay diferentes modos posibles de hacerlo, un buen mtodo es evaluar el nivel general del defecto siguiendo el plan general de evaluar la presencia de los tipos celulares y las proporciones relativas de cada uno a la vista de las reas de funcin general disminuida y entonces poner en marcha los estudios de la funcin efectora.

Pruebas cutneas
En este momento puede ser importante la utilizacin de un panel de pruebas cutneas. Este abordaje en la evaluacin de la inmunidad celular sirvi en un principio como punto de partida para el desarrollo de las pruebas funcionales de la inmunidad celular y mide la respuesta de hipersensibilidad retardada directamente in vivo. La experiencia con las pruebas cut-

Funcin inmune diferencial


Hay dos tipos principales de clulas implicados en la inmunidad (Haynes, 1990; Paul, 1993): 1) linfocitos T (clulas T) y 2) linfocitos B (clulas B). Los linfocitos T se definen por la expresin del receptor del linfocito T el cual se une al antigeno y a CD3, un determinante de superficie asociado con el receptor de clulas T que es esencial para su activacin

Tabla 36-4 Estudios analticos de confirmacin y de primera etapa Roentgenograma de la sombra timica Prueba cutnea Actividad de las clulas asesinas naturales (si el nio tiene 6 meses 0 ms) Produccin de citocinas en respuesta a la activacin con T-coadyuvante 1, T-coadyuvante 2 (IL-2, interfern-y, IL-4 y otros) Cultivo mixto de linfocitos con el paciente como estimulador y con el paciente como respondedor Respuesta a la inmunizacin Prueba para la presencia de anticuerpos especficos segn la edad Respuesta de anticuerpos naturales frente a isohemagiulimnas (sustancias de grupo sanguneo anti-A y anti-B) si el paciente es del grupo sanguneo A, B o O Prueba para el dficit de actividad de las enzimas adenosn deaminasa y purma nucletico fosforilasa

Tabla 36-6 Estudios analticos e inmunorreguladores Desarrollo de los antgenos de la activacin durante la respuesta a la estimulacin, como el antigeno Tac, el receptor de transterrina, regulacin del MHC de clase II sobre las clulas T , receptores solubles y otros Respuesta do activacin precoz (p. ej, canales de calcio) Inmunorregulacin Respuesta a IL-1, IL-2, interferones Desarrollo de funciones efectoras Sntesis de inmunoglobulinas in vitro Actividad citotoxica de las clulas T Anlisis de clulas supresoras/factores de supresin Activacin de genes, anlisis del ciclo celular Respuesta a la inmunizacin: inmunizacin de novo

CAPTULO 36

EXAMEN DE L A B O R A T O R I O DEL SISTEMA INMUNE CELULAR

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Tabla 36-7 Fenotipificacin inmunolgica de las subpoblaciones de linlocilos Panel bsico de sangre perifrica (sangre, glbulos rojos Usados*) CD45/CD14 Inmunoglobulinas control de isofipo de ratn CD3/CD19 CD3/CD4 CD3/CD8 CD3-/CD56 y 16 Clulas mononucleares aisladas, panel de activacin' CD45/CD14 Inmunoglobulinas control de isotipo de ratn CD3/CD25 (IL-2R) CD3/HLA-DR
' Si el CD3 est bajo, entonces repetir y aadir CD2. Posteriormente, pueden aadirse monoclonales trente al receptor de las clulas T acoplado con CD3. Tambin pueden evaluarse los marcadores de monocitos. Esto tambin puede realizarse utilizando reactivos de tres o cuatro colores empleando CD45 como iniciador ' Despus de 2 das de cultivo, extraer las clulas y lavarlas antes de teirlas con los anticuerpos monoclonales escogidos: analizar las clulas control que no contienen activador, despus analizar las clulas activadas. Los activadores pueden incluir mitgenos. IL-2 y/o mleilern-y.

conocidas como clulas que pueden matar inespecficamente (naturalmente) a las clulas infectadas por virus y bacterias y que evitan las metstasis de las clulas tumorales. Sin embargo, las clulas NK tambin regulan funciones de las clulas T y B y la hemalopoyesis. Estas funciones de las clulas NK son, probablemente, dependientes de su capacidad para producir linfocinas, particularmente IFN-y. Las clulas N K son importantes para la activacin de las clulas fagociticas independientes de antgeno durante las fases precoces de la infeccin y para favorecer el desarrollo de las clulas Th1 especficas de antgeno. El sistema N K est por naturaleza activado y no tiene que ser inducido por antgenos para destruir. Sin embargo, cuando se presentan con anticuerpos especficos, estas clulas pueden matar especficamente. La evaluacin funcional de esta poblacin celular puede llevarse a cabo de forma adecuada utilizando un anlisis rpido de liberacin de cromo conocido como un ensayo de citotoxicidad NK empleando K-562s como dianas) o mediante citometra de flujo. Los estudios futuros estarn encaminados a detectar cmo las clulas N K ligan la inmunidad innata y la adaptativa (Peritt, 1998).

Desarrollo de la respuesta inmune


Si se ha determinado que la poblacin de clulas est esencialmente intacta en ausencia de activacin, la cuestin de un fallo intrnseco puede estudiarse mediante muchos abordajes diferentes que incluyen el anlisis expandido de marcadores de superficie de linfocitos, entre ellos los determinantes del receptor antignico de las clulas T (TCR) y los antgenos de activacin como el CD25. el CD38 y el HLA-DR (Tabla 36-7). La ausencia de regulacin del MHC de clase II en respuesta al IFN-y es un ejemplo. Aunque las poblaciones celulares pueden expresar un antgeno de diferenciacin normal de referencia, tambin pueden coexpresar otros inapropiadamente. lo cual puede ser la clave de la anormalidad funcional. Por ejemplo, las clulas T CD8+ que coexpresan CD38 no son funcionalmente iguales que las clulas CD8 que no expresan este marcador y se encuentran expandidas en la enfermedad por VIH (Giorgi, 1989). La ausencia de expresin de ciertas molculas, como el CD28. tambin es un indicador importante. En algunos sndromes de inmunodeficiencia primaria, la regulacin del receptor de IL-2 en respuesta a la IL-2 puede ser anormal. Los receptores pueden no estar translocados normalmente o los receptores pueden estar alterados prematuramente (Cunningham-Rundles. 1990). El desarrollo de la respuesta puede ser anormal cinticamente, debido al retraso del reclutamiento secundario durante la fase de amplificacin. Esto debe ser comprobado mediante estudios peridicos. En algunos casos, n o pueden fabricarse citocinas o pueden estar funcionalmente alteradas. Las funciones efectoras pueden haberse perdido o estar alteradas. Esta evaluacin puede requerir un abordaje detallado. Los intentos de restaurar la respuesta aadiendo citocinas pueden ser tiles, aunque pueden no mostrar la lesin al compensar y no solucionar la deficiencia real. Las nuevas estrategias de anlisis pueden utilizar sangre en lugar de clulas mononucleares aisladas (Bocchieri, 1995). Este sistema proporciona una excelente visualizacin, ex vivo, de la respuesta inmune, ya que las relaciones reales entre las clulas no se alteran. Adems, este sistema puede utilizarse para medir la produccin de citocinas (Petrovsky, 1995; De Grote, 1998; Suni, 1998). Se aconseja al laboratorio de inmunologa clnica elegir estudios analticos bsicos, que normalmente se realizan de rutina, de modo que exista una base para la comparacin. El establecimiento de los valores de referencia y el mantenimiento del control de calidad de los reactivos del laboratorio, especialmente para ciertos elementos variables, es esencial para la exactitud y sensibilidad de estas pruebas.

Los lintocitos T tienen receptores diferentes, clonalmente variables, para un amplio grupo de antgenos, requieren la maduracin tmica para su funcin normal y median la inmunidad celular. Los linfocitos B se identifican por las inmunoglobulinas de superficie (detectadas mediante anticuerpos monoclonales como el CD19 o el CD20) y tras una activacin adecuada se diferencian en clulas plasmticas que secretan anticuerpos especficos, mediando, de este modo, la inmunidad humoral. La falta de un timo normal comprometer la funcin de los linfocitos T y afectar a la activacin de los linfocitos B dependientes de los linfocitos T. El fallo a nivel de la mdula sea puede afectar tanto a la respuesta inmune de los linfocitos T como a la de los linfocitos B. aunque pueden estar implicadas relaciones especificas. Esto se describe con ms detalle posteriormente en la Proliferacin linfoctica como mtodo In Vitro de evaluacin de la inmunidad celular. L a distincin entre respuesta inmune especfica y no especifica es una necesidad fundamental de la respuesta inmune, ya que el sistema debe ser capaz de distinguir entre lo propio y lo extrao. En general, esto se logra medanle la incorporacin del sistema de autoantigenos del complejo molecular MHC en la fase de reconocimiento antignico. El antigeno debe ser procesado y presentado en el contexto del reconocimiento del propio MHC y conducir al desarrollo de la memoria inmune. La funcin del procesamiento antignico se lleva a cabo por las clulas presentadoras de antgeno (APCs), siendo el monocito la mejor estudiada. Esta respuesta dispara la activacin y la proliferacin de los linfocitos. y puede incluir la produccin de clulas electoras y la activacin de los linfocitos B para producir anticuerpos. Este tipo de inmunidad, a menudo denominada inmunidad adaptativa. se mantiene como "memoria" y se desencadena tpicamente despus de inmunizaciones o infecciones naturales (Owen, 1993). La falta de expresin del antgeno MHC de clase II puede detectarse en los linfocitos por citometra de flujo utilizando anticuerpos monoclonales contra el HLA-DR o el HLA-DQ y es el mejor marcador de dficit de MHC de clase II (Tabla 36-7). Un segundo tipo fundamental de inmunidad puede describirse como la inmunidad innata, que no tiene memoria, y no aumenta con contactos repetidos. Esta inmunidad est mediada por las clulas fagociticas. algunas de las cuales, como el monocito. tambin pueden procesar y presentar antgenos, y las clulas NK. A diferencia de las clulas fagociticas. las clulas NK no estn desarrolladas funcionalmente al nacer, debido, probablemente, a que la atocina clave, el IFN-y, que es necesaria para el desarrollo y la maduracin de este sistema, est tambin disminuida al nacer. Esta tercera rama est representada por las clulas NK. que no son ni clula B ni exactamente clulas T por no tener ni inmunoglobulinas de superficie ni el receptor de clulas T. Estas clulas, antes llamadas clulas "K", clulas "nulas" o "tercera poblacin", ha eludido la clasificacin convencional por anlisis de linaje celular. Actualmente, el CD56 es considerado el marcador ms definitivo de la clula N K (Trinchieri. 1998). Las clulas N K han sido ms

PROLIFERACIN LINFOCTICA COMO MTODO IN VITRO DE EVALUACIN DE LA INMUNIDAD CELULAR Inmunologa celular Activacin y proliferacin linfoctica

Aunque el sistema inmune se divide clsicamente en componentes humoral y celular, esta separacin n o es absoluta, ya que hay una considerable interdependencia entre las clulas B y las clulas T.

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SECCIN V

INMUNOLOGA INMUNOPATOIOGA

El parmetro funcional de la inmunidad celular ms frecuentemente medido es la proliferacin linfocitaria. La medida de la activacin/proliferacin de los linfocitos ha evolucionado sustancialmente desde finales de los aos 50 e inicio de los 60. cuando la divisin celular se determinaba por el recuento del nmero de linfocitos que se haban transformado en blastos. Estos mtodos fueron reemplazados por la cuantificacin de la incorporacin de precursores marcados de los cidos nucleicos (timidma tritiada) en el cido desoxirribonucleico (ADN) recin sintetizado. Aunque este "anlisis en masa' permanece como el procedimiento de laboratorio ms frecuentemente utilizado para medir la proliferacin celular, recientemente han aparecido nuevos reactivos y nuevos procedimientos para evaluar la activacin y proliferacin linfocitaria. Estos incluyen la disponibilidad comercial de marcadores de proliferacin de la superficie celular, la posibilidad de medir el porcentaje de clulas en fases especificas del ciclo celular, la cuantificacin de citocinas y de receptores de citocnas asociados a clulas y la posibilidad de evaluar el nmero de divisiones celulares en linfocitos marcados con 'tinciones de seguimiento". En esta seccin se revisan los acontecimientos moleculares implicados en la activacin y en la proliferacin de los linfocitos T y se revisan algunos de los nuevos mtodos que se han desarrollado para evaluar las funciones del sistema inmune celular.

Determinacin de las vas bioqumicas de la activacin linfocitaria


Tras la interaccin especfica del mitgeno o el antigeno/MHC con los receptores apropiados de los linfocitos. tienen lugar muchos procesos celulares que incluyen cambios en el transporte de membrana, redistribucin del sistema del ciloesqueleto (polarizando el linfocito hacia la APC) y la activacin de mltiples vas de sealizacin. Estos cambios conducen finalmente a la diferenciacin de la clula T. a la secrecin de citocinas. a la proliferacin, a la anergia o a la apoptosis. Las investigaciones actuales estn desvelando las complejas rutas moleculares y bioqumicas que conducen a la clula T activada por estas rutas. Constantemente se estn descubriendo alteraciones especificas en estas vas y subyacen en muchas de las enfermedades de la inmunodeficiencia primaria. Desgraciadamente, las alteraciones en los anlisis de proliferacin en masa indican solo que no hay divisin celular o que esta es limitada y no proporcionan informacin sobre las alteraciones subyacentes de la activacin del linfocito. Se requieren ensayos ms sofisticados para investigar las alteraciones subyacentes de las clulas T.

superficie celular sin el CD3 (Weiss. 1991) y no tiene capacidad de sealizacin por si mismo. La estructura de reconocimiento antignico est compuesta por cadenas estructuralmenle divergentes a y \i (o menos frecuentemente por las cadenas y y 6) y el complejo de transduccin CD3 est formado por cinco cadenas polipeplidicas invariantes, a. p\ e. y un dmero de cadena zeta. Cada una de las protenas del CD3 contienen un residuo llamado residuo inmune de activacin de la tirosina (ITAM). que se une al dominio SH2 de la proteina tirosma cinasa. La cadena f (que existe como un homodmero f una cadena i con una n, o una cadena y con una Fe e Rl y) contiene 3 ITAM y es el componente ms significativo del complejo TCR. estando implicado en la transduccin de la seal desde el TCR (Weiss 1994). Inicialmente descritos por Reth (1989). estos residuos juegan un papel esencial en los acontecimientos iniciales que siguen a la activacin de las clulas Tflrving. 1991). Las molculas CD4y CD8 de la superficie de las clulas T tambin estn unidas de forma no covalente al complejo TCR Se unen a las molculas del HLA Clase II y I. respectivamente, sobre la APC y tambin estn implicadas en la transduccin de las seales de activacin Una vez procesado el antigeno, este es presentado a las clulas T en el contexto de los antigenos del MHC. En general, las clulas T CD4+ responden a antgenos exgenos procesados y presentados en el contexto de MHC de Clase II y las clulas T CD8+ responden a antigenos endgenos procesados y presentados en el contexto de MHC de Clase I, Los CD4 y los CD8 tambin estn asociados con la tirosina cinasa implicada en los acontecimientos precoces tras la activacin de las clulas T. Adems de estas interacciones y las interacciones de las molculas estimuladoras, otro grupo de molculas (molculas de adhesin), presentes tanto en la APC como en las clulas T respondedoras, se unen unas a otras y sirven para aumentar la avidez de la unin. Las molculas coestimuladoras identificadas en las APC incluyen el B7 (CD80) (Linsley. 1991a). el B7.2 (Azuma. 1993). el antigeno estable al calor (HSA) (Liu. 1992) y otros (Foletta. 1998; Wingren. 1995) Sobre las clulas T. la CD28 es la principal molcula estimuladora y se une al B7: la CTLA-4. por otra parte, se une tanto al B7 como al B7.2 y est implicada en la disminucin de modulacin de la activacin de las clulas T (Linsley, 1991b). El receptor en las clulas T para el HSA no ha sido identilicado. La presentacin del antigeno en presencia de reactantes que bloquean las molculas coestimuladoras lleva a una respuesta anrgica (tolerancia) en posteriores exposiciones a ese antgeno especifico pero no afecta a las respuestas a otros antgenos (Tan, 1993). La posibilidad de hacer no inmunognicos a tumores inmunognicos transplantados transfirindoles el gen 87 (Townsend. 1993: Chen. 1992; Baskar, 1993: Janeway. 1994) sugiere que las molculas coestimuladoras juegan un papel importante en la activacin de las clulas T in vivo.

Activacin de los linfocitos T inducida por antigenos


La activacin de los linfocitos T inducida por los antigeno/MHC implica una serie de acontecimientos complejos y definidos que difieren sutilmente entre la activacin de una clula T nativa frente a la activacin de una clula T de memoria. El antigeno es procesado por las clulas B o por los monocilos provocando el ensamblaje de pptidos inmunognicos en los productos de los genes del MHC de clase I o II El complejo pptidoMHC es presentado a las clulas T que portan el receptor apropiado de esa clula T. Adems, la APC expresa una serie de molculas de adhesin y coestimulacin que interactan con los receptores ligando/antagonista apropiados de la superficie de la clula T. La unin aislada del receptor de la clula T no es suficiente para la activacin de la clula T lo que ha conducido al "modelo de las 2 seales" para la activacin de la clula T (Brestcher, 1992). La primera seal que ocurre por la va TCR/CD4/CD8 modula la transicin de la clula T en las primeras etapas de la activacin (p ej.. de G a G.). La 2- seal se produce por la via de los coestimuladores. ms concretamente por el CD28 y en menor medida por LFA-3. CD2, CD5 y CD7. y lleva a la induccin de la IL-2 y de otros genes de citocinas requeridos para la proliferacin y diferenciacin de la clula T hacia clulas efectoras.
0

Transduccin de seales despus de la estimulacin antigeno-especfica


La presentacin del antigeno a las clulas T conduce a la agregacin del complejo del TCR-CD3 y a la activacin de la protena tirosina cinasa (PTK), El TCR por si mismo tiene un pequeo dominio ciloplasmtico sin actividad de transduccin conocida. Es la cadena asociada del complejo CD3, que contiene residuos ITAM y que se ha demostrado que coprecipita la actividad de la protena tirosina cinasa Dos clases bien conocidas de familias citoplasmticas de PTK estn implicadas en las etapas mas precoces que siguen a la agregacin del receptor de clulas T, Src y Syk/ZAP-70. Las cascadas de sealizacin que se originan a partir del complejo TCR-CD3 y la va d e la coestimulacin por CD28 son bien conocidas (Foletta, 1998). La activacin de las tirosina cinasas asociadas al TCR. ZAP70. p59- y p56 originan la activacin de tres vas. p2T , calcio calicreina. y proteina cinasa C (PKC). La activacin del p21" activa las prolena cinasas activadas por mitgenos (MAPK) que fosfonlan muchos factores de transcripcin regulando de este modo la expresin gentica. La activacin de la tirosina cinasa tambin activa a la fosfolipasa C que hidroliza el fosfatidil inositol y origina la generacin de los segundos mensajeros diacil glicerol (DAG) e inosilol trifosfato (IP3). El DAG activa la proteina cinasa C. y el IP, origina un rpido y sustancial aumento del calcio ciloplasmtico. El aumento del calcio libre activa la fosfatasa calcineurina dependiente de calmodulma.
1b

Reconocimiento de las clulas T, activacin y transduccin de la seal


El complejo TCR est compuesto por una estructura de reconocimiento del antgeno heterodimrica (esto es. el TCR) y un complejo de transduccin no unido covalentemente que es el CD3. El TCR no puede expresarse en la

CAPTULO 36

EXAMEN DE L A B O R A T O R I O DEL SISTEMA I N M U N E CELULAR

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Estos procesos tambin conducen a la induccin de protenas de unin al ADN y a la transcripcin de numerosos genes incluyendo la IL-2 y el receptor de IL-2 requeridos para la proliferacin de la clula T. Para ms informacin sobre las vas de transduccin molecular tras la activacin del TCP. y el CD28, consultar a Wiss (1994). Zhao (1997), Foletta (1998) y Halloran (1999). La comprensin de las vas que conducen a la activacin de la clula T ha llevado al descubrimiento de los defectos moleculares de muchas enfermedades de inmunodeficiencia adquirida y puede ayudar finalmente a proporcionar estrategias teraputicas para corregir esos defectos. Por ejemplo, se han publicado mutaciones en la proteina tirosina cinasa ZAP70 y estn asociadas con la forma autosmica del sndrome de la inmunodeficiencia combinada severa (SCID) en humanos (Eider, 1998). Las mutaciones en la cadena comn y de los receptores de interleucina IL-2, IL-4, IL-7, IL-9 e IL-15 originan anomalas de la transduccin y estn asociadas con la forma ligada al cromosoma X del SCID (Noguchi, 1993). Es interesante hacer notar que otras formas de SCI adquiridas autosmicamente estn asociadas con las mutaciones en la protena tirosina Jak3 de la familia de protenas Jano. la nica molcula de sealizacin asociada con la cadena comn y (Russell. 1995). A medida que se van descubriendo ms anomalas subyacentes que conducen a la inmunodeficiencia de clulas T. se ha propuesto que los trastornos deben clasificarse empleando un extenso sistema que identificar los trastornos de acuerdo con las alteraciones en la diferenciacin, la maduracin y la funcin (Gelfand. 1993). Estas designaciones podran comenzar a enfocarse en los defectos fisiolgicos o bioqumicos propiamente dichos y pueden finalmente proporcionar nuevas opciones teraputicas. Para una revisin de las alteraciones moleculares especficas que originan alteraciones en la activacin y proliferacin de la clula T. consultar a Arnaiz-Villena (1992), Gelfand (1993) y IUIS (1999).

estos individuos seronegativos de alto riesgo han desarrollado una inmunidad protectora mediada por clulas como resultado de una baja dosis de inmunizacin o de infeccin.

Metodologa: determinacin de la activacin y la proliferacin linfocitica en la evaluacin de la inmunodeficiencia celular


Los defectos del desarrollo, las alteraciones genticas congnitas y las infecciones adquiridas provocan estados de inmunodeficiencia severa. Adems, las quemaduras graves, los traumatismos y las intervenciones teraputicas tambin originan mmunodeficiencias. Los anlisis en masa pueden emplearse para determinar si un individuo tiene o no una disminucin de la respuesta proliferativa de las clulas T y han estado disponible durante algn tiempo pero estn limitados por una baja reproducibilidad y por la limitada informacin que aportan. El desarrollo de las nuevas tecnologas ha permitido la produccin de una variedad de reactivos que pueden emplearse para evaluar mltiples actividades a lo largo de la via de activacin de la clula T. Estos reactantes incluyen anticuerpos monoclonales especficos como marcadores de la activacin de la clula T. reactivos y sistemas para la deteccin de citocinas intracelulares. y marcadores de seguimiento y precursores no radioactivos del ADN desarrollados para evaluar la proliferacin linfocitica.

Procedimientos empleados para evaluar la activacin y la proliferacin de la clula T


El procedimiento ms frecuentemente utilizado in wVopara evaluar la inmunidad celular es una simple prueba cutnea. Una prueba cutnea positiva para la deleccin de una respuesta de hpersensibilidad implica una inmunidad celular y una quimiotaxis de monocitos intacta (Borut. 1980). Aunque las pruebas cutneas se llevan a cabo fcilmente, los resultados negativos son difciles de interpretar, especialmente en nios pequeos, y las pruebas cutneas no son tan sensibles como los ensayos de estimulacin de linfocitos in vitro (Borut. 1980). Otras variables, m vivo, de la inmunidad mediada por clulas son la sensibilidad por contacto, la formacin de granulomas y el rechazo alognico. Los linfocitos son los nicos en los que se expresan receptores de superficie capaces de identificar virtualmente cualquier molcula o sustancia extraa (antigeno). La diversidad estructural de estos receptores se origina por el reordenamiento diferencial de los genes del receptor de la clula T. En general, solo hay un nmero limitado de linfocitos circulantes capaces de reconocer un antigeno. In vivo, cuando un linfocito reconoce un antigeno extrao, las clulas proliferan rpidamente de forma clonal para generar un gran nmero de clulas tanto efectoras como de memoria. Los primeros mtodos empleados para evaluar la proliferacin linfocitica incluan el recuento manual del nmero de clulas antes y despus de la estimulacin. Desgraciadamente, estas tcnicas requieren mucho tiempo y presentan muchos problemas tcnicos. En los ltimos aos se han desarrollado nuevos mtodos que miden los diferentes acontecimientos celulares que ocurren en la ruta de la divisin celular. Hay que subrayar que los mtodos que miden los sucesos iniciales en la activacin del linfocito T pueden o no correlacionarse con la divisin celular.

Respuestas de la clula T
Recientemente, se ha preterido la designacin de la respuesta de la clula T tipo I frente a la respuesta de citocinas tipo II para aquellas respuestas de la clula T que originan unos patrones de secrecin de citocinas que se sabe que estn implicados en la inmunidad celular frente a los patrones de secrecin de citocinas observados en la inmunidad humoral, respectivamente. Las respuestas tipo I se caracterizan por la secrecin de citocinas que se sabe que aumentan la inflamacin (promflamatorias) e inducen la activacin y la proliferacin de las clulas T y los monocitos, a saber, IL-2, IFN-y, e IL-12. Las respuestas tipo II se caracterizan por la secrecin de citocinas que suprimen la inflamacin (antiinflamatorias) y estimulan a las clulas B a dividirse y diferenciarse en clulas secretoras de inmunoglobulinas (esto es, IL-4, IL-5, IL-10 e IL-13). Hay evidencias que sugieren que la secrecin de las citocinas del tipo I regulan la secrecin de las citocinas tipo II y viceversa (Paul. 1994). Por ejemplo, en presencia de IL-4, tanto in vivo (Chtelain, 1992) como ih vitro (Seder, 1992:1993). las clulas T no se diferencian en clulas secretoras de IFN-y (es decir, este ambiente favorece el desarrollo de una respuesta inmune humoral). Se ha propuesto que las cantidades relativas de IL-4 e IL-12 presentes durante la estimulacin de las clulas T nativas dirigirn la respuesta hacia un lado o hacia otro (Paul, 1994). Muchos factores estn implicados en la regulacin del tipo de respuesta de la clula T que sigue a la estimulacin antignica. Adems del ambiente de citocinas, hay evidencias que sugieren que la dosis de antgeno influye en el tipo de respuesta (Bretscher. 1992: Madreas, 1995). La respuesta predominante que se desarrolla Iras la activacin de la clula T tiene implicaciones clnicas significativas. Se ha postulado que el desarrollo de una respuesta de tipo I a la infeccin por el VIH puede conducir a una inmunidad protectora (Clerici, 1994). Claramente, una respuesta tipo II no es protectora, ya que la mayora de las personas infectadas seroconvierten y eventualmente fallecen por intensa inmunodepresin. Clerici y Shearer (1993,1994) argumentan que la exposicin repetida a una dosis baja de VIH-1 puede originar una inmunidad protectora celular tipo I. Los resultados de estos grupos indican que entre el 39% y el 75% de las clulas mononucleares de la sangre perifrica (PBMC) de los individuos de alto riesgo (varones homosexuales, adictos a droga va intravenosa y nios nacidos de madres VIH positivas) seronegativos para VIH-1 y negativos para la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR), secretan IL-2 en respuesta a la protena env in vitro. Estos cientficos proponen que

Ensayo de incorporacin de timidina tritiada H (ensayo TdR)


Muchos laboratorios evalan la capacidad proliferativa de los linfocitos calculando el grado de incorporacin de nuclesidos radiactivos del ADN (timidina tritiada) durante un pulso de 4 a 24 horas tras una incubacin prolongada de cultivos celulares de mononucleares de sangre perifrica con mtgenos (tres a cuatro das) o con antgenos (5 a 10 das). En general, solo un nmero limitado de clulas T responden a un antigeno in vitro; por lo tanto, las clulas deben cultivarse durante 5 a 10 das para detectar la respuesta. Los mitogenos, por otra pane, inducirn la rpida proliferacin de hasta el 100% de las clulas T. Por esta razn, la proliferacin puede detectarse en tres o cualro dias proporcionando con ello una herramienta de cribado efectiva. La transformacin linfocitaria in vitro en respuesta a un rmtgeno fue descrita por pri-

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SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA

mera vez por Nowell (1960). Los mitgenos son, en general, los estimuladores ms potentes, ya que activan una gran proporcin de linfocitos en relacin con los aloantigenos y los antigenos.

Citometria de flujo en la evaluacin de la activacin y la proliferacin linfocitaria


Los anlisis en masa, adems de sus inherentes problemas tcnicos, no proporcionan informacin sobre las subpoblaciones celulares especficas que estn respondiendo. La citometria de flujo con su potencial multiparamtrico inherente se ha convertido en el instrumento de eleccin para el anlisis de la inmunologa celular. La figura 36-1 ilustra algunos de los acontecimientos celulares que ocurren a lo largo de la ruta de activacin/proliferacin de la clula T que pueden medirse por citometria de flujo. Para una revisin extensa de la citometria de llujo y de los mtodos empleados para evaluar la activacin y la proliferacin linfoctica. vase Bauer (1993) y Shapiro (1995). Otro mtodo basado en la citometria de flujo que ha alcanzado un uso importante en los laboratorios clnicos es la medida de los linfocitos en varas fases del ciclo celular. En general, los anlisis del ciclo celular se llevan a cabo midiendo el nivel de intensidad fluorescente emitida por las sondas de ADN. El marcador empleado ms frecuentemente es el yoduro de propidio. que interacciona estequiomtricamente con el ADN (esto es. la cantidad o intensidad de fluorescencia es proporcional a la cantidad de ADN de la clula). Utilizando complejos modelos matemticos, es posible medir el porcentaje de clulas con un contenido en ADN entre 2- y 4 , que se correlaciona con el porcentaje de clulas en fase "S" del ciclo celular. En general, los linfocitos de sangre perifrica se encuentran en la fase de reposo del ciclo celular, con menos del 5% de las clulas en la fase "S"
C

FLUORESCENCIA

I.O

lKH26

Figure 36-2. Empleo de marcadores de seguimiento PKH26 en linfocitos perifricos estimulados y no estimulados por mitgenos tras cinco dias en cultivo. La proliferacin celular se indica p o r la dilucin d e la intensidad fluorescente en c a d a generacin sucesiva. (Modificada de Shapiro HM: Practical F l o w Citometry. 3* ed. Nueva York. Wiley-Liss. 1995. pg. 3 1 3 . Copyright Wiley-Liss. 1995. Reimpreso c o n permiso de Wiley-Liss. Inc.. subsidiaria de John Wiley & Sons. Inc.) ware necesario para el anlisis junto con los marcadores de rastreo (Sigma Immunochemicals. St. Louis. MO). Una evaluacin de 14 de los marcadores utilizados ms frecuentemente inform que dos de los marcadores. PKH26 y el ester succinimidilco del diacetato de carboxifluoresceina (CSFE). eran los ms adecuados por su capacidad para cuantificar la proliferacin de los linfocitos (Parish, 1999). Este ensayo puede proporcionar la evaluacin ms fiable de la respuesta proliferativa celular en sistemas de cultivo in vitro con ventajas importantes sobre los anlisis en masa habituales, permitiendo la medicin de subpoblaciones especficas de linfocitos. Los indices de CSFE parecen correlacionarse ms estrechamente con los anlisis con TdR que la medida de las clulas CD69* (ngulo. 1998). La medida de la proliferacin linfocitaria empleando las sondas marcadas PKH26 y el CSFE ha sido desarrollada, optimizada y analizada para su empleo en aplicaciones clnicas (Allsopp, 1998; ngulo. 1998). La posibilidad recientemente desarrollada de medir la produccin de atocinas asociadas a las clulas a nivel de una sola clula tiene un importante potencial como herramienta clnica en la evaluacin de la respuesta celular inmune. Bsicamente, las clulas son estimuladas, ya sea c o m o PBMC o como sangre completa, durante cuatro a seis horas en presencia de reactivos que bloquean el transporte de membrana (breleldina A o monensma) para evitar la secrecin de atocinas. Entonces, se marcan las clulas con anticuerpos monoclonales especficos de cada subpoblacin, se fijan, se permeabilzan y se marcan con anticuerpos monoclonales fluorescentes especficos para el estudio de la citocina de inters (Jung, 1993; Prussia 1995). El ensayo se ha desarrollado en presencia de anticuerpos estimuladores para la deteccin sensible de respuestas antignicas en cultivos de sangre tras periodos relativamente cortos de incubacin (Suni, 1998). Se ha prestado especial atencin al desarrollo de anticuerpos que reconozcan las formas de nacientes de las citocinas (dentro del aparato de Golg) y la optimizacin del tiempo de cultivo para detectar la mxima respuesta de las atocinas (Mascher, 1999). Los estudios clnicos han comenzado a demostrar la utilidad potencial de esta tcnica. Por ejemplo, los pacientes que sufren quemaduras m u y graves y que muestran una deriva hacia la respuesta de citocinas Th2 pueden tener un riesgo mayor de desarrollar fracaso multorgnico (Zedler. 1999). Esto puede ser m u y ventajoso, ya que no hay pruebas actuales que indiquen qu pacientes sufrirn esta complicacin potencialmente

Algunos laboratorios han reemplazado los ensayos de incorporacin de timidina tritada por anlisis de induccin de marcadores de superficie celular combinados con una medida del porcentaje de clulas en vanas fases del ciclo celular tras la activacin (Cost. 1993). Recientemente, se han desarrollado marcadores que se integran de forma estable en las membranas de los linfocitos vivos. Tras eliminar el exceso de marcador, se estimula la divisin de los linfocitos. Con cada divisin sucesiva la cantidad de marcador por clula se reduce a la mitad. La fluorescencia emitida por las clulas tras el cultivo puede modelarse permitiendo la estimacin del nmero de divisiones celulares (Fig. 36-2). Esta metodologa se ha estandarizado recientemente en un equipo analtico que incluye el soft-

Figura 36-1. Curso temporal de los acontecimientos implicados en la activacin de los linfocitos T, que pueden detectarse por citometria de flujo (Modificada de Shapiro HM: Practical Flow Otometry. 3- ed. Nueva York. Wiley-Liss. 1995. pag 397 Copyright <g Wiley-Liss. 1995. Reimpreso con permiso de Wiley-Liss. Inc.. subsidiaria de John Wiley 8 Sous, Inc.)

CAPTULO 36

EXAMEN DE LABORATORIO DEL SISTEMA INMUNE CELULAR

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mortal. Se estn realizando actualmente muchos estudios que evalan la utilidad clnica de esta prometedora nueva tecnologa. Se ha informado la expansin de esta tcnica para incorporar la capacidad de medir simultneamente la proliferacin y la sntesis especfica de citocinas a nivel de una sola clula pero todava no ha sido evaluada en un marco clnico (Mehta, 1997). Ciertamente, se estn desarrollando nuevas tcnicas que miden los diferentes acontecimientos implicados en la activacin de la clula T. Hay mtodos y reactivos disponibles para medir los acontecimientos precoces de fosforilacin/desfosforilacin hasta la transduccin de seales, la transcripcin de los genes y la divisin celular. Segn se adapten estos mtodos a la actividad clnica diaria, podremos disponer de un arsenal de estos para evaluar muchos de los procesos implicados en la activacin y proliferacin de los linfocitos. Aunque un elevado nmero de estas nuevas tecnologas todava estn en manos de los laboratorios de investigacin, los mtodos se estn simplificando y adaptando constantemente para su uso y evaluacin en los laboratorios clnicos.

FUNCIN GRANULOCTICA EN LA INMUNIDAD MEDIADA POR CLULAS


Tanto los monocitos como los granulocitos derivan de un precursor comn. Los granulocitos son extremadamente importantes en la respuesta inflamatoria precoz, y las alteraciones en sus funciones conducen a deficiencias importantes en la inmunidad celular. Estas suceden en cualquier punto de una serie de procesos necesarios para la funcin de los granulocitos, incluyendo la dificultad en abandonar la vasculatura (diapdesis), el movimiento hacia el agente agresor (quimiotaxis. quimioquinesia). la opsonizacin del agente agresor (fagocitosis) y la destruccin por la va de la generacin de radicales txicos del oxgeno.

sean ms relevantes y tiles en el laboratorio clnico (Weinberg. 1993). Recientemente, la FDA aprob el anticuerpo monoclonal obtenido por ingeniera gentica trastuzumab (Herceptin) para el tratamiento de pacientes con cncer de mama metasttico cuyos tumores sobreexpresan el gen HER2meu y al mismo tiempo aprob una prueba diagnstica en la que se usan mtodos de inmunohstoqumica (IHC) para la deteccin de la proteina HER2/'neu, que es la diana del anticuerpo. Otra prueba que utiliza la FISH para detectar la amplificacin de la expresin gnica de la proteina HER2/neu se est utilizando en laboratorios especialmente entrenados. Cada prueba complementa a la otra, poseyendo cada una distintas dificultades tcnicas y sensibilidad. El IHC suele producir falsos negativos debido a la existencia de artefactos y necesita ser revisado por otro mtodo. Con el FISH existe la posibilidad de falsos positivos (la expresin gnica no tiene por qu equipararse necesariamente con la amplificacin gnica). Como sucede en muchas tcnicas, incluyendo el anlisis del ciclo celular en el ADN. cada uno de los nuevos marcadores y de las nuevas tcnicas deben ser definidos, evaluados y correlacionados con los resultados del paciente antes de otorgarle o no una utilidad clnica absoluta. Se ha introducido el desarrollo de instrumentacin que combina la fuerza de la citometria de flujo y las ventajas estticas del anlisis de imagen. Esos instrumentos, conocidos como citmetros de exploracin por lser, realizan las mediciones tradicionales de citometria de flujo de dispersiones hacia adelante, dispersiones laterales y fluorescencia en las clulas en suspensin o fijadas en el portaobjetos. La experiencia con estos sistemas determinar si este abordaje ofrece ventajas de las que no se dispone con la citometria de flujo actual y con las configuraciones de sistemas de imagen (MartinReay, 1994) (Fig. 36-3). Los citmetros de exploracin por lser y los anlisis de imagen no se desarrollan en este captulo. Los avances combinados en el procesamiento por pulsos electrnicos, pticos y en el almacenamiento de datos junto con los avances en la tecnologa de los ordenadores y del software han permitido que la tecnologa de la citometria de flujo llegue a ser una rutina en el laboratorio. Adems, la amplia posibilidad de anticuerpos monoclonales agrupados, que incluyen ms de 150 (Kishimoto, 1998), marcados con muchos colores, directamente conjugados y en formato preformado ha permitido la deteccin simultnea de mltiples antigenos de superficie as como de constituyentes citopiasmticos y nucleares. La posibilidad de desarrollar anlisis multiparamtricos es la mayor fuerza de la citometria de tiujo. Actualmente, la determinacin tanto de los marcadores fenotpicos como de los intracelulares es una rutina en muchos laboratorios. Los principales fabricantes han desarrollado el arte de la citometria de flujo convirtindolo en una ciencia de rutina en los laboratorios (ciencia de "caja negra") para desgracia de muchos. Como se ha descrito, este fenmeno es el resultado del uso de la citometria de flujo en la fenotipificacin de las poblaciones de las clulas T para la monitorizacin de los pacientes con VIH (Shapiro, 1993: Centers for Disease Control [CDC], 1992; Calvelli, 1993). Antes de la aparicin de la epidemia del VIH, la utilidad de la citometria de flujo en el laboratorio le principalmente para la caracterizacin de las leucemias y de otras enfermedades hematolgicas malignas y para el anlisis del ADN de tumores en la fase de sntesis (fase S) y el ndice de ADN (DI). Aunque la tecnologa de la citometria de flujo puede ser ms "caja negra", la epidemia de VIH ha aportado la citometria de flujo a un nmero mucho mayor de instituciones y laboratorios [College of American Pathology [CAP]. 1990-2000). Esto ha permitido a esta tecnologa ser una parte integral de muchos diagnsticos y un importante complemento en el tratamiento de los pacientes. A pesar de su simplificacin, persisten muchas cuestiones relacionadas con la regulacin de la FDA, la competencia de los anlisis y la gestin y reproducibilidad de los datos. Eslo es particularmente cierto en lo referente al anlisis del ADN (CAP, 1990-2000). No es el propsito de este captulo describir todos los matices de la citometria de flujo o de la citometria de imagen. Todas las citometras de flujo actuales pueden utilizarse adecuadamente como rutina en la fenotipificacin y anlisis del ADN. La mayora de los problemas de los laboratorios son la imposibilidad de estandarizar los reactivos de control de calidad y los calibradores y la prdida de mtodos rpidos y fiables para la transferencia y almacenaje de datos, compatibles con los sistemas de informacin del laboratorio. Se insta a los lectores a que consulten las numerosas referencias para una seleccin apropiada del citmetro de flujo o de imagen referente en cuanto a sus muchas configuraciones y capacidades (Shapiro, 1993, 1995).

METODOLOGA: CITOMETRA DE FLUJO Y DE IMAGEN


El empleo de la citometria de flujo (anlisis celular basado en el lser) se ha convertido en el estndar de la prctica del laboratorio clnico en el estudio de respuesta inmune celular, como se indic previamente (Kamientsky. 1969; Hertzenber, 1976). Las determinaciones de la inmunocompetencia e nmunomodulacn de los marcadores y receptores de superficie especficos, la caracterizacin de la lnea por medio de la fenotipificacin inmune de los linfomas y de las leucemias, la definicin de malignidad empleando sondas especficas de cromosomas, as como el estudio de la heterogeneidad tumoral por las mediciones multiparamtricas del ADN son estudios frecuentemente realizados en muchos laboratorios, como se estableci previamente, y se detallan en Keren (1989a. 1989b), as como en muchas otras referencias mencionadas a lo largo de este texto. La clasificacin de los tipos celulares por estos medios significa la posibilidad de definir las funciones biolgicas y efectoras en las bases moleculares y permite establecer las relaciones de estas mediciones con procesos y definiciones de enfermedades. Estas son unas pocas de las aplicaciones que son posibles empleando las tecnologas basadas en el lser. Se utilizan dos tecnologas principales. En la primera, conocida como citometria de flujo, se contabilizan las partculas y se determinan las caractersticas fsicas y qumicas de las partculas que pasan a travs de un flujo de lquido en una suspensin de clulas aisladas. En la segunda, conocida como anlisis esttico, las partculas son estacionarias y la plataforma o el lser se mueven como en un anlisis de imagen (Martin-Reay. 1994). La tecnologa del anlisis de imagen se est haciendo un hueco poco a poco en el laboratorio para la evaluacin de citospines preparaciones de contacto {louch preparations). en preparaciones cromosmicas. y en secciones titulares para ciertas aplicaciones, como la hibridacin n situ fluorescente (FISH) y de DNA. Los avances en la disponibilidad de las sondas fluorescentes para la FISH y la representacin cromosmica en los aos recientes har que estos anlisis

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SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA

Figura 36-3. El empleo de citmetro de exploracin por lser (LSC) produce dalos que son comparables a los datos de la citomelra de flujo: sin embargo, debido a que la mquina se basa en cortes, hay algunas diferencias clave. A diferencia de la citomelra de flujo, en la que toda la informacin de cada clula se encuentra en un solo pulso electrnico para cada parmetro, la LSC emplea cientos de mediciones para calcular y extraer los parmetros para cada clula. Tambin es posible obtener parmetros derivados. El valor celular es la cantidad total de fluorescencia por clula, pero los parmetros derivados, como el rea celular y el valor pico, son tambin importantes. La figura muestra los datos de una preparacin con cytospin de clulas HL-60 que fueron marcadas con yoduro de propidio (Pl). Se muestra el histograma de un solo parmetro del valor rojo, as c o m o las tres posibles combinaciones de los parmetros rojos derivados. De particular inters es la agrupacin de clulas localizada debajo de la letra c. La muestra tue teida con hematoxilina y eosina. y las clulas de las reas m a r c a d a s (videsupca) fueron trasladadas. Se muestran las lotos digitales de las primeras 20 clulas trasladadas a cada regin. Las clulas en la regin c estn en mitosis. mientras que las clulas en la regin d, b. y a se corresponden a clulas a travs de las etapas G.a, G,b. y G;m del ciclo celular. (Cortesa de CompuCyte. Cambridge, MA.)

Ms importante para los mdicos es la comprensin de la tecnologa, las fortalezas y las debilidades en el control y garanta de la calidad, en la preparacin de la muestra y en la interpretacin de los datos.

Hardware y otras herramientas Fuente luminosa y procesamiento de la seal


La citomelra de flujo actual rara vez se utiliza para realizar una clasificacin, y esta propiedad persiste con los elementos de investigacin en los laboratorios altamente especializados. La citometra de flujo clnica emplea

ahora helio-nen o diodos lser y lser de ion de argn refrigerados por aire o un nico ion de argn refrigerado por aire con emisin a 488 nm (Bogh. 1993). El lser actual tiene una salida de pocos milivatios, entre 10 y 20 mW, y dura ms de 6.000 horas. Esos lseres, comparados con los previos refrigerados por agua, son fciles de mantener, no requieren precauciones especiales de seguridad y son ms baratos de sustituir. Si un laboratorio est interesado en desarrollar cinco o ms colores de anlisis empleando sondas de Hoescht estimuladas con radiacin ultravioleta, entonces es necesario emplear grandes lseres refrigerados por agua de 5 W combinados con los lseres refrigerados por aire, aunque los nuevos instrumentos con nuevos lser estn eliminando la necesidad de los lseres relrigerados por agua. La

CAPTULO 36

EXAMEN DE L A B O R A T O R I O DEL SISTEMA I N M U N E CELULAR

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mayora de los citmetros de lujo multifacticos clnicos utilizan un lser simple de ion argn refrigerado por aire con un minimo de cuatro tubos lotomultplicadores. Las configuraciones instrumentales ms Irecuentes incluyen el Becton-Dickmson FACScan que est siendo reemplazado por el FACS-Calibur (tiene un mdulo de clasificacin con capacidades limitadas) y el FACS Vantage para ocho o ms parmetros y categonzacin de alta velocidad. El Coulter Protile II y el Odho Cytoron, instrumentos de laboratorio habituales, ya no se fabrican y han sido sustituidos sobre todo por el Coulter XLs o el FACSCalibur. Beckman Coulter contina con el Coulter XL y software mejorado para el tratamiento de datos. Adems, el ASTRA de Beckman Coulter aade a la categonzacin de alta velocidad, ocho parmetros adicionales para el laboratorio de investigacin. La introduccin del XL como ltima tecnologa en citometra de flujo con el empleo de seales de procesamiento de pulso digital (Coulter, 1994; Shapiro, 1995). con convertidores de analoga digital de alta resolucin (ADCs). invalida el uso de los amplificadores logartmicos (log amps). Este es un importante avance ya que elimina cuestiones de alineacin y baja sensibilidad en los lmites bajos (umbral) en la medicin de la intensidad de fluorescencia. En la citometria de flujo tradicional, las mediciones de la fluorescencia se realizan en una escala lineal pero tienen que ser convertidas a logaritmos para que la escala sea razonable (para colocar todos los puntos de inters). Este proceso en los instrumentos no digitales se lleva a cabo con el empleo de ACD con amplificadores logartmicos. Desgraciadamente, esta conversin de la seal lineal por medio del ADC a los amplificadores logartmicos ocasiona un ruido que origina un aumento de los coeficientes de variacin de procesamiento de la seal (CV) al aumentar la seal fluorescente Esto hace que cada medicin tenga diferente sensibilidad ya que el CV de la seal de conversin aumenta con un mayor nmero de canales (Shapiro. 1995a). Aunque muchos tcnicos que utilizan una citometria de flujo clnica realmente no entienden la causa de la sensibilidad variable de los amplificadores logartmicos en sus instrumentos, se enfrentan a los resultados o a la falta de respuesta en ciertas regiones de su escala logartmica. La linealidad es particularmente importante en la medicin del contenido del ADN (como las mediciones del ADN se hacen en una escala lineal, los problemas de la amplificacin logartmica se eliminan pero entran en juego otros factores electrnicos similares) ya que el valor DI depende de su exactitud. Ademas, la alineacin se est haciendo cada vez ms importante en la medida cuantitativa de la fluorescencia de la proliferacin y la activacin (Auer. 1994; Shapiro, 1995) as como est afectando al valor pronstico de los valores de la fase S en ciertos cnceres. El laboratorio debe realizar medidas de linearidad. sensibilidad y resolucin, y controles de calidad antes de desarrollar trabajos clnicos. Los controles de calidad diarios se definen posteriormente en este captulo. Se remite de nuevo a los lectores a revisar referencias apropiadas para ampliar con detalle (Bauer. 1993: Shapiro, 1995).

en estos sistemas para proporcionar seguridad y una mxima sensibilidad con el uso de sistemas basados en lser de baja potencia iBogh. "993). Todos los trminos empleados en la definicin de estos sistemas son confusos, incluyendo la tasa del flujo, la cubierta de presin, el tamao de la parte central, la velocidad resultante de la partcula, el CV resultante, etc El factor ms importante que ha de comprender un trabajador de laboratorio es que en el anlisis del ADN, las clulas son analizadas con un flujo bajo para aumentar el tiempo que permanece la partcula en el haz, lo que permite una mayor sensibilidad y un mejor CV. En la inmunotipificacin. la sensibilidad no es un problema especial, y el flujo de la partcula puede aumentarse. Muchos sistemas clnicos estn comprometidos en acomodar las dos aplicaciones ms frecuentes: la inmunotipificacin y el anlisis del ADN (Shapiro, 1993, 1995a: Goetzman. 1993). Los citmetros de flujo de investigacin tienen mucha mayor flexibilidad y el operador puede controlar el flujo de la muestra, la presin diferencial y el tiempo

Colores y ms colores: aplicaciones de los fluorocromos


Muchos laboratorios todava emplean los fluorocromos ms frecuentes, el isotiocianato de fluorescena (FITC: 530 nm de emisin) y el ficoeritrin (PE; 575 nm de emisin) en la medida del ADN (Shapiro. 1995b). El FITC y el PC se conjugan directamente por el anticuerpo de inters y simultneamente se aaden a la muestra del paciente. Ya no se requiere del uso de un anticuerpo secundario como una IgG de carnero antirratn (GAM) marcada con fluorescena para tener una mayor sensibilidad, y por lo tanto se minimiza la fluorescencia de fondo. Muchos de los anticuerpos utilizados en la clnica en el estudio del VIH son premezclados y prediluidos para su empleo con sangre completa. El Pl puede utilizarse simultneamente con el anlisis de superficie realizado en el anlisis multiparamtrico del ADN, aunque esto requiere la conservacin de la membrana celular (Clevenger, 1993). Existen ms tinciones disponibles en el laboratorio clnico que permiten mediciones simultneas de cuatro colores con anticuerpos monoclonales marcados directamente y excitados en un lser a 488 nm. Esta disponibilidad est revolucionando el desarrollo actual de la citometria de flujo en la prctica de laboratorio Estas tinciones con una emisin roja o roja lejana incluyen el tndem PE Texas Red (625 nm de emisin), el tndem PE-Cy-5 (675 nm de emisin) y la alolicocianina (675 nm de emisin), por nombrar unos pocos (Fig. 36-4). Los primeros tndem eran problemticos ya que el exceso de PE libre en la solucin conduca a un exceso de fluorescencia de fondo. Estn surgiendo nuevas tecnologas para la sntesis de estas tinciones, resolviendo muchos de los problemas tcnicos, y constantemente se estn aadiendo nuevas tinciones para el empleo en el laboratorio clnico (Clevenger. 1993). Con la disponibilidad de las tinciones rojas y rojas lejanas, se puede desarrollar un anlisis de la poblacin de VIH en un nico tubo con gran seguridad. Un tubo con 100 pL de sangre completa se lie simultneamente con CD45, PE-Cy-5. CD3 PE-Texas Red. CD8 FITC y CD4 PE. Con el nuevo procesamiento de seal digitalizado. la compensacin (wde inlral se lleva a cabo fcilmente, y se realiza el anlisis empleando el CD45 c o m o un agente iniciador mediante dispersin lateral (SSC) y el anlisis simultneo de CD3. CD4 y el CD8 (Fig. 36-5). Otro fenmeno interesante es que estas nuevas tinciones han permitido el empleo de la fluorescencia c o m o un iniciador en lugar de los parmetros habituales de dispersin de luz. Esto es posible porque no hay espectro de colores rojo lejano en los componentes de la mayora de las clulas o no tienen competicin autofluoresceme en estado natural como se encuentra con el FITC. Adems, pueden excitarse a una longitud de onda que minimiza la autofluorescencia de los constituyentes celulares como la riboflavina. Por tanto, cuando ocurre un suceso raro (presencia celular <0.1% de la poblacin total) empleando un iniciador fluorescente, se pueden analizar muchas clulas rpidamente Este mtodo tambin se emplea para marcar leucocitos en sangre no lisada utilizando fluoresceina como iniciador. Se utiliza un marcador que marca el ncleo o el citoplasma de los leucocitos y no el de los eritrocitos. Los mtodos de evaluacin de sucesos raros son cada vez ms frecuentes y ms fiables para el laboratorio clnico. Se han realizado y evaluado algunas investigaciones. En la evaluacin de la enfermedad residual mnima (MRD) incluyen la PCR. la citometria de flujo combinada con sondas nucleares, la citometria de flujo

Flujo celular
En el laboratorio se utilizan dos flujos celulares frecuentes, pero como la mayora de los instrumentos clnicos se utilizan en la medicin de las clulas CD4 en la monitonzacin de la enfermedad por VIH, la mayora de los sistemas clnicos utilizan un sistema cerrado como precaucin de riesgo biolgico. El primero, conocido como un flujo celular de corriente en aire o de flujo en aire, permite que el punto de medida ptico se encuentre directamente sobre la corriente de muestra. Este tipo de flujo celular minimiza la distancia entre la cmara de flujo y la punta del inyector de la muestra y por lo tanto minimiza el arrastre entre muestras y el tiempo de lavado de muestra necesario entre las mismas. Esta cmara permite una mayor variabilidad del grado de flujo de la muestra que en un sistema cerrado (Shapiro. 1993: Bogh. 1993). Otras ventajas de las puntas en la corriente en aire son importantes en la clasificacin celular y no se consideran aqu. En el sistema cerrado, a menudo referido como punta de cuarzo o clula de flujo, el punto focal est dentro de la cmara. Las desventajas de estos sistemas de cuarzo son la fineza del cuarzo y por ello la difraccin del haz del lser o la dispersin de la seal. Adicionalmente. la seccin cuadrada tan relativamente amplia (200/ pm) hace que sea ms difcil controlar el flujo. El xito de estas clulas de flujo de cuarzo en el sistema clnico depende de la iluminacin y de las pticas de recogida. Los fabricantes conocidos han avanzado mucho

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Figura 36-4. Sondas fluorescentes frecuentes empleadas en la citometra de flujo multicolor multiparamtrica (De Shapiro HM: Practical Flow Cytometry. 3- ed. Nueva Cork, Wiley-Liss, 1995. pg. 245. Copyright Wiley-Liss. 1995. Reimpreso con permiso de Wiley-Liss. Inc.. subsidiaria de John Wiley & Sons. Inc.)

con la utilizacin de mltiples marcadores que delinen el fenotipo leucmico y varias aplicaciones del FISH. Los datos sugieren que la remisin real de la mdula sea en la leucemia mieloide nunca ocurre realmente como se ha demostrado en el anlisis de citometra de flujo; simplemente es un tema de nivel de sensibilidad y de deteccin del suceso (Campana. 1995.1999). Esto

obviamente tiene grandes implicaciones cuando se correlacionan los resultados de la citometra de flujo frente a los criterios morfolgicos de remisin y prediccin de recidivas. Sigue evalundose cmo afectar esto a las estrategias de tratamiento en varias enfermedades hematolgicas malignas. Adems, el empleo de la PCR con transcriptasa inversa (RT-PCR) es ms habi-

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EXAMEN DE LABORATORIO DEL SISTEMA INMUNE CELULAR

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tual. La deteccin de las seales de RT-PCR en pacientes que se encuentran en remisin clnica todava no est clara, mientras que la deteccin del MRD por amplificacin de la PCR de los genes del receptor antignico se ha correlacionado consistentemente con los resultados del tratamiento (Campana, 1999). El empleo de fluorescencia multicolor ha permitido que el concepto del anlisis mulliparamtrico llegue a ser una realidad en muchos laboratorios. Los parmetros pueden evaluar 1) diferentes poblaciones funcionales de una poblacin celular particular empleando unas sondas fluorescentes mtracelulares; 2) el empleo de muchos colores para identificar pequeos grupos de

otros sucesos no identificables de otra forma (como en el MRD): (3) el estatus de activacin celular en una etapa particular de la enfermedad (p. ej., el empleo del HLA-DR y el CD38 en los CD4 y CD8s en la estadificacin del VIH empleando un abordaje en ancla): (4) asi como observar la expresin de la superficie celular y el DI o fase S de una poblacin particular de clulas al igual que definir la fase S CD19 en la leucemia aguda. Obviamente, las posibles combinaciones son casi infinitas y su sofisticacin est aumentada por la disponibilidad de marcadores especficos y sondas de ADNARN (Fig. 36-6). A continuacin se expone un anlisis sobre algunas de esas investigaciones y tcnicas.

4 C O L O R (1)45/4/3/8

Figura 36-5. A. Empleo de la atometra de flujo de cuatro colores en el desarrollo del panel de m o n i tonzacin del VIH. El mtodo d e m u e s t r a el e m p l e o del CD45 c o m o estrategia de c o m i e n z o y el empleo del CD45 y la dispersin de luz en el desarrollo de una diferenciacin en tres partes (H-6). El empleo de la citometria de flujo de cuatro colores permite que las poblaciones de clulas T sean medidas en el m i s m o tubo y que todas las clulas sean contadas. El histograma 7 se incorpora en la regin F contenida en el histograma 1 (FALX frente a SSC). En el histograma 1. el e m p l e o de l a regin Q define los desechos. Si estos son m a y o r e s del 1 5 % del total de sucesos, n o r m a l m e n t e se t o m ac o m o una muestra inaceptable. Esta investigacin permite analizar t o d o s los parmetros y c o m p a r a r l o s entre si. (Los anticuerpos monoclonales directamente conjugados fueron de clones Coulter o ( S e c t o r Dickinson para el FTIC PE. Coulter para el ECD y de Callag Corporation para el Cy-5-CD45.) La ilustracin contina en pgina siguiente

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INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA

Figura 36-5. Continuacin. B. panel de monilorizacin del VIH c o m o en A, excepto que en este caso los paneles incorporan el empleo de un parmetro de recuperacin lintoctico calculado con FALS trente a SSC y CD45 y Irente a SSC. Adicionalmente, en H:2 se demuestra el empleo de una entrada-T. Estas estrategias de recepcin permiten calcular y comparar mltiples valores del CD3 trente a otros.

ID Pcnt 11 1.7 12 71.2 13 1.4 14 25.6

Figura 36-6. El empleo de la citometra de flujo multiparamtrica permite la deteccin simultnea d eu n a superficie fluorescente (CD20 positiva) y por lo tanto la definicin de la linea celular y despus la posibilidad simultnea de medir la intensidad de yoduro de propidio y as la medicin del contenido total de ADN. para identificar las clulas leucmicas especficas marcadas c o m o CD20. Esta tcnica evita la necesidad de aislar la poblacin de inters antes de la tincin del ADN y puede hacerse simultneamente c o n la tincin de la mdula sea para la evaluacin leucmica. Otras poblaciones, c o m o las citoqueratinas y otros m a r c a d o r e s de estirpe celular, pueden ser identificadas en t u b o s adicionales. La muestra de mdula sea fue teida con CD20 FITC (Coulter, Miami, FL) y despus fijada empleando metanol, permeabilizada usando Tritn X al 0.1%, y teida con solucin d e yoduro de propidio (Pl) y ARNasa estndar. L o s linfocitos d e sangre perifrica fueron utilizados c o m o control normal no ciclico (no se m u e s t r a n los dalos).

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RECEPCIN Y ANLISIS Inmunofenotipificacion: aplicacin a las muestras habituales y leucmicas


El anlisis de las poblaciones celulares con la citometra de flujo emplea una combinacin de parmetros que. cuando se aplican, definen una poblacin especifica de clulas. La citometria de flujo emplea parmetros similares a aquellos que se han empleado durante muchos aos en hematologa, incluyendo el tamao (por dispersin de luz hacia delante), la granulacin citoplasmtica (dispersin lateral), las afinidades por marcadores especficos y otros, y las combina con las herramientas inmunolgicas ya mencionadas. Estas incluyen mltiples marcadores fluorescentes unidos a anticuerpos o sondas, mediciones de ADN realizadas empleando bien Pl o 4'6-diamidin-2fenolindol (DAPI) y otros marcadores nucleares. La clave es la deteccin simultnea de estos parmetros por los sistemas analticos actuales. Durante muchos aos, la citometria de flujo del laboratorio clnico slo poda emplear tres mediciones simultneas incluyendo la dispersin de luz hacia adelante (FALS) frente al SSC, frente al FTIC o al PE. La tincin de las poblaciones celulares estaba limitada por la no disponibilidad de anticuerpos monoclonales conjugados directamente, necesitndose la utilizacin de un reactante GAM secundario o el empleo de anticuerpos marcados con botina. La definicin de poblaciones positivas o negativas en los casos con gran tondo hizo necesario el uso de un algoritmo de resta canal por canal para diferenciar lo positivo de lo negativo (Bagwell. 1993). En los casos en los que la poblacin celular tiene un lmite definido entre negativo y positivo, se colocaba un cursor de modo que no ms del 2% de los acontecimientos considerados como negativos cayeran a la derecha del cursor, diferenciando los acontecimientos positivos empleando un control isotpico emparejado. Aunque esta investigacin pareca razonable en aquel momento (Lewis, 1993) y funcion bien con grupos celulares brillantes, se ha hecho bastante incmoda a la hora de identificar clulas leucmicas o de desarrollar anlisis de marcadores de activacin celular. Las clulas leucmicas eran particularmente problemticas, porque cada leucemia tiene su propia intensidad fluorescente "relativa" y los controles isotpicos pueden tener poca relevancia. La aplicacin de reglas estrictas y rpidas a los cursores de posicin conduca a una infraestimacin de los grupos positivos. El fallo de esta lorma de actuacin se hace especialmente dramtico en el anlisis de la monoclonalidad de la expresin de cadenas ligeras K y A. A menudo se perdan diferencias pequeas pero significativas. Se ha cuestionado en muchos casos el empleo de isotipos de control en ciertas situaciones, tanto por las aberraciones tcnicas asociadas con su utilizacin como por los costes aadidos al laboratorio. Los nuevos algoritmos de software tienen la capacidad de realizar mediciones de intensidad y de definicin de grupos basndose en los significados de las intensidades de las poblaciones, incluyendo las intensidades fluorescentes relativas asi como la cuantilicacin del MESF real [vide intra). Claramente, ha de considerarse la necesidad de recordar lo que estamos midiendo y comprender la biologa de la poblacin de inters cuando se disea un protocolo de anlisis. Afortunadamente, algunos software sofisticados y los mejores reactantes nos han permitido utilizar entradas multiparamtncas para identificar las poblaciones, antes que intentar hacer estimaciones de la expresin fluorescente empleando valores cursor. Muchos investigadores han empleado la investigacin mulliparamtrica para definir grupos u otras poblaciones de inters (Shapiro, 1995c; Loken, 1987; Terstapen, 1988,1990; Verwer, 1993; Porter, 1999). Estas investigaciones tienen muchas formas, y algunas de ellas se revisan aqu. Con la llegada de la florescencia multicolor surgi la necesidad de analizar el nmero de clulas que expresaban uno o ms colores al mismo tiempo en una poblacin celular particular identificada por las regiones FALS y SSC. Cuando se desarroll este mtodo por primera vez. los cientficos estaban pensando bsicamente en clculos matemticos y recuento de todas las clulas y en el nmero de estas clulas que expresaban uno o ms colores. Se desarroll una investigacin binaria para este anlisis, conocida como prisma (Coulter. Hialeah, FL). Las regiones de anlisis tenan una entrada difcil y fueron introducidas en el instrumento por el operador. Estas regiones no se podan redefnir posteriormente utilizando listas de anlisis de modos,

provocando una frustracin importante. La tcnica fue modificada con posterioridad para permitir ms recepciones, y otros fabricantes con el software realizaron esta aproximacin binaria con base postanallica Loken entonces identific las poblaciones de la mdula sea empleando el CD45 frente al SSC. una investigacin nica para identificar las poblaciones heterogneas presentes en la mdula sea (Fig. 36-7). Estos y otros iBorowitz. 1992) desarrollaron el concepto de patrones que identifican estados leucmicos especficos. Shapiro emple una va de estimulacin para definir la evolucin de este concepto (Shapiro, 1995c). Despus Loken promocion el empleo del anlisis de entrada dual-paramtrico con CD45 y CD14 en la regin linloci tica del FALS frente al SSC en sangre perifrica (Loken, 1990). Muchas agencias aceptaron y promovieron esta investigacin en la mayoria de los paneles de citometria de flujo para el VIH para minimizar el efecto de los monocitos contaminantes en la poblacin Imfoctica ya que podran interferir con el recuento real de linfocitos CD4. porque los monocitos tienen receptores CD4 en su superficie (Passlick. 1989). Las agencias que iniciaron este tipo de anlisis incluan los Centros para el Control y Prevencin de Enfermedades (CDC. 1992), el Instituto Nacional de Enfermedades Alrgicas e Infecciosas, la Divisin de SIDA (NIH, DAIDS) (Calvelli, 1993). el Estado de Nueva Cork, el Comit Nacional para la Estandarizacin del Laboratorio Clnico (NCCLS. 1992) y el CAP (1990-2000). Desgraciadamente, aunque esta investigacin solucion muchos problemas, no asegura que cada tubo en el panel tenga los mismos contenidos que el tubo que contiene el CD45 y el CD14, y la correccin purificada corregida puede ser sobreestimada, conduciendo a valores incorrectos del CD4 Estos temas fueron revisados durante una conferencia convocada por el CDC. un ao despus de que se publicaran las lneas para el desarrollo del recuento del CD4 en el VIH (Steizer. 1993; CDC. 1993). Otros anlisis de esta investigacin se han desarrollado por el ACTG Flow Advisory Comittee en el programa DAIDS Proficiency CD4.CD8 iCDC. 1 9 9 3 ; Kagan, 1993) y por el CAP en su programa de anlisis de competencia (Homberger, 1993). Una nueva investigacin de recepcin fue evaluada en los paneles del VIH que siguieron a la investigacin original de Loken para identificar los grupos de la mdula sea (Loken. 1990). El empleo del CD45 como parmetro de entrada ha simplificado el anlisis de la mdula sea, las leucemias y los paneles de VIH. En las revisiones de mdula sea y leucemia, el CD45 normalmente se establece como un tercer o cuarto color y se empareja con la dispersin luminosa anterior o la dispersin lateral; esto permite la identificacin de una pobla cin potencial de blastos (malignos) La poblacin de blastos entonces se identifica empleando un panel de monoclonales utilizando los tres parmetros de color disponibles (Fig. 36-7). En el VIH. el mtodo de CD45 en tubo, con cuatro colores, permite la identificacin de una regin grande de linfocitos iniciados, que son introducidos secundariamente para el CD45. Esto tambin puede hacerse sin la utilizacin de los parmetros de dispersin luminosa, como se describi previamente (tambin puede hacerse empleando un panel de dos tubos, tres colores). Recientemente, nuevos productos (Becton-Dickinson y Beckman Coulter) aaden gotas precontadas ai tubo de contenido monoclonal y esto permite el recuento absoluto de irfo citos (conocido como flujo diferencial) para realizarse al mismo tiempo que la fenotipificacin. Esto elimina la necesidad de realizar un recuento hematologa) cuando se desarrollan las enumeraciones de clula T y elimina los problemas del deterioro de los glbulos blancos al empaquetarse y permite un diferencial exacto para obtener el nmero de clulas T exacto. Estos mtodos estn siendo incorporados en los ensayos ACTG VIH y en oros laboratorios. Otra estrategia de recepcin es el empleo de dos o tres identilicadores de una poblacin particular de inters. Esta investigacin, frecuentemente conocida como puerta de entrada (anchor gating), utiliza las propiedades particulares de algunas clulas para investigar otro tipo de parmetros. Cuando se aplican especficamente a linfocitos T, se considera como una puerta-T (Mandy. 1992). El empleo de una puerta de entrada (Paxton, 1995) es de especial utilidad cuando se buscan los marcadores de actividad, como en las poblaciones de VIH CD3 CD8 que expresan CD38 y HLA-DR o para buscar la expresin de CD45Ra y CD45Ro frente a CD3CD4 o CD3CD8. La ventaja de este mtodo es que es intuitivo y que cada color acta como un control de calidad para la otra poblacin (Fig. 36-8). Adems, tenemos la posibilidad de identificar la expresin de marcadores biolgicamente relevantes en relacin

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3: P
4:

k ENTRADA Bl STIC A

ENTRADA DF. MEDULA OSEA 45 (1)34 C"D33 (1)45

Figura 36-7. Mdula sea utilizando entrada de CD45 frente a la tradicional entrada de imagen luminosa: (paneles H1-H3): H1: FALS frente a SSC. H2: entrada linftica. FTIC frente a PE, identificando la poblacin de blastos CD34/CD33 doble positiva (61,1% de todos los linfocitos se identifican c o m o blastos). H3: Entrada total. CD34/CD33 doble positivo (43,6% del total de acontecimientos identificados c o m o blastos). H4: Blastos identificados por el CD45 frente al FALS son iguales a 46,5% (letra regin k). con un 74,8% CD34/CD33 doble positivo. Paneles H5, H6, H7: Dispersin lateral identificada p o r marcador fluorescente de inters (PE-CD33, FITC-CD34. Cy-5 [tricolor] CD45). (Los anticuerpos monoclonales conjugados directamente fueron obtenidos tanto de Coulter c o m o de Becton-Dickmson para los clones FITC- y PE marcados. Coulter para los clones ECD marcados y Caltag Crp. [S. San Francisco, CA] para los clones Cy-5 marcados.)

con las poblaciones funcional o biolgicamente relevantes. Esta evaluacin es buena por si misma para cuantificar la fluorescencia (vanse histogramas 2 y 3. respectivamente). Aunque el concepto de fluorescencia cuantitativa no es nuevo, s lo son las tcnicas para medir los equivalentes de fluorescencia o los umbrales de fluorescencia u otros similares. Las mediciones cuantitativas de la fluorescencia se describirn tras el anlisis y entrada del ADN. Otra investigacin para la puerta de entrada se encuentra en la recogida de CD34, que emplea el CD34 y el CD45 teidos con o sin ADD como una evaluacin de viabilidad en la identificacin y enumeracin de los progenitores celulares CD34. Estos mtodos tambin utilizan gotas para enumerar el nmero de clulas recubiertas. Estos mtodos tienen gran utilidad en los protocolos de trasplante de mdula sea en los que los progenitores celulares se extraen de la sangre del cordn, de la mdula sea o de sangre perifrica y, posteriormente, se reinfunden (p. ej., The Internacional Society for Hematolherapy and Graft Engineering [ISHAGE] (Fig. 36-9). Esta investigacin se ha convertido en el patrn para muchos laboratorios que realizan trasplantes. La Figura 36-9 delinea dos mtodos estndar, el ISHAGE y el protocolo Miln para desarro-

llar la enumeracin de CD34. Un sistema comercial llamado ProCount (Becton-Dickinson) utiliza una investigacin similar y reactivos para automatizar el proceso. Adicionalmente. se ha diseado un mtodo capilar llamado ensayo Steller, un procedimiento sin lisado ni lavado para el IMAGN 2000 (BectonDickinson).

Anlisis del ADN Generalidades


Conceptualmente, la realizacin del anlisis del ADN debera ser ms simple que el anlisis de inmunotipificacin, pero la revisin de los datos publicados y sus capacidades pronosticas asi como los progresos por los laboratorios sobre las pruebas de competencia indican otra cosa (Nicholson, 1993; Coon, 1994; Trinidelli Danesi, 1997). Se convoc una conferencia de consenso de ADN y los resultados se publicaron en Cytometry (Shankey. 1993). Esta publicacin fue una revisin histrica de los principales tipos de

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tumores (en muestras en fresco, congeladas y en parafina) y del valor clnico de la medida de la ploidia por DI y el valor de la fase S. Estos parmetros fueron analizados en trminos de efectividad como marcadores pronsticos. L a conferencia CAP #26 de 1994 se bas en los marcadores previos y en marcadores indirectos de algunos tumores potenciales adicionales. En cada caso, el DI y la fase E fueron menos predecibles como marcadores pronsticos de lo que se esperaba. Esto fue atribuido a la variabilidad en la realizacin tcnica y al anlisis de estos ensayos (tanto en la preparacin de instrumentos c o m o de muestras) y en el riesgo inherente de la heterogeneidad tumoral y por lo tanto el muestreo apropiado del tumor. Se realizaron recomendaciones especficas en cada tipo de tumor para las medidas apropiadas de control de calidad que deben realizarse y de la ausencia de involucin apropiada de los histogramas.

Preparacin de la muestra
Los mtodos de preparacin del ADN son razonablemente simples y baratos de realizar. Existen muchas referencias para los mtodos originales, asi

como muchas modificaciones. Los mtodos ms frecuentes, desarrollados por Krishan. Vmdelov, Crissman. Steinkamp y otros (Rabinovitch, 1993; Vindelov, 1994), son aquellos que utilizan tejidos frescos o congelados y aquellos que utilizan bloques de parafina con preparaciones de Hedley (1983). En cada caso, ya estn las clulas enucleadas o conservada la membrana celular, el marcador Pl de ADN es el que ms frecuentemente se utiliza en la mayora de los laboratorios clnicos y ya se ha descrito. La tincin Pl es directa a condicin de que se sigan el tiempo, la saturacin y los parmetros de extraccin del ARN Las medidas de las alteraciones macroscpicas del cariolipo se realizan comparando el pico (intensidad fluorescente, captacin de Pl) del tumor frente al calibrador diploide. Los factores que afectan esta medicin incluyen el CV del pico tanto del calibrador como del posible tumor, el ndice GyG, o la linealidad del instrumento, linealidad medida por el paquete de software de deconvolucion (Bagwell. 2000) y el porcentaje del tumor presente (muestreado) en la muestra. Es frecuente ver que los laboratorios publican el resultado de un tumor diploide en una muestra que "no" contiene tumor. Los tumores con valores casi diploides necesitan reglas de interpretacin estrictas, como la definicin de tetraploidia. Surgen ms pro-

Figura 36-8, La citometra de flujo con cuatro colores para realizar estudios funcionales permite el estudio recproco de poblaciones celulares, c o m o sucede con el estudio CD45Ro (definido c o m o memoria) y el CD45Ra (definido funcionalmente c o m o nave) en un determinado subgrupo d e clulas T. Esta figura demuestra la definicin de un ancla (Patxon. 1994) de CD3CD4 (regin E) evaluada en los histogramas 5. 6 y 7 para la expresin de RARO. Los histogramas 2. 3 y 8 determinan RARO y las clulas no CD4. Esto se puede utilizar c o m o una determinacin comparativa de los CD3 CD4 sin necesidad de un segundo tubo. La fluorescencia en cinco colores debera permitir el uso simultneo de CD8. que debera medirse y compararse con los CD4. Obsrvese la ausencia clara de tincin no especfica actualmente disponible utilizando directamente clones conjugados. El procesamiento digital pulsado permite la cuantificacin directa de estos marcadores en equivalentes de fluoresceina y la comparacin de un punto y otro en el tiempo en un estudio longitudinal mediante histogramas simples con parmetros, c o m o es el caso de los histogramas 2, 3, 6 y 7. (Los anticuerpos monoclonales conjugados directamente a travs de CD45Ra y CD45Ro s e obtuvieron de Coulter y Becton-Dickinson. Todos los ensayos se realizaron utilizando los mtodos de lisado de sangre completa estndares).

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Figura 36-9. Protocolos ISHAGE/Miln para la enumeracin del CD34. Arriba, la enumeracin de las clulas CD34+ en sangre del cordn por anlisis de citometria de flujo utilizando el protocolo ISHACGE (filas de arriba y del medio) o el protocolo Miln (fila de abajo). Se define la estrategia de entrada para el ISHAGE. La estrategia utiliza la entrada secuencial para excluir los acontecimientos no CD34+ en la regin celular dim CD45 y para excluir las clulas muertas empleando 7AAD (no mostrado) (fila superior). La fila del medio muestra el protocolo ISHAGE con un isotipo control. El protocolo Miln utiliza un isotipo conlrol (diagrama de puntos del centro, abajo) para establecer los cuadrantes, el inferior derecho se usa para excluir los sucesos putativos C034+. (De Sutherland DR Anderson L, K e e n e y M, y cois: The I S H A G E guidelmes lor CD34+ cell determination by flow cytometry. J H e m a t o t h e r 1996; 3:213, con permiso.)

blemas en la definicin de los agregados, dobletes, detritus, tratamiento de cortes y restos de ncleo y la poblacin en fase S. La sigla, descriptiva y semicuantitativa, de BAD se utiliza en el paquete de software de anlisis para moldear los efectos de fondo, agregados y dobletes (Ravinovitch, 1993, 1994) (Figs. 36-10 y 36-11). El impacto de este parmetro en el anlisis es controvertido.

Las mediciones resultantes de la fase S y del DI utilizando un modo de anlisis paramtrico simple (slo Pl) estn sujetas a estos algoritmos de deconvolucin. llevando a una gran variabilidad entre los laboratorios (Coon, 1994). Los algoritmos de deconvolucin para el ADN se han estu diado de forma extensa (Coon. 1994: Rabinovilch. 1993. 1994. 1999: Wheeless, 1991: Shankey, 1993; Bagwell, 2000), pero muchos modelos

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EXAMEN DE LABORATORIO D E L SISTEMA INMUNE CELULAR

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empleados para el anlisis necesitan un mayor estudio. El documento de consenso del ADN hizo recomendaciones especificas aplicables a ciertos tipos de tumores y sugiere que los laboratorios desarrollen anlisis en concordancia, pero incluso con estas pautas existe un nivel de ambigedad en la interpretacin y rendimiento en el laboratorio clinico. Estas ambigedades contribuyen a la discordancia de los resultados en estudios comparativos asi como en las pruebas de competencia (Coon. 1988, 1994; Wheeless. 1991). La dilicultad de llegar a un consenso hace que la interpretacin de los resultados sea ms difcil para los laboratorios nuevos y para ios el nicos que estn intentando comparar los resultados de su laboratorio con la bibliografa reciente en el tratamiento de sus pacientes Esto es especialmente cierto en la clasificacin de los valores de la fase S. Las medidas de la (ase S estn sujetas a los efectos de los restos y modelacin de los agregados como describieron Rabinovitch (1993. 1994. 1999), Bagwell ( 1 9 9 3 . 2000), Shankey (1993). Coon (1988), Wheeless, (1991) y otros. El rea entre 2C y 4C est sujeta a interferencias por artefactos. Adems, es de importancia clave que la decisin con res-

pecto al modelo matemtico usado para un tumor determinado se mantenga constante y que los datos del modo de lista se conserven sin cambios por si se necesitan ms anlisis. Debido a la dificultad en el anlisis del histograma del ADN. algunos han propuesto que las mediciones del ADN las realicen solo laboratorios expertos. La actualizacin de la FDA no ha aclarado ningn mtodo y todava se considera como una prueba en investigacin. Desgraciadamente, durante muchos aos la prctica clnica sugera otra cosa. Mltiples artculos proponen realizar las mediciones de ADN conjuntamente debido al alto grado de variabilidad y de prdida de significado pronstico (ASCO. 1996). Poste riormente. varios grupos han conseguido avances significativos para resolver algunos de los temas en el anlisis (Rabinovitch. 1996) (Figs. 36-12 y 36-13). Est en desarrollo un patrn o gua de la NCCLS para su emplee por los laboratorios. En cualquier caso, deben hacerse estrictos controles de calidad para permitir mediciones significativas del ADN que puedan servir como marcadores pronsticos y como medidas de la actuacin y prctica mdica.

Figura 36-10. Empleo de diferentes tcnicas de entrada para el anlisis del ADN A. Pico tradicional frente a su integracin con la correspondiente excusin de dobletes. El histograma de un parmetro (inserto) demuestra la intensidad lineal del yoduro de propidio (Pl) demostrando un pico diploide (2N) y un pico aneuploide G -G c o n el correspondiente G..M. B. Nuevo mtodo d e entrada (K.D. Bauer. c o m u n i c a c i o n e s personales [1994]) utilizando el cociente del pico trente a la medicin integral y al FL3 (rea) Este mtodo est siendo evaluado para m a y o r consistencia en la eva luacin d e los valores de la fase S C. Pico frente a integral demostrando que el 66.8% de los acontecimientos s e encuentran en la puerta de la poblacin (pico frente a integral, puerta b).

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4(H)

SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA
DIPLOID CVCLE

80818589.H83 FL3 HP's "A"

Figura 36-11. A y 8, El empleo de tcnicas con modelado informtico en dos tipos diferentes de muestras. En A. se demuestra una linea celular fijada. Esta preparacin muestra pequeos restos y una buena recuperacin de la poblacin aneuploide. Ambas poblaciones demuestran un buen CV. El valor de la fase S es constante para una linea celular de la muestra. En B. se demuestra una seccin de una muestra en parafina con la presencia de restos y un pico casi diploide aneuploide. El CV es bueno, y los restos son minimos. La muestra demuestra una fase S del 9%. (Cortesa de Multicycle Software, Phoenix Flow System. San Diego. CA.)

Se utilizan otros enfoques empleando sondas de ADN y ARN como los deri- un modelo esttico o un dibujo en el tiempo de todas las clulas analizadas. La integracin del rea para el nmero de clulas entre 2C y 4C en el histovados de la timidina, la bromodesoxiuridina (BrdU). diversos abreviados, y grama del ADN no es capaz de dar ninguna informacin respecto a las cluotros (Fig. 36-14) y naranja de acridina (ARN) para mejorar la calidad de los las "detenidas" en S (las clulas en realidad detienen la sntesis de ADN) o modelos en la estimacin de las propiedades proliferativas y cinticas de un de medir el nmero de clulas normales infiltrantes que pueden estar tambin determinado tumor. Es importante recordar que las medidas de la proliferaproliferando. El valor de la fase S a menudo puede ser mayor que la capacicin no son iguales que las medidas de la cuantificacin de la fase S, que son
c

CAPTULO 36

EXAMEN DE LABORATORIO DEL SISTEMA INMUNE CELULAR

871

Contenido de A D N / D A P 1 Figura 36-12. Representacin mulliparamtrica del contenido de ADN (escala vertical) Irente a la fluorescencia de la citoqueratina (escala horizontal) que muestra una poblacin celular citoqueratina-positiva con menos de 2N de contenido de A D N El estroma celular citoqueratina negativo se emplea para establecer la referencia 2N. permitiendo esto la identificacin de las clulas hipodiploides. El histog r a m a sin entrada convencional en el panel inferior demuestra la imposibilidad de asignar un contenido de ADN a la poblacin celular mixta del t u m o r y de clulas estromales (Glogovac, 1999).

sito de este captulo desarrollar este tema. Aunque se estn realizando muchos estudios, las mediciones de la apoptosis todava no son parte de la rutina del laboratorio clnico. Como se mencion anteriormente, el anlisis de laboratorio del ADN se ha controlado mucho, y en algunas regiones, estos esludios ya no se reembolsan. Muchos investigadores de este campo han votado por la exclusin sistemtica de esta prueba del laboratorio, aunque tiene cierta utilidad en ciertos tumores. Bagwell y otros, estn estudiando retrospectivamente la reevaluacin de un grupo de casos de cncer de mama para tratar de desarrollar un modelo pronstico unificado para los pacientes con cncer de m a m a con ganglios negativos En el anlisis se incluyen un total de 350 histogramas de ADN unvariantes de tres centros de cncer de Suecia (Bagwell, 2000). El estudio est tratando de identificar y corregir los factores que pueden haber disminuido la utilidad de la fraccin de la fase S como describieron las recomendaciones de la Sociedad Americana de Oncologa Clnica (ASCO), para desarrollar un modelo pronstico para el cncer de mama ganglio-negativo, para identificar posibles avances en los mtodos de la citometra de lujo y para demostrar la utilidad de estas tcnicas. Otro estudio de Rabinovitch (comunicacin personal. 2000) y col. se ha publicado recientemente sobre 630 muestras de tumores de mama fijadas con formol de mujeres menores de 45 aos empleando un anlisis bivariante de citoqueratina'ADN (Figs. 36-12 y 36-13). Este anlisis se desarroll para aumentar la capacidad de detectar poolaciones tumorales mezcladas donde los ndices de supervivencia pueden disminuir y sus tumores hipodiploides o tetraploides pueden haberse perdido en el anlisis convencional del ADN. Se espera que estos estudios y otros hagan resurgir lo que puede ser una herramienta pronostica y diagnstica til que previamente quiz fue infravalorada por su complejidad.

Citometra de flujo cuantitativa: mediciones de intensidad de fluorescencia


La definicin de los tipos celulares en trminos mmunolgicos c o m o las clulas efectoras implica la propiedad de estas clulas de regular, y a sea aumentado o disminuyendo, las funciones moleculares especificas a travs de receptores de superficie. Conocidas como fenotipos inmunolgicos (Poncelet, 1993). estas clulas necesitan otras propiedades mediles para definir sus papeles biolgicos en la maduracin y en los procesos de enfermedad. Uno de los fenmenos observados es la diferente expresin de antgenos de superficie celular (CD) en trminos cuantitativos relativos y absolutos. Antes de la disponibilidad de las medidas absolutas, los trminos descriptivos como brillante u oscuro, bimodal. y dems, eran utilizados en la bibliografa para describir un fenmeno visual de diferentes densidades antignicas. Aunque descriptivos, estos trminos son dificiles de definir y de estandarizar entre los laboratorios y entre los pacientes. Tambin pueden perder precisin a la hora de definir un hecho y no pueden emplearse objetivamente para monitorizar el tratamiento de los pacientes o la definicin (tipo celular) mediante la medida de la expresin de CD y el solapamiento de la expresin. La evidencia sugiere que las diferencias cuantitativas en la expresin antignica en la leucemia linfoctica crnica y en otras leucemias puede ser importante para determinar el pronstico (Poncelet. 1985). Estas medidas tambin se emplean en la definicin del MRD y en la investigacin del efecto o activacin viral en la enfermedad por VIH (Poncelet, 1991). El porcentaje de clulas especficas presentes a menudo no aporta una imagen clnica real. Esto es particularmente cierto en los casos de leucopenia y cuando la poblacin de blastos es un porcentaje relativamente pequeo del total de clulas presentes. La citometra de flujo cuantitativa (QFCM) se define como la cuantificacin de la intensidad fluorescente (Fl) determinada por la capacidad de unin del anticuerpo de un anticuerpo conjugado con un fluorocromo. y es una medida indirecta de la cantidad de antgeno celular de superficie por cada clula individual (Stelzer. 1997). Los investigadores (Poncelet. 1985, 1986; Schwartz, 1994; Vogt. 1991. 1994) han descrito el empleo de granos de polieslireno o lneas celulares mezcladas con cantidades saturantes de anticuerpo para determinar el nmero de absoluto de receptores o de determinantes amgameos por clula, tambin denominados densidad antignica (Poncelet. 1993). Las unidades ABC se definen como la medida de la capacidad retal/va de unin del anticuerpo.

dad proliferativa real debido a artefactos de la heterogeneidad tumoral. El histograma de un parmetro proyecta resultados razonables cuando se trata de una poblacin celular asincrnica, relativamente homognea. El mareaje por pulsos se utiliza ms frecuentemente en grandes entornos acadmicos y ms a menudo para medir la efectividad de la irradiacin y quimioterapia obteniendo medidas reales de las clulas G,. G.. as como de los compartimentos G + M. lo que no es posible empleando medidas paramtricas simples de la fase S. Pueden utilizarse otras tcnicas con sondas nucleares y citoplasmticas asi como marcadores de superficie para separar la poblacin de inters de la mezcla de tipos celulares. Este tipo de anlisis multiparamtrico es muy til para medir la lase S en las neoplasias hematolgicas malignas (Fig. 36-6). Puede identificarse la poblacin especifica de blastos por el FITC fluorescente y por el FALS. y estos hechos pueden analizarse por el contenido de ADN y de la lase S empleando el Pl. Los mtodos de tincin estn alterados para conservar las propiedades de la superficie nuclear o las propiedades nucleares (Clevenger. 1993: Ramaekers, 1993: Carothers, 1994; Bauer, 1994: Rabinovitch. 1996: Poder. 1999). Estos mtodos normalmente incluyen la tincin del marcador de superficie de inters (p. ej.. KI-67. ciclina B1. citoqueratina. CD10) con el anticuerpo monoclonal. fijacin en alcohol (o fijacin comercial y permeabilizacin reaclante) y tratamiento con un detergente para permitir la entrada de Pl u otro marcador nuclear. Los mtodos de tincin se modifican selectivamente para conservar las propiedades de membrana y ncleo especificas de la sonda de inters (Bauer, 1994).

Esludios de inters del ADN


Se ha publicado mucho en la bibliografa sobre la apoptosis (a menudo definida como muerte celular programada) y su relevancia en los parmetros tradicionales del ADN y en otras consideraciones fenotipicas. No es el prop-

Figura 36-13. A Diagramas de contorno bivariantes de clulas de t u m o r e s tijados en parafina analizadas con ADN (Pl) frente a tincin de citoqueratina (FITC). Al Una poblacin aneuploide de CK+ de cncer de mama: A2, Un cncer de m a m a mulliploide con una poblacin hipodiploide y casi Iriploide aneuploide. Vase que el contenido diploide de ADN se identifica por la localizacin de la poblacin celular CK. A3. Un ganglio linttico axilar con metstasis de adenocarcinoma de m a m a . La presencia de la poblacin celular muy pequea ce clulas aneuploides (2%) es ambigua en los datos no m e t i d o s (vase Fig. 36-128): sin embargo, en la presentacin bivariabte. las clulas CK+ aneuploides son clar a m e n t e evidentes. A4, Tincin con citoqueratina de clulas de t u m o r prosttco extradas de biopsias fijadas en parafina. La exclusin de las clulas C K del estroma en el anlisis del ciclo celular del ADN incluye la medicin del 2,6% a 3.9% de la fase S. 8, Histograma de ADN de un ganglio axilar con metstasis de adenocarcinoma de m a m a mostrando un dato sin entrada (lnea gruesa y lnea de puntos mostrando 1 0 x en la escala vertical) y el dato de la citoqueratina del ADN introducido (lnea d e guiones) L a presencia de clulas aneuploides e s ambigua en los datos no metidos: si se reconocen c o m o una poblacin aneuploide, representan solo el 2% de las clulas, concordando con la a b u n d a n c i a histolgica de linfocitos. (De Glogovac JK, Pierce R. P a l a n c a BJA. Rabinovitch PS: Cytokeratin Immunofluorescence in D N A analysis of paraffin extracted cells. Clin Immunol. Newslett, 1996; 16:157-161. c o n permiso.)

CAPTULO 36

EXAMEN DE LABORATORIO D E L SISTEMA INMUNE C E L U L A R

873

Este mtodo no necesita igualar los ndices de fluoresceinaprotena (F P). ya que las clulas y el modelo se han teido con el mismo anticuerpo. El empleo de mediciones de intensidad fluorescente debera proporcionar al usuario un medio para evitar esta situacin. El empleo de lineas celulares o microgrnulos para construir una curva de calibracin estndar sigue ciertos supuestos (modilicado de Poncelet. 1986): 1. Los anticuerpos en condiciones de saturacin deben unirse a la super ticie celular a travs de una interaccin monovalente. 2 El nmero de lugares antignicos por clula puede inferirse de la cantidad de anticuerpo unido. 3. La intensidad fluorescente puede determinarse utilizando una curva de calibracin con clulas de diferente expresin antgnica o con gra-

nulos recubiertos de diferentes cantidades de mmunoglobulinas de ratn a las concentraciones de saturacin del anticuerpo. Estas medidas estn sujetas a la variacin de la capacidad de unin de los anticuerpos monoclonales especficos con la inmunoglobulina de ratn, asi como a las interacciones del poliestireno con los clones especficos. Puede que estas medidas no se puedan transferir de un laboratorio a otro y pueden no ser las mismas para los diferentes monoclonales fabricados de la misma especificidad (Schwartz. 1994: Paxlon. 1995). 4. Se puede utilizar la intensidad de fluorescencia media del canal de estas partculas, determinada por citometra de flujo, para estimar la molcula del fluorocromo soluble equivalente (MESF) de una determinada clula.

Figura 36-14. Este histograma demuestra el empleo del anlisis multiparamtrico del ADN empleando BrdU c o m o sonda nuclear. Fue realizado empleando una lnea celular CEM de crecimiento exponencial que fue marcada con BrdU y despus con un anticuerpo FITC anti-BrdU y teida para el contenido de ADN con yoouro de propidio (Pl). L a figura de abajo demuestra un control negativo (linea celular no ciclada o linlocitos de sangre perifrica |PBL|) utilizados para validar la uncin con BrdU. Los controles negativos son obligados para el xito de la interpretacin de estos anlisis Estos estudios proporcionan una mejor comprensin de las clulas que estn en el ciclo y en qu fase del ciclo celular estn.

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SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA

5. Estas medidas, si se llevan a cabo de torma indirecta utilizando una fuente constante de inmunoglobulinas antirratones de cabra (GAM). son independientes de las subclases de anticuerpo empleado para detmir el antigeno. 6. Estas determinaciones pueden realizarse empleando monoclonales conjugados directamente a saturacin utilizando patrones de granulos apropiados. Debe tenerse ms cuidado para evitar problemas espaciales relativos al tamao de la molcula de tluorocromo y los ndices de fluorescena'protena. Se puede obtener ms informacin recurriendo al documento consensuado de 1997 de U.S.-Canad que revisa los parmetros necesarios para la estandarizacin (Stelzer. 1997). Aunque precoces en su desarrollo, los fenotipos cuantitativos nos ayudarn a definir programas de software de anlisis de grupos para la cuantificacin e identificacin celular estableciendo la intensidad fluorescente media de los canales como medida de separacin de clulas con diferentes fenotipos tuncionales.

CONTROL DE CALIDAD Y GARANTA DE LA CALIDAD EN EL LABORATORIO CELULAR


En este captulo, se han tratado de resaltar las reas donde los mdicos asi como los laboratorios deben prestar particular atencin a los mtodos utilizados y a las interpretaciones realizadas en la evaluacin de la respuesta celular. La garanta de la calidad y el control de calidad de los parmetros no estn bien definidos en esta rea del laboratorio, y existen pocos estndares absolutos cuando se compara con los anlisis qumicos o las determinaciones de anticuerpos humorales. El xito del laboratorio celular reside en su aproximacin al problema y en la evaluacin longitudinal de la condicin que va a ser diagnosticada. Se seal claramente que los estudios de base necesitan repetirse si la evaluacin original se lleva a cabo en un momento de estrs inmunolgico. Los parmetros bsicos de las variaciones diurnas en las poblaciones de linfocitos son obvios pero a menudo se olvidan o se pasan por alto. Malone (1990) concluy que la variabilidad en las medidas del CD4 de los recuentos absolutos se debe en un 50% a la biologa y en otro 50% se debe a otros problemas tcnicos. Los factores que afectan la evaluacin longitudinal de las cantidades absolutas de CD4 en un ensayo clnico han sido revisadas por Fei (1993). Adems. Fahey (1990) revis el valor pronstico tanto humoral como celular de los anlisis en VIH. En otros ensayos clnicos celulares, la variabilidad es inherente al ensayo debido a la falta de formatos y mtodos estandarizados asi como a los reactivos. Adems, la calibracin de los instrumentos y la sensibilidad no estn bien monitorizados. Los ensayos con linfocitos T citotxicos son particularmente difciles de estandarizar. Los ensayos histricos como la proliferacin mitognica son tambin difciles, con variabilidad entre los laboratorios. Por lo tanto, los laboratorios que ofrecen estas pruebas inmunologas deben tener una amplia base de dalos mediante la cual se pueda interpretar el resultado individual del paciente. Los laboratorios celulares deben establecer rangos normales para sus ensayos y tener cuidado en que los rangos normales de adultos no se apliquen en los ensayos peditricos. Esto es particularmente problemtico porque los rangos normales peditricos son difciles de determinar debido a la falta de nios disponibles en el primer ao de vida, y la correcta interpretacin de los resultados del laboratorio depende de ellos. Deben hacerse cuidadosamente las comparaciones de los datos entre los laboratorios. Siempre que est disponible, un laboratorio de inmunologa celular debe utilizar los estndares adecuados en el desarrollo de la citometra de flujo y en el anlisis del ADN y tener presentes las regulaciones federales y estatales con respecto al laboratorio, incluyendo la Ley de 1988 (Human Health and Services Clinical Laboratory Improvement Acf). Adems, deben participar en pruebas de capacidad, cuando estn disponibles, y estar incluidos en programas de formacin incluyendo evaluaciones de competencia para todo el personal implicado en la prueba. Todos los ensayos desarrollados en el labora-

torio deben incluir un control normal y. cuando sea posible, controles durante el proceso para establecer la validez del ensayo. Las muestras enviadas deben ser cuidadosamente controladas en cuanto a la exposicin al calor y al fro y el tiempo desde que se extraen al paciente Debe acompaar a las muestras una historia clnica para que se puedan realizar estudios particulares de modo que el director del laboratorio pueda realizar la correcta aproximacin a la prueba. Se ha publicado un documento de consenso con recomendaciones sobre el anlisis inmunofenotipico de las neoplasias hematolgicas por citometra de flujo (Braylan, 1997). Este documento fue minuciosamente desarrollado por los proveedores de la comunidad mdica interesados en cubrir los procedimientos de laboratorio, la seleccin de anticuerpos para la identificacin de neoplasias, el anlisis de datos y la interpretacin, informes mdicos e indicaciones, en ausencia de equipos estandarizados y otros artefactos. La FDA ha puesto en marcha la Analyte Specific Regulation |ASF. 1998). que elimina reactivos como los monoclonales para su empleo en la investigacin. Esta regla no permite a los fabricantes decir a los empleados del laboratorio cmo emplear sus reactivos. No pueden especificar las instrucciones de uso. La regla ASR proporciona unos reactivos estables, bien definidos, fabricados en buenas condiciones. Todos los laboratorios que utilizan estos reactivos c o m o una prueba de fabricacin casera" deben desarrollar sus propios ensayos clnicos y estudios de validacin y deben emplear una declaracin de descargo de responsabilidad en su informe final. El documento de consenso permite al laboratorio desarrollar sus anlisis de un modo consistente y la definicin del significado clnico a un gran nmero de laboratorios e instituciones. El documento no es un patrn pero concuerda con otro estndar NCCLS que est actualmente en uso. El laboratorio celular se enfrenta con una mayor dificultad de trabajo de interpretacin ya que los datos no son fcilmente estandarizabas. Adems, la garanta de la calidad de la muestra y la evaluacin realizada dependen de la cuidadosa documentacin de los parmetros biolgicos y logisticos que pueden influir en el resultado. El futuro de las pruebas utilizadas en la evaluacin de los componentes celulares de la respuesta inmune residen en el desarrollo de nuevos mtodos que conduzcan a una mejor estandarizacin. BIBLIOGRAFA Allsopp , Nicholls SJ. Langhorne J: A flow cytometric m e t h o d to assess antigen-specific proliferative responses of difterent subpopulations of fresh and cryo preserved h u m a n peripheral blood m o n o n u c l e a r cells J I m m u n o lM e t h o d s 1998: 214:175-186. Analyte Specific Regulation. Medical Devices: Classificalionreclassification: restricted devices: analyste specific reagents. Fed Reg Nov. 21,1997; 66243-62260. Anderson DC. 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CAPTULO 36

EXAMEN DE LABORATORIO DEL SISTEMA INMUNE CELULAR

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SECCIN V

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CAPTULO 36

EXAMEN DE LABORATORIO D E L SISTEMA INMUNE C E L U L A R

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7

C A P T U L O

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S Evaluacin del funcionamiento de las > inmunoglobulinas y la inmunidad humoral


Inmunoglobulina D 878 Inmunoglobulina E Resumen IMPORTANCIA CLNICA DE LAS INMUNOGLOBULINAS Patognesis 880 881 DIAGNSTICO DE ENFERMEDADES Inmunoelectroforesis Inmunofijacin Prevencin de las enfermedades y terapia BIBLIOGRAFA 891 888 886

Richard A. McPherson, M.D.


PROPIEDADES ESTRUCTURALES DE LOS ANTICUERPOS Molculas de anticuerpo Interaccin antgeno-anticuerpo BASE GENTICA DE LA DIVERSIDAD DE ANTICUERPOS PROPIEDADES GENERALES DE LAS INMUNOGLOBULINAS Inmunoglobulina M Inmunoglobulina G Inmunoglobulina A

Los anticuerpos son las molculas electoras de la inmunidad humoral (mediada por clulas B). Son inmunoglobulinas que reaccionan y se unen especficamente a los antigenos que estimularon su produccin. Las inmunoglobulinas constituyen un 20% de las protenas plasmticas de un individuo sano. La actividad de los anticuerpos se asocia a las protenas con menor velocidad de migracin en una electroforesis. las y-globulmas. Este capitulo se centra en la discusin de las propiedades estructurales y funcionales de las inmunoglobulinas, su evaluacin en el laboratorio y su importancia clnica.

PROPIEDADES ESTRUCTURALES DE LOS ANTICUERPOS Molculas de anticuerpo


Hay una gran cantidad de trabajo realizado y publicado sobre las propiedades estructurales de los anticuerpos (Padlan, 1991; Poljak, 1991; Tedford, 1991). Una molcula de inmunoglobulina es una glucoproteina en lorma de "Y". Presenta dos dominios de unin al antigeno en las puntas de la "Y" (regin Fab) y zonas de unin para componentes del sistema del complemento y/o varios receptores de la superficie celular en la cola de la "Y" (regin Fe). Cada molcula de inmunoglobulina est compuesta por 2 cadenas pesadas (H: heavy) y dos cadenas ligeras (L: lighf) idnticas entre si. Estas cadenas polipeptidicas se mantienen unidas mediante interacciones no covalentes que se encuentran estabilizadas por puentes disulfuro. Los dominios de interaccin con el antigeno estn compuestos por partes de ambas cadenas. Cada una de las cadenas de inmunoglobulina, tanto H como L, consta de una regin variable de unos 110 residuos de aminocidos en el extremo amino-terminal (las puntas de la "Y"), que forma el dominio de interaccin con el anligeno, unido a una regin constante. La regin conslante de la cadena H es unas 3 o 4 veces ms grande que en la cadena L. Cada cadena est compuesta por repeticiones de dominios plegados de forma semejante: una cadena L tiene un dominio de regin variable (V ) y un dominio de regin constante (CJ. mientras que la cadena H tiene un dominio de regin variable (V,.) y 3 4 dominios de regin constante (C ) (Fig. 37-1). La variabilidad de la secuencia de aminocidos en
H

las regiones vanables de ambas cadenas. H y L, se reduce principalmente a 3 pequeas regiones hipervariables. las cuales se asocian en el extremo aminoterminal de la molcula para formar el sitio de unin al antigeno. Cada dominio de unin al antgeno tiene slo el tamao suficiente para unir un determinante antignico del tamao de cinco o seis residuos de azcar. Las cadenas pesadas pueden ser de cinco isotipos distintos (y, a, p. 8, e) y las cadenas ligeras de dos (,- y X), donde algunos de los isotipos presentan subtipos. Por ejemplo, las cadenas y presentan los subtipos y y , y y y.. Los isotipos se torman como resultado de variaciones en las regiones constantes de las cadenas pesadas y ligeras. Estas denominaciones isotipicas forman la base de la nomenclatura de los anticuerpos. Debido a que la cadena pesada por s sola determina las funciones efectoras. las inmunoglobulinas se denominan haciendo referencia al isotipo de su cadena pesada empleando una letra de nuestro alfabeto (IgG. IgA, IgM, IgD e IgE).
2 3

Los anticuerpos tienen dos dominios idnticos de interaccin con el antigeno. El dominio de interaccin con el antigeno est compuesto por los aminocidos de un tipo de cadena H y de un tipo de cadena L. Asi. la molcula monomrica compuesta por 4 cadenas (vase Fig. 37-1) posee dos sitios idnticos de asociacin con el antgeno, y se dice que son molculas bivalentes. Estas molculas son capaces de entrecruzar molculas de antigeno, si cada una de ellas presenta 3 o ms determinantes antignicos, formando un complejo macromolecular. y una vez que este complejo supere un determinado tamao, precipitar (Davies. 1983). Este entrecruzamiento es importante fisiolgicamente porque facilita ia internalizacin del antgeno. c o m o puede ser el expresado por bacterias o por leucocitos lagociticos. Tambin interviene en la activacin del sistema del complemento. Adems, este entrecruzamiento puede ser necesario para desencadenar la produccin de anticuerpos (por la accin de linfocitos B) por parte del antgeno. La eficiencia con la que el anticuerpo se une al antgeno y produce entrecruzamiento se ve aumentada gracias a una regin m u y flexible (regin de bisagra) que se encuentra donde los brazos de la "Y" se unen a la cola, permitiendo que vare la distancia que separa los dos dominios de unin al antgeno. La multivalencia afecta a la avidez con que un anticuerpo puede unir determinados tipos de antgeno. Un antigeno particulado (como una bacteria o un virus) presenta repeticiones de determinantes antignicos en su superficie.

CAPTULO 37

EVALUACIN DEL FUNCIONAMIENTO DE LAS INMUNOGLOBULINAS Y LA INMUNIDAD HUMORAL

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(denominado asi porque en primates no humanos cristaliza con facilidad). Por otro lado, el corte con pepsina produce un fragmento F(ab\, lamado asi porque consta de dos fragmentos F(ab'), cada uno de ellos un poco ms grande que un fragmento Fab, unidos covalentemente; el resto de la molcula est cortada en fragmentos ms pequeos de varios tamaos (Fig. 37-1). Como los fragmentos F(ab'),son bivalentes, todava pueden entrecruzar antigenos y formar precipitados. Esto no ocurre con los fragmentos Fab puesto que son univalentes. Ninguno de estos fragmentos (subundades de anticuerpos) tiene las dems propiedades biolgicas de las molculas intactas de anticuerpos puesto que carecen de la cola (la regin Fe) que media estas propiedades. Sin embargo, los fragmentos monovalentes Fab es la forma de anticuerpo monoclonal que se emplea teraputicamente (Digibind) para unir digoxina, neutralizando asi niveles txicos y facilitando la eliminacin de la sustancia del cuerpo. Cada clon de clulas B produce molculas de anticuerpo con un nico dominio de unin al antgeno. Inicialmente, las molculas se insertan en la membrana plasmtica, donde funcionan como receptores de superficie para el antgeno. Cuando un antigeno se une a los anticuerpos en la superficie celular, activan a las clulas B, las cuales se multiplican, diferencian en una clula plasmtica, y sintetizan una gran cantidad de anticuerpo soluble con el mismo dominio de interaccin con el antgeno, que se secreta a la sangre. Los anticuerpos humorales protegen a los humanos y animales de infecciones, inactivando virus y toxinas bacterianas mediante sus dominios V,/V y reclutando el complemento y diversas clulas para matar e ingerir los microorganismos invasores mediante sus dominios C en la regin Fe de la molcula. Las propiedades biolgicas de los diversos dominios de inmunoglobulinas se resumen en la Tabla 37-1.
t L

IKKK'

OKIH

Figura 37-1. Representacin esquemtica de la molcula de inmunoglobulina G. Se muestran las posiciones relativas de los puentes disulfuro intercatenarios e intracalenarios que determinan los lazos Cada uno d e los lazos determina un dominio de cadena pesada y ligera que reciben un determinado nombre. Se indican las regiones de corte enzimtico ms probables en la regin "bisagra" por parte de la pepsina y papaina. Los fragmentos resultantes de la accin de la papaina se laman Fab y Fe. Los fragmentos producidos por la pepsina son Fe' y Fab'2 (2 fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro). La digestin de Fab con pepsina en las condiciones adecuadas libera el fragmento F (V y V asociados de forma no covalente). La porcin de la cadena pesada que forma parte del fragmento Fab se denomina Fd.
v H L

Interaccin antgeno-anticuerpo
La unin de un antgeno a un anticuerpo es reversible. La afinidad y el nmero de sitios de unin contribuyen a la fuerza de la interaccin antgeno-anticuerpo. Esta unin reversible es el resultado de muchas fuerzas no covalentes relativamente dbiles, incluyendo uniones hidrofbicas y de hidrgeno, fuerzas de van der Waals e interacciones inicas. Estas fuerzas dbiles son efectivas slo cuando la molcula del antigeno est lo suficientemente cerca para permitir que algunos de sus tomos puedan insertarse en las regiones complementarias de la superficie del anticuerpo. Las regiones complementarias de un anticuerpo de cuatro cadenas son sus dos dominios de interaccin con el antgeno idnticos entre s, mientras que la regin correspondiente del antgeno es lo que se denomina el determinante antignico (epitopo). La mayora de las macromoleculas antgnicas presentan vanos determinantes antignicos distintos; si dos 3 ms de ellos son idnticos, se dice que el antigeno es multivalente. La afinidad de una molcula de anticuerpo refleja la fuerza con que el determinante antignico se inserta en un solo sitio de unin al antigeno, y es independiente del nmero de determinantes antignicos. Sin embargo, la avidez total de un anticuerpo por un antgeno multivalente. como un polmero con

Una molcula de anticuerpo puede interaccionar con una sola partcula de tal forma que ambos dominios de interaccin antignica se encuentren unidos a determinantes antignicos de esa misma partcula, en lugar de encontrarse en dos partculas adyacentes. Cuando se produce este tipo de unin, la energa efectiva de la interaccin o avidez, es mucho mayor que la que presenta una unin monovalente a dos partculas. Se ha demostrado que este mecanismo es m u y importante desde un punto de vista fisiolgico, en la neutralizacin de virus por anticuerpos que poseen baja afinidad por la unin. El efecto protector de las inmunoglobulinas no se debe simplemente a su habilidad para unir antgenos. Intervienen en una gran variedad de actividades biolgicas mediadas por la cola de la "Y", la regin Fe de la molcula. Esta parte de la molcula de anticuerpo determina lo que ocurrir con el antgeno una vez que se haya unido. Inmunoglobulinas con la misma capacidad de interaccin con el anlgeno pueden presentar una variedad de regiones Fe distintas, por tanto, diferentes propiedades funcionales, como puede ser activar el sistema de complemento y unirse a receptores de Fe presentes en la superficie de macrfagos, facilitando asi la fagocitosis de antgenos. Debido a que posee una localizacin expuesta y una estructura flexible, la regin bisagra es atacada por diversas enzimas proteoliticas. Como su nombre indica, esta regin confiere una cierta flexibilidad a la molcula, permitiendo que adopte la estructura en forma de "Y". Esto permite que un anticuerpo se una a una sola partcula (p. ej. una bacteria) mediante sus dos regiones de unin al antgeno o. alternativamente, puede estirarse al mximo para unir dos partculas. Las propiedades que aporta la regin bisagra a las molculas de inmunoglobulina estn relacionadas con su alto contenido en prolina y residuos de aminocidos hidroflicos. Los puentes disulfuro que se establecen entre las cadenas H en molculas de IgG. IgA y en IgD se encuentran en la regin bisagra (Fig. 37-1). Las enzimas proteoliticas papaina y pepsina escinden las molculas de anticuerpo en diferentes fragmentos caractersticos que permiten un entendimiento de la relacin estructura-funcin de la proteina. El corte con papaina produce dos fragmentos Fab (Iragment antigen-binding. fragmento de unin al antgeno) idnticos, cada uno de ellos con un dominio de unin al antigeno, y un fragmento Fe

Tabla 37-1 Dominio C3

Propiedades biolgicas de los dominios de inmunoglobulina (IgG) Funcin conocida o probable

C,,2 C..1/C

V H T V ,

1. Reacciones citotrpicas que implican (a) Macrfagos y monocitos (b) Mastocitos heterlogos (c) Clulas citotxicas (K) (d) Clulas B 2. Ensamblaje no covalente de las cadenas pesadas y ligeras 1. Unin al complemento (C1q) 2. Control del ritmo catablico 1. Ensamblaje no covalente de las cadenas ligeras y pesadas 2. Ensamblaje covalente de cadenas ligeras y pesadas. 3. Espaciadores entre interacciones entre dominios que conllevan unin del antgeno y funciones electoras 1. Unin al antgeno 2. Formacin de enlaces no covalentes entre cadenas pesadas y ligeras

De Dornngion KJ Painter RH Biological activities of the constant region of immunoglobulin G. En Mandel TE, el al (eds) Progress in Inmunology III Ciudad de Canberra. Australian Academy of Science. 1977. con permiso

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SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA Dadas las condiciones de valencia que permiten la formacin de grandes agregados, el tamao de los complejos antgeno-anticuerpo que se forman depende criticamente de las concentraciones molares relativas de los dos reactivos. Si hay un exceso de antgeno o de anticuerpo es poco probable que se formen grandes complejos (Fig. 37-2). El tamao y composicin de los complejos antgeno-anticuerpo no slo son importantes para las reacciones de precipitacin in vilro. tambin son cruciales para determinar el destino de los complejos en el organismo. Los complejos formados en equivalencia o en exceso de anticuerpo presentan mltiples regiones Fe expuestas en la superficie y por tanto se unen con fuerza a los receptores Fe de los macrfagos, los cuales los ingieren y degradan. Los complejos pequeos, formados en exceso de antgeno, slo presentan una regin Fe por complejo. As, se unen pobremente a los receptores Fe de los macrfagos y se destruyen con menos eficiencia. En lugar de ser destruidos se pueden depositar en pequeos vasos sanguneos de la piel, rones, articulaciones y cerebro, donde pueden activar el sistema del complemento, causando inflamacin y destruccin del tejido. Aunque parece que los complejos antgeno-anticuerpo tienen una apariencia muy rgida, los anticuerpos son entidades dinmicas que sufren fluctuaciones estructurales (Karplus, 1983; Wilson, 1991). Cambios conformacionales pueden ser necesarios para la unin. Estos ajustes incluyen desplazamientos laterales de las cadenas de hasta 2 a 3 A, rotaciones de anillos aromticos, cambios conformacionales e incluso pequeas rotaciones entre dominios V y V (Bhat, 1990; Standfield, 1990; Herrn, 1991).
H L

subunidades repetidas, se define como la fuerza total de unin de todos los sitios de unin juntos. Una molcula de IgG tpica se une con al menos 10.000 veces mayor fuerza a un antgeno multivalente si ambos dominios de interaccin con el antigeno estn implicados, que si slo interviene uno de ellos. Por el mismo motivo, si la afinidad de los dominios de interaccin con el antgeno entre molculas de IgG e IgM es la misma, la molcula de IgM (debido a que es un pentmero y por tanto posee 10 dominios de interaccin con el antgeno) poseer una avidez mucho mayor por un antgeno mullivalente que una molcula de IgG (que posee dos dominios de interaccin con el antgeno). Esta diferencia de avidez es importante en vista del hecho de que los anticuerpos producidos al comienzo de una respuesta inmune, generalmente poseen afinidades mucho menores que los que se producirn ms adelante. El aumento en la afinidad media de los anticuerpos producidos con el transcurso de tiempo desde la inmunizacin se denomina maduracin de la afinidad. Esto ocurre porque la respuesta humoral frente a un antgeno es heterognea, esto es, se producen anticuerpos con distintos dominios de unin al antgeno por parte de los clones de linfocitos B de respuesta. Debido a su elevada avidez total, IgM (el principal tipo de Ig producida al principio de una respuesta inmune) puede funcionar incluso cuando cada uno de sus dominios de interaccin slo tiene una baja afinidad. El tamao del complejo antgeno-anticuerpo se determina por la valencia del antgeno y las concentraciones relativas del antgeno y el anticuerpo. La reaccin de precipitacin de antigeno-anticuerpo se basa en el entrecruzamiento de antgenos multivalentes por anticuerpos bivalentes. Si slo est presente un tipo de anticuerpo (una respuesta monoclonal), molculas con un solo determinante antignico no pueden entrecruzarse. Si un antgeno es bivalente, puede formar pequeos complejos cclicos o cadenas lineales con el anticuerpo, mientras que un antgeno con tres o ms determinantes antignicos puede formar complejos tridimensionales que precipitan con facilidad. Sin embargo, la mayora de los antisueros producidos frente a un antgeno contienen una variedad de anticuerpos diferentes (una respuesta policlonal) que reaccionan con diferentes determinantes del antgeno y pueden cooperar en el entrecruzamiento del antgeno. Por el contrario, anticuerpos homogneos (monoclonales) slo pueden precipitar molculas que presentan repeticiones idnticas de determinantes antignicos.

BASE GENETICA DE LA DIVERSIDAD DE ANTICUERPOS


Se estima que un individuo puede producir al menos entre 10 y 10 molculas de anticuerpo diferentes. Han evolucionado mecanismos genticos especiales para producir una gran cantidad de molculas de inmunoglobulina, que se desarrollan durante la respuesta a un antgeno sin la necesidad d e involucrar un nmero excesivo de genes (Edward, 1993).
6 9

Figura 37-2. L a s concentraciones del antgeno y del anticuerpo influencian el tamao de los complejos antgeno-anticuerpo que s e forman. Los complejos de mayor tamao se forman cuando a m b a s molculas estn presentes en aproximadamente la misma concentracin molar (zona de equivalencia), mientras que los complejos ms pequeos se forman cuando existe un gran e x c e s o de antigeno. Ntese que los pequeos complejos formados en exceso de antigeno presentan pocas molculas de anticuerpo por complejo: por este motivo, no son eliminados eficientemente p o r los macrfagos de los fluidos extracelulares.

CAPTULO 37

EVALUACIN D E L FUNCIONAMIENTO DE L A S INMUNOGLOBULINAS Y LA INMUNIDAD HUMORAL

881

Figura 37-3. Organizacin y reagrupamiento de los genes de cadenas pesadas de inmunoglobulinas (exones) en el c r o m o s o m a 12 de ratn. Cada gen V tiene tambin una secuencia lder que no aparece en la representacin Los genes de la regin constante se identifican mediante el isolipo de la cadena pesada, y existe ms de un gen para los isotipos C, y C A diferencia de los genes de C,, y C,. los genes C estn c o m puestos por mltiples exones, tal y c o m o se ilustra para el gen C (dominios C,-C,...). Los sitios de recombmacin se encuentran en el e x t r e m o 5' de c a d a uno de los genes C y t a m p o c o se muestran. La linea continua representa las secuencias intermedias (intrones) entre genes o segm e n t o s gnicos. Cada cadena pesada est codificada por cuatro segmentos gnicos diferentes. V, D. J. y C. (Reproducido de M a r c u KB: I m m u noglobulin heavy-chain constant region genes. Cell 1982; 29:719, con permiso. Copyright de Cell Press).
M

Las inmunoglobulinas se producen mediante 3 grupos de genes que codifican para las cadenas K, K y H. respectivamente Los grupos de genes que codifican para las cadenas ligeras y pesadas se encuentran en cromosomas diferentes. En cada grupo, distintos segmentos gnicos que codifican para diferentes partes de las regiones variables de cadenas ligeras y pesadas se pueden poner en contacto mediante procesos de recombinacin especficos que tienen lugar durante la diferenciacin de clulas B. Los grupos de genes de cadenas ligeras contienen uno o ms genes constantes (C) y juegos de segmentos variables (V) y de genes de unin (J). El grupo de genes de la cadena H contiene un juego de genes C. y juegos de genes V. genes de diversidad (D) y segmentos J. Para generar una molcula de anticuerpo, un segmento gnico V se recombina con otro segmento gnico J , dando lugar a un gen V para la cadena ligera; y un segmento V se recombina con un segmento D y otro J para generar un gen V para la cadena pesada (Fig. 37-3). Cada uno de los segmentos gnicos generados se cotranscribir con el segmento de la regin constante correspondiente para producir un ARN mensajero que codifica para la cadena polipeptidica completa. Mediante la combinacin de los diferentes segmentos gnicos que codifican para las regiones V, y V. los vertebrados pueden producir miles de cadenas ligeras distintas y miles de cadenas H diferentes que pueden asociarse para dar lugar a millones de molculas de anticuerpo diferentes.
H

una mayor afinidad de los anticuerpos que se producen en un segundo contacto con el antigeno que en la respuesta inicial. Asi. este proceso de hipermutacin somtica puede dar lugar a la presencia en individuos inmunizados de anticuerpos de alta afinidad que resultan mucho ms efectivos. Todas las clulas B producen inicialmente anticuerpos IgM. Ms adelante algunas pasan a producir otros tipos de anticuerpos (isotipos) que poseen el mismo dominio de unin al antgeno (idiotipo) que la IgM original (exclusin allica) (Fig. 37-4 y Tabla 37-2). Este cambio de lipo en combinacin con la exclusin allica permite que los mismos dominios de unin al antgeno (la misma cadena V y L) se distribuyan entre anticuerpos con distintas propiedades biolgicas (funciones efectoras secundarias). As. este mecanismo de organizacin gmea permite la construccin d e molculas de inmunoglobulina con una variedad de especificidades. La diversidad de los anticuerpos depende de la presencia de mltiples segmentos gnicos, su reagrupacin en diferentes secuencias, la combinacin de distintas cadenas pesadas y ligeras en la construccin de molculas de inmunoglobulina, y de mutaciones somticas.

Este repertorio inicial de molculas de anticuerpo se puede expandir incluso ms mediante la hipermutacin somtica, la cual se activa mediante la exposicin al antgeno. As, el papel que juega el antgeno en presencia de la mutacin somtica parece derivar en un refinamiento de la respuesta inmune y a una diversidad prcticamente ilimitada de molculas de anticuerpo. Mutaciones somticas puntuales tienen lugar en clulas B (no en clulas germinales) durante toda la vida de un animal o un humano (Tonegawa, 1983). Las hipermutaciones somticas se encuentran, en su mayora, confinadas a los genes de las regiones variables de las cadenas H y L y a los intrones contiguos. Se estima que tendr lugar, aproximadamente, una mutacin en la regin V de la cadena H o L. en cada clula individual con cada divisin celular. Esto no slo aumenta la diversidad de anticuerpos, sino que tambin puede causar un cambio en la afinidad con la que el anticuerpo se une a su ligando. Aquellas clulas B resultantes que puedan unir al antgeno con mayor avidez presentan una ventaja sobre otras clulas B que no son capaces de unir al antgeno con tanta avidez. A medida que decae la concentracin de antgeno, aquellas clulas B que presentan receptores con mayor avidez dominan la poblacin de clulas involucradas en la respuesta. Esto origina

PROPIEDADES GENERALES DE LAS INMUNOGLOBULINAS


(Spielgelberg. 1974: Carayannopoulos. 1993) Los diversos tipos de inmunoglobulinas humanas y sus propiedades estn resumidos en las Tablas 37-3 y 37-4.

Inmunoglobulina M
Esta glucoprotena es el principal tipo de anticuerpo secretado a la sangre en las primeras fases de una respuesta humoral primaria. Normalmente, la IgM se secreta en forma de pentmero compuesto por cinco unidades de cuatro cadenas cada una. una macroglobulina con una velocidad de sedimentacin de 19S y una masa molecular de 900 kDa. Sin embargo, en trastornos autoinmunes humanos, como puede ser el lupus entrematoso sistmico (SLE), la forma monomrica de 7S se puede detectar en cantidades apreciables en el suero. La deficiencia selectiva de IgM es un trastorno poco frecuente asociado con una ausencia de IgM y niveles normales del resto de inmunoglobulinas. El origen de este trastorno es desconocido.

882

SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA

Figura 37-4. Estructura de las cadenas pesada y ligera mostrando las posiciones y longitudes de las regiones hipervariables del dominio V\ (denominados Lv1. Lv2. Lv3) y del dominio V (denominados Hv1. Hv2. Hv3). Los residuos de aminocidos se enumeran empezando por el extremo amino-terminal. En algunas cadenas pesadas, se ha observado una regin hipervariable adicional (N84-N91). En el diagrama tambin se ilustra la regin donde pueden encontrarse la mayora de las vanantes de inmunoglobulina. Los determinantes idiotipicos se encuentran exclusivamente en los dominios V, y V. y el marcador isotipico en las regiones constantes de ambas cadenas. L o s marcadores alotipicos pueden aparecer a lo largo de ambas cadenas.

Debido a que la forma pentamrica de la IgM tiene un total de 10 dominios de unin al antigeno, resulla ms eficiente que su forma monomrica 7S o la IgG en el entrecruzamiento del antgeno y en la activacin del sistema del complemento una vez unido al antigeno. Asi, esta elevada eficiencia en la unin y activacin del complemento, unido a su temprana

aparicin durante el transcurso de una infeccin, hace de la IgM un agente especialmente potente para combatir las invasiones microbianas. Cada pentmero de IgM contiene una copia de otra cadena polipeptdica. denominada cadena J (del ingls joming). con un tamao molecular de 15 kDa. Este polipptido accesorio se produce por parte de las clulas secretoras de

CAPTULO 37

EVALUACIN DEL FUNCIONAMIENTO DE LAS INMUNOGIOBULINAS Y LA INMUNIDAD HUMORAL

883

Tabla 37-4

P r o p i e d a d e s de las i n m u n o g i o b u l i n a s h u m a n a s
IgM IgG IgA IgD

A Fisiolgicas Concentracin mg/ml en suero de un adulto normal 1.2-4.0 8.0-16.0 0.4-2.2 0.03 17-450 ng/ml Unidades internacionales/ml 69-322 92-207 54-268 <100 Porcentaie de la inmunoglobulina total 13 80 6 0.002 Porcentaje de distribucin intravascular 41 48 76 75 51 Ritmo de sintesis mg/kg/dia 2,2 35 24 0.4 0,003 Ritmo de catlisis en suero, %/da 10,6 6 24 37 90 (o vida media/dia) (5-6) (18-23) (5-6.5) (2.8) (2,3) Biolgicas Capacidad de aglutinacin +4 +2 + Capacidad de fijacin del complemento por la va clsica 4 Hipersensibilidad anafilctica homologa +4 + Anafilaxis helerloga en conejillo de Indias Fijacin a baslilos y mastocitos homlogos +4 + Unin citolilica a macrfagos 1 + Transporte Iransplacentario + Unin al tactor reumatoide Presencia en secreciones externas + +4 +2 Otras propiedades caractersticas: IgM - Se produce en el inicio de la respuesta inmune, es la primera defensa electiva frente a la bacteremia. IgG Combate los microorganismos y sus toxinas en los fluidos extravasculares IgA -Defiende las superficies externas del cuerpo. IgD -Presente en la superficie de hnfocitos inmunocompetentes importante para la activacin de clulas B y/o la inmunorregulacin

IgM Se trata de una glucoproteina acidica con un elevado contenido en residuos de cisteina y. por tanto, se asocia mediante puentes disulfuro al extremo carboxilo-terminal de dos regiones Fe de molculas monomricas de IgM adyacentes. Se cree que la oligomerizacin se inicia en este punto. La IgM es adems, el primer tipo de anticuerpo secretado por las clulas B durante su desarrollo. Los precursores inmediatos de las clulas B. llamadas clulas pre-B. sintetizan cadenas u., pero no cadenas ligeras, que acumulan en el interior de las clulas. A continuacin las clulas pre-B empiezan a sintetizar cadenas ligeras que se combinan con las cadenas u para formar molculas de IgM monomricas. El conjunto formado por las dos cadenas pesadas y las dos cadenas ligeras se inserta en la membrana plasmtica, donde funciona como receptor para el antigeno. En este momento, las clulas se han convertido en linfocitos B y pueden responder al antgeno. Quizs debido a su gran tamao, el pentmero de IgM secretado no se encuentra de modo significativo en los espacios intersticiales; se encuentra confinado a la sangre y no atraviesa la placenta. La IgM es un componente minoritario de las inmunogiobulinas secretadas en superficies mucosas y en la leche materna. Filogenticamente, la IgM es la inmunoglobulina ms primitiva, y la mayora de las variantes de los genes de la cadena LI parecen haber evolucionado para dar genes de cadenas pesadas de otros tipos de inmunogiobulinas. Otras propiedades fsicas y biolgicas de la IgM y de otros tipos de inmunoglobulinas se citan en las Tablas 37-3 y 37-4.

necesitan al menos dos molculas de IgG para la activacin del complemento, en comparacin con una sola molcula de IgM, que contiene cinco regiones Fe Las molculas de IgG son los nicos anticuerpos que pueden pasar de la madre al feto. Clulas placentarias que se encuentran en contacto con la sangre materna poseen receptores que se unen a la regin Fe de la IgG y median su paso hasta el feto. Los anticuerpos primero penetran por un proceso de endocitosis mediada por receptores y despus se transportan a travs de la clula para liberarse posteriormente por exocitosis a la sangre fetal. Otros tipos de anticuerpos no pueden unirse a estos receptores y. por tanto, no pueden atravesar la placenta. La habilidad de la IgG para cruzar la placenta confiere una linea de defensa fundamental frente a la infeccin durante las primeras semanas de vida del nio. Normalmente, el embrin humano empieza a recibir cantidades significativas de IgG materna por va transplacentaria a las 12 semanas de gestacin. La cantidad aumenta de forma constante hasta que, al nacer, el suero del cordn contiene una concentracin de IgG comparable a la del suero materno. Salvo que existan trastornos inmunolgicos. los niveles de IgG de un adulto se alcanzan en el sptimo ao de vida y a partir de este momento permanecen constantes. Los anticuerpos IgG tienen un elevado coeficiente de difusin que les permite difundir a espacios extravasculares del cuerpo con mayor facilidad que otros tipos de Ig. Como la IgG es la principal representante de las Ig en estos espacios, es la principal encargada de neutralizar toxinas bactenanas y de unirse a microorganismos para facilitar su fagocitosis. Ademas, solo los anticuerpos IgG que se encuentran recubriendo clulas diana, como pueden ser clulas tumorales, pueden desencadenar su muerte extracelular mediante ADCC; las clulas NK responsables de la ADCC presentan receptores para Fe de IgG. Existen cuatro subtipos de IgG humana, de 1 a 4. Las cuatro subclases reflejan la existencia de cuatro cadenas H distintas no genticamente (y1 a y4). que son similares pero no idnticas en cuanto a su secuencia de aminocidos y propiedades generales. Por ejemplo. lgG1 es el subtipo dominante en adultos humanos. La lgG3 es la ms efectiva en su unin al complemento, seguida de lgG1 e lgG2. La lgG4 en la mayoria de los casos es incapaz de unirse al complemento por la va clsica. Todos los subtipos excepto la lgG2 pueden atravesar la placenta. Un resumen de las propiedades fsicas y biolgicas de la IgG se encuentra en las Tablas 37-3 y 37-4. y de los subtipos en la Tabla 37-5.

Inmunoglobulina G
La IgG es el isotipo mejor estudiado tanto a nivel estructural como funcional (Burton. 1985). Los anticuerpos de este tipo constituyen la principal inmunoglobulina en sangre. Se producen copiosamente durante la respuesta inmune secundaria. La regin Fe de las molculas de IgG se une a receptores especficos de clulas lagocficas, como macrfagos y leucocitos polimorfonucleares. incrementando asi la eficiencia con que las clulas fagociticas pueden ingerir y destruir microorganismos infecciosos que se han recubierto con anticuerpos de IgG en respuesta a la infeccin. Estos anticuerpos unidos a clulas diana tambin pueden guiar a linfocitos NK (Natural Killer) a destruirlos mediante un proceso de citotoxicidad celular mediada por anticuerpos (ADCC del ingls antibody-dependenl cell-mediated cytotoxicty. La funcin mejor conocida de la IgG es la activacin del complemento por la va clsica. La regin Fe de la IgG puede unirse, y por tanto activar al primer componente del sistema del complemento, que desencadena un ataque bioqumico que mata a los micoorganismos Se

Inmunoglobulina A
Los anticuerpos de esta clase constituyen el principal tipo de anticuerpo presente en las secreciones (leche, saliva, lgrimas y secreciones respiratorias

884

SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA

Tabla 37-5 Propiedades de las subclases de inmunoglobulinas G IgGI A. Fisiolgicas Porcentaje de IgG total en suero Ritmo de sntesis, mg/kg/dia en suero Ritmo de catlisis en suero, %/da (vida media, da) Relacin K/X Marcadores alotpicos (tipo de Gm) B. Biolgicas Capacidad de fijacin del complemento por la via clsica Capacidad de adhesin a piel heterloga Transporte transplacentario Receptor en macrfagos Capacidad de reaccin con protena A Actividades dominantes: Toxoide antitetnco Toxode antidiftrico Antitiroglobulma Anti-ADN Anti-Fth Anli-lactor VIII Anlidextrano Anlilevano Anti-cido teicoico Nmero de puentes disulfuro entre cadenas pesadas en la regin de bisagra Posicin de los puentes disulluro de las cadenas ligeras sobre las cadenas pesadas 66*8 25 8 (23) 1,4-2,4 a, z, f, x igG2 23 8 ? 6,9 (23) 1,0-1,1 n igG3 7,3 3.8 3,4 16.8 (7) 1.1-1,3 bo, bi, bz. g. st. etc +3 lgG4 4.2 2.6 ? 6.9 (23) 5,0-7,0

+2

+ +
+

+ + + +
+ +

+
-

+
+2 +2 +2 +2 +2

+
+

+ +
+2


2 N214

+ 4 N131

5 N131

2
N131

e intestinales). Existe en forma de un monmero de cuatro cadenas (como la IgG) o formando un dmero de dos unidades monomricas. Las molculas de IgA presentes en las secreciones son dmeros que llevan una sola cadena J. similar a la asociada con la IgM pentamrca, con una cadena adicional glicopolipeptdica llamada el componente secretor (SC) de 70 kDa. Los dmeros de IgA recogen el SC de la superficie de clulas epiteliales que recubren el intestino, tos bronquios o los conductos galactforos, salivares o lacrimales. El componente secretor se sintetiza en las clulas epiteliales e inicialmenle se expone en la superficie extema de estas clulas, donde acta con un receptor que une los dmeros de IgA. El complejo resultante de la unin del dmero a su receptor se internaliza por endocifosis mediada por receptor, y se transfiere a travs del citoplasma de la clula epitelial en forma de vescula membranosa, la cual se fusiona con la membrana plasmtica en el lado luminal de la clula

epitelial. La porcin extramembranal del receptor se escinde por accin enzimtica y se secreta como parte de la molcula de IgA secretora ([(/. ,L,,)/J(/.) al lumen. El extremo amino-terminal del receptor del dmero de IgA que permanece unido a este dmero es el SC (Fig. 37-5). As, la molcula secretora completa de IgA es un producto sinttico de dos tipos celulares, clulas plasmticas y clulas epiteliales. Adems de su papel en el transporte, el SC tambin puede proteger las molculas dimricas de IgA de la digestin por parte de enzimas proteolticas presentes en las secreciones. En los humanos se han clasificado los anticuerpos de IgA en dos subtipos, lgA1 e lgA2, en funcin de la estructura antignica y la variacin en la disposicin de los puentes disulfuro intercatenarios. As como la lgA2 es un componente menor del suero, este subtipo es la forma dominante en las secreciones. Adems, la IgA secretada alcanza los niveles de un adulto antes que
?

Figura 37-5. M e c a n i s m o por el cual el componente secretor m e d i a el transporte de la molcula dimrica de IgA a travs de una clula epitelial. T o d o el complejo se transporta desde el fluido extracelular al interior del lumen del tubo epitelial. El componente secretor s e sintetiza en la clula epitelial c o m o una glucoprotena transmembranal y funciona c o m o un receptor en su superficie basolaleral para unir el dmero de IgA. El complejo IgA-receptor penetra en la clula en una vescula endoctic que cruza la clula y es exocitada en la superficie apical L a escisin del receptor libera el dmero de I g A para su secrecin a la superficie exterior (luminal). La porcin del receptor que permanece unida al dmero de IgA se denomina el componente secretor. Este mecanismo de transporte es responsable de la deposicin de I g A en diversas secreciones exocrinas (p. ej., saliva, leche, bilis, lgrimas y sudor) y en capas mucosas que protegen el revestimiento de los conductos nasofarngeos, intestinales y del tracto genitourinario.

CAPTULO 37

EVALUACIN D E L FUNCIONAMIENTO DE L A S INMUNOGLOBULINAS Y LA INMUNIDAD HUMORAL

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la IgA en suero. El sistema de IgA en el tracto intestinal humano, por ejemplo, puede estar plenamente desarrollado a los dos aos de edad, mientras que los niveles de IgA en suero no alcanzan las concentraciones de un adulto hasta los 12 aos de edad. Debido a su presencia cerca de las membranas extemas, la IgA secretada constituye u n a primera linea de defensa frente a microorganismos del ambiente exterior Se ha postulado que la IgA inhibe la adhesin de microorganismos a la superficie de las clulas mucosas, previniendo asi. su entrada en los tejidos. Una propiedad de la IgA secretada que es importante en este aspecto es su multivalencia. que se asocia a una gran avidez por la unin de antgenos; esto puede resultar especialmente relevante en la neutralizacin de virus. La actividad antiviral de anticuerpos de IgA se ha demostrado en individuos a los que se le ha suministrado cualquiera de las vacunas para la polio. La IgA secretada tambin puede combinarse con determinados antgenos de la comida, impidiendo su absorcin al torrente sanguneo y reduciendo asi la incidencia de reacciones alrgicas. Por eiemplo. las inmunodeficiencias de IgA pueden desencadenar incrementos en tos niveles e incidencias de anticuerpos humorales dirigidos contra antgenos derivados de la comida y microorganismos intestinales. La IgA posee las siguientes propiedades efectivas: fija el complemento mediante la va alternativa; a travs de un receptor especfico de Fe presente en macrfagos puede funcionar como una opsonina para la fagocitosis; y puede inducir la degranulacin de eosinfilos mediante un receptor especifico, que ha implicado a la IgA en respuestas antiparasitarias. Las propiedades fsicas y biolgicas de la IgA estn enumeradas en las Tablas 37-3 y 37-4.

Inmunoglobulina E
De los diversos tipos de inmunoglobulinas. la IgE est presente en la menor concentracin en suero (Tabla 37-4). Posee la habilidad de unirse a la piel humana (anticuerpo homoertotropico) y de iniciar aspectos de la reaccin alrgica (anticuerpo reagnico) La actividad biolgica de la IgE se basa en su propiedad de unirse mediante su regin Fe a basfilos y a su equivalente en los tejidos, los mastocitos L a IgE puede ser importante tambin en la respuesta inmune humoral durante enfermedades parasitarias, ya que a menudo se encuentran elevados los niveles de esta inmunoglobulina en suero de pacientes que presentan una infeccin por helmintos. La IgE puede jugar un papel en el paso de leucocitos, anticuerpos y componentes del complemento a los locos de inflamacin desencadenando una reaccin de hipersensibilidad inmediala. Los anticuerpos de IgE representan un claro ejemplo de la naturaleza biluncional de las molculas de anticuerpo Su porcin Fe se une a las clulas diana mientras que su porcin Fab se une al alrgeno (vase Capitulo 46 para el papel de la IgE en enfermedades alrgicas y ensayos relacionados) Los niveles de IgE en suero en determinadas condiciones se muestran en la tabla 37-6. Al igual que la IgA, la IgE se produce principalmente en el revestimiento de los tractos respiratorios e intestinales y forma parte del sistema secretor externo de anticuerpos. Una deficiencia de IgE se ha asociado de forma poco consistente con la deficiencia de IgA en individuos inmunodeficienles que presentan una excesiva susceptibilidad frente a infecciones. La IgE no atraviesa la placenta y los complejos de IgE-antigeno no se unen al complemento por la va clsica (Tabla 37-4).

Inmunoglobulina D
A pesar de ser un componente minoritario del suero, la IgD es una de las principales inmunoglobulinas de membrana presentes en la superficie de una proporcin elevada de linfocitos B, especialmente en recin nacidos. Durante el transcurso de la diferenciacin de las clulas B. estas clulas sintetizan y presentan en superficie tanto molculas de IgD como de IgM. Aunque esto aparentemente contradice la regla de "una clula, una inmunoglobulina", los dominios de unin al antgeno (idiotipos) de ambas molculas y de sus cadenas ligeras son idnticos. Slo difieren en sus regiones C. La IgD asociada a la membrana puede funcionar como uno de los receptores con que las clulas B unen el antigeno y se estimulan para sufrir la proliferacin clonal. Existen evidencias que sugieren que las clulas B que presentan IgM pueden responder a ciertos antgenos T-independientes y que la adquisicin de IgD se requiere por parte de las clulas B para poder responder a la ayuda de clulas T necesaria para las respuestas a antigenos T-dependientes. Adems, si las molculas de IgD se eliminan selectivamente de clulas B que presentan tanto IgD como IgM. aprovechando que la cadena 8 es mucho ms sensible a la accin de la papaina, estas clulas pasan a ser susceptibles de convertirse en tolerantes. El papel exacto de la IgD en una respuesta inmune sigue sin conocerse, pero la opinin general es que enciende, apaga o modula la divisin o la diferenciacin de clulas B. La IgD generalmente se detecta en suero a los seis meses de edad, y su concentracin a lo largo de toda la vida es m u y baja. Sin embargo, en estados de enfermedad la concentracin de IgD puede variar enormemente. En infecciones crnicas, los niveles en suero de IgD se elevan, al igual que los del resto de las inmunoglobulinas. Hasta la fecha, no se ha asociado un incremento especfico de IgD con una enfermedad en concreto. Pacientes con alergias y enfermedades autoinmunes no presentan variaciones de las concentraciones normales de IgD. Generalmente, la IgD est ausente en individuos con hipogammaglobulinemia. Hasta la lecha, la IgD no tiene asignado un papel biolgico especfico como anticuerpo humoral. Se ha descrito la actividad de la IgD frente a un cierto nmero de antigenos. La IgD de superficie, que tiene protenas semejantes a las de la IgM de superficie, es un marcador de clulas B maduras, y su papel c o m o receptor est aceptado a pesar de que la naturaleza y finalidad de la seal que Iransmile siguen siendo controvertidas (Carsetti. 1993; Roes. 1993). La IgD no une al complemento, no atraviesa la placenta y no se une a clulas a travs de su regin Fe. La forma secretada de IgD. al igual que la del resto de las inmunoglobulinas. carece del pptido transmembranal en la regin carboxi-terminal que ancla la molcula en la superficie de las clulas B. Las Tablas 37-3 y 37-4 enumeran otras propiedades de la IgD. Tabla 37-6 Niveles de IgE en suero en determinadas afecciones
Elevado

Dermatitis atpica Mieloma de IgE Hiper-lgE e inlecciones recurrentes Sndrome de Wiskott-Aldrich Enfermedad de Hodgkin (especialmente en lases tardas) Aspergilosis broncopulmonar Pnfigo Parsitos (como la ascariasis) Lepra Sida
De normal a elevado

Rinitis alrgica Asma alrgica Alveolitis extrnseca alrgica Fibrosis quistica Aspergiloma Alergias a medicamentos Enfermedad heptica grave Urticaria alrgica Enfermedad de Kawasaki Periarteritis nodulosa
Normal

Linfangiectasia intestinal Bronquiolitis Pnligo Tiroiditis Fallo renal crnico


De normal a disminuido

Leucemias Mieloma mltiple Deficiencia de IgA


Disminuido

Ataxia-telangiectasia Hipogammaglobulinemia ligada al sexo Hipogammaglobulinemia congenita Hipogammaglobulinemia adquirida Deficiencia de IgE
Modificado a partir de Waldmanri TA Strober W, Polmar SH. Terry WD en Ishizaka K Daylon DH Jr (eds) Tue Biological Role ol the Immunoglobulin E System. Washington DC. US. Governrnenl Printing Oltice 1975 y Arbesman CA tvi Ishi/aka K. Daylon DH. Jr (eds): The Biological Role ol the Immunoglobulin E System, Washington. DC. U S. Government Printing Ottice, 1975

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SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPAKXOGI'A

Tabla 37-7 Concentraciones d e inmunoglobulina e n suero Edad (Aos) 5-9 10-14 15-19 20-24 25-29 30-34 35-39 40-44 45-49 50-54 55-59 60-64 65-69 70-74 75+ Media de IgG (mg/ml) Media de IgA (mg/ml)

Hiperinmunoglobulinemia
NIVELES D EI N M U N O G L O B U L I N A SE NS U E R O Una interpretacin vlida de los niveles de inmunoglobulinas en suero requiere un reconocimiento de las variaciones biolgicas que existen a lo largo de la vida de los individuos. Las vanables ms importantes son la edad, sexo y raza. Estudios en un grupo de individuos sanos de raza blanca (3.212) de u n a sola comunidad (Tecumseh, MI) mostraron que la concentracin media de IgG e IgA aumenta con la edad, con diferencias pequeas pero significativas entre sexos. Las mujeres presentaban niveles mayores en suero de IgG y menores de IgA (Tablas 37-7 y 37-8) A pesar de que estas diferencias entre sexos para la IgG y la IgA son estadsticamente significativas, su significado biolgico no resulta evidente. Los niveles de IgM en estos sujetos permanecieron relativamente constantes con la edad. Sin embargo, las mujeres lenan niveles medios de IgM (1,06 mg/ml) superiores a los hombres (0,77 mg/ml). Vanos estudios han descrito que los niveles de inmunoglobulinas son m a s elevados en personas con pieles pigmentadas. En la Tabla 37-8 se muestran los resultados obtenidos en una poblacin birracial de individuos sanos del condado de Evans. Georgia. Los individuos de color tenan niveles mayores de las tres inmunoglobulinas principales (IgM. IgG e IgA) que los blancos. La mayor diferencia se encontr en la IgG. No se detectaron diferencias entre individuos urbanos y rurales en este estudio. Individuos blancos de Rochester, Nueva York, tenan niveles en suero de IgG e IgM similares a los de individuos blancos de la Georgia rural. Un estudio trirracial en Durban, Natal, Sudfrica, demostr que varones adultos bantes tenan niveles significativamente mayores de IgM (32% ms), IgG (40% ms) e IgA (32% ms) en suero que individuos blancos de esta comunidad que nacieron en el mismo ao y pertenecan al mismo grupo sanguneo ABO. Varones asiticos sanos mostraban aproximadamente un 20% ms de IgG. un 23% ms de IgA. y un 7% ms de IgM que individuos comparables de raza blanca. Un estudio de individuos del rea metropolitana de Washington, D.C. demostr que individuos de color tenan niveles significativamente mayores de IgG que individuos blancos pero niveles similares de IgA e IgM (Tollerud. 1995). Los grupos control empleados en estos estudios se hicieron atendiendo a la edad. sexo, raza y tambin a diversos factores ambientales (Cassidy, 1974; Lichtman, 1967). Los incrementos de '/-globulinas a menudo se detectan primero tras una electreforesis de protenas del suero, una medida de las protenas totales o de albmina y fracciones de y-globulinas. Los valores de referencia para las diversas inmunoglobulinas varan con la edad, sexo y raza (Tablas 37-7 y 37-8). Los incrementos de inmunoglobulinas pueden ser monoclonales o policlonales. Las inmunoglobulinas monoclonales de un nico individuo son idnticas estructuralmente, y se cree que son el resultado de la expansin clonal de una sola clula linfoide productora de inmunoglobulinas, y por tanto, son especficas para un solo antigeno. Las inmunoglobulinas policlonales de un m i s m o individuo son estructuralmente diferentes entre ellas en una o ms caractersticas importantes: por tipo, IgG, IgA o IgM policlonales: por su cadena ligera; o por su especificidad antignica. Las inmunoglobulinas policlonales provienen de la expansin clonal de varias clulas linfoides productoras de distintas inmunoglobulinas. I N M U N O G L O B U L I N A SP O L I C L O N A L E S Los aumentos policlonales de inmunoglobulinas se han asociado con diversos estados patolgicos (Tabla 37-9) (Buckley, 1977; Cushman. 1973). La electroforesis de protenas sricas es a menudo suficiente para estable-

Varn blanco Mujer blanca Varn blanco Mujer blanca 10,28 10.41 10,55 10,69 10.83 10.98 11.12 11.27 11,42 11,57 11,72 11.88 12,04 12.20 12.36 11.05 11.13 11 20 11 28 11.35 11.43 11.50 11.58 11,66 11,74 11,81 11.89 11,97 12.05 12.13 1.09 1,16 1,23 1,32 1.40 1,50 1.59 1.70 1.81 1.93 2.06 220 2.34 2.49 2.66 1,10 1.15 1.21 I.28 1.35 1.42 1,49 1.57 1,65 1,74 1,83 1.93 2.03 2.14 2.26

Los dalos se obtuvieron de 3 213 muestras de suero recogidas de un grupo de sujetos no praseleccionados de una sola comunidad sana (Tecumserv MI) (Cassidy. 1974).

Resumen
En humanos existen cinco tipos diferentes de anticuerpos (IgM. IgG, IgA, IgD e IgE). cuatro subtipos de anticuerpos IgG (lgG1, lgG2. lgG3 e lgG4) y dos subtipos de IgA (lgA1 e lgA2). Cada uno de estos isotipos de anticuerpo posee una determinada cadena H (n, y, a. 8, e, y y, y . y y n, a. respectivamente). Las cadenas H contienen la regin F e del anticuerpo, que determina qu otras protenas se unirn al anticuerpo y por tanto, las propiedades biolgicas del tipo y subtipo. Cualquiera de las cadenas L (K- O X) pueden asociarse con cualquiera de las cadenas H.
3

Las diferencias estructurales entre los cinco tipos de inmunoglobulinas corresponden a las diferencias funcionales en sus lugares de produccin y accin, sus niveles relativos de sntesis en respuestas inmunes primarias y secundarias, y sus papeles como efectores fisiolgicos. Por ejemplo, la IgG predomina tanto en sangre como en los fluidos intersticiales, mientras que la IgM est principalmente confinada a la sangre, y la IgA secretada se encuentra fundamentalmente en superficies epiteliales. La IgD e IgE se encuentran principalmente unidas a clulas, la IgD en clulas B. y la IgE en basfilos y mastocitos.

IMPORTANCIA CLNICA DE LAS INMUNOGLOBULINAS


Las inmunoglobulinas juegan papeles muy importantes en la patognesis, diagnosis, prevencin y terapia de las enfermedades.

Patognesis
La hiperinmunoglobulinemia es una destacada caracterstica del mieloma mltiple y de la macroglobulinemia de Waldenstrom. Anticuerpos contra antgenos nativos pueden aparecer en enfermedades autoinmunes. tal y como se describe en los Captulos 43 y 45. La hipo- y agammaglobulinemia es a menudo una de las caractersticas ms destacadas de algunas inmunodeficiencias (vase Captulo 42).

Tabla 37-8 Sexo Hombres

Concentracin de le G en suero en una poblacin birracial Edad (Aos) 15-34 35-54 55-74 15-34 35-54 55-74 N. de muestras 17 17 20 19 19 20 Media de la raza blanca ( SE) (mg/ml) 11.2(7.3) 10.8 (5.9) 10,9(7.4) 10,6 (6,3) 12,3(3.4) 10,9 (6.1) N. de muestras 21
"

Media de la raza negra ( SE) (mg/ml) 13.4 (6.5) 13,5 (9,0) 13,3 (5.8) 15,6 (8.0) 15,4 (6,4) 14.2 (9,6)

20 I8 15 16

Mujeres

Estos datos son representativos de habitantes de Evans County, Georgia (Lichtman. 1967)

CAPTULO 37

EVALUACIN DEL FUNCIONAMIENTO DE LAS INMUNOGLOBULINAS Y LA INMUNIDAD HUMORAL

887

Tabla 37-9

Hiperinmunoglobulinemias policlonales: algunas enfermedades asociadas Tipo de inmunoglobulina

Afeccin Inmunodeliaenaas Hiperinmunoglobulina E e infecciones recurrentes Sndrome de Wiskott-Aldrich Disgammaglobulinemia tipo 1 Hiperinmunoglobulina A e infecciones recurrentes Sida Infecciones Infecciones congnitas (sfilis. toxoplasmosis, rubola, citomegalovirus) Mononucleosis infecciosa Tripanosomiasis Parasitismo intestinal Varias infecciones helmnticas Larva migrans visceral Granulomatosis crnica infantil Lepra Infecciones crnicas en general Enfermedades hepticas Hepatitis crnica activa Hepatitis aguda Cirrosis biliar Hepatitis lupoide Trastornos pulmonares Sndrome de hipersensibilidad pulmonar Sarcoidosis Beryliosis Trastornos autommunes Lupus eritematoso sistmico Artritis reumatoide Muchos estados autoinmunes como la tiroiditis Escleroderma Enfermedad de la aglutinina fra Prpura anafilctica Otras Sndrome do Down Amiloidosis Adiccin a narcticos Enfermedad de los lbulos renales

igE igA, igE IgM igA Todos los tipos IgM IgM o todas IgM o todas Todos los tipos igE Todos los tipos Todos los tipos Todos los tipos Todos los tipos, con preferencia de IgG Predomina IgG Predomina IgG Predomina IgM Todos los tipos Todos los tipos Todos los tipos Todos los tipos Todos los tipos igA o todos Todos los tipos Todos los tipos IgM IgA Todos los tipos Todos los tipos IgM Todos los tipos

La incidencia de las inmunoglobulinas monoclonales (componentes M) en estudios de una poblacin no seleccionada se estima en 0,9% (Bachman. 1965: Axelsson. 1968; Cohn 1985). En labratenos clnicos se encuentra una incidencia mucho mayor de resultados positivos, puesto que los sueros son preseleccionados. El mieloma mltiple, la macroglobulmemia de Waldenstrm y neoplasias de clulas B son algunas de las enfermedades asociadas con un aumento en el nivel de inmunoglobulinas monoclonales. Antes se crea que las gammapatias monoclonales eran poco frecuentes en casos de leucemia linfoctica crnica o de linterna Imfocitico bien diferenciado. Actualmente se ha demostrado que cuando se combinan la inmunofijacin y la electroforesis de alta resolucin para estudiar muestras de estos pacientes, la mayoria de ellos presentan una gammapata monoclonal (Keren. 1988). Tambin se ha demostrado la existencia de gammapatias en pacientes con linterna de Burkitt y leucemia linfoctica aguda de clulas B. Aunque generalmente se desconocen las especificidades antignicas de las gammapatias monoclonales, algunas causan neuropatas paraproteinmicas. Este sndrome clnico generalmente se debe a la interaccin de una paraproteina de IgM con una glucoproleina asociada a la mielina (MAG), ganglisidos (por ej. GM. en la neuropata motora y GD, en la neuropata sensorial) u otros glicoesfingolipidos (Ropper, 1998). El trmino de gammapata monoclonal de significado indeterminado (MGUS: monoclonal gammopathy of undetermmed signiticance) fue acuado por Kyle para categorizar individuos en los que se ha demostrado un componente monoclonal en el suero pero que carecen de otras caractersticas que permitan el diagnstico de un cncer (Kyle. 1982). Individuos con MGUS pueden tener hasta un 10% de sus clulas plasmticas en la mdula sea. Esto es considerablemente menos que la plasmacitosis de mdula sea que se asocia con el mieloma mltiple. Aproximadamente un 20% de individuos con MGUS desarrollarn un trastorno linfoproliferativo de clulas B, siendo el ms comn de ellos el mieloma mltiple, en un periodo de 10 aos. Algunos de los otros casos pueden desarrollar leucemia linfoctica crnica, amiloidosis. linterna linfoctico diferenciado y otras patologas que afectan a la proliferacin de clulas B. La mayoria de los casos de MGUS no progresan hacia ninguna otra patologa clnica. Pacientes con MGUS poseen cantidades del componente M de entre 300 y 3.000 mg'dl y normalmente no presentan la protema de Bence Jones en la orina. Se recomienda que estos pacientes tengan un seguimiento mediante electroforesis de protenas sricas cada 6 a 12 meses para determinar si el proceso progresa o retrocede. Una consideracin especial es el MGUS que se observa en pacientes Irasplantados que han recibido inmunosupresores que afectan a las funciones de clulas T incluyendo la modulacin de la respuesta B. Estas gammapatias monoclonales pueden ser transitorias hasta en un 75% de los casos (Radl, 1985). Pueden ocurrir tanto en forma monoclonal como oligoclonal (Stanko, 1989). y pueden coincidir con infecciones por citomegalovirus o por el virus de Epstein-Barr (Drouet, 1999). Su progresin probablemente se estimula por los elevados niveles de interleucina-6 circulantes (Nickerson, 1994).

cer esta condicin. La inmunoelectroforesis, inmunofijacin y determinacin de las inmunoglobulinas individuales o cadenas ligeras de inmunoglobulina pueden ayudar a confirmar una distribucin policlonal o un aumento de uno o ms tipos de inmunoglobulina. El aumento de las inmunoglobulms sricas puede deberse a un descenso del catabolismo y un aumento de la sntesis. Los mecanismos de control de estos sucesos no se conocen bien. Las consecuencias de una elevacin de inmunoglobulinas son desconocidas. La mayor parte de las inmunoglobulinas no parecen estar dirigidas frente a un solo determinante antignico o grupo de ellos. Adems, la mayora de los autoanticuerpos no son monoclonales sino policlonales, En general, los incrementos persistentes de carcter policlonal en y-globulinas, se relacionan con una estimulacin antignica de naturaleza crnica, o con una prdida de la regulacin de las inmunoglobulinas.

Tabla 37-10

Alteraciones asociadas a inmunoglobulinas monoclonadas

Inmunoglobulinas

monoclonales

L a s inmunoglobulinas monoclonales o los fragmentos de inmunoglobulinas se han asociado con diversos estados patolgicos (Tabla 37-10) (Atkinson, 1977; Benbassat, 1976: Schaefer, 1978; Wells, 1974; Kelly, 1985). Estas inmunoglobulinas tambin se han llamado inmunoglobulinas de heterogeneidad restringida.

Mieloma mltiple Macroglobulinemia de Waldenstrom Leucemia linfoctica crnica Otras leucemias : Linfomas I Gammapata monoclonal "benigna" j Sndrome de escape capilar sistmico Amiloidosis i Enfermedad heptica crnica como la hepatitis activa, o la cirrosis biliar primaria Trastornos autoinmunes, incluidas la artritis reumatoide. el lupus eritematoso sistmico. la tiroiditis. la anemia perniciosa, la poliarteritis nodulosa o el sndrome de Sjogren Enfermedad de Gaucher | Varios tipos de cncer Esferocitosis hereditaria I Infeccin por VIH, incluido el sida

888

SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOIOGA Se recomiendan los siguientes tipos de antisuero: antisuero completo humano; anti-lgG (cadenas y). anti-lgM (u), anti-lgA (a), anti-K y anti-A (Fig. 37-6). Es importante darse cuenta de que no todos los antisueros son semejantes en cuanto a fuerza y especificidad y es posible que un componente M no se detecte con un antisuero y, sin embargo, pueda encontrarse con un segundo antisuero. Asi, cada lote de antisuero debe compararse con un suero control para su actividad mediante una difusin en gel, y para su especificidad con suero humano completo mediante IEP. La interpretacin de una IEP puede requerir una considerable experiencia, pero generalmente uno busca una variacin de una linea normalmente uniforme, como puede ser porque se curva, presenta engrasamiento o tiene diferente movilidad. Ejemplos de IEP se muestran en la Figura 37-6. La IEP es una tcnica til pero tiene sus limitaciones. Puede identificar la presencia de cadenas pesadas y ligeras pero no asegura que lo que hay es efectivamente una molcula de inmunoglobulina compuesta por dos cadenas pesadas y dos ligeras. Tambin es posible, aunque poco frecuente, que existan anticuerpos monoclonales por debajo del lmite de deteccin del sistema empleado. El umbral de deteccin puede determinarse diluyendo un anticuerpo monoclonal conocido y probndolo en IEP. Debido a que protenas monoclonales pertenecientes a las IgM, IgA. IgD e IgE pueden estar presentes en cantidades relativamente pequeas en comparacin con la IgG, la cadena ligera de la inmunoglobulina no-lgG puede no ser detectada mediante IEP. La incapacidad para detectar las cadenas ligeras de inmunoglobulinas presentes en menor concentracin en presencia de una mayor concentracin de IgG, s e denomina efecto sombra (umbrella eflecl). Por tanto, pueden ser necesarios otros procedimientos para descartar la enfermedad de Franklin o de cadena pesada. Es posible que el suero que se est testando y el anticuerpo que se est utilizando no estn a la concentracin adecuada y que no se detecte el componente M. Finalmente, puede ser que el antisuero que se est usando no detecte los determinantes disponibles de un componente M concreto. Si uno tiene una importante sospecha, puede ser til utilizar un segundo antisuero de distinto origen.

DIAGNSTICO DE ENFERMEDADES
La evaluacin en el laboratorio de los niveles y funciones de inmunoglobulinas puede ayudar en el diagnstico y tratamiento de las patologas. El empleo de pruebas de fijacin del complemento, de hemaglutinacin y otros inmunoensayos pueden detectar un aumento o cambio en la titracin de anticuerpos frente a determinados antigenos, como los que estn presentes en microorganismos. Las peticiones de examinar un suero para la presencia de protena monoclonal generalmente vienen de un mdico que reconoce en un paciente los sntomas clnicos y signos de este tipo de trastorno, o del examen clnico de una electroforesis de proteina srica que sugiere la presencia de una protena monoclonal. A menudo la sospecha del mdico de la existencia de una discrasia de clulas plasmticas viene con la deteccin de anemia (con una o ms citopenias), niveles elevados de proteina total en el suero con un aumento de las globulinas, y proteinuria: otras detecciones pueden incluir hiperuricema, hipercalcemia, un incremento de fosfatasa alcalina, dolor seo o lesiones lticas del tejido seo en radiografas. Si efectivamente existe un componente M en la electroforesis de protenas sricas, una medida cuantitativa de inmunoglobulinas por inmunodifusin radial, nefelometra u otra tcnica apropiada puede identificar la inmunoglobulina especifica si slo se encuentra elevado uno de los tres tipos principales de inmunoglobulina. Obviamente, esto no determina la cadena ligera de una inmunoglobulina monoclonal ni detecta los mielomas de cadena ligera. Las gammapatas biclonales pueden ser confusas. El empleo de inmunoglobulinas cuantitativas resulta til en la monitorizacin del transcurso de la enfermedad y su tratamiento y puede ayudar a distinguir la condicin benigna de la maligna. Niveles de IgG monoclonal de 2 g/100 mi o de IgA de 1 g/100 mi (Isobe, 1971) o superiores sugieren una condicin maligna. En muchas inmunoctopatas malignas, la concentracin de inmunoglobulinas no monoclonales se encuentra reducida. Asi, una deficiencia de inmunoglobulinas policlonales sugiere la malignidad. Paradjicamente el paciente que posee una inmunocitopata maligna es inmunodeficiente a pesar de que posee grandes cantidades de inmunoglobulinas "sin sentido" producidas por un clon de clulas linfoides mal controlado.

Inmunofijacin
La IFE prcticamente ha sustituido a la IEP en el laboratorio clnico debido a su rapidez, sensibilidad y facilidad en la interpretacin; ambos procedimientos son comparables en cuanto a sensibilidad. La IFE adems posee la ventaja de dar un resultado ms rpido ya que no requiere la difusin a travs de gel. Muestras de suero del paciente se someten por duplicado a una electroforesis en gel de alta resolucin antes de aadir un antisuero monoespecfico directamente sobre las protenas separadas. Se lava el gel, y los complejos antigeno-anticuerpo se tien y miden directamente (Fig. 37-7). De vez en cuando, la concentracin de una protena monoclonal en el suero de un paciente es tan alta que excede la capacidad de los anticuerpos para lormar complejos que precipiten por IFE. Este fenmeno se corresponde con la zona de exceso de antigeno indicada en la Figura 37-2. El resultado es un halo de complejos precipitados (donde las concentraciones se aproximan a la equivalencia) con una zona central clara donde existe el exceso de antgeno. Aunque este resultado parece atpico, se puede interpretar y comprobar de forma directa repitiendo el IFE con una mayor dilucin del suero del pctenle (Keren, 1999). Cualquiera de las dos tcnicas puede aplicarse a otros fluidos corporales, siendo la orina el ms comn. Se pueden detectar cadenas ligeras monoclonales en la orina (protena de Bence Jones) de ms de la mitad de los pacientes con mieloma mltiple (Isobe. 1971; Wells. 1974). Cadenas ligeras policlonales pueden detectarse en pacientes con otros trastornos, normalmente formando parte de molculas de inmunoglobulina completas. La deteccin de la protena de Bence Jones por calor se describe en el Capitulo 18. L a IEP/IEF de orina es ms especfica y ms sensible que otros ensayos de Bence Jones ms antiguos. Se pueden realizar IEP/IEF en muestras de orina con suficiente proteina o tras concentracin por liofilizacin o mediante membranas selectivas (Minicon, Amicon). La medida de la viscosidad del suero se estudia en el Captulo 27.

Inmunoelectroforesis
La inmunoelectroforesis (IEP) y la electroforesis con inmunofijacin (IFE) son muy tiles en la deteccin de protenas monoclonales. Asi, en pacientes que presentan signos sospechosos, sntomas o especialmente cuando se detectan signos hematopatolgicos en sangre perifrica, mdula sea o ganglios linfticos, un IEP puede dar un diagnstico. El que una electroforesis de proteina srica deba preceder a una IEP o IFE depende de la disponibilidad relativa de estas tcnicas y de la sofisticacin de cada laboratorio. Por ejemplo, una electroforesis en agarosa de protenas sricas detecta la mayora de los componentes M. Sin embargo, la electroforesis en papel o acetato de celulosa no es tan sensible. Otro modo de seleccionar sueros para IEP o IFE es revisando las determinaciones electroforticas de las protenas sricas. Otra manera de abordar el anlisis sugerida por Keren y sus colaboradores (Keren, 1988) consiste en determinar los valores del suero y la relacin K/X conjuntamente con una electroforesis de alta resolucin. La inmunofijacin del suero se realiza si no se detectan anomalas en la electroforesis, ni hipergammaglobulinemia, ni hipogammaglobulinemia. y si la relacin K/X no se encuentra dentro de los valores de referencia. Tambin se recomienda la inmunofijacin del suero cuando la relacin K/X es normal pero aparece una banda no identificada en la electroforesis. L a IEP es una tcnica sensible y relativamente sencilla empleada para detectar componentes M y sus cadenas pesadas y ligeras. Permite una semicuantificacin de la concentracin de las inmunoglobulinas. El suero de pacientes se debe comparar con sueros "normales" o un grupo normal". Por ejemplo, de muestras de 100 a 200 mi de individuos sanos, se hacen porciones de 1 mi que se congelan rpidamente en hielo seco y acetona y se conservan a -70 C. El suero control que no se ha utilizado no se vuelve a congelar sino que se tira tras mantenerlo durante 3 dias a 4 C.

EVALUACIN D E L FUNCIONAMIENTO DE L A S INMUNOGLOBULINAS Y LA INMUNIDAD HUMORAL


I
v

Figura 37-7. Presencia de inmunoglobulinas demostrada mediante inmunofijacin del suero Se sometieron por duplicado muestras de suero de un paciente a una electroloresis en geles de agarosa a pH 8.6. Las protenas separadas reaccionan con un antisuero monoespecilico, los geles se lavaron, fijaron y tieron. SP o SPE = muestra que no ha sido lavada o que no se ha sometido a reaccin con el antisuero: G o IgG = muestra que ha reaccionado c o n anti-lgG: A o anti-lgA = muestra que ha reaccionado c o n IgA: M o anti-lgM = muestra que ha reaccionado con anli-IgM. K o anti- = muestra que ha reaccionado con anti- ;Loanti- - muestra que ha reaccionado con anti- . A. "normar. B Componentes M de IgG-K (2). C. Componente M de IgA- . D. componente M de IgM- . E. componente M de cadena F. componente M de cadena .

Prevencin de las enfermedades y terapia


La inmunizacin pasiva es la administracin de anticuerpos preformados obtenidos de otro individuo de la misma especie ( -globulinas homologas) o de una especie diferente ( -globulinas heterlogas); proporciona una proteccin inmediata frente a la infeccin. La inmunidad dura poco y decae a medida que los anticuerpos se utilizan y catabolizan. La proteccin pasiva durante el periodo neonatal se basa en la transferencia de anticuerpos maternos a travs de la placenta o el calostro (Pennington. 1991). Grupos de -globulinas humanas son tiles para la proteccin temporal frente a varias infecciones vricas o bacterianas (Berkman, 1990; Hammarstrm, 1990; Desai, 1991). Dependiendo de la dosis empleada y el momento de administracin, la enfermedad puede modificarse a una forma ms suave o puede prevenirse por completo. El efecto es ms completo y predecible si se usan preparaciones hiperinmunes preparadas a partir del plasma de individuos que estn convaleciendo de la enfermedad en cuestin o que se han inmunizado

frente a ella recientemente. Estas preparaciones contienen una concentracin ms elevada de anticuerpos especficos. Tambin se pueden producir anticuerpos en animales, como pueden ser los caballos, y en el pasado han tenido una importante aplicacin. Sin embargo, la sensibilizacin a protenas externas puede desencadenar reacciones clnicas como la anafilaxis, enfermedad del suero, pirexia y reacciones de Arthus locales. Los anticuerpos monoclonales han revolucionado muchas reas de la medicina, incluyendo la investigacin, diagnstico y terapia. Se han desarrollado anticuerpos murinos, humanos y humanizados (Lefrano, 1990: Mountain, 1992: Morrison, 1992; Ward. 1992; Shin, 1993). Muchos anticuerpos monoclonales. que a menudo reemplazan a los antisueros policlonales. se usan con fines diagnsticos (Vase Cap. 35). Quizs las aplicaciones teraputicas ms importantes se ven en el campo del trasplante y la oncologa (Neame. 1994; Stevenson. 1990: Vitetta, 1993). OKT3. un anticuerpo monoclonal munno frente al receptor CD3 de linfocitos, a menudo se emplea c o m o terapia antirrechazo para bloquear la actividad de linfocitos T citotxicos en

CAPTULO 37

EVALUACIN DEL FUNCIONAMIENTO DE LAS INMUNOGLOBULINAS Y LA INMUNIDAD HUMORAL

891

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Anticuerpos monoclonales anticitocinas y antimolculas de adhesin de neutrfilos pueden resultar efectivos en condiciones asociadas con inflamacin aguda y liberacin de cilocinas, por ejemplo, inhalacin de cido, isquemia o heridas de reperfusin (infarto de miocardio, choque hemorrgico, reparacin de un aneurisma artico); y anticuerpos que inhiben la adhesin de neutrfilos pueden resultar efectivos en el tratamiento de asma, fibrosis pulmonar, meningitis y malaria cerebral. Parece razonable esperar que una multitud de aplicaciones teraputicas aparezcan en el luluro, en que se disearn anticuerpos monoclonales que modulen las acciones de uno o ms mediadores naturales de inflamacin, infeccin o proliferaciones malignas.

C A P T U L O

38

Complemento y cininas: mediadores de la inflamacin

Eric Wagner, PhD. Haixiang Jiang, M.D., PhD Michael M. Frank, M.D.
ESTRUCTURA Y FUNCIN DEL SISTEMA DEL COMPLEMENTO Nomenclatura C3: molcula central de las vas de activacin del complemento Va clsica Va alternativa Va de la lectma fijada a maosa Componentes finales del complemento Anafilotoxinas Regulacin de la activacin del complemento Receptores del complemento Biosntesis del complemento Gentica del complemento Complemento e inmunidad adquirida DEFICIENCIAS GENTICAS DEL COMPLEMENTO EVALUACIN DE LA ACTIVIDAD DEL COMPLEMENTO EN LA ENFERMEDAD COMPLEMENTO EN LOS ESTADOS DE ENFERMEDAD Enfermedades reumatolgicas Enfermedades infecciosas Enfermedades renales BIBLIOGRAFA 910 903 903 902 Enfermedades dermatolgicas 892 Enfermedades hematolgicas Enfermedades neurolgicas Enfermedades cardiovasculares Biocompatibilidad Trasplante de rganos UTILIDAD CLNICA DE LOS INHIBIDORES DEL COMPLEMENTO ENSAYOS DEL COMPLEMENTO Principios generales Evaluacin funcional de la va clsica Manejo de las muestras Preparacin de eritrocitos Preparacin de eritrocitos de oveja sensibilizados con anticuerpos Ensayo del complemento hemoltico total Ensayo de la va alterna Niveles del complemento mediante ensayos antignicos Prueba de fijacin del complemento CININAS Y SISTEMA DE GENERACIN DE CININAS 910 906 906

ESTRUCTURA Y FUNCIN DEL SISTEMA DEL COMPLEMENTO


El trmino "complemento" se refiere a un grupo de glicoprotenas circulantes que funcionan facilitando la inflamacin y realizan un importante papel en la defensa del husped. El dao tisular incontrolado es una posible complicacin de la activacin del complemento, y existen una gran variedad de glicoproteinas circulantes as c o m o protenas tisulares de unin a membrana que funcionan regulando la actividad del complemento y disminuyen la agresin del complemento. La existencia de este sistema de protenas fue inferido en los ltimos aos del siglo xix cuando qued claro que el suero fresco tena la posibilidad de lisar bacterias Gram negativas y vibriones clera en presencia de anticuerpos especficos. A medida que las tcnicas para la purificacin y la identificacin de protenas se hicieron ms sofisticadas con los aos, qued claro que haba un sistema muy complejo con muchas protenas interaccionando. En general, el sistema funciona identificando clulas y microorganismos extraos y destruyndolos Esto ocurre por lisis directa, por opsonizacin (el proceso de cubrirlos con pptidos especficos del complemento reconocidos por receptores especficos de los fagocitos para producir su ingestin) o provocando infla-

macin con la atraccin de clulas fagocitos. Tambin ha quedado claro que el complemento juega un papel para facilitar la respuesta inmune. El sistema de protenas del complemento es ms antiguo filogenticamente que la inmunidad adquirida (anticuerpo) y est presente en muchos organismos primitivos. Presumiblemente, proporciona un nivel de inmunidad natural y defensa del husped incluso en ausencia de anticuerpos. Esto lo hace a travs de la va de la de lecitina unida a manosa (MBL) y la va alternativa del complemento, que se tratan mas adelante. Los anticuerpos proporcionan un nivel de especificidad aumentado y aumentan la eficacia mediando la defensa del husped. En otras obras se puede encontrar una detallada historia del descubrimiento del complemento y de las diferentes vias del complemento (Frank. 1998).

Nomenclatura
Hay tres vias pnncipales de activacin del complemento en el suero humano: la va clsica, la va alternativa y la via de la MBL (o va de la MBLectina). La Figura 38-1 muestra la secuencia de reaccin de cada va. La Tabla 38-1 proporciona informacin especifica sobre cada proteina del complemento plasmtica La nomenclatura para las protenas del sistema del complemento

CAPTULO 38

COMPLEMENTO Y CININAS: MEDIADORES DE LA INFLAMACIN

893

C5b678(9)n

Complejo de alague de membrana

Figura 38-1. Los componentes de las vas clsica, MBIecitina y alternativa convergen para formar una convertasa que degrada al C3. En la via clsica, el complejo antigeno-anticuerpo se une y activa secuencialmente al C1,C4y C2. En la va de la MBIectina, la interaccin de la MBL con un carbohidrato en la superficie de un microorganismo origina la formacin de un complejo enzimtico (MBL-MASP-l-MASP-2, llam a d o M en la figura) que se une y activa al C4 y al C2. En la via alternativa, el C3 sufre la hidrlisis de su enlace tiol-sler. lo que induce un cambio en su conformacin. Entonces se une al factor B (B), que es degradado por el factor D (D) para formar una convertasa que es estabilizada por la properdina (P). El C3b, el producto de degradacin del C3, tambin tiene un residuo tiol-ester degradado y es capaz de activar la via alternativa. La convertasa con C3b de todas las vas contina secuencialmente mediante la unin con los componentes de aparicin final hasta que la secuencia de activacin se completa.

generalmente sigue dos convenciones (WHO. 1968: IUIS-WHO. 1981). Por razones histricas, las nueve protenas de la va clsica se nombran por la letra C seguida del nmero que cuenta su orden de aparicin en la secuencia de reaccin. Una excepcin importante es C4, que aparece antes que C2. Las molculas que son parte del complejo C1 se denominan Clq, Clr y Cls. Las protenas que reaccionan nicamente en la va alternativa son llamadas factores y se denominan con una letra mayscula (p. ej., factor B. factor D). Adems, los fragmentos de las protenas del complemento resultantes de la ruptura proteoltica se denominan con una letra en minscula (p. ej.. C4a, C4b) donde a representa el fragmento pequeo y b representa el fragmento grande. La excepcin a esta regla es C2, donde C2a es el fragmento grande y C2b es el fragmento pequeo. Los posteriores fragmentos degradantes de los fragmentos grandes del complemento en un componente son denomina-

dos con una letra en minscula (p. ej., C3c, C3d). Los componentes que han perdido su actividad normalmente se denominan con un prefijo con i minscula (p. ej.. iC3b, iC4b). Las cadenas polipeptdicas de la protena nativa del complemento se denominan con letras griegas (r/.. |5. y) excepto para el Clq, cuyas cadenas son denominadas A, B y C. Los componentes simples o complejos multicomponentes que tienen actividad enzimtica se denominan con una barra sobre el componente o los componentes. Las protenas de la recientemente descrita va MBLectina son denominados con las abreviaturas de los nombres de las protenas (p. ej., MBL para lectina lijada a maosa, MASP para la proteinasa srica asociada a la MBL). Las protenas reguladoras son denominadas con un ltulo o una letra descriptiva (p. ej.. protena unida a C4, factor H). Las protenas reguladoras de unin a la membrana han sido denominadas con nmeros CD y ttulos descriptivos (p. ej., protena

894

SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPAIOLOGA

Tabla 37-8

Protenas del c o m p l e m e n t o en el plasma h u m a n o P e s o molecular (kDa) 185 460 85 85 205 102 93 24 55 (monomoro) 200-400 93 7 C 190 110 too 150 70 105 550 88 150 84 70 20 Localizacin c r o m o s o m i c a 19p13.3-p132 1p34.1-36.3 12p13 12p13 6p21.3 6p21 3 6p2t 3 Desconocido Xpl 1 4-p 11 2 10p11 2-q21 3q27-28 1p36 3-36.2 9q33 5p13 5p13 1p32 (cadenas u y ) 9q22 3-q32 (cadena y) 5p13 11q11-q13.1 1q32 4q25 1q32 17q11 Desconocido Desconocido Concentracin (mg'ml) 1 200-1.300 150 50 50 300-600 20 200 2 25 0.002-10 1,5-13 Desconocida 80 45 90 55 60 240 250 35 300-450 500 50 -5,4

Proteina Comn a todas las vias C3 Via clsica C1q Cir C1S C4 C2 Via alternativa Factor B Factor D Properdina Va MBLecitina MBL MASP-1 MASP-2 Complejo de ataque a la membrana C5 C6 C7 C8 C9 Protenas de control C1inh C4bp Factor I Factor H Proteina S Clusterin Factor J

En presencia de un a c e p t o r adecuado, el tiol-ster interno p u e d e no sufrir la hidrlisis y degradarse, p e r op u e d er e a c c i o n a r con un nuclefilo en u n a clula diana p a r af o r m a r una unin a m i d a o ster con el s u s t r a t o diana del c o m p l e m e n t o de ataque. De e s t em o d o ,l a activacin del C3 con la c o n s i g u i e n t e degradacin del tiol-ster p u e d e originar una unin c o v a l e n t e de l a molcula de C3 a ia superficie de la clula diana. C3: molcula central de las vas de activacin As queda cubierta una diana con C3b. pudiendo interaccionar con las cludel complemento las q u ee x p r e s a nr e c e p t o r e sd e C3b. E s t a s incluyen t o d o sl o s fagocitos, l o s La protena la m a d a C3 es f u n d a m e n t a lp a r a la funcin de las tres vias de linfocitos B y una poblacin de linfocilos T, activacin del c o m p l e m e n t o (la via de la MBLectina, la via alternativa y la va El C3, c o n su c a d e n a a' unida c o v a l e n t e m e n t e a la diana y la c a d e n a \i clsica) y la comprensin del C3, su m e c a n i s m o de accin y sus funciones es unida debido a la unin disulfuro intracatenaria. se d e n o m i n a C3b (Fig. 38-2). esencial p a r ac o m p r e n d e r la activacin y la funcin de t o d a s las vias del c o m Es la f o r m a en la q u e el C3 contina la c a s c a d a del c o m p l e m e n t oc o n d u c i e n plemento. do a la lisis. Adems, de e s t a forma, la molcula p u e d ei n t e r a c c i o n a r con las El C3 es una molcula de dos cadenas sintetizada en m u c h a s clulas, pard o s glicoproteinas circulantes, l o s factores H e I. s i e n d o la s e g u n d au n a enzit i c u l a r m e n t e en los hepatocitos. f o r m a d a a partir de una molcula de c a d e n a m a proteoltica que degrada el C3 de la sangre. En la interaccin con los f a c nica, el pro-C3, y liberado a la circulacin. Las dos c a d e n a s (a y p) estn tores H e I. un pequeo fragmento, el C3f, de 3 kDa. es liberado, s i g u i e n d o estabilizadas p o rp u e n t e s disulfuro m t r a c a t e n a r i o ,yh a y un p u e n t e disulfuro d o s degradaciones adicionales de la c a d e n a a en u n ac u r v a disulfuro d e n t r o intercatenario estabilizando la interaccin de la c a d e n a a y la p (Fig. 38-2). de la c a d e n aq u ec o n e c t a las p o r c i o n e sa m i n oyc a r b o x i t e r m i n a l de la c a d e Las i n t e r a c c i o n e s hidrofbicas son tambin importantes, y la reduccin de los na a' (Fig. 38-2). Debido a las diferentes u n i o n e s disulfuro, la mayora del p u e n t e s disulfuro i n t r a c a t e n a n o no origina la separacin de las c a d e n a s en C 3 bp e r m a n e c e unido a la diana del c o m p l e m e n t o . ausencia de agentes que rompan la interaccin hidrofbica. Una vez realizada la degradacin del C3b p o r los f a c t o r e s H e I. todava En la c a d e n a a del C3. hay un tiol-ster u n i e n d o el sulfhdrilo de la c i s t e r n a ocurre otro c a m b i o conformacional. E s t a molcula, a h o r a la m a d a iC3b. interen la posicin 988 con un residuo de glutamina de 3 aminocidos. E s t e tiol-ster a c c i o n ap o b r e m e n t ec o n el CR1. el r e c e p t o r C3bC4b. p e r oi n t e r a c c i o n ac o n interno confiere una estructura inestable a la molcula de C3 El tiol-ster interla integrina p\, C R 3 (CDl1b CD18). El i C 3 b ya no p u e d ei n t e r a c c i o n a rc o n las n o est o c u l t o en el c e n t r o hidrofbico de la molcula. P u e d e ser d e g r a d a d o por protenas de la p a r t e final del c o m p l e m e n t op a r a inducir la lisis. la hidrlisis gradual a m e d i d a que el a g u ap e n e t r a en la molcula. Es degradaIgual q u ec o n el C3b. el iC3b facilita la fagocitosis u n i e n d o la d i a n a del c o m do m u c h o ms rpidamente una vez d e g r a d a d a la c a d e n a alfa del C3 con libep l e m e n t o a los fagocitos m e d i a n t el o sr e c e p t o r e s de iC3b. E s t o si n c l u y e n racin del C3a ( f r a g m e n t o de 9 kDa) en el e x t r e m oa m i n o t e r m i n a l de la c a d e t o d o s los lagocilos y los macrfagos, p e r o no i n c l u y e n los linfocilos B o l a s na a. La c a d e n ar e s t a n t e se la m a a'. El C3 nativo, p r e s e n t e en 1 , 2m g ' m l en clulas T. En p r e s e n c i a de CR1, el C3b y el iC3b p u e d e ns u f r i rp o s t e r i o r e s el p l a s m a normal, no i n t e r a c c i o n a con las clulas que e x p r e s a nr e c e p t o r e s de d e g r a d a c i o n e s por el f a c t o r I. En ese caso, una degradacin a d i c i o n a l se proC3. Sufre una gran alteracin c o n f o r m a c i o n a l con la degradacin del tiol-ster d u c e en la porcin amino-terminal de la c a d e n a (/.. Una porcin de 4 1 k D a de interno. El C3 con el tiol-ster hidrolizado interacta con las clulas que e x p r e la c a d e n aau n i d a por enlaces a m i n o o ster a la diana p e r m a n e c e detrs, y s a nr e c e p t o r e s de C3b. e s p e c i a l m e n t eC R 1 (receptor C3b C4b, CD35). es liberado el C3c. q u ec o n t i e n e las p o r c i o n e sa m i n o t e r m i n a lyc a r b o x i t e r

c o f a c t o r de m e m b r a n a .C D 4 6 ) y los receptores del c o m p l e m e n t os o n denom i n a d a s con nmeros que siguen al pretijo CR (para los r e c e p t o r e s del c o m p l e m e n t o 1 a 4). L o s otros r e c e p t o r e s del c o m p l e m e n t o se d e n o m i n a nc o n smbolos del c o m p l e m e n t os e g u i d o s por la letra mayscula R.

CAPTULO 38

COMPLEMENTO Y CININAS: MEDIADORES DE LA INFLAMACIN

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mnal del C3b. u n i d a s por un disulfuro entre ellas, y unida por un disulfuro a c o n v e r t a s a de la va alternativa descrita antes, d e g r a d a las molculas adiciola c a d e n a |5 (Fg. 38-2). La porcin r e s t a n t e unida c o v a l e n t e m e n t e a la diana nales del C3 c o n t i n u a n d o la c a s c a d a del c o m p l e m e n t o {vide mira). se d e n o m i n aC 3 d gyp u e d e sufrir una posterior degradacin a C3d. De nueD a t o s recientes sugieren que existe una va M B L e c i t i n a que acta via M B L vo, e x i s t e un r e c e p t o r especfico p a r a el C3d y p a r a el C 3 d g (CR2, CD21). y serin proteasas la m a d a s MASP-1 y MASP-2 ya sea p a r a la degradacin E s t er e c e p t o r est p r e s e n t e en t o d o s los I m f o c i t o s B, en a l g u n o s linfocitos T d i r e c t a del C3 por una de las e n z i m a sM A S Pop a r a la activacin de la va cly en a l g u n a s clulas epiteliales, pero no est p r e s e n t e en los fagocitos. Se s i c a para formar la C3 c o n v e r t a s a de la va clsica. En c u a l q u i e r caso, el C3a analiza c o n ms detalle posteriormente. se degrada de C3. El tiolster es degradado y la molcula entonces es c a p a z de unirse a las dianas. D e b eq u e d a r claro que el C3 sufre una hidrlisis o la El C3 en su configuracin nativa no a c t i v a la via alternativa. Sin embargo, escisin a C3b, una posterior degradacin a iC3b, y despus l ap o s t e r i o r el C3 (H 0) (tambin la m a d o iC3) y el C3b interaccionan con los factores e c e p t o r e s celulares i n t e r a c c i o n a n p r o t e i c o s D, B y properdina de la via alternativa para f o r m a ru n an u e v a enzi- degradacin a 3dg y a C3d. Los diferentes r t a p a s especficas en la va de degradacin. m a , el C3bBb. la convertasa da la va alternativa. Esta enzima es c a p a z de con el C3 en e d e g r a d a rp o s t e r i o r m e n t e el C3 separando la c a d e n a a de las molculas adiD e este m o d o ,e lC 3r e p r e s e n t al a proteina central d el a s tres vias del c o m c i o n a l e s del C3 nativo. La hidrlisis interna gradual del C3 a C3(H-,0). por lo plemento. La proteina no interaccona con ningn r e c e p t o r en su l o r m a natitanto, p u e d em e d i a r la activacin de la va alternativa a c t i v a n d o el C3 a una va. D e b es e r hidrolizada p a r a activar la va alternativa e m t e r a c c i o n a rc o n los configuracin hidrolizada de C3. u n i e n d o los factores B. D y properdina y r e c e p t o r e s de C3b. La separacin del C3a de su c a d e n aap r o d u c e el m i s m o d e g r a d a n d o molculas adicionales de C3. Esto se d e n o m i n a "seal" interna efecto. E s t op u e d e ocurrir a travs de la activacin de c u a l q u i e r a de las tres y se c r e e que es b a s t a n t ei m p o r t a n t e en la activacin inicial del C3 por la va vas del complemento. L a posterior degradacin, c o m o se describi, conlleva alternativa. a una progresiva interaccin con los r e c e p t o r e s en diferentes e t a p a s de las clulas p r e s u m i b l e m e n t em e d i a n d o la fagocitosis por un l a d o y la regulacin El a n t i c u e r p o y los c o m p o n e n t e s de la va clsica originan la produccin de de la r e s p u e s t ai n m u n ep o r el otro. una va clsica C3 convertasa en la superlicie de las dianas, que, c o m o la C3
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Figura 38-2. S e c u e n c i ad e degradacin del C3 e i n a c t i vacin del C3b. El p e s om o l e c u l a ra p r o x i m a d od ec a d a c a d e n aof r a g m e n t o se da en kilodaltons. L a se n z i m a sy c o f a c t o r e sr e s p o n s a b l e s de c a d a degradacin ( d e s i g n a d o s en l e t r a s maysculas) son: A. C3 c o n v e r t a s a : B, f a c t o rHoC R 1+f a c t o r I; C. C R 1+f a c t o r I; D, tripsina, e l a s t a s aop l a s m m a .

896 Va clsica

SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA

La activacin de la via clsica del complemento, descrita alrededor del ao 1 9 0 0 . fue la p r i m e r a en s e r estudiada. E s t a via es r e s p o n s a b l e de la activacin del c o m p l e m e n t o en la mayora de las clulas sensibilizadas con anticuerpos. L o s detalles de e s t a va estn publicados en otras obras (Volanakis. 1998: Fries, 1987). N u e v e protenas n u m e r a d a sc o m p o n e n la va clsica. La activacin de la via clsica n o r m a l m e n t e requiere la interaccin entre un antg e n o y un anticuerpo fijador de C1. En humanos, solo la inmunoglobulina M (Ig M ) y la Ig G son efectivas en a c t i v a r la via clsica. L a eficacia de la activacin d e la va clsica por las subclases de Ig G es la siguiente: Ig G3>lg G1>lg G2; la Ig G4 no es c a p a z de activar el c o m p l e m e n t o .I n t e r e s a n t e m e n te, un nmero d e molculas, diferentes d e las inmunoglobulinas. tiene la c a p a c i d a dd ea c t i v a r la via clsica a travs de la interaccin d i r e c t a con el C1q. E s t a s incluyen la prolena C reactiva, el c o m p o n e n t e srico del amiloide P, el fi-amiloide. a l g u n a s bacterias g r a m negativas, ciertos virus, el m i c o p l a s m a , protozoos y c o m p o n e n t e s intracelulares c o m o el ADN, las m e m b r a n a s m i t o c o n d r i a l e syl o s filamentos del ciloesqueleto (Gewurtz. 1993). Interesant e m e n t e , las clulas apoptticas se unen al C1q (Korb, 1997) y tienen la capaL ac a p a c i d a dd e las i n m u n o g l o b u l i n a sa g r e g a d a sp a r au n i re l Ciq h ap r o cidad de activar la va clsica. Esto p u e d e ser de importancia crtica en la elip o r c i o n a d o las b a s e s para un nmero de p r u e b a s diseadas p a r ad e t e c t a rl a minacin de las clulas apoptticas de la circulacin. p r e s e n c i ad ec o m p l e j o si n m u n e s solubles e n las m u e s t r a sd es a n g r ed e los pacientes. El C1q r a d i o m a r c a d o se aade a la m u e s t r a de s u e r o o de p l a s m a , N o sc e n t r a r e m o s en la activacin del c o m p l e m e n t oc o m os u c e d e en las diax i s t e n t e sp a r as e p a r a r el Ciq libre del u n i d o a los n a s sensibilizadas a anticuerpos. U n av e zu n i d a la i n m u n o g l o b u l i n a al objetivo, y se usa una de las tcnicas e c o m p o n e n t e sp r o t e i c o s del suero. El Ciq u n i d os u g i e r e la p r e s e n c i a de c o m el C1 se u n e a la i n m u n o g l o b u l i n a y se activa. La n a t u r a l e z ap r e c i s a de la interplejos de i n m u n o g l o b u l i n a s en la m u e s t r a de suero o de p l a s m a (Zubler. 1 9 7 6 ) . accin antgeno-anticuerpo-C1 n o est clara. El C1 es u n a macromolcula d e 740 kDa que c o n s t a de una molcula s i m p l e de C1q c o m p l e j a con dos c a d e n a s C 1 r y dos c a d e n a s C1S unidas t o d a s en p r e s e n c i a de iones calcio. El C1q est Va alternativa f o r m a d op o r seis subunidades, c a d au n ac o n t e n i e n d o tres c a d e n a s polipeptdicas ( d e s i g n a d a s A. B y C). Las tres c a d e n a sf o r m a n una triple hlice p a r e c i d a al La presencia de u n a segunda va de activacin del c o m p l e m e n t o fue colgeno con r e g i o n e s globulares que constituyen la porcin carboxi-terminal de propuesta p o r primera v e zp o r Piilemer (1954) pero fue a c e p t a d ap o r la la molcula. El C1q se u n e a las inmunoglobulinas a travs de sus cabezas glo- comunidad cientfica dos dcadas despus. Esta va de activacin del combulares, m i e n t r a sq u e se u n e a otros a c t i v a d o r e s de la va clsica c o m o la prop l e m e n t o parece s e r importante en la defensa precoz contra los m i c r o o r teina C reactiva y el ADN a travs de su regin p a r e c i d a al colgeno. L a sc a d e ganismos patgenos (Pangburn. 1984). Los anticuerpos pueden activar la n a s C1r y C1S se u n e n a la regin similar al colgeno del C1q. Se s a b e que el via pero n o r m a l m e n t e no s o n necesarios. El comienzo de la via alternativa p r i m e rc o m p o n e n t e de la via clsica, el Ciq. se une al d o m i n i o Cy2 de la Ig G o en la superficie de un a c e p t o rd e p e n d e de la capacidad del g r u p o carbonil al d o m i n i o Cu3 de la Ig M. U n av e zu n i d o a la i n m u n o g l o b u l i n a , el C 1 qa d o p t a del grupo tiolster e x p u e s t o del C3b d e interaccionar ya sea con un grupo un c a m b i oc o n f o r m a c i o n a l que conlleva la autoactivacin de las dos c a d e n a s a m i d a o con uno hidroxilo de la protena o del carbohidrato p r e s e n t e en la C1r. S ec r e e que e s t o origina la degradacin de las dos c a d e n a s C1r p a r ac r e a r superficie del objetivo (Law, 1979). La generacin del C3b se consigue por un s i t i oa c t i v o enzimticamente e nc a d ac a d e n a . El C1r a c t i v a d o se e s c i n d e la denominada C3 convertasa de iniciacin. En el suero, el C3 es hidrolie n t o n c e s en d o sc a d e n a s C1s. E s t e C1 "activado" es u n ap r o t e a s a y tiene a d e -zado a un ndice de 0,2% a 0,4% del depsito plasmtico por hora (Pangms, en a l g u n o ss i s t e m a sm o d e l o , actividad estearasa. El C1s aclivado d e g r a - burn, 1981). El C3 con un tiolster hidrolizado sufre un c a m b i o conformada el s i g u i e n t ec o m p o n e n t e de la c a s c a d a , el C4. El f r a g m e n t om a y o r , C4b, se cional que le permite interaccionar con las protenas que n o interaccionan une a la superficie del a c t i v a d o r ,m i e n t r a s que el f r a g m e n t o pequeo, el C4a, es con el C3 nativo y se d e n o m i n a C3(H,0) (tambin lamado iC3). El 03(^0) l i b e r a d o en la f a s e de fluido. El C 4 a es u n a anafilotoxina y se d e s c r i b e en o t r a entonces tiene la capacidad de interaccionar c o n el factor B en p r e s e n c i a seccin de este captulo. El C4b es a l t a m e n t e n t e reactivo qumicamente durande iones magnesio. El factor B. u n av e z unido al C3(H,0), p u e d e interacte u n o sm o m e n t o s despus de la degradacin del C 4yp u e d e unirse a la s u p e r - cionar c o n el factor D y es degradado p a r a generar la convertasa de inificie del a c t i v a d o r .L a unin a la superficie del a c t i v a d o r es r e l a t i v a m e n t e ineficaz. ciacin C3(H;0)Bb y liberar un pequeo fragmento, el Ba. E s t a degradaPor lo tanto, la mayora del C4b g e n e r a d o es hidrolizado y p e r m a n e c e en la fase cin e sm e d i a d ap o r el factor D, u n a proteasa srica q u ea d o p t au n a de fluido. De c u a l q u i e rm a n e r a ,a l g u n a s de las molculas de C4b g e n e r a d a s se configuracin activa una vez reconocido su sustrato y vuelve a u n a conforu n e n a la superficie del a c t i v a d o rc o m o un g r u p oa l r e d e d o r del l u g a r antgenomacin inactiva una vez que se produce la degradacin proteoltica (Volaanticuerpo-Cl. Un lugar s i m p l e antgeno-anticuerpo-C1 p u e d ee n t o n c e sc o n d u nakis, 1996). L a convertasa de iniciacin C 3 degrada el C3 para g e n e r a r cir a la sedimentacin de m u c h a s molculas de C4b. un C3b m e t a e s t a b l e a un ndice c o n s t a n t e m e n t e bajo en la circulacin. El C 3 bm e t a e s t a b l ep u e d e unirse covalentemente a la superficie del activador En p r e s e n c i a de iones magnesio, el C4b acta c o m o un lugar para la unin y entonces, c o m o el C3(H 0). unirse al factor B. Se ha propuesto q u e la yp o s t e r i o r degradacin del C2. El C1s, en asociacin con el C4b. d e g r a d a el presencia de cido silico en las glicoprotenas y glicolpidos asociados a C2 en d o sf r a g m e n t o s . El f r a g m e n t om a y o r . C2a, p e r m a n e c e unido al C4b, la m e m b r a n a previene la formacin de una C3 c o n v e r t a s a de la va alterm i e n t r a s que el pequeo, el C2b. se libera en la f a s e liquida. Esle c o m p l e j o nativa a u m e n t a n d o la afinidad del f a c t o r H (vase despus en Regulacin m o l e c u l a r( C 4 b 2 a ) es i n e s t a b l e y tiene u n av i d am e d i ar e l a t i v a m e n t ec o r t a debide la activacin del complemento) para el C3b (Kazatchkine, 1979). C o m o do a la desintegracin que resulta de la disociacin de C2a en una f o r m a inacen l a C3 convertasa de iniciacin, el factor D degrada al f a c t o rBp a r a tiva. E s t ec o m p l e j o (C4b2a) representa la c o n v e r t a s aC 3 de la va clsica r e q u e generar la C3 convertasa de unin celular C3bBb. Este c o m p l e j o se desinrida p a r a la unin y degradacin del C3. El C2a en el c o m p l e j oC 4 b 2 a es la tegra rpidamente p e r o es estable una vez unido a la properdina. que proe n z i m a que d e g r a d a el C3 en la siguiente e t a p a de la c a s c a d a de activacin y longa la vida m e d i a de la C3 convertasa de u n o a dos minutos a 18 minudel C 5e nu n ae t a p a posterior. E lC 2 ad e g r a d ae lC 3e nu nf r a g m e n t o grande, tos (Fearon, 1975). Esta C3 convertasa estabilizada rpidamente degrada el C3b, que se u n e a la s u p e r f i c i e del a c t i v a d o r , y un f r a g m e n t o pequeo, el ms C3, que p u e d e unirse a la superficie del activador y e n t o n c e s se conC3a. q u e es liberado en la f a s e de fluido y sirve c o m ou n a anafilotoxina. C o m o sidera c o m o la amplificacin de la C3 convertasa de la va alternativa. E s t a en el c a s o del C4. no t o d o el C 3 b se u n e a la superficie del a n t i g e n o objetivo. amplificacin del C3b depositado en la superficie del a c t i v a d o rp e r m i t el a E na l g u n o ss i s t e m a s modelo, a l r e d e d o r del 5 % del C 3a c t i v a d os eu n ea l objeformacin de una C5 convertasa (C3b-BbP) (Kinoshita, 1988) que tiene la tivo. Adems, en a l g u n o sm o d e l o s , un alto p o r c e n t a j e del C3 del objetivo se une
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al a n t i c u e r p o Ig G c u a n d oe s t ai n m u n o g l o b u l i n a es la iniciadora de la activacin de la va clsica del c o m p l e m e n t o (Brown. 1983). El n u e v oc o m p l e j og e n e r a d o (C4b2a3b) r e p r e s e n t a la C5 c o n v e r t a s a de la va clsica y d i s p a r a la s e d i m e n tacin de los c o m p o n e n t e s finales del c o m p l e m e n t o en la superficie diana. La IgM y la IgG difieren en su c a p a c i d a dp a r aa c t i v a r la va clsica del c o m plemento. P a r e c e que una molcula s i m p l es o b r et o d o de a n t i c u e r p o s Ig M unida por mltiples lugares del anticuerpo a un antgeno p u e d e unir una molcula de C 1 y disparar u n as e c u e n c i ac o m p l e t ad e activacin del c o m p l e m e n t o . L a Ig M. con sus c i n c o sitios de unin antignicos, a d o p t au n a conformacin "bsica" en la superficie antignica p a r a permitir mltiples interacciones con los antgenos. En contraste, la unin del C 1 a la Ig G requiere dos molculas d e Ig G una al l a d o de la otra en la mayora de los e s t u d i o se x p e r i m e n t a l e s (Borsos, 1965). Ya q u e los anticuerpos Ig G se u n e nau n a superficie d i a n a de form a aleatoria y ya que los antgenos p u e d e nn o ser distribuidos d ef o r m a unif o r m e en un o r g a n i s m o diana, p u e d e ser n e c e s a r i a la unin de c i e n t o som i l e s de I g Gs para generar un lugar de unin para el C1. La activacin de la va clsica por el c o m p l e j o Ig G-antgeno tambin p a r e c e facilitar la va a l t e r n a t i v a (vase siguiente seccin) sobre la superficie del activador (Moore, 1981).

CAPTULO 38

COMPLEMENTO Y CININAS: MEDIADORES DE LA INFLAMACIN

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embrago, es necesaria la insercin de mltiples copias de C9 a travs de la bicapa lipdica a travs de la interaccin inicial con la c a d e n a a del C8 p a r a producir la c o m p l e t a actividad citoltica del M A C (Plumb. 1998). Se c r e e que el c o m p l e j o C5b-8 sirve c o m o un iniciador para la polimerizacin del C9 en Va de la lectina fijada a maosa la m e m b r a n a celular. El MAC, p o r microscopa electrnica, m u e s t r au n a estructura p a r e c i d a a un cilindro h u e c of o r m a d ap o r el e n s a m b l a j e de sus R e c i e n t e m e n t e se h a descrito una tercera via de activacin del c o m p l e c o m p o n e n t e se n presencia d eu ne x c e s od eC 9 (Podack. 1984). E lm e c a m e n t o que utiliza una proteina srica, presente en alrededor d e1 . 5 ug mi. n i s m o por el que el M A Cr o m p e la m e m b r a n a celular todava es c o n t r o v e r la M B L (tambin lamada lectina unida a maosa o protena fijadora d e tido y p u e d e incluir la distorsin d e la bicapa lipdica p a r af o r m a rp a r c h e s maosa). L aM B L est presente en t o d o s los mamferos y pjaros, y peragujereados" (Esser, 1991) o, ms probablemente, la lormaan de un p o r o t e n e c e a la familia d e molculas lamadas c o l e c t m a s (Turner, 1996: Epst r a n s m e m b r a n a con un c e n t r o hidroflico a travs del que los i o n e sp u e d e n tein, 1996). La familia de las colectinas incluye, adems de la MBL, las prop a s a r libremente (Bhakdi. 1991). L a formacin del M A Ci n d u c e la lisis d e tenas del surfactante p u l m o n a r A y D (SP-A, SP-D), la conglutinina bovina ciertas bacterias y virus, y d e eritrocitos heterlogos. L a mayora d el a s y la CL-43 bovina (Epstein. 1996). La M B L est estructuralmente relacioclulas n u c l e a d a s resisten la citotoxicidad inducida p o r el MAC. E s t a pron a d ac o n el C1q. Su estructura primaria es u n ac a d e n a polipeptidica forteccin, e s p e c i a l m e n t e del a t a q u e del c o m p l e m e n t op o r las protenas del m a d a por un ncleo colgeno y un dominio globular carboxi-termmal (Hanc o m p l e m e n t o propias, es m e d i a d ap o r las molculas reguladores a s o c i a d a s sen, 1998). T r e s de las c a d e n a s se asocian p a r a formar la subunidad de la a la m e m b r a n a que previenen la formacin del M A C (vase despus Regumolcula. En el suero, la M B Ls ee n c u e n t r ac o m o una m e z c l ad e dmeros lacin de la activacin del complemento) asi c o m o por la liberacin de proy hexmeros de su subunidad primaria. L aM B Lr e c o n o c e ciertos carbohitenas del c o m p l e m e n t o activadas p o r la s a n g r ed e la superficie celular. L a d r a t o se x p r e s a d o s en la superficie de los m i c r o o r g a n i s m o s (es decir, no lisis d e las clulas n u c l e a d a sm e d i a d ap o r el M A Cp u e d e ocurrir p e r o r e c o n o c e carbohidratos c o m o la galactosa y el cido silico que son los requiere mltiples lesiones por el M A C para producirse (Koski, 1983). Se na azcares terminales expresados en las glicoproteinas de los mamferos) propuesto que la prdida d e cantidades subliticas d eM A Cp u e d ep r o t e g e r (Epstein. 1996). En orden de importancia, los ligandos de la M B L son: a la clula del consiguiente a t a q u e del c o m p l e m e n t o (Reiter, 1992). L a s maosa, W-acetil-glucosalina, -fucosa, rv-acetil-manosamina y glucosa clulas nucleadas estn protegidas en parte de los efectos del M A C debido (Hansen, 1998). E s t op e r m i t e a la M B L discriminar entre lo propio y lo a la eliminacin a c t i v a de la superficie celular a travs de la reparacin de extrao. Se inform que la M B L reaccionaba con un amplio n u m e r o de bacla m e m b r a n au n i d a al r e c a m b i o lipidico (Mold, 1998). La formacin del M A C terias no c a p s u l a d a sG r a m positivas y G r a m negativas, con virus, levadu- tiene un efecto estimulante s o b r em u c h o s tipos de clulas nucleadas. E n t r e ras, micobactenas. parsitos y protozoos (Epstein, 1996). U n a vez reconootros, estos efectos incluyen la produccin de radicales reactivos del oxgec i d os u carbohidrato ligando, l aM B La d o p t au nc a m b i o conformacional q u e no por los neutrfilos y los macrfagos, la liberacin de ecosanoides por las c o n le v a la activacin d ed o s proteasas sricas asociadas a la MBL, la clulas tagociticas. la induccin de actividad p r o c o a g u l a n t ep o r las plaqueM A S P 1 y la MASP-2 (Thiel, 1997). T a n t o la MASP-1 c o m o la MASP-2 t a s y las clulas endoteliales. la actividad proinflamatoria e n las clulas m u e s t r a n homologa estructural con el C1 r y el Cis, sugiriendo similitudes endoteliales y las clulas del msculo liso, la proliferacin d e clulas del c o n el complejo C1 (C1qrs). U n a vez activada, la MASP-2 degrada el C4 msculo liso y de clulas endoteliales. y la iniciacin de las vias d e transpara generar la C3 convertasa C 4 b 2 a (Vorup-Jensen. 1998). La MASP-1 duccin de seales (Mold. 1998; Sims. 1995: Tudesco. 1997: Benzaquen. tiene la c a p a c i d a d de degradar el C3 (Matsushita. 1998). sugiriendo q u e 1994; Kilgore, 1996; Niculescu. 1999, 1993). e s t op u e d ed e s e n c a d e n a r directamente la activacin de la va alternativa (Schweinle, 1989). Despus de la generacin de la C3 convertasa de la va clsica, l a C4b2a, p o r el complejo MBL-MARSP-1-MASP-2, la activacin Anafilotoxinas del c o m p l e m e n t os ep r o d u c ec o m o en la va clsica con el posible reclutam i e n t o de la va alternativa tambin (Suankratay. 1998). La via de la MBLeL a activacin de la va clsica, alternativa o d e la M B L e c t i n a del c o m p l e citina tambin puede dispararse p o r un complejo antgeno-anticuerpo Se m e n t o origina la generacin de los f r a g m e n t o sp r o t e i c o s de! c o m p l e m e n t o demostr que una fraccin de las molculas de Ig G que c a r e c e n de resique tienen i m p o r t a n t e sp a p e l e s en diferentes f u n c i o n e s biolgicas c o m o la d u o s galactosa terminal (llamados Ig G-GO), tal y c o m o se encuentran en opsonizacin. la fagocitosis, l a inmunomodulacin y l a generacin d er e a c el p l a s m a de pacientes con condiciones patolgicas c o m o la artritis reuc i o n e s inflamatorias. L a opsonizacin, la fagocitosis y la inmunomodulacin m a t o i d e . tienen la c a p a c i d a d de interaccionar c o n la M B L y activar la va d e p e n d e ne ns um a y o rp a n ed e los r e c e p t o r e s del c o m p l e m e n t oe x p r e s a d o s clsica (Malhotra, 1995). La M B Lp u e d e jugar un papel en la eliminacin d e en las diferentes clulas del cuerpo, y se discuten en u n a seccin posterior. o r g a n i s m o s diana por los fagocitos a travs de la interaccin con un recepC o m os e discuti previamente, la activacin del c o m p l e m e n t o origina u n a tor especfico p r e s e n t e en estas clulas (Hansen. 1998: T e n n e r . 1995). L a degradacin proteolitica de m u c h a s protenas del c o m p l e m e n t oc o n la consiregulacin d e la va de la M B L e c i t i n ap a r e c es e rm e d i a d a por el Cl inhibiguiente liberacin en la f a s ed e fluido d e pequeos f r a g m e n t o s que t i e n e n d o r (Matsushita. 1 9 9 6 )yp o r la cx-macroglobulina (Terai. 1995). efectos biolgicos. T r e s de e s t o sf r a g m e n t o s liberados s e la m a n anafilotoxinas. S o n el C4a. el C 3 a y el C5a. L a s caraclerislicas e s t r u c t u r a l e syf u n c i o nales de estas molculas se describen en un m l o r m ee x c e l e n t es o b r e el t e m a (Ember. 1998). El C4a e s un pptido d e 8.7 k D a liberado del C 4 una v e z Componentes finales del complemento d e g r a d a d op o r el Cls . El C 3 a es un f r a g m e n t o peplidico de 9 k D al i b e r a d o d u r a n t e la degradacin proteolitica selectiva de la c a d e n a C3r/ p o r el C 2 a en Las tres vas principales d e activacin del c o m p l e m e n t o convergen en la la va de activacin de la C 3 convertasa clsica y MBLectina. Tambin es libeactivacin del C3 y en el e n s a m b l a j e del c o m p l e j o de a t a q u e a la m e m b r a a d op o r la degradacin proteolitica del C3 p o r el pptido enzimticamente na (MAC), q u e est f o r m a d op o r los c o m p o n e n t e s C5 a C9, U n a vez forma- r activo, Bb, en la via de la C3 c o n v e r t a s a alternativa. El C5a es un pptido d e das las c o n v e r t a s a sd e la via clsica, de la M B L e c i t i n a (C4b2a3b) y de l a 1 1k D a liberado de la c a d e n a a del C5 p o r la degradacin i n d u c i d ap o r el C 2 a alternativa (C3b2Bb). el C5 es degradado. El f r a g m e n t og r a n d e (C5b) pueo n v e r t a s a clsica o M B L e c t i n aop o r el B b (y quizs en la de a s o c i a r s ec o n la m e m b r a n a celular e interaccionar c o n el C6. La siguien- en la va de la C5 c M B L e c t i n a ) en la va de la C5 c o n v e r t a s a alternativa. En general, l a s anafilote e t a p a incluye la interaccin del c o m p l e j o C5b-6 con un fluido fase C7 forloxinas se definen p o r sus e f e c t o s biolgicos s o b r e las clulas del msculo m a n d o un c o m p l e j o trimnco con propiedades anfiflicas (alta afinidad p o r liso, los maslocitos, los pequeos v a s o s sanguneos y los l e u c o c i t o s de s a n los constituyentes lipideos de la m e m b r a n a celular) (Podack, 1979). El C5bgre perifrica. Los e f e c t o s especficos m e d i a d o sp o re s t o s pptidos i n c l u y e n 7s e inserta en la b i c a p a lipdica de la m e m b r a n a celular pero no e s sufie los m a s t o c i t o s y los basfilos c o n la c o n s i g u i e n t e liberac i e n t ep a r aq u eo c u r r a la lisis celular. El C8 se a s o c i ac o ne s t ec o m p l e j o tri- la degranulacin d cin de diferentes m e d i a d o r e sc o m ol ah i s t a m i n a o la s e r o t o m n a . Adems, m o l e c u l a r a travs de la interaccin con el C5b expuesto. El complejo C5b-8 inducen la agregacin neulroflica h u m a n a , la contraccin del msculo liso, el p e n e t r a a travs de la b i c a p a lipdica p a r af o r m a r un pequeo poro transu m e n t o de la permeabilidad vascular, la induccin d e la liberacin d et r o m m e m b r a n ayp u e d e originar la lenta lisis de los eritrocitos (Ramm, 1982). Sin a
L 2 ? :

c a p a c i d a d de disparar la activacin de los c o m p o n e n t e s terminales del sist e m a del c o m p l e m e n t o .

898

SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA

b o x a n o de l o s macrlagos d e l conejilo de Indias, y la estimulacin de la Reguladores del fluido sanguneo secreccin de m o c op o rl a s clulas c a l i c i f o r m e s (Marn, 1985). Un e f e c t o i m p o r t a n t e de las anafilotoxinas sobre los basfilos es originar vasodilatacin El control del p r i m e rc o m p o n e n t e de la via clsica, el C1. est m e d i a d o a travs de la liberacin de histamina, c o n d u c i e n d o a un a u m e n t o del flujo sanpor el C1 inhibidor (C1inh). El Clinh es una protena a l t a m e n t e glicosilada guneo en el l u g a r de la inflamacin. La funcin del C4a g e n e r a l m e n t e es simid e1 0 5k D aq u e tiene l ac a p a c i d a dd e disociar e lC 1a c t i v a d o (Davis. 1989). lar a la del C3a. S i ne m b a r g o , el C 4 a es m u c h om e n o s efectivo en s u se f e c t o s El Clinh inhibe la autoactivacin del C1. la activacin del C1 en el fluido sanbiolgicos s o b r e una b a s em o l e c u l a r . El C5a es sin d u d a la ms p o t e n t e de las guneo, y la activacin del C1 en la s u p e r f i c i e de los a c t i v a d o r e s de la va clanafilotoxinas h u m a n a s .P o r ejemplo, e le f e c t o del C 5 ae s2 0 0v e c e sm a y o r s i c ap e r on oe nl am a y o r i ad e los c o m p l e j o si n m u n e s (Doekes. 1983). E l Clinh q u e el del C 3 ay3 . 0 0 0v e c e sm a y o rq u e el del C 4 a originando la contraccin es un inhibidor sern p r o t e a s a (serpin) que d i s o c i a el c o m p l e j o C1 a c t i v a d o del msculo liso del leon del conejilo de I n d i a sD e b e observarse, sin e m b a r unindose a las subunidades de C 1 ryC 1 s del complejo. M i e n t r a s el C 1 qp e r go, que la relativa efectividad de e s t o s pptidos es t a n t o especfica de tejido m a n e c e en la superficie del activador, el C 1 r y el C 1 ss o nl i b e r a d o s al fluido c o m od e especie. S eh as u g e r i d oq u ee lC 3 ae s efectivo s e l e c t i v a m e n t es o b r es a n g u i n e oe nf o r m ad ed o sc o m p l e j o sd e Ciinh-Clr-Cls-Clmh (Ziccardi. los eosinfilos localizados en los l u g a r e s alrgicos, m i e n t r a s que el C5a tiene 1979). R e c i e n t e m e n t e ,s ep r o p u s oq u ee l Clinh tiene l ac a p a c i d a dd es e p a r a r e f e c t o en m u c h o s otros tipos celulares (DiScipio. 1999). el c o m p l e j o Clqr s e n t e r o de l a si n m u n o g l o b u l i n a sq u et i e n e nu n ab a j a afinid a dp o r el Clq (Chen, 1 9 9 8 b ) o de objetivos sensibilizados c o n dosis b a j a s de Adems de e s t e papel c o m o anafilotoxina. el C5a tiene otras m u c h a s proIg G h u m a n a (Chen. 1998b). In vitro, el Clinh i n a c t i v a la m a n o s a fijadora de p i e d a d e s biolgicas importantes. L a unin del C5a a los neutrlilos origina un lectina a s o c i a d a a sern proteasas (MASP) (Matsushita. 1996). El Clinh t a m a u m e n t o de la adhesin, la agregacin y la induccin de una r e s p u e s t a oxibin inhibe al f a c t o r Xlla y a la calicrena del s i s t e m a de c o n t a c t o .E s t et e m a dativa, y la liberacin de enzimas lisosmicas. Adems, el C5a es fuertemenser tratado en la seccin C i n m a s y el s i s t e m a de generacin de C i n m a s . Intete quimiotctico p a r a los m o n o c i t o s y los neutrfilos. i n d u c i e n d o la migracin r e s a n t e m e n t e , el Clinh demostr interferir con la proliferacin in vitro de los linde las clulas h a c i a la f u e n t e de activacin del c o m p l e m e n t o . De e s t e modo, f o c i t o s T y con el desarrollo de linfocitos T citotxicos b l o q u e a n d o la d e g r a d a una reaccin inflamatoria de activacin del c o m p l e m e n t o local p u e d e por tancin de la (5-microlobulina a desLys" p\-microlobulina p o rl o sl i n f o c i t o sT to i n d u c i r un a u m e n t o del flujo sanguneo al tejido, la a d h e r e n c i a de los neua c t i v a d o s y por el C1r (Nissen. 1998). Sin e m b a r g o , la r e l e v a n c i a in vivo de trfilos al endotelio local, y la migracin directa de los f a g o c i t o s a los lugares estos hallazgos no est an clara. Se h ai n f o r m a d o una proteina de 20 kDa inflamatorios. Los neutrfilos agregados por el C5a pueden embolizar al pulcon actividad inhibitoria sobre la funcin C1. la m a d af a c t o r J (Lopez-Trascasa. mn, originando c a m b i o s en el intercambio g a s e o s op u l m o n a r e incluso la 1989). Se inform que inhiba la formacin del c o m p l e j o C1 (Lopez-Trascasa. m u e r t e . Se c r e e que m u c h a de la inflamacin de los p u l m o n e sc a u s a d a por 1989) y despus a c t u a b a sobre la va alternativa inhibiendo la degradacin del la formacin del c o m p l e j oi n m u n e est m e d i a d a por el C5a (Ward, 1997). En a c t o r B (Gonzlez- Rubio. 1994) L a defensina, pptido-1 neulrofliu nm o d e l oe x p e r i m e n t a ld e sepsis e n ratas, s eh ad e m o s t r a d or e c i e n t e m e n t e C3 por el f co h u m a n o (HNP-1 ). tambin p u e d e inhibir al C1 en los lugares de inflamacin. que el C5a p u e d eb l o q u e a r las funciones b a c t e r i c i d a s de los neulrfilos si se Se demostr que se una al C1q en el fluido sanguneo y b l o q u e a b a la a c t i v a p r o d u c e en c a n t i d a d e s suficientes, sugiriendo un papel p a r a la activacin del cin del c o m p l e m e n t o mediada por la via clsica (van d e n Berg. 1998). c o m p l e m e n t o en los a l t o s ndices de m o r t a l i d a do b s e r v a d o s en l a sepsis (Czermak. 1999). La a c t i v i d a d del C 4 b es r e g u l a d ap o r el f a c t o rI( a n t e sd e n o m i n a d oi n a c t i v a Los e f e c t o s biolgicos de las anafilotoxinas estn m e d i a d o s por los r e c e p d o r del C3b'4b) (Fries. 1987). El f a c t o rId e g r a d a la c a d e n a a del C 4 bp a r a tores especficos e x p r e s a d o s por los dilerentes tipos celulares. E s t o sr e c e p g e n e r a rd o s Iragmentos. el C 4 c y el C4d; el ltimo f r a g m e n t op e r m a n e c eu n i d o tores se d e s c r i b e n en la seccin de los r e c e p t o r e s del c o m p l e m e n t o . a la clula. P a r a la protehsis se n e c e s i t a un cofactor. la protena fijadora de C4 (C4BP). El C 4 B P es una proteina de 570 kDa que tambin p u e d e unirse al C4b unido a partculas y sanguneo, y desplazar al C2a de la via clsica de la C3 Regulacin de la activacin del complemento c o n v e r t a s a C4bza (Gilgli, 1979). Adems, el C 4 B Pc i r c u l a en asociacin con a p r o x i m a d a m e n t ee l6 0 %d el ap r o t e i n aS ,u nc o f a c t o rd e p e n d i e n t ed el a vitaLos graves e f e c t o s de la activacin del c o m p l e m e n t op a r a inducir el dao i n aKp a r a la proteina C m e d i a n d o la degradacin de los f a c t o r e s de la c o a tisular requieren mecanismos de control internos para: (1) limitar la inflama- m gulacin Va y Villa. E s t a asociacin inhibe la actividad del c o f a c t o r de la proteicin diseminada cercana, (2) evitar una excesiva activacin, y (3) proteger las na S (Dahlbck, 1986) y p a r e c e inhibir la activacin del f a c t o r X a travs de las clulas husped de la lesin inadvertida. Se ha implicado un potente sistema i n t e r a c c i o n e s del C 4 B Pt a n t o con la protena S c o m o con el f a c t o r VIII ( K o p p e l de regulacin p a r ac o n t r o l a r la activacin del c o m p l e m e n t o en cualquier etaman. 1995). U n a protena de 120 kDa con s i m i l i t u d e se s t r u c t u r a l e s con el C2 pa de la c a s c a d a de la activacin. Asi existen protenas sanguneas o asop e r of u n c i o n a l m e n t e distinta del C2 f u e aislada, y p u e d et e n e ra c t i v i d a dr e g u l a c i a d a sam e m b r a n a que desarrollan una accin reguladora en la activacin d o r as o b r e el s i s t e m a del c o m p l e m e n t o unindose al C4b ( H a m m e r , 1989). del c o m p l e m e n t o( T a b l a 38-2).
?

Tabla 38-2 Protenas reguladoras del complemento Protenas Fases del fluido Cl inhibidor Factor H Protena fijada a C4 Protena S (vilronectina) Clusterin Factor J Clula asociada CR1 DAF (CD55) MCP (CD46) CD59 (protectina) HRF
Isoterma ms frecuente del CRI CRU receplor del complemento tipo 1. DAF= factor acelerador de la degradacin, MCP= proteina cofactor de membrana. HRF= tactor de restriccin homologo

Peso molecular (kDa) 105 150 550 84 70 20

Objetivo C1 C3b C4 C5b-7 C5b-7 C1. C3. B

Mecanismo de accin Disocia el complejo C1 unindose al C1r y C1s Colador para la inactivacin del C3b por el (actor I Cofactor para la inactivacin del C4b por el factor I Inhibe la insercin del MAC en las membranas celulares Inhibe la insercin del MAC en las membranas celulares Inhibe la formacin del complejo C1 inhibe la degradacin de C3 por el Bb Disociacin de las C3/C5 convertasas cofactor par la inactivacin del C3b y el C4b por el factor I Disociacin de las convertasas C3/C5 Cofactor para la inactivacin del C3b por el factor I Inhibicin de la formacin del MAC Inhibicin de la formacin del MAC

190" 70 45-70 18-20 65

C3b. C4b C3bBb. C4b?a C3b (C4b) C8, C9 C8, C9

CAPITULO 38

COMPLEMENTO Y CININAS: MEDIADORES DE LA INFLAMACIN

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Debido a su papel crucial en las tres vas de activacin del complemento, el C3 est bajo un control rgido. El C3b sanguneo y el C3(H 0) son rpidamente inactivados por el factor I que degrada los tres pptidos unidos de la cadena a' del C3b (Davis. 1982]. generando entonces una lorma inactiva de la molcula, la iC3b. que es incapaz de atraer al C5 o al factor B. Esta degradacin mediada por el factor I requiere al tactor H como cofactor. El factor H es una protena de 150 kDa que se une al C3b y tienen actividad aceleradora de la desintegracin a travs de la va alternativa de la C3 convertasa adems de su actividad de cofactor para la degradacin del C3b mediada por el factor I. Adems de regular al C3b en el fluido sanguineo, el factor H se une al C3b unido a la clula y dispara la degradacin por el factor I. limitando asi la activacin por la va clsica (Ollert. 1995). Una vez que el C3b es degradado en iC3b. que permanece unido a la superficie del objetivo, puede nteraccionar con el receptor del complemento tipo 3 (CR3) presente en las clulas fagocticas y promover la fagocitosis (vase despus en Receptores del complemento).
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tambin tiene la capacidad de servir como colador para la degradacin mediada por el factor I de iC3b en fragmentos pequeos (Mitomo. 1987). El control del C4b y C3b depositado en la membrana celular se lleva acabo posteriormente por la proteina cofadora de membrana MCP, CD46). Esta protena es expresada en casi todas las clulas, con la importante excepcin de los eritrocitos. Sirve como cofactor para la degradacin del C4b y el C3b en C4c y C4d. e iC3b. respedivamente. mediada por el factor I (Seya. 1986. 1989) pero es incapaz de promover la posterior degradacin del iC3b Se inform que el MCP protege a la clula de la activacin de la va alternativa ms eficazmente que de la activacin de la va clsica (Kojima, 1993). Se ha sugerido que esta protena de 50 a 58 kDa juega un papel significativo en prevenir el dao celular mediado por el complemento en aquellas clulas en las que se expresa (Liszweski, 1992). A diferencia del DAF. no protege a las clulas vecinas (vieintra). Otra proteina asociada a la membrana celular que controla la activacin del complemento a nivel de las C3 y C5 convertasas es el tactor acelerador de la eliminacin (DAF. CD55). El DAF es expresado por todas las clulas de la circulacin, las clulas endoteliales y un nmero de clulas epiteliales iMorgan. 1994b). Esta protena de 70 kDa lunciona. como su nombre implica, acelerando la eliminacin de las C3 y C5 convertasas tanto de la via clsica como de la alternativa. Interesantemente, tiene una mejor capacidad de afectar a la C3 convertasa de la va clsica que a su contrapartida de la va alternativa (Nicholson-Weller. 1982). El DAF media la disociacin del C2a y el Bb de las C3 convertasas (Fujita. 1987). a diferencia del factor H y CR1. que tienen la capacidad de bloquear la unin de C2 a C4b o del factor B a C3b. El DAF est unido a la membrana celular por un enlace glicosil fosfatidilinositol ms que por un dominio hidrofbico transmembrana, que ofrece a la molcula una gran mobilidad y presumiblemente una mejor eficacia como inhibidor del complemento (Davitz. 1987). Notablemente, el DAF no tiene actividad cofadora para la degradacin del C3b y C4b mediada por el fador I. El control de los componentes finales del complemento en la superficie celular se lleva a cabo por dos protenas unidas al glicosil fosfatidilinositol. llamadas factores de restriccin homlogos (HRF) o proteina fijadora de C8 y CD59 (tambin llamado proleclina. HRF-20. inhibidor de membrana de la lisis reactiva y P-18). El HRF es una proteina de 65 kDa expresada en los eritro citos. las plaquetas, los linfocitos T, los linfocitos B. los neulrfilos y los monocitos (Morgan. 1994b). El HRF funciona unindose al C8. inhibiendo la polimerizacin del C9 (Morgan, 1994b). Otra protena que inhibe el complejo de ataque a la membrana es el CD59, El CD59 es una protena de 20 kDa que se encuentra en una amplia variedad de clulas incluyendo todas las clulas circulantes, las clulas endoteliales, las clulas epiteliales, los espermatozoides, los podocitos glomerulares. numerosas lneas celulares (Morgan. 1994b) e incluso las clulas del cerebro (Morgan. 1996). Se demostr que se una tanto a la cadena |i del C8 como al domino b de la del C9 (Chang. 1994). Inhibe la formacin del MAC sobre las clulas husped y acta de un modo intrnseco, esto es, proteger a la clula sobre la que se expresa. El DAF, HRF y CD59 estn ausentes en las clulas de los pacientes con hemoglobinuria paroxstica nocturna (HPN). debido a la unin de su glicosil fosfatidilinositol a la membrana celular (Volanakis. 1998).

Hay un nmero de inhibidores sanguneos de los componentes terminales del complemento que previenen la insercin del complejo de ataque a la membrana en las membranas celulares. La protena S [S-protein). tambin llamada vitronectina, se une al complejo C5b-7. previniendo as su insercin en la membrana celular (Podack. 1977) e inhibiendo la polimerizacin del C9 (Johnson, 1994). Recientemente, se ha publicado que la protena S se une al C5b y al C8 en el complejo C5b-9 (Su, 1996) y se une al receptor de la cabeza globular del Clq (Ljm, 1996). Aunque el papel exacto de la proteina S en la regulacin de la activacin del complemento in vivo es incierta. Peake y col. mostraron que la proteina S forma un complejo con el sC5b-9 cuando el complemento es activado en conejos y que este complejo todava tiene la capacidad de bloquear la lisis mediada por el C9 de los eritrocitos de oveja sensibilizados llevando los componentes 1 al 7 del complemento (Peake. 1996). Clusterin (tambin llamado Sp-40.40 o apolipoprotena J) es otro inhibidor sanguineo de los componentes finales del complemento. Como la vitronectina. clusterin previene la insercin del complejo C5b-7 en la membrana celular (Choi, 1989) y regula el complejo de ataque a la membrana en los niveles C5b-7 y C9 (Berge. 1997). Todava se desconoce el papel in vivo del clusterin. aunque recientemente se public que el clusterin se deposita en las lesiones cerebrales de los pacientes con enfermedad de Alzheimer iVerbeek. 1998). Tambin, se ha publicado recientemente una asociacin significativa entre los niveles bajos de clusterin y algunos signos clnicos del lupus eritematoso sistmico (LES), sugiriendo un control insuficiente de la inflamacin mediada por anticuerpos (Newkirk, 1999).

Protenas reguladoras asociadas a las clulas


Adems de estar regulado en la lase liquida, la activacin del complemento tambin est regulada en la superficie de muchos tipos celulares para limitar la lesin inadvetida a las clulas husped. Algunas de estas protenas no solo se unen a las protenas del complemento sino que actan como receptores. Una de estas protenas es el receptor del complemento tipo 1 (CR1). La estructura del CR1 se describe con ms detalle en la seccin Receptores del complemento. La funcin del CR1 es unirse al C4b y C3b activado y servir como cofactor para la degradacin mediada por el (actor I de estos componentes en sus productos de degradacin inactivos. Adems de servir como colador para la degradacin mediada por el factor I del C3b en iC3b. el CR1 tambin promueve la degradacin posterior del iC3b por el factor I en C3dg. El C3dg puede ser degradado posteriormente en C3d por varias enzimas como la elastasa, la tripsina y la plasmina (Davis, 1984; Ross, 1982). El CR1 tambin tiene una actividad aceleradora de la desintegracin hacia las convertasas C3 y C5 de la va alternativa y la clsica de la activacin del complemento. Al unirse a C4b o C3b. el CR1 tambin desplaza al C2a (va clsica) o al Bb (va alternativa), acelerando entonces la eliminacin de las C3 convertasas. Interesantemente, el CR1 promueve la eliminacin acelerada de la C3 convertasa unida a la superficie de la va alternativa mucho ms eficientemente que de la va clsica (Ross. 1982; Nicholson-Weller, 1982). Debido a que se expresa en los eritrocitos, ms que sobre otros tipos celulares, el CR1 ayuda al trasporte de los complejos inmunes que llevan el C3b a los lugares de degradacin de las clulas de Kupffer del hgado (Cornacoff, 1988). Parece que otro receptor del complemento, el CR2,

Receptores del complemento


Los receptores que se unen a los componentes adivados del complemento han sido descritos en vanos tipos celulares Estos receptores controlan los efectos biolgicos de los pptidos de activacin del complemento y estn unidos a muchas otras funciones celulares (Tabla 38-3). Esto ser descrito para cada receptor del complemento. Los receptores del complemento que han sido mejor estudiados son aquellos que se unen a los fragmentos de degradacin del C3. El receptor del complemento tipo 1 (CR1. CD35, receptor de C3b'C4b) es una glicoprotena de cadena simple de 190 kDa (isoforma ms frecuente). En humanos, se expresa en eritrocitos, fagocitos mononucleares. eosinfilos. linfocitos B, un subgrupo de linfocitos T, podocitos glomerulares, clulas dendrticas foliculares (Ahearn. 1998) y astrocitos (Morgan, 1996). Este receptor del complemento se une tanto al C3b como al C4b. y. en menor medida, al iC3b. Se inform recientemente que el CR1 se una tambin al Clq (Klickstein. 1997). Existen cuatro formas allicas diferentes del CRl que difieren en tama-

900 Tabla 38-3 Receptor CR1 CR2 CR3 CR4 C1qRp' C3aR C5aR

SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA

Receptores celulares para los f r a g m e n t o s proteicos d e l c o m p l e m e n t o Peso molecular (kDa) 190 (isoforma ms frecuente) 140 165 (cadena u) 95 (cadena (5) 150 (cadena a) 95 (cadena |5) 126 48 43 Ligando C3b, C4b. iC3b C3d. C3dg, iC3b iC3b C3d. C3b iC3b. C3b C1q. MBL. SP-A C3a C5a C5a desArg Papel fisiolgico Fagocitosis, aclaramiento del complejo inmune Activacin de las clulas B Fagocitosis, adhesin celular Adhesin celular Fagocitosis Quimiotaxis, degranulacin de los mastocitos del suero, aumento de la permeabilidad vascular Quimiotaxis. degranulacin de los mastocitos del suero. aumento de la permeabilidad vascular

' Tambin han sido descritos otros receptores del Ctq. CR1 = receptor del complemento tipo 1; CR2 = receptor del complemento tipo 2, CR3 = receptor del complemento tipo3 CR4 = receptor del complemento Upo 4; C1qRp = receptor para la regin del colgeno del Ctq; C3aR = receptor de C3a; C5aR = receptor de C5a; MBL = maosa fijadora de lectma: SP-A = proteina surfactante A; C5a desArg = prdida del residuo argiruna terminal del C5a tras la inactivacin por la carboxipeptidasa-N.

o y nmero de lugares de unin. La forma allica ms frecuente (llamada alotipo A o F) est formada por 30 unidades repetidas de 60 a 70 aminocidos, la mayora de las cuales estn altamente conservadas. Estas unidades repetidas son llamadas repeticiones consensuadas cortas (SCR). De estos 30 SCR, 28 estn agrupados en cuatro parejas de repeticin de siete SCR cada uno. Esas parejas repetidas se denominan repeticiones homologas largas (LHR). Como se seal en la seccin Regulacin de la activacin del complemento, el CR1 sirve como cofactor para la degradacin del C3b mediada por el factor I, el iC3b y el C4b y tiene actividad aceleradora de la eliminacin tanto sobre la via de la C3 y C5 convertasa clsica y alternativa. Un papel fisiolgico ms importante del CR1 est relacionado con la fagocitosis de las partculas envueltas por el complemento (partculas opsonizadas). El CR1 puede aumentar la unin de las partculas envueltas con Ig G y C3b o iC3b a los monocitos o los neutrfilos, aumentando entonces la eficacia de la fagocitosis mediada por el receptor Ig G-Fc (Wright. 1985; Sengelov. 1995). El CR1 tambin puede disparar la fagocitosis de los objetivos envueltos por el C3b en ausencia de IgG en los macrlagos activados por varios estimuladores como la libronectma. el acetato forfol mirislato. el interfern-y y la anafilotoxina C5a. El CR1 sobre los eritrocitos regula la funcin C3b sirviendo como cofactor para la degradacin del C3b mediada por el factor I y aumentando la eliminacin de C3 convertasas. Se cree que el CR1 eritrocitario tiene un papel importante en secuestrar el C3b y el complejo inmune relacionado con iC3b. sacndolos del plasma y facilitando su transferencia a los lugares de degradacin en el higado y en el bazo (Birmingham. 1995). Recientemente se propuso que la captacin dependiente del CR1 de los complejos inmunes por los eritrocitos de la circulacin puede servir como mecanismo de inhibicin de la activacin excesiva de las clulas fagocticas o las clulas B (Nielsen, 1997). El CR1 tambin es expresado en las clulas B humanas y en las clulas dendrticas foliculares del bazo y puede tener un efecto inmunorregulador en estas clulas. Este tema se analiza con ms detalle despus, en la seccin Complemento e inmunidad adquirida. Un receptor para el fragmento C3d del C3 se encuentra en las clulas humanas |i las lineas celulares B, las clulas dendriticas foliculares, algunas clulas T perifricas, algunas lineas celulares T, timocitos (Ahearn. 1998) y astrocitos (Morgan, 1996), y es denominado CR2 (CD21). El CR2 es una glicoproteina transmembrana tipo I, de 1 4 0 kDa, que sirve como receptor para el C3d. el C3dg, y se une dbilmente al iC3b. El CR2 tiene la capacidad de servir como cofactor para la degradacin de iC3b unido a los objetivos mediada por el factor I (Mitomo. 1987). El CR2 tambin es el receptor o sitio de unin a travs del cual el virus de Epstein-Barr entra en las clulas B, en la sangre, modalidad independiente del complemento, para causar la mononucleosis infecciosa (Fingeroth. 1984). Se cree que la principal funcin del CR2 es la regulacin de la respuesta inmune de las clulas B ante el antigeno (Carroll, 1998b). Este tema se discute con ms detalle despus, en la seccin Complemento e inmunidad adquirida. Un tercer receptor del complemento, el CR3 (tambin denominado Mac-1, Cd11b'CDi8) es un miembro de la familia de molculas de sdhesin de la |3
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integnna leucoctica. Est formada por dos cadenas polipeptidicas con pesos moleculares de 165 kDa (cadena a) y de 95 kDa (cadena |i) (Ahearn, 1998). Otros dos miembros de la familia de molculas de adhesin de la |i, integrina (LFA-1 y CR4) comparten la misma cadena p* con el CR3. El CR3 se expresa en los fagocitos mononucleares, granulocitos y clulas asesinas naturales (NK) (Ahearn. 1998), y en las clulas microgliales (Morgan. 1996). El CR3 se une al iC3b, y al C3b y el C3d pero con menor afinidad (Brown. 1991). En las clulas fagocticas, el CR3 dispara el proceso fagocitico de un modo paralelo al CR1. El CR3 aumenta la ingesta de partculas recubiertas con Ig G y C3 (Sengelov, 1995; Gaither, 1987). Otro papel importante del CR3 es la adhesin de los monocitos y los neutrfilos a las clulas endoteliales a travs de la interaccin con su contraligando, molcula de adhesin intracelular tipo 1 (ICAM-1). Esto permite la acumulacin de los fagocitos en los lugares de dao tisular donde las clulas endoteliales son activadas. El receptor del complemento tipo 4 (CR4. CD11c/CD18) es una glicoprotena que comparte caractersticas con el CR3. Tambin es un miembro de la familia de molculas de adhesin de las miegrinas con una nica cadena a de 150 kDa. Se expresa en las clulas mieloides. clulas dendriticas. clulas NK. clulas B activadas, algunas clulas T activadas, plaquetas (Ahearn. 1998). y clulas microgliales (Morgan, 1996). El CR4 se une al iC3b. y al C3b en m e n o r medida (Brown, 1991). Sin embargo, el papel exacto del CR4 en trminos de activacin del complemento es desconocido y, como esta glicoprotena es una molcula de adhesin, puede servir para ayudar" a la adhesin de los neutrfilos al endotelio durante el proceso inflamatorio (Sengelov, 1995). Se han descrito varias molculas de superficie celular con actividad receptora para el Clq. Son receptores (ClqR.. C1qRJ, modificadores de la respuesta (gC1qR. proteoglicano condroitin sulfato derivado de las clulas B). y protenas de unin (CR1, cClqR) (Tenner, 1998). El CiqR es una glicoprotena de 126 kDa expresada en las clulas de origen mieloide. en las clulas endoteliales, en las plaquetas y en las clulas microgliales (Nepomucenc, 1998). Se ha mostrado que se une a la regin tipo colgeno del C1q (tenner,1998) y a las colectinas MBL y SP-A (Hansen. 1998). Se demostr que este receptor aumenta la fagocitosis de partculas subptimamente recubiertas con complemento o Ig G mediada por el CR1 y por el receptor Fe. Un segundo receptor, todava pobremente caracterizado, es denominado C1qR , se une al C1q e inicia la generacin de radicales txicos del oxgeno por los neutrfilos, los eosinfilos y las clulas del msculo liso vascular (Tenner. 1998). El receptor para las cabezas globulares del Clq (gCiqR) es una proteina de 33 kDa expresada en las clulas B, en los fagocitos mononucleares, en los neutrfilos, en las plaquetas y en las clulas endoteliales. Se ha informado que induce la quimiotaxis de neutrfilos humanos (Nepomuceno, 1998). Tambin se ha informado que otra molcula de superficie celular se une a la regin tipo colgeno del C1q (cClqR). Esta protena de 56 kDa se expresa en una variedad de clulas, se une la Clq, a la MBL y a la SP-A (Hansen, 1998) y tiene homologa con la calreticulma. Puede inducir la fagocitosis de los objetivos recubiertos con Clq asi como mediar la citotoxicidad, la produccin de anticuerpos y la secrecin de citocinas. El papel del CR1 una
3 o2

CAPITUIO 38

COMPLEMENTO Y CININAS: MEDIADORES DE LA INFLAMACIN

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v e zu n i d oa lC 1 qe st o t a l m e n t e desconocido. E si m p o r t a n t e realzar q u ee l zados por los h e p a t o c i t o s o por las clulas extraheplicas a m e n u d or e q u i e r e papel e x a c t o que juegan in vivo estas protenas unidas al C1 q asociadas a las un estmulo g e n e r a d o en las r e s p u e s t a s inflamatorias c o m o la interleucina-lu, clulas sigue e s t a n d op o c o claro. la i n t e r l e u c m a 6 o el interfern-y. En oirs o b r a s se p u e d e ver u n am e j o r desC o m o se trat a n t e r i o r m e n t e en la seccin Anafilotoxinas, los f r a g m e n t o s pepcripcin de la regulacin de la sntesis de las protenas del c o m p l e m e n t op o r las tdcos pequeos l i b e r a d o st r a s la degradacin p r o t e o l i t i c a del C4. C3 y C5 t i e d i f e r e n t e s clulas (Collen. 1998) I n t e r e s a n t e m e n t e los d a t o s del h i g a d o y la n e np r o f u n d o se f e c t o se nl ar e s p u e s t a inflamatoria. E s t oi n c l u y ee la u m e n t od e mdula sea h u m a n a (Naughton. 1996) y el t r a s p l a n t er e n a l( T a n g , 1999) la p e r m e a b i l i d a dv a s c u l a r , la degranulacin de los m a s t o c i t o s y la induccin de d e m o s t r a r o n que. a u n q u e el higado es el l u g a r ms i m p o r t a n t e de la sntesis del l aq u i m i o t a x i s .E lr e c e p t o r del C 3 ah u m a n o( C 3 a R )h as i d oc l o n a d or e c i e n t e c o m p l e m e n t o , los l u g a r e s extrahepticos p u e d e nc o n t r i b u i r a ios n i v e l e s de los m e n t e . Es una proteina t r a n s m e m b r a n au n i d a a la protena G. de c a d e n a nica c o m p o n e n t e s del c o m p l e m e n t oe ne lp l a s m a . d e4 8k D a( E m b e r , 1998). E lC 3 a Rs ee x p r e s ae n las p l a q u e t a s del conejilo d e Indias, en los m a s t o c i t o s de rata, en los macrfagos alveolares h u m a n o s , en los neutrfilos. en los basfilos y en los eosinfilos (Ember, 1998). Recientemente, Gentica del complemento se ha d e m o s t r a d oq u e se e x p r e s a n en las clulas B de las amgdalas h u m a n a s M u c h o s de los g e n e s que c o d i f i c a n las protenas, los r e c e p t o r e s y las mol(Fisher, 1997) y en varias clulas del c e r e b r oh u m a n oi n f l a m a d o (Gasque. 1998). c u l a s regul a doras del c o m p l e m e n t o h a n s i d o c l o n a d o s y se l e s ha a s i g n a d o S eh ai n f o r m a d oq u ee lC 3 au n i d oas ur e c e p t o r origina q u i m i o t a x i s eosinofilica: u n a localizacin cromosmica ( T a b l a 38-1). I n t e r e s a n t e m e n t e ,e x i s t eu n a la degranulacin de los eosinfilos. los m a s t o c i t o s y las plaquetas: la adheson unin para un nmero de genes que codifican las molculas r e l a c i o n a d a s con de los eosinfilos y las plaquetas; y la supresin de las f u n c i o n e s de las cluo m p l e m e n t o .E s t o s grupos de unin i n c l u y e n los g e n e s del M H Cc l a s e III las B a m i g d a l a r e si n c l u y e n d o la produccin de inmunoglobulinas. D e b i d o a las el c (C2. f a c t o r B y C4), los g e n e s de los r e g u l a d o r e s de la activacin del c o m p l e s i m i l i t u d e se s t r u c t u r a l e se n t r e el C3 y el C4, se pens que el C4a era c a p a z de m e n t o (protena fijadora de C4. CR1. CR2, DAF, MCP y f a c t o r H). y los g e n e s i n t e r a c c i o n a rc o n el C3aR. S i ne m b a r g o ,p a r e c eq u e no es as y el C 4 ah u m a n o o m p l e j o de a t a q u e a la m e m b r a n a (C6. C7 y C9) (Schnein op u e d ei n t e r a c c i o n a rc o ne lC 3 a Rh u m a n o( A m e s . 1997). a u n q u ep a r e c eq u e de las protenas del c der, 1999). Las molculas de c a d a uno de e s t o st r e sg r u p o sm u e s t r a nh o m o i n t e r a c c i o n ac o ne lC 3 a R del conejilo d eI n d i a s (Lienenklaus. 1998). logia estructural, lo que sugiriere que las protenas del c o m p l e m e n t op u e d e n U nr e c e p t o rp a r a la a n a l i l o t o x m a C5a (C5aR) se e x p r e s a en los neutrfilos. derivar de una duplicacin gentica de un nmero limitado de g e n e s ancestralos m o n o c i t o s , los basfilos, los eosinfilos, las plaquetas, los m a s t o c i t o s , las les. Es de inters que e x i s t e n dos g e n e sp a r a el C4. Originan dos isolipos de clulas del parnquima heptico, las clulas del msculo liso v a s c u l a r del pulC4 la m a d o sC 4 A y C4B, los c u a l e ss o np r o d u c i d o sc o nf r e c u e n c i a (O'Neill. mn, las clulas endoteliales vasculares del pulmn y umbilicales, las clulas 1978a: A w d e h , 1980). E s t o s dos p r o d u c t o s gnicos difieren f u n c i o n a i m e n t ey epiteliales bronquiales y alveolares, l o s astrocitos, las clulas microgliales tienen diferente eficacia hemolitica. Una vez e x p u e s t o s al g r u p o tolster de la ( E m b e r . 1998) y las clulas T h u m a n a s (Nataf. 1999). El C 5 a R es una protemolcula. C4A f o r m a un e n l a c ea m i d a con un a c e p t o r de la molcula en su na t r a n s m e m b r a n aa s o c i a d a la proteina G de 43 k D a El C 5 au n i d o al C 5 a R microambiente. m i e n t r a s que la f o r m a C4B f o r m a un e n l a c e ster. Adems, s e i n d u c e una a m p l i a variedad de e f e c t o sd e p e n d i e n d o del tipo de clula diana. descubri que el C4A se une al CR1 con m a y o r afinidad que el C4B (Reily. E s t o s incluyen las quimiotaxis de neutrfilos. eosinfilos. basfilos y fagocitos 1997). Tambin t o d a s las protenas r e l a c i o n a d a s con el c o m p l e m e n t om u e s m o n o n u c l e a r e s ; la degranulacin de los m a s t o c i t o s de las serosas; la protran p o l i m o r f i s m o (es decir, existen mltiples alelos con variables f r e c u e n c i a s duccin de r a d i c a l e s del oxigeno: facilitar la adhesin celular; y la produccin en humanos). El c o m p o n e n t e ms polimrfico del c o m p l e m e n t o es el C4, c o n d el e u c o t r i e n o syp r o s t a g l a n d i n a s en l o s neutrfilos y l o s eosinfilos. E n ms de 35 alelos identificados (Schneider. 1997). L a degradacin de los I t a g varios e s t u d i o s el C5a tambin demostr i n d u c i r la produccin de protenas m e n t o s del C4A y C4B y su unin a los e r i t r o c i t o s origina a los a n t i g e n o sd e de fase aguda, citocinas y anticuerpos ( E m b e r , 1998). g r u p o sanguneo R o d g e r d s y Chido. r e s p e c t i v a m e n t e (O'Neill. 1978b). L a s L o sr e c e p t o r e s de los factores H y B se h a n descrito en m u c h o s tipos de v a r i a c i o n e s allicas del f a c t o ra c e l e r a d o r de la degradacin (DAF) o r i g i n a n el l e u c o c i t o s y estn descritos en otras obras (Fres. 1987). Sin embargo, el sigs i s t e m a de g r u p o sanguneo C r o m e r con el fenotipo I n a b que c a r e c e de DAF. nificado fisiolgico de estos receptores todava no est claro. Las m u t a c i o n e s puntuales, l a si n s e r c i o n e sol a sd e l e c i o n e s de l o s cidos n u c l e i c o sn o r m a l m e n t e van u n i d a s con d e f e c t o s de las protenas del c o m p l e m e n t o (Schneider, 1997). C o m o se d i s c u t e despus en la seccin D e f e c t o s Biosintesis del complemento genticos del c o m p l e m e n t o ,e s t a s son n o r m a l m e n t ep o c of r e c u e n t e se n t r e la poblacin. El p o l i m o r f i s m o de l a s protenas del c o m p l e m e n t o se evala t a n t o S ec a l c u l aq u ee l9 0 %d e los c o m p o n e n t e s del c o m p l e m e n t o del p l a s m as o n p o r los anlisis f e n o t i p i c o sc o m op o r los genotipicos. Los d e t a le s de e s t o s s i n t e t i z a d o s en el hgado y son protenas de f a s ea g u d a (es decir, su sntesis mtodos no sern di s cuti d os en e s t e captulo y el l e ctor es r e m i t i d o al Capi t up o re lh i g a d oa u m e n t ae nl ar e s p u e s t a inflamatoria p a r aa u m e n t a r los n i v e l e s lo 41 y o t r o s captulos s o b r e el t e m a (Schneider. 1997; M a u f f . 1997). del plasma). El h e p a t o c i t op r o d u c e la gran mayora de los c o m p o n e n t e s del c o m p l e m e n t o , con la excepcin del C1q. el f a c t o r D, la p r o p e r d i n a y el C7 ( M o r gan, 1997a). El C1q p a r e c e que es s i n t e t i z a d o por las clulas epiteliales, l o s m o n o c i t o s 'macrfagos y los fibroblastos. El principal p r o d u c t o r de f a c t o r D es el adiposito. La p r o p e r d i n a es sintetizada m a y o n t a r i a m e n t ep o rl o sm o n o c i t o sy los macrfagos o c u r r i e n d oa l g o de la sntesis en los l i n f o c i t o s y en los granulootos. L a mayora del C7 del p l a s m a tambin p a r e c e originarse por los m o n o c i t o syl o s macrfagos. a u n q u el o sl e u c o c i t o sp o l i m o r f o n u c l e a r e sp a r e c e que a l m a c e n a n C7. Es de inters que m u c h o s otros tipos celulares han sido descritos c o m os i n t e t i z a d o r e s de los c o m p o n e n t e s del c o m p l e m e n t o in vitro. Se ha p u b l i c a d o una e x h a u s t i v a lista de clulas que p r o d u c e nc o m p o n e n t e s del c o m p l e m e n t o (Morgan, 1 9 9 7 a ) .B r e v e m e n t e , se ha i n f o r m a d oq u el o s linfocitos B y T, los m o n o c i t o s , las plaquetas, los neutrfilos. los macrfagos. los fibroblastos, las clulas endoteliales. las clulas epiteliales, los queratinootos. los m i o b l a s tos. las clulas del msculo liso, los a d i p o c i t o s y las clulas de la sinovial. cereb r oyt r a c t o genital sintetizan u n o o ms c o m p o n e n t e s del c o m p l e m e n t o .I n t e r e s a n t e m e n t e , los m o n o c i t o s . los macrfagos. las clulas del tejido sinovial y los a s t r o c i t o s del c e r e b r ot i e n e nl ac a p a c i d a dd es i n t e t i z a rt o d o sl o sc o m p o n e n t e s de las vas clsica y alternativa. E s t op u e d et e n e ri m p o r t a n t e si m p l i c a c i o n e s en la inflamacin especifica de tejido, d o n d ed e b ee s t a rp r e s e n t e un m e c a n i s m o l o c a l i z a d o de d e f e n s a del husped para eliminar las partculas extraas eficazm e n t e . La produccin de c o m p o n e n t e s del c o m p l e m e n t on o r m a l m e n t e sinteti-

Complemento e inmunidad adquirida Est q u e d a n d o claro q u e el s i s t e m a del c o m p l e m e n t oj u e g a un p a p e l i m p o r t a n t ee ne le s t a b l e c i m i e n t od e las r e s p u e s t a si n m u n e s adquiridas. L a depresin de las r e s p u e s t a s de a n t i c u e r p o s a la estimulacin anlignica se demostr en a n i m a l e s deplecionados transitoriamente de C3 (Pepys, 1974), en a n i m a l e s con d e f e c t o s genticos en el C2. C 4 o C3 (Btger, 1985; Ochs, 1983; O'Neil, 1988), y en p a c i e n t e s con d e f e c t o s genticos en C2, C4, C3 o CR3 (Ochs. 1986). El desarrollo r e c i e n t e de r a t o n e s knockout sin C4, C3. o r e c e p t o r e s del c o m p l e m e n t o tipos 1 y 2 (CR1 y C R 2s o np r o d u c t o s de la divisin de un m i s m o gen en el ratn en oposicin a los h u m a n o s )h ap e r m i t i d o u nm e j o rc o n o c i m i e n t o del papel del c o m p l e m e n t oe nl a sr e s p u e s t a sd e antic u e r p o s al antigeno. E s t e efecto ha sido revisado r e c i e n t e m e n t e (Carroll. 1998a: 1998b: Fearon, 1998). El c o m p l e m e n t op u e d e influir en la r e s p u e s t a de a n t i c u e r p o s al antgeno de m u c h a s maneras. Primero, el CR 1 y el CR2 son e x p r e s a d o s en las clulas B y en las clulas dendriticas foliculares (que estn p r e s e n t e s en el bazo). EL CR2 est p r e s e n t e en la s u p e r t i c i e de las clulas B en asociacin con el CD19 y el TAPA-1. Una vez que se ha ligado el r e c e p t o r de la clula B p a r a el antigeno y p a r a el CR2 ( c o m o ocurrir c u a n d o el ant-

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SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA

geno esl unido al C3d), disminuye drsticamente el umbral para la activacin de la clula B. Tambin, el complemento ayuda en el atrapamiento de los complejos inmunes por las clulas dendriticas foliculares en el bazo. Esto facilita la formacin de centros germinales donde las clulas B adquieren el fenotipo memoria. Por lo tanto, la prdida de uno de los componentes iniciales de la via clsica de la activacin del complemento o la prdida del CR1 y/o el CR2 conduce a una respuesta inmune inapropiada al antgeno y, en algunos casos, puede conducir a la incapacidad para producir una respuesta de anticuerpos secundaria. El complemento puede jugar un papel en la generacin de clulas B CD5 positivas, las cuales producen anticuerpos "naturales" (Carroll. 1998a). La activacin adecuada de las clulas B en respuesta a antigenos parece depender, en algunos casos, de la activacin de los anticuerpos "naturales" y el complemento (Boes, 1998: Lutz, 1999). Interesantemente, el complemento parece importante en el mantenimiento de la tolerancia de las clulas B a los antgenos propios. Esto parece depender del componente del complemento C4, y del CR1 y del CR2 (Prodeus, 1998). Finalmente, el complemento (especialmente el C3) ayuda a la generacin de una respuesta inmune adquirida al antgeno a travs de las clulas presentadoras de antgeno (APCs). La presencia de productos de degradacin de C3 sobre los antgenos aumenta la captacin del anligeno por las APCs (clulas B y otras APCs profesionales que expresan CR1 y/o CR2), aumentando por lo tanto la eficacia de la presenlacin antgnica a las clulas T con la consiguiente respuesta mediada por las clulas T (Boackle. 1998: Kerekes. 1998).
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DEFICIENCIAS GENTICAS DEL COMPLEMENTO


Los pacientes con deficiencias del complemento genticamente controlados son m u y raros pero son interesantes porque nos permiten determinar el papel de los componentes del complemento en distintos fenmenos biolgicos y en diferentes estados de enfermedad. En general, la ausencia de un componente sigue los principios de la gentica mendeliana simple y es heredada c o m o un rasgo autosmico recesivo. Por ello, los pacientes heterocgticos tienden a tener la mitad de los niveles normales o menos, y los pacientes con defectos homocigticos tienen poca o indelectable actividad del complemento. El gen de la properdina est en el cromosoma X. Se conocen deficiencias para todas las protenas ligadas a la activacin del complemento (Tabla 38-4). Con el descubrimiento reciente de la va de la MBL de la activacin del complemento lleg el sorprendente hallazgo de que el dficit en suero de MBL es bastante frecuente. Se calcula que aproximadamente el 5% de la poblacin tiene una de las tres mutaciones genticas reconocidas que conducen a la deficiencia de MBL (Sumiya. 1997). Se ha descrito una correlacin entre la deficiencia de MBL y las infecciones del tracto respiratorio superior, especialmente entre los 6 y 18 meses de edad, demostrando la importancia de la va de la MBLecitina en la primera infancia (Turner. 1996). Un estudio reciente sugiere que la variacin de genes de la MBL puede estar asociada con al menos un tercio de las inlecciones meningoccicas en la infancia (Hibberd. 1999). Se ha informa?

Tabla 38-4 Deficiencias h e r e d a d a s d e l c o m p l e m e n t o y d e las protenas relacionadas c o n el c o m p l e m e n t o Patrn de herencia Principal correlacin clinica' Proteina Comn a todas las vas C3 Va clsica C1q C1r C1S C4> C2t Va alternativa Factor B Factor D Properdina Via de la MBLectina MBL Complejo de ataque a la membrana C5 C6 C7 Autosmica recesiva Autosmica Autosmica Autosmica Autosmica Autosmica recesiva recesiva recesiva recesiva recesiva Infecciones pigenas recurrentes, glomerulonefritis Glomerulonefritis. LES Glomerulonefritis. LES Glomerulonefritis. LES LES LES, LED. artritis reumatoide juvenil, glomerulonefritis Infecciones por Neisseria meningitidis Infecciones pigenas recurrentes Infecciones pigenas recurrentes, meningococcemia fulminante Infecciones recurrentes Infecciones diseminadas recurrentes por Neisseria. LES Infecciones diseminadas recurrentes por Neisseria Infecciones diseminadas recurrentes por Neisseria, enfermedad de Raynaud Infecciones diseminadas recurrentes por Neisseria Nada Angioedema hereditario, enfermedades autoinmunes' Angioedema, sndrome semejante al Behcet Inlecciones pigenas recurrentes Inlecciones pigenas recurrentes, glomerulonefritis Asociacin entre la expresin baja en eritrocitos y el LES Infecciones pigenas recurrentes, leucocitosis Hemoglobinuria paroxstica nocturna

Autosmica recesiva Autosmica recesiva Ligada al X Autosmica dominante Autosmica recesiva Autosmica recesiva Autosmica recesiva

C8 (cadenas y a-y) Autosmica recesiva C9 Autosmica recesiva Proleinas de control del fluido sanguineo C1inh Autosmica dominante o adquirida C4bp Autosmica recesiva Factor I Autosmica recesiva Factor H Autosmica recesiva Protenas unidas a clulas CR1 Autosmica recesiva ' CR3 Autosmica recesiva" DAF/CD59/HRF Adquirida
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* Vase que algunas personas con deficiencias del complemento, especialmente C2 y componentes del complejo de ataque a la membrana, estn clnicamente bien. Un nmero sustancial de pacientes con defectos en del C5 al C9 han tenido una enfermedad autoinmune. Las deficiencias del Ct al C9 estn asociadas con un CH50 de O. Las deficiencias de Ct. C4 y C2 estn asociadas con LES y los pacientes a menudo tienen prep. LE negativos Las deficiencias de C3 a C9 esln asociadas con una ausencia o una baja actividad bactericida en suero La deficiencia de C3 o C5 est asociada con la ausencia o disminucin de la actividad quimiotctica en suero y puede estar asociada con la ausencia de respuesta leucoctica a la infeccin. i La deficiencia en cualquier gen del C4 (C4A y C4FJ) se denomina "qO", para la cantidad cero Tal deficiencia es designada C4AqO o C4BqO Los pacientes con tales deficiencias tienen una incidencia mayor de lo normal de enfermedades autoinmunes. Los individuos heterozigticos para la deficiencia de C2 tambin tienen un aumento de la incidencia de enleimedades autoinmunes. Aproximadamente el 85% de los casos incluyen aletas silentes, y un 15% incluyen alelos que codifican para la variante adquirida disluncional de la proteina Ct inhibidor. En el angioedema hereditario, el nivel de C1 esta normal o disminuido, el nivel de C3 est siempre normal, y el nivel de C4 esl disminuido. En la enfermedad adquirida, los niveles de Cl y C4 estn disminuidos, el nivel del antignico Cl inhibidor suele ser normal o alto, y el nivel funcional del Cl inhibidor esta muy disminuido. La homocigosis para la expresin numrica ba|a (no ausente) de CR1 en los eritrocitos es detectable in vilro y puede estar asociada con el LES Tambin puedo detectarse un defecto adquirido en el nmero de CRI Niveles bajos, pero no ausentes de CR3 leucocitico son detectables en los padres de la mayora de los nios con delicit de CR3. LES = lupus eritemaloso sislmico. LED = lupus eritematoso diseminado. MBL = lectina fijadora de maosa
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CAPTULO 38

COMPLEMENTO Y CININAS: MEDIADORES DE LA INFLAMACIN

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do q u el a s infusiones de M B L purificada corrigen el d e f e c t o y la susceptibilidad Es importante r e c o n o c e r que la medicin de los niveles del c o m p l e m e n t o a las i n f e c c i o n e s en los nios con deficiencias del M B L (Valdimarsson, 1998). srico representa los niveles estticos de protenas que se r e c a m b i a n rpiAdems, se h a sugerido que la deficiencia de M B Lc o n d u c eae n f e r m e d a d e s damente. I n c l u s o en los individuos normales, el ndice fraccional catablico a u t o i n m u n e sc o m o el l u p u se r i t e m a t o s o sistmico (Turner. 1996) y que es un de la mayora de los componentes que han sido m e d i d o s est alrededor del f a c t o r de riesgo p a r a el a b o r t or e c u r r e n t e (Christiansen. 1999). 2 % por hora. M u c h a s de e s t a s protenas se c o m p o r t a nc o m or e a c t a n t e s de u e d e na u m e n t a r drsticamente e n los L a deficiencia e n cualquiera d e los c o m p o n e n t e sd el ac a s c a d a del c o m - fase aguda, y sus niveles en suero p e s t a d o s inflamatorios. Sus ndices d ec a t a b o l i s m op u e d e na u m e n t a re n p l e m e n t o tiene alguna asociacin con la susceptibilidad a infecciones (Figueroa. 1991; Densen. 1998). D e b i d o al papel central q u e el C3 tiene en la opso- varias enfermedades autoinmunes. El hallazgo de una disminucin del nivel del c o m p l e m e n t op u e d e avalar la s o s p e c h a de q u e el s i s t e m a del c o m p l e nizacin, la deficiencia de C3. de otros c o m p o n e n t e s de la va alternativa, o m e n t o participa en el dao tisular, pero no lo prueba. El hallazgo de un nivel de las molculas reguladoras c o m o los factores H e I est a s o c i a d a con un normal de c o m p l e m e n t o en el suero no e x c l u y e la participacin del c o m p l e a u m e n t od el a incidencia d e infecciones. Interesantemente, las deficiencias m e n t o en el dao tisular. Por ejemplo, los p a c i e n t e s con cirrosis biliar tienen de los c o m p o n e n t e s del c o m p l e j o de a t a q u e a la m e m b r a n a (C5-C9) estn un aumento del ndice catablico de C3, y se ha sugerido que el C3 p u e d e a l t a m e n t ea s o c i a d a sc o nu na u m e n t od el a incidencia d e infecciones p o r jugar un papel en el desarrollo de e s t a enfermedad. No obstante, el nivel de Neisseria meningitidis, sugiriendo l ai m p o r t a n c i a de la lisis m e d i a d ap o r el C3 en el suero de los pacientes c o n cirrosis biliar est casi s i e m p r e elevado. c o m p l e m e n t o en el control del m e n i n g o c o c o La vacunacin e m p l e a n d ou n En e s t e caso, el a u m e n t o de la sntesis e n c u b r e el c a t a b o l i s m oa u m e n t a d o . polisacrido c a p s u l a rm u l t i v a l e n t ep a r a Neisseria meningitidis demostr ofreTambin debe reconocerse que la funcin del c o m p l e m e n t o en los diversos c e ra l g u n a proteccin f r e n t e a la infeccin menmgoccica e nl o sp a c i e n t e s c o m p a r t i m e n t o s del c u e r p op u e d es e r diferente. L a actividad del c o m p l e c o n deficiencia del c o m p l e m e n t o (Fijen. 1998). m e n t o en la sangre de pacientes con artritis r e u m a t o i d e seropostiva p u e d e O t r a caracterstica de la deficiencia del c o m p l e m e n t o ,e s p e c i a l m e n t e en los s e rn o r m a l o elevada; sin embargo, la actividad del c o m p l e m e n t o del liquido c o m p o n e n t e s iniciales de la via clsica (C1. C4, C2). es la asociacin c o n u e d e eslar s e v e r a m e n t e disminuida. e n f e r m e d a d e sa u t o i n m u n e sc o m oe l LES. Y aq u ee lc o m p l e m e n t oe si m p o r - sinovial p t a n t e en el a c l a r a m i e n t o de los c o m p l e j o si n m u n e s de la circulacin, p u e d e ser M u c h o s investigadores han i n t e n t a d o identificar qu va de activacin del q u e la deficiencia de los c o m p o n e n t e s iniciales del c o m p l e m e n t oc o n d u z c aa c o m p l e m e n t op r e d o m i n a en la mediacin del dao tisular o en los niveles disu n a degradacin inadecuada de los complejos i n m u n e s con su acumulacin m i n u i d o s del c o m p l e m e n t o en u n a y otra e n f e r m e d a de s t a b l e c i e n d o el" perfil e nl o s tejidos c o m o el rion. R e c i e n t e sd a t o se x p e r i m e n t a l e s que e m p l e a n del c o m p l e m e n t o " . La aproximacin ms s i m p l e a este p r o b l e m a examina los r a t o n e s transgnicos sugieren que la a u t o m m u m d a da s o c i a d a con la deficienniveles de varios c o m p o n e n t e s y da p o rh e c h oq u e los niveles d i s m i n u i d o s de cia de Clq origina un a c l a r a m i e n t oi n a d e c u a d o de las clulas apoplticas que. un c o m p l e m e n t od a d o de una de las vias de activacin del c o m p o n e n t e es a su vez. c o n d u c e al desarrollo de a n t i c u e r p o s autorreactivos (Bofto. 1998). ms frecuente que ocurra c u a n d o la va est activada. P o rl o tanto, si u n C o m o se discuti previamente en la seccin C o m p l e m e n t o e inmunidad adqui- p a c i e n t e tiene niveles disminuidos de C3 y C4 y niveles n o r m a l e s de f a c t o r B, rida, la deficiencia del c o m p l e m e n t o( e s p e c i a l m e n t e de C4 o C R 1C R 2 )t a m - s e g u r a m e n t e estar implicada la va clsica. Si un paciente tiene niveles disbin p u e d e alterar el m e c a n i s m o por el que las clulas B se h a c e n tolerantes m i n u i d o s de C3, factor B y properdina, y niveles n o r m a l e s de C4, probablea los antgenos propios, c o n d u c i e n d o por ello a una a u t o i n m u n i d a d (Prodeus, m e n t e estara activada la va alternativa. De esta manera, la determinacin de 1998). E x i s t e nd e f i c i e n c i a s en l a s molculas reguladoras del c o m p l e m e n t o l o s niveles d eu n nmero limitado d ec o m p o n e n t e sp u e d ep r o p o r c i o n a r u n i d a s a la m e m b r a n a . La deficiencia de C R 3 origina s e v e r a s infecciones pi- m u c h a informacin. E x c e p t u a n d o el c a s o de alteraciones conlroladas gentig e n a syd e f e c t o s en la adhesin l e u c o c i t a n a (Fres. 1986; Morgan. 1991). La c a m e n t e del c o m p l e m e n t o ,u n on u n c an e c e s i t ac o n o c e rl o s niveles d et o d o s d e f i c i e n c i a en la c a p a c i d a dp a r ag e n e r a r el e n l a c e glicosil fosfatidilinositol q u e los c o m p o n e n t e se x c e p t o para objetivos de investigacin. u n ea l g u n a s protenas de control del c o m p l e m e n t o a la m e m b r a n a celular oriUn i m p o r t a n t ea v a n c e en e s t e rea es el e m p l e o de e n s a y o s de enzimas gina HPN. L o sp a c i e n t e sc o n tal e n f e r m e d a d no tienen D A F .C D 5 9yH R F en fijadoras i n m u n o a b s o r b e n t e s (ELISAj p a r ad e t e c t a r los c o m p l e j o se s t a b l e s la superficie de sus clulas y sufren u n a hemolisis intravascular crnica, tromf o r m a d o s en el s u e r o durante la activacin del c o m p l e m e n t o .E s t o se n s a y o s b o c i l o p e n i a y disminucin de la h e m a t o p o y e s i s (Jarva, 1999). L a deficiencia son m u y sensibles y pueden d e m o s t r a r rpidamente q u e va del c o m p l e m e n del C 1 inhibidor origina e la n g i o e d e m a hereditario, u n ae n f e r m e d a d caracteri- to est activada en varios e s t a d o s de e n f e r m e d a d (Morgan. 1994a). z a d ap o r episodios recurrentes de e d e m a subcutneo y s u b m u c o s o . Esta defiEn la activacin, m u c h a s protenas del c o m p l e m e n t oe x p r e s a nn u e v o s c i e n c i ap u e d eh e r e d a r s e o adquirirse tras el desarrollo de a u t o a n t i c u e r p o sc o n antigenos (neoantgenos) que no son e x p u e s t o s en la protena n a t i v a plastra el C1 inhibidor. L o sp a c i e n t e sc o n deficiencia del C1 inhibidor a m e n u d o mtica. El neoantgeno presente en el M A C pero n o presente en los c o m p o m u e s t r a n niveles bajos de C4 y C2. d e m o s t r a n d o una activacin incontrolada n e n t e sn a t i v o s termnales es quizs el ms interesante. El a n t i c u e r p op a r a del C1. Se c r e eq u e el a n g i o e d e m a hereditario es c a u s a d o principalmente p o r e s t e neoantgeno e x i s t e y se ha utilizado p a r a estudiar el nivel de neoantla prdida de la regulacin del s i s t e m ag e n e r a d o r de cininas por el C1 inhibig e n op o r inmunofluorescencia as c o m op o rE L I S A (Falk. 1 9 8 3 ; Sanders. d o r (Cugno. 1998; Davis. 1998). 1985). El nivel de neoantgeno est elevado en sangre y en lquido cefalou c h o s pacientes con activacin consiguiente del c o m p l e m e n L o sp a c i e n t e sc o nh y p o g a m m a g l o b u l i n e m i aoi n m u n o d e f i c i e n c i ac o m b i n a d a rraqudeo en m u g a r e s de s e v e r aam e n u d ot i e n e n disminuidos los niveles de Clq. En parte, e s t o s nive- to (Sanders. 1986). Adems, est presente en los tejidos en los l o m p l e j o terminal. Por ejemplo, est p r e s e n t e en el tejido lesiol e sd i s m i n u i d o sd eC 1 qs e relacionan c o n los niveles b a j o sd eI g Ge nl a circu- depsito del c n a d o en los glomrulos de los p a c i e n t e s con glomerulonefritis (Falk. 1983) y lacin. P a r e c e que el Clq i n t e r a c c i o n a con la IgG en la circulacin y que e s t a en la piel lesionada en los lugares de L E S activo (Biesecker. 1982). A q u e interaccin c o n d u c e , a su vez. a una disminucin del c a t a b o l i s m o del Clq. rencia del C3 depositado en la piel n o r m a l de p a c i e n t e sc o nL E Syc o nt e s t de b a n d a para el lupus positivo, el neoantgeno M A C solo se e n c u e n t r a en las lesiones. EVALUACIN DE LA ACTIVIDAD DEL COMPLEMENTO EN LA ENFERMEDAD COMPLEMENTO EN LOS ESTADOS DE ENFERMEDAD E nm u c h o sc o n t e x t o sd e enfermedad, las f u n c i o n e s del c o m p l e m e n t os o n n o r m a l m e n t ep r o d u c i r inflamacin o dao tisular. C u a n d o el c o m p l e m e n t o juega un p a p e l en el desanollo de la enfermedad, a m e n u d o es a c t i v a d op o r un Enfermedades reumatolgicas a n t i c u e r p o anormal, un c o m p l e j oi n m u n eop o rm a t e r i a l extrao. F r e c u e n t e L ae n f e r m e d a d reumatolgica que ha sido evaluada ms e x t e n s a m e n t e m e n t e es i m p o r t a n t ee v a l u a r el nivel de u n oyo t r oc o m p o n e n t e del c o m p l e - en c u a n t o a la contribucin del c o m p l e m e n t o a la actividad de la e n l e r m e d a d m e n t oc o m om e d i d ad el a actividad d eu np r o c e s od ee n f e r m e d a d .P o r ello, l o s es el L E S (Agnello. 1986: Alkinson. 1986). En esta e n f e r m e d a d se f o r m a n p a c i e n t e sc o nL E Sa c t i v op u e d e nt e n e rd i s m i n u i d o s los niveles de C3 y C4, y grandes cantidades d ec o m p l e j o s inmunes. S ee n c u e n t r a ni n m u n o c o m p l e j o s e s t o s niveles d i s m i n u i d o s del c o m p l e m e n t op u e d e ns e g u i r s ec o m ou nm a r c a - circulantes y u n i d o s a tejidos. E s t o si n m u n o c o m p l e j o sa c t i v a n el c o m p l e d o ra p r o x i m a d od el a actividad d el ae n f e r m e d a d . mento, y los productos de activacin del c o m p l e m e n t oc o n t r i b u y e n a que

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SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA

m a t i s m o severo o sepsis incontenible. H a y evidencia de activacin m a s i v a contine la inflamacin. A m e n u d o estn disminuidos los niveles de C3 y C4 del c o m p l e m e n t o en estos pacientes, lo q u e sugiere q u el a sb a c t e r i a syl o s en el LES y, en general, los niveles bajos se encuentran en los pacientes c o n p r o d u c t o sb a c t e r i a n o s activan e lc o m p l e m e n t o( H a m m e r s c h m i d t , 1980). e n f e r m e d a d activa. Algunos sugieren q u e un nivel bajo de C4 es el m e j o r P a r e c e que se activan la va clsica y la va alternativa (Langlois. 1988). Se indicador de que la e n f e r m e d a d contina activa. Sin embargo, hay pacientes f o r m a n factores inflamatorios c o m o el factor activador de neutrfilos y el C5a. c o ne n f e r m e d a d activa q u em u e s t r a n niveles n o r m a l e sd e C4. D ea c u e r d o H a y evidencia de que los neutrfilos infiltran el pulmn, y se c r e e que los procon otros, el nivel de sC5b-9 circulante o de neoantgeno del MAC p u e d e ser ductos oxidativos neutroflicos y las proteasas son responsables d em u c h o un indicador m e j o r de enfermedad activa (Gawryl, 1987). C o m o se trat preu l m o n a rq u e ocurre. viamente, el c o m p l e m e n t op a r e c e jugar un papel esencial en el aclaramien- del dao p to de l o si n m u n o c o m p l e j o s circulantes, particularmente de aquellos q u e contienen isotipos a c t i v a n t e s del c o m p l e m e n t o IgM o IgG. El depsito de C3b sobre el i n m u n o c o m p l e j o procede de la activacin del complemento, que Enfermedades renales p e r m i t e la interaccin con clulas que poseen el receptor de C3b (CR1). Con la unin a los eritrocitos a travs del CR1. se impide que los complejos inmuEl c o m p l e m e n t op a r e c e ser una c l a v e importante en el dao g l o m e r u l a r en nes se difundan del p l a s m a a los tejidos d o n d ep u e d e n originar dao. Los erim u c h a s de las glomerulonefritis (West, 1998). E s t o se d e m u e s t r aam e n u d o t r o c i t o s que u n e nai n m u n o c o m p l e j o s circulan h a c i a el hgado, donde los por el depsito de C3 y otros c o m p o n e n t e s , en o c e r c a de la m e m b r a n ab a s a l i n m u n o c o m p l e j o s son eliminados p o r un p r o c e s o que no disminuye la vida glomerular. Adems, el M A Ch a sido r e c o n o c i d o en el dao g l o m e r u l a r en m e d i a de los hemates (Cornacoff, 1988; Birmingham, 1995). E n las enferpacientes c o n glomerulonelritis y LES. Se ha d e m o s t r a d oq u e los p a c i e n t e s m e d a d e s en las que el c o m p l e m e n t o es activado y estos p r o d u c t o si n m u n o - c o ne n f e r m e d a d del s u e r od e b i d aai n m u n o c o m p l e j o s circulantes tienen lgicamente activados se f o r m a n en la circulacin, el nmero de CR1 por erilesin glomerular. En el anlisis del suero, estos pacientes m u e s l r a n la actitrocito est disminuido. Esto p u e d e resultar de la eliminacin d e algunos d e vacin de las vas clsica y alternativa, o de ambas. Tradicionalmente, se h a l o s CR1 c u a n d o el c o m p l e j oi n m u n e es retirado del eritrocito en el hgado credo que los complejos son depositados en los glomerulus a m e d i d aq u e (Ross, 1985). Adems del LES, se ha publicado que los eritrocitos de paciense filtra el p l a s m aq u e contiene los i n m u n o c o m p l e j o s .U n av e z depositados, t e s con e n f e r m e d a d crnica por aglutininas fras. HPN, a n e m i a hemolhca e s t o sc o m p l e j o s activan e lc o m p l e m e n t o .U np u n t od e vista alternativo e s autoinmune. sndrome de Sjogren y neumona por Mycoplasma pneumoniae q u e los anticuerpos contra las estructuras glomerulares f o r m a ni n m u n o c o m tienen r e d u c i d o el CR1 eritrocitano, sugiriendo que los depsitos i n m u n e s plejos en el rion que luego activan el c o m p l e m e n t op a r ac a u s a r dao local h a n sido eliminados de los eritrocitos en estas e n f e r m e d a d e s (Atkinson, (Daha, 1979). A u n q u e los anticuerpos frente a las estructuras de la m e m 1986: Ross, 1985). brana basal glomerular son c l a r a m e n t e importantes en el sndrome de Goodpasture, su papel global en las glomerulonefritis es ms cuestionable. El L a s protenas del c o m p l e m e n t o actan c o m o reactantes d e fase a g u d ay papel del c o m p l e m e n t o en la e n f e r m e d a d intersticial y tubular est m e n o s los niveles p u e d e nn oe s t a r disminuidos incluso e n situaciones e n las q u e claro; sin embargo, hay quienes c r e e n que el c o m p l e m e n t o tambin funcioocurre la activacin del c o m p l e m e n t o . Se encuentran niveles sricos del c o m ae n estos trastornos. Interesantemente, e na l g u n o sp a c i e n t e sc o ng l o m e p l e m e n t on o r m a l e soa u m e n t a d o s en la artritis r e u m a t o i d e juvenil, en el reu- n rulonefritis con ni v el e s m u y baj o s d e C3. una protei n a l a m a d a factor nefrtim a t i s m o palindrmico. en la seudogota. en la gota, en el sndrome de Reiter co C3 (C3NeF o Nf) estabiliza la va de la C3 c o n v e r t a s a alternativa. E s t e y en la artritis gonoccica. AI m i s m o tiempo, p a r e c e n existir niveles disminuifactor es un autoanticuerpo dirigido contra el Bb q u ea u m e n t a la v i d am e d i a dos del c o m p l e m e n t o en el lquido sinovial en un nmero de otras enfermede l a C3 convertasa de l a via al t ernati v a en ms de 10 v e c e s (Daha. 1 9 7 9 . d a d e s reumatolgicas. incluyendo la artritis reumatoide. Se c r e e que la dis1976). El C 3 N e Fp a r e c e proteger a la C3 convertasa de la va alternativa de minucin d e la actividad hemolitica total del c o m p l e m e n t o (CH50; vase la eliminacin por la disociacin por el f a c t o r H (Fearon, 1980). Se c r e eq u e despus en E n s a y o s del c o m p l e m e n t o ) y la presencia de productos de degrael C 3 N e F es responsabl e de l o s ni v el e s tan baj o s de C3 p r e s e n t e s en e s t o s dacin del C3 y del f a c t o rBr e p r e s e n t a n la activacin intraarticular en el lquip a c i e n t e s pero n os ec r e eq u e juegue u n papel central e ne l desarrollo d el a do sinovial de m u c h o sp a c i e n t e sc o n artritis r e u m a t o i d e seronegativa. LES, nefritis. seudogota, gota, sndrome d e Reiter y artritis gonoccica. Esto n o es cierto
a

en fluidos o b t e n i d o s de p a c i e n t e sc o n artritis degenerativa. Enfermedades dermatolgicas Enfermedades infecciosas C o m o en los otros grupos d ee n f e r m e d a d e s sealados, se c r e e que el c o m p l e m e n t ot o m a parte en el dao tisular en una variedad de e n f e r m e d a C o m o se mencion anteriormente y c o m o se evidenci en hallazgos clnides dermatolgicas. Estas incluyen el penfigoide ampollse el penfigoide cos en p a c i e n t e s con deliciencias genticamente controladas del c o m p l e m p o lo s a adquirida, la m e n t o , el s i s t e m a del c o m p l e m e n t oj u e g a un papel crucial en la defensa con- gestacional. el penfigoide cicatricial, la epidermlisis a m p o r t a n t e tra l o s microorganismos. L o s pacientes c o ns e p t i c e m i ap o rG r a m negativos dermatitis herpetiforme y el pnfigo vulgar (Yancey, 1998). Es i s a b e r que los niveles sricos del c o m p l e m e n t o suelen e s t a rn o r m a l e s o eleam e n u d o tienen niveles disminuidos de C3 y de c o m p o n e n t e s de la va altervados en estos estados inflamatorios, y de q u e la i m p o r t a n c i a del c o m p l e nativa, al igual que p a c i e n t e s con ciertas e n f e r m e d a d e s fngicas c o m o la m e n t o es estimada por anlisis de inmunofluorescencia de las biopsias lisus e p t i c e m i a criptoccica. El c o m p l e m e n t op u e d ee s t a r implicado en el dao lares y p o r estudios del liquido de l a ampolla. Adems. G a m m o n y cois. tisular a s o c i a d o con la infeccin crnica. Se s a b e que los p a c i e n t e sc o n (1984) han desarrollado un m o d e l o in vilro til para el e s t u d i o de e n f e r m e hepatitis infecciosa H b s A g positiva tienen una cada precoz en el C3 srico, a d e s cutneas m e d i a d a sp o r anticuerpos anli-membrana basal. E s t o s q u ep o s t e r i o r m e n t e vuelve a la normalidad. E s t op u e d ee s t a ra s o c i a d o con d autores h a nm o s t r a d oc o n c l u y e n t e m e n t e que e lC 5 ae su ne l e m e n t oc l a v e signos de e n f e r m e d a dp o ri n m u n o c o m p l e j o s (esto es, la artralgia). De u n a f o r m a similar, e lc o m p l e m e n t op a r e c e jugar u n papel importante e nm u c h a s en la patognesis del penfigoide ampolloso y de la epidermlisis ampollosa adquirida. El C5a acta c o m o un quimioatrayente necesario p a r a el aflujo d e i n f e c c i o n e s parasitarias, incluyendo la leishmaniasis, la tripanosomiasis, la leucocitos polimorfonucleares a los lugares de dao tisular en e s t a s enfergiardiasis y la malaria. L a discusin detallada d e las interacciones entre el medades. s i s t e m a del c o m p l e m e n t o y los parsitos, las bacterias y los virus no s e e n c u e n t r a dentro de los objetivos de e s t e capitulo y el lector d e b e remitirse a revisiones sobre el t e m a (Frank, 1998; Kozel, 1996: Cooper, 1998; Moffitt, 1994; Fishelson. 1994). Sin embargo, es importante r e c o n o c e r que los nive- Enfermedades hematolgicas les del c o m p l e m e n t o srico en general no son un ndice fiable de actividad d ee n f e r m e d a de n estas condiciones. E nm u c h o s tipos d ea n e m i a hemolitica a u t o i n m u n e ,e lc o m p l e m e n t oj u e g a un papel i m p o r t a n t e en la opsonizacin de los eritrocitos, c o n d u c i e n d o a su Se h a estudiado el papel del c o m p l e m e n t o en el sndrome de dificultad c l a r a m i e n t o por las clulas del s i s t e m a reticuloendotelial. respiratoria del adulto (SDRA), un p r o c e s o frecuente en pacientes con trau- a

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COMPLEMENTO Y CININAS: MEDIADORES DE LA INFLAMACIN

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Sin embargo, incluso en aquellos casos en los que el complemento est claramente implicado, los niveles sricos del complemento suelen ser normales. El complemento es particularmente importante en el aclaramiento de clulas recubiertas con crioaglutininas tipo IgM con especificidad anti-l. Estos autoanticuerpos (aglutininas frias) estn asociados con trastornos linfoprolferativos que siguen a infecciones, o pueden ser hallazgos aislados, especialmente en los ancianos. Las aglutininas fras generalmente se unen ptimamente a temperaturas subfisiolgicas, que se encuentran en algunas reas del cuerpo como la punta de la nariz, los dedos de las manos, y las orejas. Suelen mediar la lisis celular cuando los eritrocitos circulantes vuelven a la temperatura corporal central. No todas las aglutininas fras son anticuerpos IgM. El sndrome de la hemoglobinuria paroxistica fra (HPF), por ejemplo, resulta de crioaglutininas IgG de Donath-Landsteiner. que se unen a las clulas a temperaturas menores de 37 C pero median la lisis una vez calientes. Aunque el anticuerpo es diferente, los efectos fisiopatolgicos son similares. Otros autoanticuerpos que activan el complemento se unen ms eficazmente a temperaturas calientes. En general, estas aglutininas calientes son del isotipo IgG. En algunos casos, estos anticuerpos pueden estar asociados con enfermedades malignas linfoprolferativas y con infecciones virales. La mayora de los anticuerpos IgG reactivos al calor encontrados en la anemia hemolitica autoinmune tienen especificidad Rh y son pobres activadores del complemento en contraposicin con las aglutininas fras y con los anticuerpos frente a los grupos sanguneos anti-A y anti-B. Sin embargo, algunos anticuerpos, como el Tja, activan el complemento y originan la lisis. En una anemia hemolitica adquirida rara, llamada HPN (hemoglobinuria paroxistica nocturna), los pacientes experimentan episodios recurrentes de lisis mtravascular. Se cree que la lisis de los eritrocitos en estos pacientes se lleva a cabo por la va alternativa (Jarva, 1999; Rosse, 1998). aunque los niveles sricos del complemento siempre son normales y el test directo antiglobulina es siempre negativo. El defecto en la HPN es una prdida de protenas de enlace glicosil fosfatidilinositol en la superficie de las clulas de los pacientes originado por mutaciones en el gen fosfalidil glicano A (p/g-A). Entre otras protenas de unin a travs de este enlace de membrana estn el DAF y el CD59. dos molculas que controlan la activacin del complemento a nivel de la C3 convertasa. y el C8 y C9 respectivamente (vase anteriormente en Regulacin de la activacin del complemento). Se cree que la lisis de los eritrocitos en pacientes con HPN se debe a la activacin incontrolada del complemento en la superficie de estas clulas. Recientemente, se inform de que, aunque la prdida de DAF y CD59 de la superficie de los eritrocitos en pacientes con HPN es responsable del aumento de la sensibilidad a la lisis mediada por el complemento, la deficiencia de CD59 origina una mayor sensibilidad a la lisis celular que la deficiencia de DAF (Shichishima, 1999).

temente, el tipo de clula glial ms abundante, el astrocito, demostr sintetizar in vitro todas las protenas del complemento en condiciones inflamatorias (Morgan. 1996). Adems, los astrocitos y las clulas microgliales expresan receptores del complemento n vitro (Morgan, 1997a). Por lo tanto, a pesar de la barrera hematoenceflica. el cerebro tiene la capacidad de preparar una reaccin inflamatoria dependiente del complemento c o m o mecanismo de defensa.

Enfermedades cardiovasculares
Se admite la implicacin del sistema del complemento en la lesin por isquemia'reperfusin miocrdica. Se ha revisado recientemente (Lucchesi. 1997a). El mecanismo por el que el complemento contribuye al infarto agudo de miocardio en los pacientes todava no est claro. Sin embargo, se han demostrado los depsitos de los componentes de las vas clsica y alternativa en el miocardio afectado junto con C5b-9 La produccin de analilotoxmas que acompaan a la activacin del complemento parece ser responsable de la reaccin inflamatoria local. La demostracin ms clara del efecto del complemento, especialmente de los componentes finales (C5b-9). proviene del modelo animal de oclusin de arterias coronarias (Kilgore. 1998). Los conejos con deficiencia genticamente controlada de C6 muestran una significativa reduccin del tamao del infarto en comparacin con los conejos normales. Adems, la infiltracin neutrofilica se redujo significativamente en los conejos con deficiencia de C6. sugiriendo un papel crucial de los componentes finales del complemento en la generacin de inflamacin local. El complemento tambin parece jugar un papel en el desarrollo de lesiones de aterosclerosis (Torzewski. 1997). De nuevo, el mecanismo exaclo por el que el complemento contribuye al desarrollo de las lesiones arteriosclerticas no est claro. Sin embargo, el depsito de los componentes finales del complemento (C5b-9) ha sido demostrado en las ntimas adelgazadas y en las placas fibrosas. La activacin del sistema del complemento est asociada con etapas prelesionales y con la progresin de lesiones arteriosclerticas (Niculescu, 1987; Seifert, 1989). Los conejos con dficit de C6 demostraron ser menos susceptibles que los conejos normales a las lesiones arteriosclerticas inducidas por colesterol (Schmiedt, 1998).

Biocompatibilidad
Muchos de los biomateriales implantados en el cuerpo activan el complemento, particularmente la va alternativa del complemento (Mollnes, 1997) En contacto con la sangre o con los lquidos tisulares. estos materiales pueden activar el complemento y producir inflamacin local o dao tisular. Los materiales deben ser testados sobre su capacidad de activar el complemento antes de ser utilizados ampliamente.

Trasplante de rganos Enfermedades neurolgicas


El papel del sistema del complemento en las enfermedades del sistema nervioso se ha hecho evidente en los aos recientes. Esto es algo sorprendente, ya que la barrera hemaloenceflica bloquea eficazmente la penetracin del complemento en el liquido cefalorraqudeo. La activacin del complemento fue demostrada en enfermedades como la miastenia gravis. la esclerosis mltiple, el lupus cerebral, el sndrome de Guillain-Barr y la enfermedad de Alzheimer (Shm, 1998; Morgan. 1994a, 1997b). El depsito de protenas del complemento fue demostrado en enfermedades tisulares y se demostr la activacin del complemento en el lquido cefalorraqudeo (LCR) de pacientes con muchas de estas enfermedades. Presumiblemente, la inflamacin origina una ruptura de la barrera hematoenceflica con la penetracin local de protenas del complemento. Adems, algunas clulas sintetizan protenas del complemento. Hay evidencia de que la activacin del complemento puede estar implicada en el dao a la mielina, originando de este modo enfermedad tanto del sistema nervioso central como del perifrico. Tambin se demostr que el complemento estaba implicado en la enfermedad de Alzheimer y en la enfermedad de Pick. En la enfermedad de Alzheimer, un pptido derivado del amiloide y denominado [5A4 se une al Clq y activa el complemento en las placas seniles del cerebro enfermo. InteresanEl xito del trasplante de rganos ha creado un gran problema, la escasez de rganos humanos para satisfacer las demandas para un nmero de pacientes que no deja de crecer que lo estn esperando como tcnica quirrgica. Por lo tanto, muchos han propuesto el empleo de donantes animales como el cerdo en este campo como una lgica alternativa a los rganos humanos. Sin embargo, los rganos porcinos vascularizados son susceptibles de una intensa reaccin de rechazo, denominada rechazo hiperagudo. cuando son implantados en primales o en humanos (Platt. 1998; Dalmasso, 1992). Esta reaccin es mediada por anticuerpos que se unen a las clulas endoteliales y la activacin del complemento. Se demostr que la activacin del complemento era crucial en el dao tisular en la reaccin hiperaguda de los xenotransplantes. La activacin del complemento en las clulas endoteliales xenognicas origina su activacin (es decir, las clulas endoteliales adoptan un fenotipo procoagulante), que conduce a trombosis intravascular e intersticial y a hemorragia. Tal intensa reaccin se debe a la incapacidad de las molculas reguladoras del complemento asociadas a las clulas porcinas como el DAF, MCP y CD59 de controlar la activacin del complemento humano. Por lo tanto, el xito de esta prometedora intervencin teraputica recae en la capacidad de controlar la activacin del complemento. El papel del complemento en el rechazo de rganos huma-

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SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA ficiosa no est claro y puede incluir el bloqueo de anticuerpos a travs de las interacciones idiotipo-antiidiotipo, el bloqueo de los receptores Fe para IgG en las clulas lagocticas, la modulacin de las funciones de las clulas T y B y la seleccin de repertorios inmunes. Sin embargo, la IVIG claramente tiene un efecto sobre el sistema del complemento (Frank, 1992). La IVIG ha demostrado interferir en la reaccin de shock dependiente de la via clsica de Frossm a n en los conejillos de Indias (Basta, 1989) y prolongar la supervivencia del xenomjerto cardiaco porcino en primates (Magee, 1995). Adems, el tratamiento con alias dosis de IVIG de pacientes con dermatomiositis inhibi el depsito de C3b y C5b-9 que normalmente se ve en los capilares del endomisio de estos pacientes (Basta, 1994). La IVIG inhibe la activacin del complemento a travs de su porcin Fe. El mecanismo exacto por el que la IVIG bloquea la activacin del complemento en la superficie del objetivo todava no se comprende completamente. Informes han demostrado que la IVIG puede prevenir el dao tisular mediado por el complemento interactuando directamente con el C 1 o previniendo la unin del C4 con la clula diana (Mollnes, 1995; Miletic, 1996).

nos (aloinjertos) es menos aceptado pero parece que la activacin del complemento contribuye de algn modo a los episodios de rechazo agudo y crnico (Baldwin, 1995).

UTILIDAD CLNICA DE LOS INHIBIDORES DEL COMPLEMENTO


La activacin del complemento contribuye indudablemente al dao lisular observado en una variedad de enfermedades humanas. Por lo tanto, el empleo de agentes que bloquean la activacin del complemento debe mostrar su utilidad para limitar el dao tisular. Desgraciadamente, no hay agentes disponibles para el uso en la prctica clnica. Se estn realizando investigaciones para desarrollar inhibidores del complemento que demuestren eficacia y seguridad. Ya que el complemento es fundamental en el control de la infeccin, un inhibidor del complemento adecuado no debera interferir con esta funcin del complemento. Tambin se sabe que el C3a y el C5a son potentes inductores de las reacciones inflamatorias. Por lo tanto, el inhibidor deseable deber actuar a nivel de la C3 convertasa clsica y alternativa para evitar la produccin de estas anafilotoxinas. Se han producido muchos inhibidores recientemente y estn siendo desarrollados actualmente. Nos centraremos solo en aquellos inhibidores que se muestran como promesas en el rea clnica. Para una descripcin ms completa de los recientes inhibidores desarrollados del sistema del complemento, se remite al lector a recientes revisiones sobre el tema (Makrides, 1998; Wagner, 1998). Como se discuti previamente, el CR1 es un potente regulador tanto de la via clsica como de la alternativa del complemento. Acelera la desintegracin de las C3 y C5 convertasas de ambas vas y sirve como cofactor para la degradacin del C4b, C3b y iC3b mediada por el factor I. Por lo tanto esta molcula representa un excelente candidato para la inhibicin teraputica del sistema del complemento en los estados de enfermedad. Una forma recombmante soluble del CR1, denominada sCR1, fue producida y demostr mantener todas las propiedades de la protena nativa unida a la membrana. En una variedad de modelos animales de enfermedad humana donde se sabe que la activacin del complemento tiene un papel, el empleo del sCR1 mejora significativamente el proceso de enfermedad. Estos incluyen, entre otros: xenotransplante cardiaco de cerdo en monos cinomolgus (Pruitt. 1994). alveoltis en un modelo de reaccin pulmonar de Arthus (Mulligan. 1992), lesin tisular de isquemia/reperfusin miocrdica (Weisman, 1990), desmielinizacin en un modelo experimental de encefalomielitis alrgica en ratas (Piddlesden, 1994) y glomerulonefritis (Couser, 1995). El sCR1 ha entrado ahora en la fase I de los ensayos clnicos en pacientes con infarto de miocardio y en pacientes con SDRA inducido por quemaduras. Otro inhibidor del complemento que ha entrado tambin en la fase I de los ensayos clnicos es un anticuerpo humanizado de cadena simple contra el C5 humano. La ventaja de tal anticuerpo es que permite el bloqueo de la activacin del complemento sin liberar C5a y depositar C5b-9, lo que se sabe que promueve el potente dao tisular debido a la inflamacin y a la activacin celular. El anticuerpo monoclonal para el C5 demostr en modelos animales interferir en el rechazo hiperagudo de los rganos porcinos en sistemas de perfusin in vilro (Kroshus, 1995), para prevenir el desarrollo de artritis en un modelo de ratn de artritis inducida por colgeno (Wang. 1995), para disminuir la glomerulonefritis en un modelo de ratn de LES (Wang, 1996) y para disminuir el tamao del infarto en un modelo de rata con un modelo de lesin de isquemia/reperfusin miocrdica (Vakeva. 1999). EL anticuerpo anti-C5 humanizado demostr ser un potente inhibidor del sistema del complemento in vitro (Evans, 1995). Los resultados de los ensayos clnicos sugieren que este anticuerpo puede disminuir significativamente el dao al miocardio en los pacientes que sufren un bypass quirrgico cardiopulmonar Rollins, 1998). Las preparaciones de IgG humana purificada para el empleo intravenoso (IVIG) se han empleado en un nmero de enfermedades autoinmunes e inflamatorias como la prpura trombocitopnica idioptica, la enfermedad de Kawasaki, el sndrome de Guillain-Barr y la miastenia gravs (Dwyer. 1992). Sin embargo, el mecanismo exacto por el que la IVIG ejerce su accin bene-

ENSAYOS DEL COMPLEMENTO Principios generales


Estn disponibles los mtodos que permiten asegurar la determinacin de los niveles de cualquiera de los componentes de las vas clsica, alternativa y de la MBLectma, as como muchas enzimas y reguladores del sistema del complemento. Sin embargo, muchos de estos ensayos no estn disponibles en los laboratorios clnicos de rutina y estn restringidos los laboratorios de investigacin. Centraremos nuestra atencin sobre las tcnicas que n o requieren para su realizacin un laboratorio especializado en la investigacin del complemento. Para ms detalles relativos a mtodos que requieren tcnicas ms especializadas se remite al lector a otras publicaciones (Whaley, 1985: Dodds, 1997; Harrison. 1986; Giclas. 1997: Wrzner, 1997). Los ensayos sobre el complemento se pueden dividir en dos lipos: aquellos que miden las protenas del complemento como antigenos en los lquidos biolgicos y aquellos que miden la actividad funcional de un componente dado. Ambos tipos de tcnicas tienen ventajas e inconvenientes. Los mtodos de anlisis antignico (inmunoquimicos) generalmente son fciles de realizar. Estos ensayos antignicos con altamente especficos, requieren menos reactantes especializados, son ms baratos y se realizan en una cantidad de tiempo considerablemente menor. Los anticuerpos para las protenas del complemento humano y para las protenas purificadas del complemento humano estn comercialmente disponibles. El Linscott's Directory ol Immunological and Biological Reagents (1998) es una gua til para conocer los reactantes del complemento disponibles. Son sulicientes en estos ensayos, en los que pueden utilizarse tanto suero como plasma, los mtodos comunes de almacenamiento congelado (-20 C). Por esta razn, los ensayos antignicos son fcilmente adaptables al laboratorio clnico. Por otra parte, los ensayos antignicos no proporcionan informacin sobre la actividad de un componente ya que pueden detectar los productos de degradacin asi como los componentes funcionalmente activos. La presencia en suero de pequeos fragmentos de una proteina con actividad antignica puede confundir los resultados. Algunos ensayos antignicos emplean inmunodifusin radial. En estos ensayos, un fragmento proteico puede difundir ms rpidamente que la molcula pariente, lo cual puede originar niveles falsamente elevados. Como ejemplo, el ensayo antignico ms frecuentemente empleado para el C3 mide su principal producto de degradacin, el C3c. por inmunodifusin radial. Para mediciones seguras del C3c. la muestra debe guardarse a 37 C durante un nmero de das para permitir la completa conversin de C3 en C3c. En realidad, esto no se hace normalmente y por ello representa un motivo de error, aunque el error es pequeo y normalmente no tiene consecuencias clnicas. En general, los ensayos antignicos no son tan sensibles c o m o los ensayos funcionales y pueden no detectar niveles bajos de un componente presente en ciertos lquidos corporales. La sensibilidad de los ensayos antignicos en cierto grado de la concentracin del anticuerpo empleado, y con los ensayos habituales, puede medirse una cantidad de proteina antignica tan pequea como 10 pg/ml.

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COMPLEMENTO Y CININAS: MEDIADORES DE LA INFLAMACIN

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H a y kits disponibles que e m p l e a n la inhibicin de la unin de un sustraTabla 38-5 Amortiguadores e m p l e a d o s frecuentemente e n los to r a d i o m a r c a d op a r ad e t e c t a r varios pptidos del complemento. Estos e n s a y o s del complemento equipos estn disponibles para la medicin del C3a. C4a y C5a. La utilidad Soluciones stock* de estas m e d i c i o n e s todava est debatindose. Est disponible un infor1. Salino tamponado con Verona tslock 5 x VBS) m e detallado sobre los procedimientos de m e d i d a de la actividad ltica funDisolver 85 g de NaCI y 10.19 g de Na-5.5'dielil barbilurato en 1 . 5 I de cional y sobre los niveles antignicos de los c o m p o n e n t e s de la va alteragua destilada. Ajustar el pH a 7.350.05 con CIH IN y llevar hasta 2 l de volumen con aguda destilada Esta solucin es cinco veces la nativa (Minta, 1985). Tambin s eh a n descrito ensayos diseados para concentracin de una solucin isotmca y puede almacenarse a 4"C m e d i r la actividad funcional de los factores proteicos H e I de control en el durante al menos un mes. suero h u m a n o pero requieren reactantes especializados que pueden no 2. cido disodio etilendiaminetertetr actico 0.01 M (stock EDTA) e s t a r disponibles c o m e r c i a l m e n t e (Gaither. 1979). H a n sido desarrollados Disolver 37,2 g de Na-EDTA en alrededor de 600 mi de agua duslila e n s a y o s con ELISA para la medicin de productos de degradacin d e las da. Ajustar el pH a 7.650.05 con NaOH 2 N y llevar hasta I I de voluprotenas del c o m p l e m e n t o o para los complejos formados tras l a activamen con agua destilada El stock EDTA puede utilizarse durante al menos tres semanas con almacenaje a 4"C. cin del complemento. H a y equipos comercialmente disponibles (Quidel. San Diego. CA). Estos m i d e n los productos de degradacin de las prote3. Dextrosa con CaMg ' y gelatina (D5wg++) Disolver 100 g de dextrosa en 1 I de agua destilada. En un tubo sepanas del c o m p l e m e n t oam e d i d a que se generan tras la activacin del c o m rado disolver 1 g de gelatina en 50 mi de agua destilada calentnp l e m e n t o empleando anticuerpos monoclonales especficos. L a activacin dolo hasta que los granulos de gelatina estn disueltos Aadir la del c o m p l e m e n t o por la va clsica p u e d e medirse siguiendo los niveles de solucin de gelatina a la solucin de dextrosa Aadir 2 mi de la soluC4d en suero frente a los de C4. Tambin, la medicin por ELISA de los cin stock 4 y 2 mi de la solucin stock 5 a la mezcla Ajustar el pH a 7 35+-0.05 con NaOH 1 N y llevar hasta 21 de volumen Esta solucin complejos C1r-Cls-C1 inh proporciona u n a medida de la activacin del puede emplearse durante una semana cuando se almacena a 4 C c o m p l e m e n t o a travs de la via clsica. L a activacin de la va alternativa 4. MgCI. 1 M p u e d em e d i r s ep o rE L I S A evaluando los niveles de los complejos Bb, o Preparar 100 mi de solucin que contenga MgCI, 2 M aproximadaC3BbBP o C3bP en la circulacin (Mayes, 1984). Se inform de que las mente. Medir la gravedad especilica de la solucin y determinar la m e d i c i o n e s de dichos complejos cuantifican tan p o c oc o m o 10 a 20 ng/ml concentracin de MgCI.. del Handbook ol Chemistry and Physics' de C 3 b P en suero. Este ensayo puede tambin emplearse para medir los (tablas de conversin para valores concentrados de soluciones acuoc o m p l e j o s de activacin unidos a la superficie. L a activacin a travs d e sas) A|ustar la concentracin a 1 M aadiendo agua destilada Almacenar a 4C. cualquier via p u e d e monitonzarse midiendo los niveles de iC3b o de la lor5. CaCl 0.15 M m a soluble del complejo de ataque a la membrana. sC5b-9. Adems, los Se preparan 100 mi de una solucin de CaCK.3 M aproximadamente kits de ELISA estn disponibles para m e d i r la generacin de anafilotoxmas Medir la gravedad especilica de esta solucin y determinar el CaCl, en sueroplasma. Y a que el C3a y el C5a son rpidamente convertidos en como se describe arriba Ajustar a 0 1 5 M aadiendo agua destilada s u sf r a g m e n t o s desArg inactivos p o r carboxipeptidasa-N en el suero, estos Almacenar a 4"C. e n s a y o s emplean anticuerpos monoclonales especficos para el C3a-desArg y el C5a-desArg. Debido a su alta sensibilidad, estos ensayos con ELI- Soluciones de trabajo 1. VBS isolnico con gelatina y metales (GVBS++) S A proporcionan una herramienta excelente para evaluar la activacin del Aadir 200 mi de la solucin stock 1 (arriba) a 700 mi de agua destilac o m p l e m e n t oe n los lquidos biolgicos a travs lanto d e la via clsica da en un malraz alorado de 1 I de volumen Aadir 1 mi de la solucin c o m o de la va alternativa. Sin embargo, estos equipos generalmente s o n stock 4 y 1ml de la solucin stock 5. Disolver 1 g de gelatina en 50 mi de agua destilada calentando como se describi en la solucin stock caros y requieren que el usuario establezca una curva de dilucin estn3. Aadir la solucin de gelatina y ajustar el pH a 7.350.05 Llevar dar. P o r lo tanto, en un solo kit se puede incluir u n a cantidad limitada de hasta 1 I de volumen con agua destilada El GVBS++ debe prepararmuestras. se en Iresco una vez cada semana
2. Dextrosa-VBS Da en iones con metales y gelatina (DGVBStt)

Evaluacin funcional de la va clsica L o se n s a y o s funcionales del c o m p l e m e n t os o nh e r r a m i e n t a s sensibles y p r e c i s a sp a r a proporcionar informacin sobre la actividad de un c o m p o n e n t e . A l g u n o s de e s t o s mtodos p u e d e n utilizarse p a r a cuantificar la actividad del nivel m o l e c u l a r , y otros p a r ae x p r e s a r la funcin del c o m p l e m e n t o en unidad e s arbitrarias. L o s reactantes c o m e r c i a l e s estn disponibles p a r a valorar c a d ac o m p o n e n t ed e las vias clsica y alternativa. Sin embargo, p a r a la m a y o r parte, estos e n s a y o s son desarrollados en un limitado nmero de centros de investigacin. M u c h o se n s a y o s funcionales requieren procedimientos q u er e q u i e r e nt i e m p oyc o m p o n e n t e s del c o m p l e m e n t o relativamente m u y purificados, q u es o n ms caros q u e aquellos requeridos p o r los e n s a y o s antignicos. Por l o tanto, se limitar la descripcin d e los e n s a y o s del c o m p l e m e n t o a los mtodos d e referencia para la evaluacin de la activacin t a n t o de la via clsica c o m o de la alternativa. Los a m o r t i g u a d o r e s que se e m p l e a n f r e c u e n t e m e n t e en la mayora de los laboratorios d o n d e se desarrollan los e n s a y o s del c o m p l e m e n t os e describen e nl aT a b l a 38-5. U n od e b e darse c u e n t ad e que la preparacin precisa de estos amortiguadores e s crtica ya que c a m b i o s en la molaridad y en la concentracin del ion m e t a lp u e d e n afeelar a los ttulos obtenidos.

Los amortiguadores de diferentes potencias inicas son preparados mezclando la solucin stock 3 con la solucin de trabaio 1. El DGVBS++ 0,065 u se prepara mezclando tres partes de la solucin citada primero con dos partes de la segunda solucin. El DGVBS+t debe prepararse en Iresco.
3. EDTA-VBS isotmco (EDTA-GVBS)

Preparar el GVBS como en la solucin de trabajo 1 con la excepcin de utilizar 600 mi de agua destilada en lugar de 700 mi Ademas, las soluciones 4 y 5 no se aaden a esta solucin. Aadir 100 mi de la solucin stock 2 y ajustar el pH a 7.35 t 0,05 Llevar a un volumen de 1 i con agua destilada Esta solucin es estable durante al menos una semana a 4C
4. VBS isotnico con glicol etilen bis (b-aminoetil ter) N. N N. N acido tetraacetico e iones Mg- (EGTAGVBS+)

Aadir 50 mi de la solucin stock a 1 a 100 mi de agua destilada en un matraz aforado de 250 mi de volumen Aadir 1.25 mi de la solucin stock 4 Disolver 0 25 g de gelatina en 25 mi de agua destilada calentando como se describi en la solucin de Irabaio 1 y aadir a la solucin. Preparar una solucin stock EGTA aadiendo 0.761 g de E G T Aa 5 mi de agua destilada Disolver E G T A con NaOH 5 NI A|ustar el pH a 7,350.05 con acido actico al 5% y llevar a un volumen de 10 mi con agua destilada Aadir esa solucin stock de EGTA a la solucin de trabajo Ajustar el pH a 7,35t0,05 y llevar a un volumen de 250 mi con agua destilada El EGTA-GVBS+ debe prepararse en Iresco. I"L a s soluciones s t o c k 1. ? y 3 d e b e na l m a c e n a r s e de 20"C a -50"C d u r a n t e un

L o se n s a y o sq u em i d e nl a actividad hemolitica total e nu n am u e s t r a( C H 5 0 ) periodo de lempo indefinido * De W e s tR C (ed) CRC H a n d b o o k Ol C h e m i s t r y and F h y s i c sB o c a Ratn FL. CRC o la actividad funcional de los c o m p o n e n t e s del c o m p l e m e n t o aislados en Press 1985-t986. con permiso g e n e r a le m p l e a n eritrocitos d e oveja c o m o objetivos d el a lisis m e d i a d ap o re l c o m p l e m e n t o .L o s eritrocitos de oveja s o n ms sensibles a la lisis p o r antic u e r p o sym e d i a d ap o r el c o m p l e m e n t oq u e los eritrocitos de otras especies. a d e c u a d o s estn c o m e r c i a l m e n t e disponibles. La activacin de la via alternaAdems, estos eritrocitos expresan un glicoesfingolpido (antgeno de Forsstiva del c o m p l e m e n t os em i d e fcilmente e m p l e a n d o eritrocitos de conejo. m a n )q u ep r o v o c au n ar e s p u e s t ap o t e n t ed e los anticuerpos e nc o n e j o su n a E s t a s clulas son particularmente sensibles a la lisis i n d e p e n d i e n t e de antiv e zi n m u n i z a d o se s t o sa n i m a l e sc o n eritrocitos d e oveja. L o sa n t i c u e r p o s c u e r p o sm e d i a d ap o r el s u e r oh u m a n o .

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SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOIOGA tos de oveja sensibilizados con anticuerpos (EA) anti-Forssman de conejo. Como se describi anteriormente, este antgeno es altamente inmungenc e induce una respuesta de anticuerpos fuerte y especifica en los conejos inmunizados. El procedimiento para producir este anticuerpo fue descrito con detalle por Mayer (1961). Antes de utilizarlo, la actividad del complemento del antisuero es destruida por la inactivacin con calor a 56 C durante 30 minutos. Los mtodos para la titulacin del anticuerpo y para la preparacin de las clulas ptimamente sensibilizadas se explican en otras obras (Gaither, 1984). Es esencial que se utilice suficiente anticuerpo para sensibilizar a los eritrocitos de oveja de modo que pequeas diferencias en la cantidad de anticuerpo sensibilizado no afecten al titulo. Los eritrocitos de oveja sensibilizados con cantidades ptimas de anticuerpo se denominan EA Los componentes intermediarios de la clula con componentes del complemento unidos a la membrana, que se utilizan en la titulacin funcional individualizada de los componentes, pueden prepararse utilizando componentes de complemento purificados Los mtodos para la preparacin de estos intermediarios celulares ya se han descrito (Gaither, 1984).

Manejo de las muestras

El correcto manejo de las muestras es crtico para el correcto anlisis funcional del sistema del complemento. Par la mayora de los ensayos funcionales, se prefiere el suero al plasma para el anlisis ya que los quelantes del calcio como el EDTA o la heparina pueden ser no complementarios. Cuando las muestras son diluidas ms de 1:100 en los ensayos funcionales, el EDTA del plasma puede emplearse ya que la dilucin sobrepasa el electo quelante. Para obtener el suero para los ensayos funcionales, la sangre debe dejarse coagular durante 30 minutos a una hora a temperatura ambiente y despus en hielo durante al menos una hora. Si se necesitan estudios del fijador de C1q. se de|a la muestra coagular durante dos horas a temperatura ambiente. En este caso, la polimerizacin completa del cogulo parece facilitar la precisin del ensayo. Para separar el suero, se recoge el cogulo y se centrifuga de 0 a 4 C durante 5 minutos. Si se sospecha la existencia de anticuerpos cnoprecipitantes. la centrifugacin y formacin del cogulo de la muestra debe hacerse a 37 C ya que puede ocurrir la fijacin del complemento si la muestra se enfra. En ciertos casos, la congelacin disminuir los ttulos de complemento considerablemente. Aunque las razones de esto son desconocidas, debe tenerse en menEnsayo del complemento hemoltico total te que un ttulo considerablemente disminuido de complemento slo puede reflejar un artefacto de una preparacin srica inadecuada. Si se sospecha El ensayo ms simple sobre la va clsica mide el complemento hemoltico esto, el suero debe prepararse a 37 C invariablemente para evitar la activacin total. La ausencia de cualquiera de los nueve componentes, como ocurre en del complemento. Las muestras de suero o plasma deben dividirse en varios los pacientes con dficit gentico homocigotos. generalmente origina un ttuvolmenes pequeos y almacenarse inmediatamente a una temperatura de lo de complemento hemoltico total (CH50) de cero. Sin embargo, un valor -40 C a -80 C Las proporciones pueden almacenarse durante largos perionormal no excluye niveles disminuidos de los componentes individuales. dos de tiempo a -80 C o durante cortos periodos a -20 C sin prdida de la Cuando la historia y los sntomas de un paciente sugieren una posible defiactividad. Cuando los sueros deban transportarse, deben sellarse bien antes ciencia, deben pedirse los ttulos hemolitico y anlignico de los componentes de empaquetarse en un contenedor con grandes cantidades de hielo seco. individuales. A menudo, el ttulo de CH50 ser una medida funcional adecuada de la actividad del complemento.

Preparacin de eritrocitos
La sangre de oveja estril se obtiene de una solucin estril de Alserver. La sangre anticoagulada se almacena a 4' C durante una semana antes de utilizarse y puede emplearse durante un mximo de seis semanas si se mantiene estril. La edad de las clulas afecta mucho a los ttulos de la mayora de los componentes del complemento, y los ttulos pueden ser falsamente bajos si se utilizan clulas frescas. En condiciones estriles, se extrae aspticamente y se centrifuga a 4 C un volumen de clulas. Se extraen el sobrenadante y la capa leucocitaria. y se remtroducen las clulas en una solucin tampn adecuada. Los detalles del lavado y sensibilizacin de las clulas con anticuerpos se pueden ver en otras obras (Gaither. 1984). En caso de la via alternativa, se extrae aspticamente sangre de coneio en tubos con EDTA y se procesa c o m o la sangre de oveja.

Preparacin de eritrocitos de oveja sensibilizados con anticuerpos


Muchos trabajadores que publican titulaciones funcionales de componentes individuales o el ttulo de complemento hemoltico total emplean eritroci-

El titulo de complemento se expresa en unidades CH50 iei reciproco de la dilucin de la cantidad de complemento que lisa el 50% de EA). Se preparan diluciones seriadas de la muestra y se aaden al EA (Tabla 38-6). En este caso, el punto linal del 50% se determina por la transformacin de los datos de Von Krogh. Esta frmula derivada empricamente convierte la curva dosis-respuesta en forma de S en una funcin lineal. Se calculan los valores de / / 1 - / donde Yes la fraccin de glbulos rojos usados en el test de dilucin. Se construye una grfica en donde se representa el logaritmo del volumen relativo del complemento frente a los valores del logaritmo de V'1-V. Normalmente, se obtiene una lnea recta, y el titulo se calcula determinando el volumen relativo de complemento donde Y/T-Y= 1.0 (o 50% de la tisis) Esle valor se divide p o r el reciproco de la dilucin srica original (1:60 para el suero humanoi para calcular la concentracin de complemento srico que lisa el 50% de las clulas El ttulo de complemento representa el nmero de unidades hemoliticas 50% que estn presentes en 1 . 0 mi de suero no diluido (Mayer. 1961: Rapp. 1970). El suero de los conejillos de Indias con dficit de C4 est disponible comercialmente y es de utilidad para determinar la actividad funcional del C4 en una muestra. El mtodo se describe en otras obras (Gaither, 1984). En un nmero limitado de laboratorios est disponible el suero de humanos y conejillos de

CAPTULO 38

COMPLEMENTO Y CININAS: MEDIADORES DE LA INFLAMACIN

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Tabla 38-7 Titulacin funcional de la va alterna (ensayo AH50)

'Si una muestra se suero muestra algn grado de hemolisis (color rojizo), se prepara un sel de lubos adicionales (1 a 5) que contengan suero y amortiguador pero no E A la hora de calcular Y los valores de OD obtenidos con esta sene de lubos se sustraen de aquellos de las diluciones del suero de la muestra que estn mezclados con E E G T A GVBS+ = salmo isotnico tamponado con Veronal con gelatina, E G T A y MgCI.; E = eritrocitos; EDTA-GVBS = salino isotnico tamponado con Veronal con EDTA; CB = E solo con lampn; CL = E con agua destilada (lisis completa).
:

I n d i a s con dlicil de C2 y el de c o n e j o s con dficit de C6. E s t o s sueros son u n aa c e p t a b l e alternativa al e m p l e o de intermediarios celulares para titular los c o m p o n e n t e s individuales, ya que solo tienen la prdida de una protena del c o m p l e m e n t o , Ensayo de la va alterna

En e s t e ensayo, el s u e r oh u m a n o( n o r m a l m e n t e diluido primero a 1:5) se diluye s e r i a d a m e n t e y se aade a eritrocitos de conejo que no estn sensibilizados con un anticuerpo especfico en un tampn que contiene iones m a g Prueba de fijacin del complemento n e s i o y cido etilenglicol tetraactico (EGTA) para quelar los iones calcio (los Se dispone de una descripcin detallada de este e n s a y o (Mayer. 1961), y i o n e s calcio son necesarios p a r a la activacin de la via clsica, no p a r a la actiaqu no se detallar. Sin embargo, ya que las reacciones de fijacin del c o m vacin de la via alternativa) (Pangburn, 1988) ( T a b l a 38-7). El ttulo de la va l e m e n t o son de gran importancia en el diagnstico clnico, s e tratarn brealternativa se d e n o m i n aA H 5 0 y representa la dilucin final del suero h u m a n o p vemente. La tcnica de la p r u e b ad e p e n d e de la c a p a c i d a d del c o m p l e m e n t o en el e n s a y o que lisa el 50% de los eritrocitos de conejo. Se crea una grfica del suero fresco de i n t e r a c c i o n a r con c o m p l e j o s antgeno-anticuerpo. En la similar a la descrita p a r a la litulacin del c o m p l e m e n t o hemoltico total para primera e t a p a de la reaccin, el c o m p l e m e n t o es i n c u b a d o con los m a t e r i a l e s d e t e r m i n a r el AH50. El suero h u m a n op u e d ep o s e e rav e c e s anticuerpos que p u e d e nc o n t e n e r el antigeno y el anticuerpo. Si se f o r m a nc o m p l e j o s ant"naturales" p a r a un c a r b o h i d r a t oe x p r e s a d oa m p l i a m e n t e en las clulas d e o ne lc o m p l e m e n t o del m i s m om o d oq u e los o t r a se s p e c i e s diferentes de los h u m a n o s y de los primates. Si se m e z c l au n a geno-anticuerpo, interaccionan c c o m p l e j o s de a n t i c u e r p os o b r e el a n t i g e n o de superficie c e l u l a ri n t e r a c c i o n a n alta concentracin de suero con los eritrocitos de c o n e j os ep u e d e inducir la c o n el c o m p l e m e n t o . El c o m p l e m e n t o es activado, los c o m p o n e n t e ss o n fragaglutinacin, que p u e d e alterar la interpretacin del titulo de A H 5 0 (Tomlinson, m e n t a d o s , y el c o m p l e m e n t o es "utilizado" o "fijado". En la s e g u n d a etapa, se 1997). P o r lo tanto, p u e d e ser til a b s o r b e r el suero con c o n c e n t r a d o de erie z c l a se i n c u b a a 37 C trocitos de c o n e j o lavados en hielo d u r a n t e 15 a 30 m i n u t o sp a r ae x t r a e ru n a aaden las clulas de oveja sensibilizadas (EA). y la m durante u n a hora. Si el s u e r o de la p r u e b ac o n t i e n e el a n t i c u e r p oc o n t r a el cierta proporcin de anticuerpos naturales, d i s m i n u y e n d o asi la aglutinacin antgeno utilizado, el c o m p l e m e n t o se lija y p o r lo tanto no est disponible pac e l u l a r en el ensayo. ra lisar el EA. Por ello, la a u s e n c i a de lisis indica una reaccin positiva, y la lisis c o m p l e t ai n d i c a un resultado negativo. Niveles del complemento mediante H a y dos aproximaciones generales de las pruebas de fijacin del c o m p l e ensayos antignicos m e n t o . En la primera, el s u e r oc o n c e n t r a d o es el que p r o p o r c i o n a el c o m p l e m e n t o , y la cantidad de c o m p l e m e n t o fijado se d e t e r m i n a por la titulacin del P a r a utilizarla en e n s a y o s antignico, la m u e s t r a (ya sea suero o plasma) suero antes y despus de la fijacin. En la segunda, se e m p l e au n a dilucin s ea l m a c e n a congelada (20C o menos). La contaminacin bacteriana puede s u e r oq u e proporciona suficiente c o m p l e m e n t op a r a la lisis de EA o p o c o de originar la desnaturalizacin o la fragmentacin de las protenas, m i e n t r a s i n c o unidades CH50) En este caso, se aaden las q u e el hielo y el deshielo no tienen un electo a d v e r s oi m p o r t a n t es o b r e los ms del suficiente (tres a c clulas sensibilizadas sin dilucin posterior d e la c a n t i d a dd ec o m p l e m e n t o . niveles antignicos. En ciertos e n s a y o s del c o m p l e m e n t o , la m u e s t r a se diluLa incubacin del material del test con el c o m p l e m e n t op u e d eh a c e r s e a 37 C ye en salino para o b t e n e r el ndice correlo de concenlracin para la adecuadurante una hora o t o d a la n o c h e en fri. En general, la incubacin en fri orida cuantificacin. gina ttulos mayores. El c o m p l e m e n t op u e d ea c t i v a r s ep o r un nmero d e L o s anlisis antignicos d e las proteinas del c o m p l e m e n t oh a c e n uso de a g e n t e s diferentes de los c o m p l e j o s antgeno-anticuerpo c o m o las bacterias, una de las m u c h a s tcnicas de precipitacin inmune. La inmunodifusin radial e n d o t o x i n a s y y-globulinas agregadas. P o r lo tanto, s o nn e c e s a r i o sl o sc o n s i m p l e (RID) utilizando el mtodo ya sea de F a h e y o de Mancini es el mtotroles p a t ad e m o s t r a r que ni el suero ni el antgeno aislados fijarn el c o m do e m p l e a d o ms frecuentemente para calcular una cuantificacin especfica plemento. El test de fijacin del c o m p l e m e n t oe s de particular v a l o r en t a n t o d eu n a protena. En a m b o s mtodos, el antgeno se aade a los pocilios en que n o n e c e s i t a que l o s anti g enos o l o s a n t i c u e r p o s estn p r e s e n t e s en su un gel q u ec o n t i e n e anticuerpo, y se f o r m a n anilos de precipitacin. El mtof o r m aa l t a m e n t e purificada. P u e d e n utilizarse tanto antgenos solubles c o m o do de F a h e ye m p l e a un anticuerpo que no est en exceso. El t i e m p o de difuparticulados, y se p u e d e nm e d i rt a n t o los antgenos c o m o los anticuerpos. sin al que los r e s u l t a d o s son ledos es por ello crtico. Los p u n t o s de difusin o m p l e m e n t o es el e m p l e o finales no se alcanzan y p u e d e n levar a m e d i c i o n e si n a d e c u a d a s de los nive-Una aproximacin alternativa al test de fijacin del c de e n s a y o s con ELISA que m i d e n los p r o d u c t o s de fragmentacin de las proles del c o m p l e m e n t o antignico. El mtodo de M a n c i n i utiliza un e x c e s o de tenas del c o m p l e m e n t o o de los c o m p l e j o sf o r m a d o s tras la activacin del a n t i c u e r p o en un gel y es ms sensible y exacto. El mtodo de M a n c i n i se uticomplemento, c o m o se discuti previamente. De cualquier m o d o , estos ensaliza p o rm u c h a s firmas c o m e r c i a l e sp a r a la preparacin de los cristales de

inmunodifusin. Existen disponibles equipos de inmunodifusin radial p a r a todos los c o m p o n e n t e s de la va clsica y alternativa. E s t o s equipos consisten e n cristales cubiertos d eu n a tina c a p ad ea g a r o s aa l2 %q u ec o n t i e n e n anticuerpos monoespecficos. El suero proteico estndar (un pool estabilizad od e suero h u m a n o normal) s e suministra, normalmente, e n soluciones prediluidas. C a d a solucin estndar contiene una cantidad especfica de la protena que s e est m i d i e n d o para su uso en la construccin d e la c u r v ad e referencia.

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SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA efectos vasculares. La des-Arg bradicinina entonces es degradada por la enzima convertidora de angiolensma para formar pptidos de bajo peso molecular que pierden su actividad biolgica. Los inhibidores del sistema de generacin de cininas incluyen el C1 inhibidor, la ,-macroglobulina, y el .-proteasa inhibidor El Cl inhibidor y la -macroglobulina son los principales inhibidores de la calicreina activa, ejerciendo el C1 inhibidor la influencia ms potente. El C1 inhibidor y la ,-proteasa son los dos principales inhibidores del laclor de Hageman activo. El angioedema hereditario resulta de la deficiencia gentica o adquirida del C1 inhibidor. Se cree que las caractersticas clnicas asociadas con esta enfermedad surgen de la prdida del control adecuado del sistema de generacin de cininas por el C1 inhibidor (Cugno, 1998: Davis. 1998) Tambin existen en el plasma los qumingenos de bajo peso molecular y pueden actuar como sustrato de la bradicinina. Los qumingenos no son fciles de degradar por la calicreina del plasma, pero las calicreinas tisulares presentes en las clulas pueden degradar el quiningeno de ba|0 peso molecular a bradicinina con una lisina adicional unida. Presumiblemente, la lisil-bradicinna sufre la misma va de degradacin que la bradicinina, Se ha postulado que la bradicinina juega un papel en una variedad de enfermedades. La bradicinina y la lisil-bradicinina libres se han encontrado en el fluido nasal en la rinitis. Tambin se ha sugerido un papel patognico para la bradicinina en enfermedades que van desde el asma al angiodema hereditario, asi como otras clases de enfermedades edematosas incluyendo la inflamacin. Est claro que no se conoce totalmente el papel exacto del sistema generador de cininas en las enfermedades. Sin embargo, la brad cinina y sus derivados indudablemente son importantes en el edema y el dolor asociados con la inflamacin.

yos utilizan equipos comerciales que generalmente son caros comparados con la prueba de fijacin estndar.

CININAS Y SISTEMA DE GENERACIN DE CININAS


El sistema de generacin de cininas es una va mediadora secundaria presente en el plasma y activa en las superficies celulares que controla la generacin de pptidos que son importantes en la respuesta inflamatoria. Aqu ser descrito brevemente. Para ms detalles, se remite al lector a recientes revisiones sobre el tema (Kozin. 1992: Sharma. 1990: Vio. 1998; Margolius. 1995). El pptido biolgicamente activo ms importante generado por este sistema parece ser la bradicinina, un nonapptido con potente actividad en muchos sistemas biolgicos. Es activa en aumentar la permeabilidad vascular, vasodilatacin, hipotensin, induccin del dolor, contraccin de muchos tipos de clulas musculares lisas, y activacin del sistema de la fosfolipasa A, con su funcin de activacin del metabolismo del cido araquidnico celular. Aunque en muchas cosas se parece al sistema del complemento, el sistema de generacin de cininas del plasma es ms simple debido a que est compuesto solo por cuatro protenas plasmticas. Los elementos tisulares tambin generan cininas. Las principales protenas del sistema de generacin de cininas comprendidas actualmente son el factor de Hageman. el factor de coagulacin XI, la precalicrena y el quiningeno de alio peso molecular. El factor XI circula en el plasma como un complejo con el quiningeno de alto peso molecular con una relacin molar de 2:1. La precalicrena tambin circula en un complejo con el quiningeno de alto peso molecular con una relacin molar de 1:1. En contraste, el factor de Hageman circula como una protena plasmtica de cadena simple, no formando complejos. Al igual que en la secuencia de activacin del complemento, la secuencia de generacin de cininas sigue una va especfica. Interaccionando con superficies con carga negativa, como aquellas conseguidas experimentalmente con cristal o naturalmente con muchos materiales activos biolgicamente como el lipido A de la endotoxina de las bacterias Gram negativas, el factor de Hageman es degradado y activado. El factor de Hageman degradado (uHFa) tiene actividad proteoltica y despus activa y degrada las molculas del tactor de Hageman adicionales para generar ms aHFa. La degradacin de la cadena simple del factor de Hageman (peso molecular de 80 kDa) libera las cadenas pesada y ligera (pesos moleculares de 50 y 28 kDa. respectivamente) que permanecen unidas por enlaces disulfuro. El lugar enzimtico activo del factor de Hageman reside en la cadena ligera. Muchas enzimas proteolticas, incluyendo la calicreina. pueden degradar y activar al factor de Hageman. El HFa mteracciona con el complejo del factor XI y el quiningeno de alto peso molecular para activar el factor XI a factor Xla, originando la activacin de la cascada intrnseca de la coagulacin. El HFa tambin interacciona con el complejo quiningeno de alto peso molecular-precalicreina para degradar la cadena simple de la precalicrena en una molcula de dos cadenas, la calicreina. con las cadenas unidas por puentes disulfuro. La precalicrena degradada tiene actividad enzimtica proteoltica localizada en la cadena de menor peso molecular. Todas estas degradaciones ocurren mucho ms eficazmente cuando las protenas se unen a superficies cargadas negativamente, las cuales son crticas para la activacin de la cascada. La calicreina activada degrada al qummogeno de alto peso molecular en muchos lugares, liberando bradicinina. La calicreina activa, generada por la degradacin de la precalicrena, tambin es capaz de degradar posteriormente el HFa a un producto de menor peso molecular con una cadena ligera intacta, la |iHFa. La |iHFa puede degradar y activar al complejo quiningeno de alio peso molecular- precalicrena pero no permanece en la superficie de unin y no interacciona eficazmente con el complejo quiningeno de alto peso molecular-factor XI. La bradicinina tiene una vida media corta ya que se inactiva rpidamente por la carboxipeptidasa-N. la cual elimina la arginina carboxi-terminal para formar des Arg bradicinina. Esta molcula ya no tiene la actividad de la bradicinina de contraer el msculo liso y no puede inducir la salida de lquido vascular cuando es inyectada en la piel Sin embargo, conserva algunos de sus

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CAPTULO 38

COMPLEMENTO Y CININAS: MEDIADORES DE LA INFLAMACIN

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SECCIN V

INMUNOIOGI'A E INMUNOPATOIOGIA

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CAPTULO 38

COMPLEMENTO Y CININAS: MEDIADORES DE LA INFLAMACIN

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C A P T U L O

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Gtocinas y molculas de adhesin


H. Davis Massey, M.D., Ph.D., D.D.S. Richard A. McPherson, M.D.

CITOCINAS lnterleucina-1 lnterleucina-2 lnterleucina-3 lnterleucina-4 lnterleucina-5 lnterleucina-6 lnterleucina-7 lnterleucina-8 y las quimiocnas lnterleucina-9 lnterleucina-10 lnterleucina-11 lnterleucina-12 lnterleucina-13

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lnterleucina-14 lnterleucina-15 lnterleucina-16 lnterleucina-17 lnterleucina-18 Factor transformante del crecimiento |i Factor de necrosis tumoral Interfern-y MOLCULAS DE ADHESIN CELULAR Integrinas Selectinas PERSPECTIVAS BIBLIOGRAFA 924 924 922

CITOCINAS
La secrecin y la unin de las citocinas es el equivalente celular a estar "en lnea". El entorno predominante de citocinas en un organismo forma un Internet" de comunicacin entre las clulas. Las seales de las citocinas son recibidas sobre la superficie celular y no slo como simples mensajes, sino tambin como combinaciones complejas e imperceptibles sinrgicas y antagnicas que regulan procesos como la respuesta inmune, la migracin celular y la cicatrizacin de las heridas. Para responder a los mensajes especficos de las citocinas, las clulas despliegan miles de receptores de superficie de citocinas, presentados como mltiples antenas. Utilizando estos receptores, las clulas seleccionan, procesan y responden a combinaciones de citocinas solubles y de unin a sustratos de manera dependiente de la densidad y el estado de activacin de los receptores de superficie. El trmino "citocina" se refiere a los productos solubles de las "clulas" en senlido genrico. Muchos tipos celulares son capaces de producirlas, pero para la mayor parte son la clula T y el macrfago las factoras virtuales de citocinas. y por esta razn muchas familias de citocinas se conocen como interleucinas (IL). Aunque los bioanlisis son a veces el mtodo de referencia para la deteccin de la actividad de las citocinas, normalmente llevan mucho tiempo y son difciles de realizar en un laboratorio de hospital. Los equipos de ensayo con enzima fijada a inmunoabsorbente (ELISA) estn ampliamente disponibles para muchas de las citocinas descritas en el texto. Las tcnicas moleculares (reaccin en cadena de la polimerasa [PCRJ. hibridacin n situ) se emplean en laboratorios ms modernos para identificar la presencia de citocinas con alta sensibilidad y para localizar ms precisamente una citocina de un tipo celular particular. En los aos recientes la lista de citocinas se ha ampliado, pero slo se presentan aquellas para las que se conoce suficiente informacin.

lnterleucina-1
La familia de citocinas de la IL-1 contiene tres protenas: la IL-1r/. y la IL-1|3 (los dos componentes agonistas), y el antagonista del receptor de IL-1 (IL-1 RA), un antagonista especfico de receptor que ocurre naturalmente (Dinarello, 1998). Los tres genes separados que codifican estas citocinas proinflamatorias han sido mapeados en el brazo largo del cromosoma 2. La IL-1a y la I L 1 1 5 son sintetizadas como protenas precursoras intracitoplasmticas de 31 kDa que son degradadas para generar las formas biolgicamente activas de 17 kDa. La pro-IL-1a es convertida en su forma activa a travs d e la accin de proteasa extracelulares, aunque la proforma no degradada puede estimular el crecimiento autocrino cuando es liberada por los queratinocitos, por las clulas T colaboradoras tipo II (Th2) o por los timocitos. La pro-IL-l f 5 se convierte intracelularmente en su forma biolgicamente activa por la enzima convertidora de IL-1|i (ICE), una enzima asociada a la apoptosis. Se han descrito dos receptores de IL-1: un receptor tipo I de 80 k D a ampliamente expresado {IL-1 Rl) que transduce la seal cuando se une tanto a IL-1 a como a IL-1 p, y un receptor tipo II de 67 kDa ms restringido (para neutrfilos, monocitos y clulas B) (IL-1RII). El II1-RII no transduce la seal intracelular, incluso cuando se une a su ligando preferido, la IL-1 (5, y por lo tanto se ha descrito como un receptor "seuelo" que acta como un "escondite" para las molculas de IL-1 (i Una vez unido a su ligando el IL-1 Rl se asocia con una proteina accesoria (IL-1 RAcP). Juntos sealizan el ncleo a travs de muchas vas de cinasas de protenas asociadas a macrotbulos (MAP) que activan los factores de transcripcin nuclear incluyendo el factor nuclear (NF) K(. entre otros (O'Neill, 1996). La molcula antagonista IL-IRA es capaz de unir IL-1RI y IL-1 RH. pero no inicia la seal de transduccin intracelular. Como regulador primario de las respuestas inmunes e inflamatorias, la IL-1 exhibe miles de efectos biolgicos (Rosenwasser, 1998). Optimiza el

CAPTULO 39

CITOCINAS Y MOLCULAS DE ADHESIN

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complejo mayor de histocompatibilidad antgeno.'receptor de clulas T (MHC/TCR) mediando la activacin de las clulas T como un componente importante de seal no conocida, y aumenta la actividad de las citocinas derivadas de la clula T como la IL-2 a travs de la regulacin a la alta del receptor de IL-2. La IL-I estimula la proliferacin de la clula progenitora hematopoytica (CPH) en sinergia con los factores estimulantes de colonias hematopoyticos, y cuando se administra aislada moviliza neutrofilia derivadas de la mdula sea. Las evidencias indican un papel para la IL-1 en promover el crecimiento y proliferacin de algunas lineas celulares leucmicas, pero es citotxica directamente para algunas clulas mlecladas por virus y para algunas clulas tumorales. La capacidad de la IL-1 de estimular el metabolismo del cido araquidnico empleando eicosanoides como la prostaglandina E, y los leucotnenos como intermediarios, y su capacidad para inducir la produccin y liberacin de cantidades de otras citocinas explica gran parte de su actividad proinflamatoria. En los lugares de inflamacin, la IL-1 origina una regulacin a la alta de los receptores de molculas de adhesin sobre el endotelio vascular y estimula la produccin de quimiocinas conduciendo a la acumulacin local de leucocitos. En situaciones de alergia como la hipersensibilidad Tipo 1, la IL-1 puede aumentar la liberacin de histamina de los basfilos y eosinfilos, contribuyendo esto a la broncoconstriccin al estimular al msculo liso vascular. La IL-1 es responsable de la produccin de reactantes de fase agua por el hgado (p. ej.. complemento, pplido C reactivo) a expensas de protenas transportadoras como la albmina. Para pagar el coste de los aminocidos de la sntesis masiva de pptidos, la IL-1 promueve la ruptura muscular, acontecimiento que explica la mialgia que acompaa a algunas enfermedades. La IL-1 contribuye a la dilatacin vascular y a la hipotensin en el choque sptico a travs de la induccin de xido ntrico (NO) en las clulas endoteliales. y tambin puede ser un significativo mediador del choque cardiognico. En el sistema nervioso central (SNC). la IL-1 promueve la fiebre, la aorexia, el sueo de ondas lentas y la letargia, as como la liberacin de corticodes del hipollamo. En los lugares articulares, la IL-1 promueve la proliferacin de clulas sinoviales. el depsito de colgeno, la resorcin del cartlago y el hueso; acciones que tienen implicaciones en enfermedades inflamatorias como la artritis reumatoide (AR). Cuando se administra en humanos en dosis bajas, la IL-1 origina profundas reacciones febriles y hipotensoras similares a las inducidas por las dosis bajas de endoloxinas. Hay un leve aumento acompaante de la hematopoyesis, que puede disminuir el punto ms bajo y acortar el periodo de supresin medular en los que reciben quimioterapia supresora medular (lizumi. 1991). Sin embargo, el efecto beneticioso de la administracin de IL-1 est limitado por su profunda toxicidad. Un nivel elevado de IL-IRA puede ser ms sensible como marcador de actividad de enfermedad que las elevaciones de cualquier isoforma de IL-1. El aumento de los niveles de IL-1 RA se observa tras el infarto de miocardio, los procedimientos de ciruga general, y en personas asintomticas que tienen el virus de la inmunodeficiencia humana tipo 1 (HIV-1). Adems, la severidad de la enlermedad a menudo es mejor indicada por los niveles de IL-1 RA que por los niveles de IL-1. Esto puede ser cierto en enfermedades del hgado, en estados autoinmunes y en enfermedades infecciosas (Dinarelio, 1996,1998). L a elevacin del IL-1 RA puede representar un importante esfuerzo para minimizar los intensos efectos txicos de los niveles sistmicos aumentados de IL-1: la inyeccin de IL-1 RA en ratones justo antes de darles endotoxina intravenosa aument la supervivencia. La IL-1 RA administrada a pacientes con choque sptico produjo una mejora de la mortalidad dosis-dependiente medida al da 28, pero este efecto no se observ uniformemente en ensayos posteriores ms grandes (Fisher, 1994). El mejor xito con la terapia con IL-1 RA se obtuvo en un gran estudio doble ciego completado en pacientes con artritis reumatoide. Los resultados indicaron una reduccin dependiente de la dosis de IL-1 RA en el edema articular, y una reduccin significativa en las nuevas erosiones seas (Bresnihan, 1998). Otros ensayos clnicos que evaluaban la eficacia de la administracin de IL-1 RA en la enfermedad injerto contra husped (EICH) cortico-resistente mostraron una mejora en la mayoria de los sujetos (Anlin. 1994).

lnterleucina-2
La IL-2 es una glicoproteina de 15.5 kDa, con 1 3 3 aminocidos, miembro de la familia de las citocinas de cuatro hlices-!/ (Bazam, 1990), con dos puentes disulfuro en su eslructura tridimensional Su gen codificador ha sido secuenciado en el cromosoma 4. La activacin de las clulas T y la liberacin de la IL-2 resulta de la interaccin entre el TCR y el anligeno presentado en asociacin con las molculas de MHC sobre las clulas presentadoras de antigeno (APCs) (Fraser, 1991). El receptor para la IL-2 (IL-2R) es un complejo de membrana tripartito compuesto por una cadena o de 55 kDa, una cadena |5 de 70 a 75 k D ayu n a cadena y de 64 kDa (Waldmann. 1998). El IL-2R existe en tres formas moleculares: un complejo de alta afinidad para las subunidades a. [J. y y. un complejo de afinidad intermedia de las subunidades |i y y, y un receptor de baja afinidad hecho solo de IL-2Ru. Solo el IL-2R</|ly y el IL-2R|iy son capaces de Iransducir la seal tras la unin con el ligando. En las clulas T y en las clulas asesinas naturales (NK). la IL-2 activa vas mtracelulares incluyendo la JAK-1 y la JAK-3 de la familia de las cinasas Jane, que actan a su vez en sus sustratos. STAT-3 y STAT-5. de transductores de la seal y activadores de la familia de Iranscnpcion de los factores de transcripcin. Los genes diana de las vas de sealizacin activadas por IL-2 incluyen el bcl-2. c-myc. c-jun. y c-los (Gmez, 1998). Ya que comparten las cadenas ot y y de las subunidades del receptor, la IL-2 y la IL-15 tienen actividades biolgicas solapadas. Junto con la IL-15. la IL-2 estimula la proliferacin in vitro de las clulas T CD4/CD8+ activadas, las subpoblaciones de clulas T y/5, y las clulas NK (Burln, 1994), mientras que promueve la funcin citoltica de los linfocitos T citxicos (LTCs) y de las clulas asesinas activadas por linfocinas (LAK) (Burton, 1994; Grabstein. 1994). Adems, ambas citocinas pueden inducir la proliferacin de las clulas B estimuladas, y la sntesis de IgM. La IL-2 es tambin quimiotctica para las clulas T (Wilkinson. 1995: Armitage. 1995). In vivo, la IL-2 puede jugar un papel indispensable en el mantenimiento de tolerancia a lo propio, ya que los animales con dficit de IL-2 desarrollan enfermedades de inmunodeficiencia y autoinmunes como la anemia hemolitica y la enfermedad inflamatoria intestinal (vVillerford, 1995). Los ratones sin IL-2R-|5 desarrollan espontneamente activacin de clulas T y diferenciacin celular plasmtica de clulas B. con aumento de los niveles sricos de IgG e IgE (Suzuki, 1995: Wang. 1996). Esto sugiere que la IL-2 puede provocar la induccin a la anergia o a la apoptosis en la muerte celular de clulas T por activacin (AICD). La readministracin de linfocitos infiltrantes de tumor aislados (TIL) que han sido expandidos y activados in vitro con IL-2 y OKT3. con infusiones farmacolgicas de dosis de IL-2. son terapias prometedoras para los tumores malignos inmunogenicos como el melanoma maligno (Goedegebuure. 1995). La actual terapia inmunosupresora para los receptores de alotransplantes incluye los inmunosupresores ciclosporina A, FK-506, y Rapamicina. Estos agentes se unen a las dianas inmunofilinas inlracelulares, creando un complejo frmaco-inmunofilina que bloquea la capacidad del factor nuclear de las clulas T activadas (NF-AT) de activar los genes de la IL-2 necesarios para la proliferacin de las clulas T, y otros genes necesarios para la activacin de las clulas B (Ho. 1996), produciendo asi inmunosupresin.

lnterleucna-3
La actividad de la IL-3 fue detectada por primera vez en cultivos de linfocitos espemeos de ratn, donde induca a la enzima 20-i/-hidroxiesteroide deshidrogenasa (Ihle, 1981). Es una protena de 26 kDa sometida a un estricto control regulador y expresada en una poblacin de clulas restringida que incluye las clulas T activadas, las clulas NK. los mastocitos y algunos megacariocitos (Blalock, 1999). La sntesis adecuada de IL-3 requiere la activacin de las clulas T a travs del complejo TCR'CD3 Esto inicia las vas mtracelulares conduciendo a la activacin del NF-KB, que se introduce en el ncleo para transactivar la expresin del gen IL-3 (Park, 1993: Link, 1992). El receptor de IL-3 (IL-3R) es un miembro de la familia gnica de los receptores de citocinas y tiene una cadena | 5 especfica de ligando asociada no covalentemente con una cadena de transduccin de seal |i. El gen que la codifica ha sido secuenciado en el cromosoma 5 (Blalock. 1999)

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SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA te en una cadena u especfica de ligando y una cadena |5 de transduccin de seal comn a los receptores para la IL-3 y GM-CSF (Tavernier. 1991). Los dominios intracitoplasmticos de las subunidades </. y \i contiene regiones implicadas en la unin del JAK-2 y el JAK-1. respectivamente, que son necesarios para la transduccin de seales. No se ha descrito completamente la total distribucin tisular del IL-5R. pero parece estar restringida a los baslilos y eosinfilos. La IL-5 es producida por las clulas Th2 que liberan la cilocma cuando son estimuladas apropiadamente. Los mastocitos. las clulas NK. las clulas B, los eosinfilos, las clulas malignas y algunas clulas transformadas por virus son capaces tambin de secretar IL-5. La IL-5 promueve la diferenciacin, la migracin, la activacin, la degranulacin y la supervivencia de los eosinfilos. Estudios en ratones implican a la IL-5 aislada en la estimulacin de la produccin de eosinfilos in vivo (Tominaga. 1991; Dent, 1990). La IL-5 es responsable de la induccin de la acumulacin, activacin y degranulacin de los eosinfilos tras el contacto antignico, posiblemente a travs de su gran actividad quimiotctica, de su capacidad de producir una regulacin a la alta de ciertas molculas de adhesin presentes en los eosinfilos como CD11b. y promoviendo la liberacin de granulos de IgG inducida (Wang, 1989: Walsh, 1991; Fujisawa. 1990). El papel de la IL-5 en la enfermedad humana puede incluir la produccin de dao en la membrana basal observado en el penfigoide ampollse promover la infiltracin eosinfila en los lugares de infestacin parasitaria, y promover la produccin de anticuerpos del receptor de la antitirotropma en la enfermedad de Graves. Adems, la eosinofilia local de la enfermedad de Hodgkin puede estar asociada con la capacidad de las clulas de Reed-Sternberg de liberar IL-5. En las respuestas alrgicas, la IL-5 liberada por los mastocitos lisulares puede servir para promover la acumulacin de eosinfilos en los tejidos (revisado en Lalani. 1999). Actualmente, se emplea el ELISA para la medicin in vilro de la IL-5, y las tcnicas de inmunofluorescencia permiten la localizacin de IL-5 en clulas especificas, mientras que la hibridacin in silu permite la precisa localizacin de la IL-5 en las clulas individuales.

Las clulas diana de la IL-3 incluyen los precursores in vilro de las clulas T y clulas B. La administracin in vivo de IL-3 a dosis farmacolgica origina un aumento de la produccin de eritrocitos, leucocitos y plaquetas en ratones, mientras que la sobreexpresin de IL-3 mediada por retrovirus en las clulas medulares conlleva el desarrollo de un sndrome meloproliferativo no neoplsico (Metcalf. 1986; Chang, 1989). Se ha sugerido un papel para la IL-3 en el desarrollo de la hipersensibilidad por contacto, ya que los ratones con dficit de IL-3 muestran un desarrollo escaso de la hipersensibilidad retardada del tipo hapteno especfico (Mach. 1998). Adems, evidencias muestran un papel para la IL-3 en el desarrollo normal del SNC (Chiang. 1996).

lnterleucina -4
La IL-4 (Paul, 1991) desarrolla importantes funciones en la regulacin de la produccin de anticuerpos, en la hematopoyesis, en la inflamacin y en el desarrollo de las respuestas T celulares efectoras. Es una protena compleja con muchos puentes disulfuro intramoleculares y muchos lugares de glicosilacin cuyo gen ha sido secuenciado en el cromosoma 5. La produccin de IL-4 est altamente regulada y se restringe a las poblaciones de clulas T activadas, mastocitos, bastilos y eosinfilos. Los efectos biolgicos de la IL-4 estn mediados a travs de receptores de IL-4 de alta afinidad (IL-4R) compuestos por una cadena a. especfica de ligando, y una cadena y de seal de transduccin compartida por muchas otras citocinas incluyendo la IL-7 y la IL-2. El dominio extracelular del IL-4R tiene homologa con el IL-5Ra y con el IL-6R. La IL-4 activa las clulas B y promueve su diferenciacin, reflejando el hecho de que la IL-4 fue descrita por primera vez en los sobrenadantes de cultivos de clulas T activadas y factor de crecimiento de clula B duplicado. Adems de inducir la expresin de CD23 y molculas de MHC en las clulas B, regula la apoptosis de las clulas B y el cambio de isotipo. particularmente de lgG1 a IgE (Brown. 1997). En el conjunto de la hematopoyesis, la IL-4 estimula la formacin de colonias por los precursores eritroides, megacariocticos. mastociticos y granulocito/monocticos, mientras promueve el desarrollo de poblaciones Th CD8+ y CD4+ (Sillaber, 1991; Erard, 1993). En la respuesta inflamatoria, la IL-4 induce la proliferacin de clulas endoteliales, y origina una regulacin a la alta de las molculas de adhesin celular del endotelio. Activando el endotelio de esta forma, la IL-4 permite el aumento de la adhesin leucoctica a la superficie de los vasos de modo que las clulas inflamatorias migran a los lugares de inflamacin local. Adems, la IL-4 es quimiotctica para los eosinfilos y facilita la citotoxicidad de los monocitos y de las clulas T (Tepper, 1989; Crawford. 1993). Se encuentra un aumento de los niveles de IL-4 en enfermedades alrgicas como la dermatitis atpica y en la fiebre del heno, y los ratones transgnicos para la IL-4 desarrollan un trastorno alrgico en el prpado (Tepper, 1989). La IL-4 tambin puede conferir un grado de proteccin ante algunos parsitos extracelulares, y disminuir el dao de las respuestas autoinmunes inhibiendo las respuestas prolongadas de clulas T (Finkelman, 1986; Rapoport, 1993). La IL-4 participa en la inmunidad tumoral ya sea promoviendo a las clulas N K efectoras o la actividad tumorcida de los macrfagos (Bosco, 1990). Al mismo tiempo, la IL-4 est implicada en el crecimiento de las leucemias de clulas T humanas in vilro. Como est asociada con un cambio de las clulas efectoras CD8+ a clulas no citotxicas, la IL-4 puede jugar un papel en la progresin del sndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) (Erard, 1993). Los niveles elevados de IL-4 en las lgrimas y en la sangre de pacientes atpicos determinados por ELISA sugieren un papel para la IL-4 en la enfermedad alrgica y puede servir como marcador de severidad de la enfermedad (Pranos, 1998: Fujishima, 1995).

lnterleucina-6
La IL-6 fue identificada inicialmente en los sobrenadantes de cultivos de clulas T cooperadoras como un agente capaz de inducir la proliferacin de una inmunoglobulna secretada por las poblaciones de clulas B. Sin embargo, sus acciones se extienden a muchas clulas diana y ahora se reconoce como una citocina importante inmune, hematopoytica y proinflamatoria (Hirano. 1998). La IL-6 es secretada como un pptido de 184 aminocidos de alrededor de 21 kDa, dependiendo de su grado de glicosilacin. El gen que codifica la IL-6 ha sido secuenciado en el cromosoma 7 (Hirano, 1986). La molcula de la IL-6 se caracteriza por cuatro asas a-helicoidales conectadas por asas de pptidos interpuestas (Bazan, 1990). El complejo del receptor de la IL-6 (IL-6R) (revisado en Hirano, 1998) es un miembro de la supertamilia de receptores de citocinas y est compuesto de una cadena de unin a especfica de ligando de 80 kDa (IL-6R) y una cadena de sealizacin |i no asociada covalentemente. la gp130. La subunidad (i es compartida por otros receptores incluyendo los de la IL-11 y del GM-CSF, y se marca por cuatro residuos conservados de cisteina y un dominio triptfano-serina-X-triptfano-serina en su regin amino-terminal. Esto puede explicar en la redundancia funcional observada en las actividades de estas citocinas. El complejo IL-6R combinado forma un receptor de alta afinidad para la IL-6. permitiendo la seal de transduccin a travs de las vas de la JAK/STAT. Una variedad de clulas producen IL-6, incluyendo las clulas T y las clulas B, los monocitos y macrlagos, los fibroblastos, los queratinocitos, los sinoviocitos, los condrocitos y las clulas endoteliales. La IL-6 acta sobre las clulas T, los hepatocitos, los progenitores hematopoyticos y las neuronas. Es un potente factor de crecimiento para las lneas celulares del meloma y el plasmocitoma humano, y tienen una accin autoenna y paracrina sobre los mielomas humanos trasplantados al ratn. En los hepatocitos. la IL-6 estimula la produccin de varios reactantes de fase aguda, y en los ratones knockout por IL-6. estn muy disminuidas la liberacin de reactantes de la lase aguda y de Ig.

lnterleucina-5
La IL-5 es un homodmero unido por disulfuros de 45 kDa. 134 aminocidos, que juega un papel central en la maduracin, activacin y supervivencia de los eosinfilos, y en el desarrollo de enfermedad atpica y eosinofilia. El gen IL-5 reside en el cromosoma 5 en un grupo de genes que codifican la IL-3, la IL-4 y el factor estimulante de colonias de granulocitosmacrfagos (GM-CSF). Estructuralmente, est relacionado con el grupo de citocinas a-helicoidal (Milburn, 1993). El receptor para la IL-5 (IL-5R) consis-

CAPTULO 39

CITOCINAS Y MOLCULAS DE ADHESIN

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En las clulas hemalopoyticas, la IL-6 origina la proliferacin y diferenciacin de clulas T, aumenta la formacin de colonias de progenitores hematopoyticos multipotenciales e induce la maduracin de los megacanocitos. Estimula la formacin de osteoclastos, la proliferacin de las clulas del msculo liso vascular, e induce la produccin del factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF). En el SNC, la IL-6 permite la supervivencia de las neuronas colinrgicas, mientras que en el sistema reproductor induce la secrecin de gonadotropina corinica humana (hCG) por el trofoblaslo. Han sido observadas alteraciones en la produccin de IL-6 en pacientes con AR, y se ha demostrado una significativa correlacin entre las concentraciones de IL-6 e IgG en el lquido sinovial de pacientes con AR (Hirano. 1988; Hermana 1989). En los modelos animales, la administracin de IL-6 parece participar en el desarrollo de la glomerulonelritis membranosa proliferatva acelerada, simulando cambios encontrados en pacientes con lupus eritematoso sistmico (LES) (Rytfel. 1994). Otros estudios en ratones transgnicos sugieren un papel para la IL-6 en la aparicin de la diabetes tipo I y en la generacin de los plasmocitomas monoclonales malignos (Suematsu, 1989; Hirano, 1991). La evidencia clnica sugiere que la determinacin de los niveles sricos de IL-6 en neonatos (Kusler, 1998) y en los pacientes con cncer en quimioterapia (de Bont, 1999) puede ayudar a identificar aquellos neonatos con riesgo inminente de sepsis, y aquellos pacientes cuyos episodios febriles se deben a la quimioterapia ms que a la sepsis.

ratoria en los macrfagos Tambin es quimiotctica para los basfilos y para un subgrupo de clulas T CD4/CD8+. Muchos tipos de clulas producen el pequeo peptido IL-8 incluyendo las clulas endoteliales, las clulas epiteliales, los fibroblastos, los neutrfilos. los monocitos. los macrfagos y las clulas T y. dependiendo de la clula de origen, la IL-8 variar en la longitud de aminocidos. Tras la degradacin proteolitica de su secuencia precursora de 99 aminocidos, la IL-8 es secretada por las clulas endoteliales existentes predominantemente como una proteina de 77 aminocidos y como una proteina de 79 aminocidos cuando es producida por los leucocitos mononucleares. La IL-8 es liberada en respuesta a varios estmulos como los lipopoiisacandos (LPS) y los leucotrienos, y aunque puede existir como un homodimero unido no covalentemente, tiene su gran actividad quimiotctica c o m o un monomero (Paohni. 1994). Dos receptores con significativa homologa en los aminocidos median los electos biolgicos de la IL-8: el receptor A de IL-8 (IL8RA) y el receptor B de IL-8 (IL-8RB), que difieren en su afinidad por el ligando. El IL-8RA aparentemente tiene mayor afinidad y especificidad por el ligando, mientras que IL-8RB muestra menor afinidad y especificidad por el ligando y es capaz de unirse a otras protenas quimioatrayentes relacionadas con la IL-8. La inyeccin intradrmica de IL-8 origina una intensa e inmediata infiltracin de neutrfilos alrededor de las venas con un exudado de plasma local. Para alcanzar las reas de inflamacin, sin embargo, los leucocitos deben primero atravesar el endotelio local. Esto est en parte facilitado por la IL-8. que altera la expresin de integrinas neutrofilicas activando el CD11/CD18 a su conformacin de alta afinidad, y dispara la expresin de la L-selectina. La IL-8 puede formar parte del gradiente quimioatrayente regulado a la alta unido a la superficie celular de las clulas endoteliales vecinas a la inflamacin que siguen los leucocitos activados. Como proteina soluble, la IL-8 forma un gradiente quimiotclico en los tejidos, guiando a los leucocitos extravasados a los lugares de inflamacin. Adems de la secrecin de IL-8 inmediatamente tras su produccin, la IL-8 puede ser almacenada en los cuerpos de Weibel-Palade. donde est disponible para la liberacin inmediata independente de su sntesis (Rot, 1996). Interesantemente, aunque acta predominantemente como quimiotctica. el aumento de los niveles de IL-8 en el sistema circulatorio est asociado con la disminucin de la acumulacin de neutrfilos en los lugares de inflamacin, aunque se observa una neutroM a sistmica (Hechtman. 1991). Esto tambin sugiere una (uncin antiinflamatoria para la IL-8. Los estudios han destacado el papel de la IL-8 en varios estados inflamatorios desde la artritis crnica a la sepsis. Algunos han sugerido medir los niveles de IL-8 en orina como medida para monitonzar la severidad de la enfermedad glomerular (Wada. 1994). Desde la identificacin de la IL-8 como la primera quimiocina en 1987. la superfamilia de las quimiocinas ha sido una coleccin de pequeas molculas solubles siempre en aumento importantes para la migracin de los leucocitos a los lugares de inflamacin. Las quimiocinas desarrollan su papel eficazmente y con gran especificidad por medio de la activacin de integrinas leucocitarias, particularmente la LFA-1, la MAC-1 y la VLA-4. para unir el ICAM-1 y el VCAM-1 de las clulas endoteliales. Las quimiocinas son crticas en la hematopoyesis, en la angiognesis, en la activacin de las clulas T y las clulas NK, en la patognesis del VIH y en el desarrollo del SNC La superfamilia se divide actualmente en cuatro familias basadas en la posicin de sus primeras y segundas cuatro cisteinas en la secuencia de aminocidos. La lamilia CXC (familia u) tiene un aminocido que separa las primeras dos cisteinas: la familia CC (familia |i) no tiene aminocidos intercalados; en la familia C (y), los miembros han perdido las cisteinas una y tres; y la familia de quimiocinas CX3C (6) tiene tres aminocidos intercalados. La familia CXC se divide posteriormente en miembros que tienen un residuo E-L-R en su secuencia amino-terminal. y que poseen actividad angiogmca y actividad quimiotctica neutroflica. La familia de quimiocinas CC contiene miembros quimiotcticos para los monocitos, los linfocitos, los eosinfilos, los basfilos, los mastocitos y las clulas NK. Sus miembros pueden tambin regular la hematopoyesis en la cavidad medular, e inducir la degranulacin de los mastocitos y los eosinfilos. La linfotactina es el nico miembro de la familia de quimiocinas C. Tiene su m a y o r expresin en el timo, donde sirve para reclutar precursores de clulas T inmaduros de la mdula sea. An no se ha definido otras funciones para esta qui-

lnterleucina-7
La IL-7 se identific por primera vez como una glicoprotena murina de 2 5 kDa que mostraba electos poliferativos in vilro en las clulas pre-B (amen, 1988). Aunque inicialmente se describi como un factor de crecimiento de las clulas B, despus se encontr que la IL-7 era crtica tanto para la linfopoyesis de las clulas T como B, as como para movilizar las clulas progenituras mieloides (Grzegorzweski, 1994). En humanos, el cido ribonucleico mensajero (ARNm) de la IL-7 ha sido detectado en rganos inmunes y hematopoyticos, como el timo, el bazo, la mdula sea y el hgado fetal (Komschhes. 1995) La atocina activa es producida por los queratinocitos epidrmicos, las clulas epiteliales intestinales y las clulas estromales de la mdula sea y el timo. El receptor de la IL-7 (IL-7R) es un miembro de la superfamila de receptores de la hematopoyetina, teniendo una cadena y en comn con los receptores de las interleucinas, -2. -4, -7. -9 y -15, lo que explica en parte los efectos solapados y redundantes que estas citocinas tienen en las poblaciones de clulas T. El IL-7R ha sido identificad tanto en clulas mieloides como linfoides (Foxwell. 1992) Los ratones transgnicos para la IL-7 desarrollan un aumento del nmero de clulas B y T y de sus progenitores. Los anticuerpos neutralizantes para el IL-7R administrados a ratones originan una gran disminucin del nmero de timocitos, y clulas de linaje B medulares, con disminucin del nmero de clulas B y T en el bazo y en los ganglios linfticos (Peschon, 1994). Los ratones knockout para la IL-7 y el IL-7R muestran an mayores reducciones de las mismas poblaciones celulares. Debido a esta importante funcin linfopoytica, la IL-7 acelera la reconstitucin de las clulas T y B en los ratones irradiados letalmente. con mnimos efectos en el compartimento mieloide. La IL-7 estimula el crecimiento y aumenta la actividad citotxica sobre las clulas T maduras y las clulas T citotxicas, respectivamente. In vitro. las clulas T aisladas de la lmina propia intestinal proliferan en respuesta a IL-7 exgena y muestran un aumento de la capacidad de responder a anticuerpos anti-CD3 y a IL-2, sugiriendo un papel para esta citocina en el aumento de las respuestas inmunes mediadas por clulas (Watanabe, 1995). Se han sugerido papeles clnicos para la IL-7. Estos van desde aumentar los compartimentos de las clulas T de aquellos que padecen SIDA, hasta el tratamiento de cnceres a travs del aumento de la actividad LAK.

lnterleucina -8 y las quimiocinas


La IL-8. un miembro de la superfamilia de las quimiocinas, es responsable de la acumulacin de neutrfilos en los lugares de inflamacin (Hoch. 1996) Induce la traslocacin del calcio, la quimiotaxis, el cambio de tipo, la polimerizacin de la actma. y posiblemente tambin la actividad de 'a cadena respi-

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SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOIOGA (CFU-GM) a partir de progenitores CD34+. La IL-9 ejerce su actividad de promover el crecimiento sobre las lneas de mastocitos, y tambin puede regular la diferenciacin de los mastocitos (Eklund, 1993). Se ha sugerido que la IL9 induce la resistencia a parsitos in vitro de las clulas dependientes de los mastocitos, y junto a la IL-4 puede facilitar la produccin de IgE e IgG (Louahed, 1995). Se ha sugerido un papel para la IL-9 en el SNC por su capacidad de mantener el aumento de la extensin neuronal y promover la excitabilidad sobre cultivos de lineas celulares del hipocampo de progenitores de ratones inmortalizados (Mehler, 1993).

miocna. La familia de quimiocinas CX3C tambin tiene un solo miembro en la actualidad, la fractalcina (la neurotactna). Es diferente de las otras quimiocinas en que es relativamente grande, con 373 aminocidos, con el dominio quimiocina encontrado en los primeros 76 residuos. Anclada a las superficies celulares por un tallo tipo-mucina, la porcin extracelular puede ser liberada de la superficie celular para actuar como quimiotctica para los monocitos, las clulas T y las clulas NK in vitro. Se ha sugerido un papel para la fractalcina en el proceso inflamatorio debido a su regulacin a la alta del endotelio en el SNC de ratones con encefalomielitis autoinmune experimental (EAE), en presencia de factor de necrosis tumoral (TNF). Ya que la fractalcina tambin se expresa en el cerebro normal, tambin puede jugar aqu un papel no patolgico. La mayora de las quimiocinas se encuentran en la familia CC, mientras que las familias C y CX3C tienen solo un miembro cada una. Las quimiocinas ejercen sus efectos a travs de la unin a miembros de la superfamilia de receptores de siete dominios transmembrana, una familia de molculas acopladas a la protena G que crece rpidamente. Las clulas no inmunes como los fibroblastos y las clulas del msculo liso vascular pueden tambin producir y liberar quimiocinas para dirigir a las clulas inflamatorias a los lugares de inflamacin, y pueden responder ellas mismas a las quimiocinas. Las quimiocinas pueden promover la progresin de enfermedades. En la sepsis, la IL-8 es central en la acumulacin de neutrfilos en varios rganos, y en la progresin del desarrollo del estado final de enfermedad. Otras quimiocinas incluyendo RANTES (reguladas en activacin clulas T, normales expresadas y secretadas), GROi/. y la MIP-1u son activas en el choque sptico, y puede proporcionar dianas para la intervencin teraputica. En las respuestas granulomalosas, la presencia de MIP-1 se correlaciona con la formacin de granulomas. Del mismo modo, en la EAE, el modelo animal de la esclerosis mltiple, la progresin y la recada de la enfermedad est afectada positivamente por la administracin de anticuerpos neutralizantes para la MIP-1u y la MCP-1.

lnterleucina-10
La IL-10 es una potente atocina antinflamatoria (Fiorentmo. 1989). Es una protena de 160 aminocidos con una masa molecular de 18,5 kDa (Kim, 1992), que contiene cuatro residuos cistena y dos puentes disulfuro que mantienen su estructura helicoidal y su actividad biolgica. La codifica un gen secuenciado en el cromosoma 1. El receptor de IL-10 (IL-10R) es expresado sobre todo en las clulas hematopoyticas, y es una proteina de 90 a 110 kDa cuyo dominio extracelular se une a las molculas dimerizadas de IL-10 (Tan. 1995). La transduccn de seales de la IL-10 est mediada a travs de la va de la JAK/'STAT (Lalani. 1997). Aunque muchos tipos de clula, incluyendo las clulas Th2. las clulas T CD4+ y CD8+, los monocitos y los macrfagos, los mastocitos, los queratinocitos, los eosinfilos, las clulas epiteliales y muchas clulas tumorales son capaces de producir IL-10, es el monocito el que produce la mayor cantidad de IL-10 en la mayora de las situaciones inflamatorias (Lalani, 1997). Ya que puede ser producida de un modo autocrino y regular su propia produccin a travs de mecanismos de retroalimentacin negativos, la IL-10 regula la respuesta inflamatoria necesaria en el foco inflamatorio (Tan, 1995). La IL-10 acta Inhibiendo la produccin de citocinas proinflamatorias como la IL-1et, la IL-B, la IL-6, la IL-8, el TNF-a. el G-CSF. el CM-CSF y las quimiocinas incluyendo la IL-8 y la MIP-1u, suprimiendo la transcripcin de sus genes correspondientes (Goldman, 1997). La IL-10 tambin suprime la liberacin de los radicales libres del oxgeno e inhibe la actividad microbicida dependiente del xido ntrico en los macrfagos (Fleming, 1996). En situaciones alrgicas como el asma, la produccin de IL-5 es crucial en la iniciacin del evento. In vitro, la IL-10 previene la produccin de IL-5 en las clulas T ThO, Th2, y de reposo y regula a la baja la expresin de MHC de Clase II sobre las APCs. Tambin inhibe la expresin de MIP-1u en los neutrfilos, monocitos y macrfagos humanos; inhibe la produccin de qumiotcticos activos en los lugares de inflamacin crnica; y puede nactvar directamente la funcin de los eosinfilos y causar la muerte del eosinfilo. Estos hallazgos sugieren el potencial de la IL-10 para limitar la inllamacin area crnica (Petrolan, 1999). Los estudios con animales tambin han sugerido un papel teraputico para la IL-10 en proporcionar una proteccin mucosa en la enfermedad inflamatoria intestinal, y en disminuir los niveles sricos de IL-8 en los animales con pancreatitis aguda necrotizante. En los modelos de sepsis, los ratones inyectados con IL-10 estaban protegidos frente a inyecciones intraperitoneales de endotoxina que. de otro modo, seran letales. La IL-10 puede servir como factor de crecimiento para muchas lneas celulares malignas como los linfomas de clulas B cultivados de pacientes con SIDA, el linfoma Burkitt y las clulas del mieloma maligno. La produccin de IL-10 en otras enfermedades malignas puede proporcionar una forma de eludir las respuestas locales de las clulas T. Sin embargo, los estudios tambin demuestran la capacidad de la IL-10 de inhibir el crecimiento de las clulas de la leucemia mieloide crnica in vitro (Benjamis, 1992; Kim. 1995). La IL-10 puede participar en la induccin y perpetuacin del LES y la actividad de la enfermedad se correlaciona con los ttulos de IL-10 (Houssiau, 1995). Est implicada en otras enfermedades autoinmunes incluyendo la miastenia gravis, la enfermedad de Graves, el sndrome de Sjgren, la polimiositis, la psoriasis, la esclerosis sistmica, el pnfigo vulgar, el penfigoide ampolloso y la enfermedad de Kawasaki (Lalani, 1997). Adems, la deteccin de IL-10 elevada en suero determinada por ELISA en pacientes con carcinoma de clulas pequeas de pulmn y adenocarcinoma de colon puede ser un predictor til de la progresin de la enfermedad clnicamente indetectable (De Vita. 1999, 2000).

lnterleucina-9
La protena IL-9 humana todava no ha sido purificada, pero a travs de la expresin del ADNc (Renauld, 1990) se cree que la protena madura contiene 144 aminocidos con cuatro lugares de glicosilacin potencial. Su gen se ha secuenciado en el cromosoma 5, donde los genes de otros factores de crecimiento y de los receptores de los factores de crecimiento (IL-3, IL-4, IL-5, GM-CSF y CSF-1R) se agrupan. El ADNc para el receptor de IL-9 (IL-9R) codifica una cadena ot de 522 aminocidos especifica de ligando miembro de la superfamilia de receptores hematopoyticos, que se asocia con una cadena y de sealizacin de transduccin que es compartida con la IL-2, IL-4. IL-7 y la IL-15. El hecho de que haya una subunidad del receptor comn utilizada por estas citocinas puede explicar algunas de las redundancias de la actividad observadas entre ellas. Una vez unida a la IL-9, la cadena y recluta la actividad de la tirosina cinasa JAK-3 (de la familia de las cinasas Jano), mientras que la IL-9Roc se asocia con la JAK-1. Tambin puede presentar un papel para la proteina de adaptacin 4PS/IRS2 (Yin, 1995). En humanos, la expresin de IL-9 est aparentemente limitada a las poblaciones de clulas T CD4+ CD45 RO positiva (clulas T memoria), y a las clulas T CD45-RA+ en presencia de IL-4 e IL-10 (Houssiau, 1995). Se requiere una cascada de citocinas que incluya la IL-2, la IL-4 y la IL-10 para mediar su expresin. Adems, el virus tipo 1 linfotrpico de clulas T humanas (HTLV-1) transformante de clulas T constitutivamente produce IL-9 en respuesta a una ruta de induccin an desconocida. El papel fisiolgico de la IL-9 en las clulas normales lodava no es conocido, pero las clulas T aisladas en fresco en cultivos a largo plazo responden a la larga a una actividad de crecimiento promovida por la IL-9, y en cultivos de clulas T murinas sufren transformacin tumoral (Uyttenhove, 1988). Interesantemente, del 5% al 10% de los ratones transgnicos que sobreproducen IL-9 desarrollan espontneamente linfomas linfoblsticos (Renauld, 1994). y la IL-9 es producida en las clulas tumorales de la enfermedad de Hodgkin y del linfoma anaplsico (Merz, 1991). Lo ltimo muestra la posibilidad de una curva de respuesta autocrina de la IL-9 (Demoulin. 1998). En el sistema hematopoytico. la IL-9 y la eritropoyetina parecen reforzar la maduracin de los progenitores entroides in vitro, y pueden promover el crecimiento de unidades formadoras colonias de granulocitos/macrfagos

CAPTUIO 39

CITOCINAS Y MOLCULAS DE ADHESIN

919

lnterleucina-11
La IL-11 es una citocma pleotrpica con numerosos efectos en muchos tejidos incluyendo la mdula sea, el cerebro, el intestino y los testculos. El ADNc de la IL-11 codifica un precursor polipeptidico de 23 kDa, 199 aminocidos, con una secuencia lder de 21 aminocidos que parecer carecer de lugares potenciales de glicosilacin y de residuos cisteina. El gen codificante se ha secuenciado en el cromosoma 19, y su estructura tridimensional contiene probablemente cuatro residuos (5-hlce (Czupryn, 1995). El receptor de la IL-11 (IL-11 R) est formado por una asociacin no covalente de una cadena i/, especfica de ligando y una cadena p de transduccin de seal, la gpl30. El complejo IL-6R tambin utiliza la subunidad gp130 como cadena de sealizacin, explicando algunos de los solapamientos en las acciones de estas cilocinas (Cherel, 1996). Cuando se asocia con el IL-11R|5 (gp130), la afinidad de unin para la IL-11 es mayor y se genera una seal biolgica a travs de la formacin de homodmeros de gp130. Se cree que estos activan las vas de transduccin incluyendo las cinasas JAK. las cinasas MAPK. las protenas cinasa ribosomales S6, y la familia de cinasas Src (Fuhrer. 1996). El ARNm de la IL-11 ha sido detectado en muchos tejidos estimulados incluyendo los fibroblastos, las clulas epiteliales, los condrocitos. los sinoviocitos, los osteoblastos y las clulas del glioblastoma. Las evidencias indican que la IL-11 es una potente citocina antiinflamatoria (Trepicchio. 1998: Redlich, 1996) que. al igual que la IL-6. puede regulara la baja la funcin efectora macrofgica inhibiendo la expresin de los genes del TNF-a, la IL-1p. la IL-12 y el xido ntrico, a travs de la prevencin de la translocacin nuclear del factor de la transcripcin nuclear NF-Kp" (Trepicchio. 1998). Sus efectos hematopoyticos (Du. 1995) incluyen un papel en la megacariocitopoyesis, y la estimulacin de la eritropoyesis, la proliferacin y diferenciacin macrofgica, y la produccin de inmunoglobulinas por las clulas B. Adems, regula la diferenciacin y maduracin de los progenitores de clulas mieloides en combinacin con el factor de clulas madre (SCF), y puede participar en la linfopoyesis. En cultivos de mdula sea a largo plazo (LTBNMCs). la IL-11 aumenta la celularidad de las clulas estromales adherentes y promueve la hematopoyesis en estos cultivos. En los pacientes en quimioterapia, la terapia con IL-11 mejora la recuperacin de la hematopoyesis y de la funcin inmune, y disminuye la morbilidad de la supresin de la mdula sea por la quimioterapia. La IL-11 tiene tambin extensos efectos no hematopoyticos (Du. 1995). La IL-11 puede funcionar en la inflamacin pulmonar y es producida por la estimulacin alveolar y por las clulas pulmonares epiteliales en grandes cantidades. Los virus respiratorios son potentes estimuladores de la sntesis de IL-11 en el pulmn, y la IL-11 es detectada en las secreciones nasales de nios con infecciones del tracto respiratorio superior (Einarsson, 1996). La IL-11 tambin est implicada en el control del crecimiento de las clulas epiteliales gastrointestinales, ya que muestra una inhibicin reversible de la proliferacin de las lineas celulares madre de las criptas intestinales in vitro. La IL-11 tambin puede ser capaz de conferir proteccin mucosa al epitelio gastrointestinal tras la radiacin y la quimioterapia (Keith. 1994). Otras actividades de la IL-11 incluyen el desarrollo de los osteoclastos in vilro. un papel en la supervivencia tanto de las neuronas sensitivas como motoras, la estimulacin de la liberacin in vivo e in vitro de reactantes de lase aguda y la regulacin del metabolismo de la matriz exlracelular (ECM). En la biologa lumoral, la IL-11 acta sinrgicamente con otras citocinas para promover el crecimiento de las lineas celulares de la leucemia humana y estimula la formacin de la colonia de blastos leucmicos (Hu. 1993; Lemoli. 1995). Se ha detectado un efecto trombootopoytico beneficioso en pacientes con enfermedad de Crohn que reciben IL-11 recombinante (Sands. 1999).

las clulas NK CD56+. el receptor de la IL-12 (IL-12R) es un miembro de la superfamilia de receptores hematopoyticos y tiene una homologa significativa con la gpl 30 y con los receptores del G-CSF y del factor inhibidor de leucemia (LIF). La IL-12 es producida principalmente por los monocitos y los macrfagos, por las clulas dendriticas (APC profesionales) y, en una pequea cantidad, por los neutrfilos y los queratinocitos. Su produccin est regulada a la baja por la IL-10 y el TGF-p. y su sntesis esta aumentada por el IFN-y. La sntesis de IL-12 es inducida rpidamente en las clulas fagociticas por ciertos tipos de bacterias, patgenos intracelulares incluyendo los protozoos y los hongos, y en menor medida los virus. Tambin puede producirse con la interaccin homotipica del antigeno CD40 en las clulas T activadas y en los fagocitos (Trinchieri, 1997). La IL-12 tiene un papel vital como citocina proinflamatoria. En modelos de choque sptico implicando inyecciones intraperitoneales de endotoxina en ratones, se encontr que la IL-12 promueve la sobreproduccin de IFN-y. que por un mecanismo de relroalimentacin positivo induce la liberacin de ms IL-12. Finalmente, la sobreproduccin de IFN-y origina la muerte del animal. El importante papel de la IL-12 en esta serie de eventos sale a la luz por la observacin de que la inyeccin de anticuerpos neutralizantes anti-IL-12 en ratones rescata alrededor del 90% de estos de la muerte (Trinchieri, 1994). Las evidencias sugieren que la IL-10 inhibe la produccin de IL-12 por los fagocitos, y que la IL-12 por si misma estimula la produccin de IL-10, sirviendo por ello como regulador negativo de su propia produccin (Meyaard, 1996). Las evidencias experimentales en animales sugieren un papel exacerbante para la IL-12 en ciertas enfermedades autoinmunes incluyendo la diabetes autoinmune. la artritis, el modelo animal de la esclerosis mltiple (EAE) y l a colitis (Trinchieri. 1997). En situaciones alrgicas, la IL-12 juega un papel paliativo a travs de su capacidad de regular a la baja la produccin de IL-4, IL-5 e IgE. El electo es asombroso en la hiperrespuesta de la va area inducida por antigeno en modelos de ratn (Gavett. 1995). L a IL-12 tiene significativos efectos antitumorales y antimetastsicos en modelos de ratn in vivo (Zitvogel. 1995) que parecen estar mediados por la produccin de IFN-y y por otros mecanismos no especilicos. Sin embargo, se ha notado toxicidad gastrointestinal, heptica y hematolgica en ensayos clnicos con rlL-12 sobre pacientes con carcinoma de clulas renales. Debido a su papel en promover las respuestas de memoria de Th1 a las vacunas, la IL-12 puede ser importante como adyuvante de las vacunas.

lnterleucina-13
La IL-13 es una proteina de 12 kDa. 132 aminocidos, clonada por primera vez de linfocitos T activados y clones de clulas T en 1993, con cuatro lugares de N-glicosilacin y dos puentes disulfuro. Su gen de 4.5 kb se ha secuenciado en el cromosoma 5 en el grupo de genes que contiene la IL-3, la IL-4, la IL-5, la IL-9 y el GM-CSF. Se cree que posee una estructura (-helicoidal, con cuatro hlices r* y dos cadenas plegadas p, El receptor de la IL-13 (IL-13R) se expresa en las clulas B. monocitos, basfilos. eosinfilos. mastocilos. clulas endoleliales, fibroblastos, queratinocitos y ciertas clulas tumorales. Aparentemente, no se expresa en linlocitos T humanos La IL-13 y la IL-4 comparten un componente del receptor comn, el gp140, una protena de 65 a 70 kDa que sirve como receptor de baja afinidad (IL-13Ra) para la IL-13, como el receptor tipo II de IL-4 (IL-4Ru). No es sorprendente, entonces, que la IL-13 simula muchas de las acciones biolgicas de la IL-4. Cuando se une a su ligando, el IL-13R y el IL-4R inducen la fosforilacin de la tirosina del JAK-1 en las clulas hematopoyticas. y del JAK-2 en las clulas no hematopoyticas. seguido por la activacin del STAT-6 y de la PI3-cinasa (Keegan, 1996: Burd, 1995). La IL-13 es liberada por las poblaciones clnales de clulas T CD4CD8+ ThO, Th1 y Th2 en respuesta a la estimulacin antignica especfica o a la activacin policlonal, y por los mastocitos, los basfilos y los eosinfilos tras la estimulacin a travs de sus receptores de alta afinidad para la IgE (CD23) (Keegan. 1996). El ARNm de la IL-13 es inducido en las clulas B normales tras la correcta estimulacin, y la protena IL-13 y su ARNm han sido detectados en enfermedades malignas y en clulas B transformadas por el virus de Epstein-Barr (VEB). sugiriendo un posible papel para la IL-13 en el desarrollo de enfermedades malignas de las clulas B (de Vnes, 1998).

Interleucina-12
La IL-12 es una citocina heterodimrica de 70 kDa formada por dos cadenas unidas covalentemete (p35 y p40), que son codificadas por dos genes separados (Trinchieri. 1994). La IL-12 promueve la diferenciacin de las clulas humanas tipo Th1, preparndolas para incrementar la produccin de interfern-y (IFN-y). y aumenta las capacidades citolticas de las NK y de las clulas T (Heufler. 1996). Estudiado inicialmente en las clulas T activadas y en

920

SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA estimula la proliferacin de mastocitos in vitro e m vivo. La IL-15 es quimiotctica para las clulas T, recatndolas a los lugares de inflamacin, y se ha sugerido un papel similar en la sinovial de pacientes con AR (Mclnnes, 1996). Otras evidencias indican un papel para la produccin de IL-15 en las situaciones inflamatorias como la colitis ulcerosa, la hepatitis C y la sarcoidosis. En estas situaciones, la IL-15 puede servir para reclutar los linfocitos activados hacia reas de inflamacin donde sern capaces de liberar citocinas adicionales pronflamatorias y ejercer sus efectos citotxicos (Kirman. 1998).

Sobre los linfocitos |3, monocitos y macrfagos, la IL-13 induce una aumento significativo de la expresin de molculas de MHC Clase II y CD23, sugiriendo un papel para la IL-13 en facilitar la capacidad de presentacin de antigenos de estas clulas a las clulas T. Es quimiotctica para los monocitos. y promueve la proliferacin de las clulas B activadas, e in vitro parece promover la formacin de colonias de megacariocitos y aumentar la proliferacin de clulas progenitoras murinas en la mdula sea. La IL-13 es en su mayor parte una citocina antiinflamatoria, y se ha notado un importante papel para ella en la respuesta alrgica. La IL-13 es capaz de inducir la secrecin de IgE de cultivos de clulas B humanas y de aumentar la expresin de la molcula de adhesin proinflamatona VCAM-1 en las clulas endoteliales. Este hecho y la observacin de que la sntesis de IL-13 est aumentada en situaciones atpicas en el pulmn en los asmticos y en pacientes con sinusitis crnica mientras que est disminuida en respuesta a la administracin de corticoesteroides pone de relieve la importancia de la IL-13 en las situaciones de alergia (de Vries. 1998). Al mismo tiempo, la IL-13 parece atenuar la respuesta alrgica regulando a la baja la capacidad de las clulas endoteliales y de las clulas del msculo liso de la va area de liberar el quimiotctico RANTES de los linfocitos T y de las clulas inflamatorias (Tony.
1994).

Interleucina-16
Reconocida inicialmente como un factor quimiotctico en cultivos de clulas mononucleares de sangre humana perifrica estimuladas con mitgenos (Center, 1982), la IL-16 est reconocida como un quimiotctico promflamatorio de clulas T. Los linfocitos estimulados con mitgenos producen IL-16 como una molcula precursora que es degradada y secretada como una protena de 17 kDa, 130 aminocidos. Solo tras la agregacin en homotetrmeros la IL-16 parece poseer actividad biolgica (Bazan, 1996). Se cree que la IL-16 contiene seis lminas de pliegues (i incluyendo la secuencia de aminocidos, glicina-leucina-glicna-fenilalanma. que se cree que facilita las interacciones proteina-protena como la autoagregacin. El gen que codifica la IL-16 ha sido secuenciado en el cromosoma 15. La superficie de las clulas CD4 parece servir como receptor de superficie para la IL-16 soluble, y es absolutamente necesaria para la sealizacin biolgica (Cruikshank, 1994) a travs de vas que pueden incluir la fosforilacin del p56 .
w

El pretratamiento con IL-13 inhibe la produccin de citocinas proinflamatorias como la IL-1i/ y la IL-1(i, la IL-12 y el IFN-ypor los monocitos activados por LPS. Su regulacin a la baja de la produccin de factor tisular y su regulacin a la alta de la produccin de trombomodulina pone de relieve tambin su naturaleza antiinflamatoria.

Interleucna-14
La IL-14 probablemente fue nombrada prematuramente y no parece ser una molcula distintiva.

Interleucina-15
La IL-15 es una protena de 14 a 15 kDa, 114 aminocidos, identificada por primera vez como un factor de crecimiento celular en los sobrenadantes de las lineas celulares epiteliales de rones de mono (Grabstem. 1994). Aunque su secuencia de aminocidos primaria es nica, su estructura tridimensional contiene dos puentes disulfuro y se parece bastante a la de otros miembros de la familia de citocinas de cuatro u hlices de unin, que incluye a la IL-2. citocina con una actividad funcional similar. El gen que codifica la IL-15 se ha secuenciado en el cromosoma 4. cerca del gen de la IL-2 (Anderson. 1995a). El receptor de la IL-15 (IL-15R) est compuesto de tres subunidades proteicas: una cadena IL-15Ra especfica de ligando, y unas cadenas p y y idnticas a las cadenas [J y y del IL-2R. Este hecho explica las actividades similares de IL-15 y la IL-2. La IL-15Ru comparte homologa con la IL-2Ra, aunque su distribucin tisular es diferente, y al igual que la IL-2R, es incapaz de transducir una seal a menos que est asociada con las cadenas de Iransduccin de seal |5 y y (Anderson, 1995b). Mientras que el IL-15R en las clulas T utiliza al JAK-1 y al JAK-3. en los mastocitos emplea la va JAK-2/STAT-5 (Johnston, 1995). Los macrfagos. los fibroblastos, los queratinoctos. las clulas epiteliales y otros tejidos secretan IL-15. pero a diferencia de la IL-2. no es secretada por los linfocitos. De cualquier modo, la distribucin tisular de la IL-15 es amplia, identificndose tambin transcripcin de ARNm en monocitos y macrfagos, clulas de Langerhans. clulas dendritas y clulas endoteliales. El ARNm de la IL-15 parece almacenarse en una muestra translacionalmente inactiva que est disponible para la traslocacin precoz en la respuesta innata a la infeccin. La produccin de IL-15 por los macrfagos en la fase inicial de la infeccin microbiana puede servir para activar a las clulas NK como parte de la respuesta a la infeccin (Cosman. 1995). Al igual que la IL-2, se ha mostrado que la IL-15 participa en la coestimulacin de las clulas T en proliferacin, en la induccin de la actividad de citocinas en las clulas T. en la proliferacin de las clulas NK. y en la activacin de la proliferacin de las clulas B y liberacin de mmunoglobulinas (Kirman, 1998). Los modelos murinos sugieren un papel esencial para la IL-15 en el desarrollo de las clulas NK. A diferencia de la IL-2. la IL-15 puede aumentar anablicamente la masa muscular esqueltica, y se ha demostrado que

La IL-16 es liberada por las clulas T tras la estimulacin con mitgenos. antgenos, histamina y serotonina. Los cultivos de eosinfilos y mastocitos tambin liberan IL-16 en presencia de GM-CSF. y tambin PMA e ionforos de calcio, respectivamente. La IL-16 tambin h a sido identificada en los sobrenadantes de cultivos de clulas epiteliales respiratorias extradas de asmticos. La IL-16 sirve como quimiolclico para las clulas T CD4+ y otras clulas perifricas inmunes que expresan CD4. incluyendo los monocitos y eosinfilos. y es un factor de crecimiento competente para ellos y estimula la progresin del ciclo celular en clulas CD4+ humanas (Cruikshank. 1994). Adems, la IL-16 promueve el aumento de la adhesin al ECM por los eosinfilos, y regula a la alza la expresin de HLA-DR sobre los monocitos (Wan, 1995). Sobre los cultivos de clulas T, la IL-16 inhibe la expresin del IL-2R mediado por el TCR y la produccin de IL-2, y puede hacer a estas clulas insensibles al AICD. El resultado in vivo puede ser el aumento de la acumulacin de clulas T CD4+ cebadas que responden a citocinas en los lugares de inflamacin, que estn protegidas de la AICD mediada por TCR (Cruikshank, 1994). Se ha informado que los asmticos tienen IL-16 constantemente presente en el epitelio de su va area con clulas T CD4+, sugiriendo un papel para la IL-16 en el reclutamiento de estas clulas en el asma. Los modelos murinos sugieren un papel para la IL-16 en la inflamacin granulomatosa. La IL-16 tambin parece suprimir la transcripcin del VIH en las clulas T infectadas por el VIH a travs de la activacin de un factor represor no identificado.

Interleucina-17
Conocida inicialmente como antigeno 8 de los linfocitos T citotxicos (CTLA-8), la IL-17 es una citocina proinflamatoria de 32 kDa secretada c o m o homodmeros unidos covalentemente por un restringido grupo de clulas T memoria activadas (Yao, 1995; Fossiez, 1996). El gen que codifica esta citocina descrita recientemente ha sido mapeado en el cromosoma 2 y su expresin parece estar estrechamente regulada. La IL-17 se expresa predominantemente por las clulas T CD4+ CD45-RO en respuesta a una variedad de seales de activacin incluyendo la Con A, el PHA, el anti-CD3 mAb, el antiCD28 mAb y el Pl (Fossiez, 1996). Los estudios en ratones sugieren que. en contraste con la expresin restringida de la IL-17. el receptor de la IL-17 (IL-17R) es una protena novel ampliamente distribuida especialmente abundante en el bazo y el rir

CAPTULO 39

CITOCINAS Y MOLCULAS DE ADHESIN

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Evidencias recientes implican la va de sealizacin JAK/STAT en la transduccin de seales por el IL-17R (Subramaniam. 1999). Algunas evidencias parecen sugerir un papel para la IL-17 como inhibidora del crecimiento de las clulas T activadas en ratones (Yao. 1995a). Esto mismo an no ha sido demostrado en sistemas humanos. La IL-17 tambin parece regular al alza la produccin de IL-6. IL-8. PGE y xido ntrico, y su secrecin por los fibroblastos cutneos, los sinoviocitos. las clulas endoteliales, las clulas del epitelio bronquial y las lineas celulares del carcinoma de rion. La IL-17 induce indirectamente la proliferacin de clulas progenitoras hematopoyticas CD34+ cocultivadas con fibroblastos, y finalmente promueve la diferenciacin de estas clulas a neulrfilos (Yao, 1995b). La IL17 tambin induce la expresin de ICAM-1 sobre los fibroblastos in vitro (Fossiez, 1996).
;

Se ha sugerido un papel in vivo para la IL-17 en la proteccin frente a la infeccin bacteriana, y debido a su capacidad para inducir la produccin de altos niveles de citocinas incluyendo la IL-6. la IL-18 y el MCP-l. puede servir para regular el proceso inflamatorio (Dalrymple, 1996). Evidencias recientes sugieren la posibilidad de que la IL-17 pueda promover indirectamente los tumores de cuello uterino en humanos (Tartour, 1999).

asocia despus con los componentes o transportadores de ECM como la a -macroglobulma. la albmina o la IgG. lo que facilita la captacin y el metabolismo del TGF-p. El TGF-p es bien conocido por su papel en el desarrollo, crecimiento y diferenciacin de clulas epiteliales: en la carcinognesis. y en la inflamacin, la reparacin y la angiognesis. Sus efectos biolgicos son transducidos a travs de cualquiera de los seis receptores descritos incluyendo las tres clases de receptores transmembrana y muchos receptores solubles. De estos, los receptores del TGF-p" tipo I y tipo II son capaces de transducir seales biolgicas, mientras que los receptores tipo III carecen de residuos de sealizacin y sirven sobre todo para almacenar y presentar el TGF-|5 a los receptores de sealizacin. La seal biolgica es transducida al ncleo aadiendo protenas Smad (miembros de la familia relacionada con MAD) como intermediarios (Lopez-Casillas. 1993; Derynck, 1996). El TGF-jJ es producido por cualquier linaje de linfocitos desde linfocitos hasta macrfagos y clulas dendrticas. y acta tanto en la respuesta autocnna como paracrina. Sus actividades biolgicas son muchas y bien equilibradas, provocando efectos perjudiciales tanto el exceso como la insuficiencia (McCartney-Francis, 1998). En ratones knockoute TGF-p, el 30% al 60% de los embriones demostraron fallo en la angiognesis y en la hematopoyesis, y abortos espontneos, mientras que en ratones transgnicos con sobreexpresin de TGF-p. la consecuencia es la hipoplasia pulmonar y la prdida de la diferenciacin epitelial respiratoria originando la muerte perinatal. El TGF-|i funciona tanto como laclor de proliferacin como inhibidor del crecimiento. Inhibe el producto del gen del retmoblastoma (Rb) e inhibe la expresin del protooncogn c-myc, provocando una alteracin del equilibrio de las protenas reguladoras positivas y negativas que controlan el ciclo celular (Alexandrow. 1995) En ratones, la sobre o infraexpresin de TGF-|4 origina hipo o hiperproliferacin de clulas epiteliales, en donde la hiperproliferacin est asociada con carcinoma (Nogaard. 1995). En humanos, la agresividad de las lneas celulares del melanoma y del carcinoma de colon aumenta con el aumento de la prdida de respuesta al TGF-|i. El TGF-|! tambin puede servir como supresor de tumores, ya que los anticuerpos contra el TGF-|i aumentan la carcmogenia de las clulas del carcinoma de colon in vitro. En el compartimento hematopoytico (McCarteny-Francis, 1998), el TGF-p controla la mielopoyesis, la linfopoyesis y la supervivencia de las clulas dendrticas de Langerhans. En la respuesta inmune el TGF-J5 mantiene el proceso inflamatorio a travs del aumento de la adhesin de las clulas inflamatorias a travs de la regulacin a la alta de las integrinas. y quimiotcticamente reclutando y activando linfoctos nativos. Interesantemente, los ratones knockout de TGF-p desarrollan una hiperactividad frente a las clulas B parecida a la autoinmunidad, con infiltracin por un nmero considerable de macrlagos y linfoctos de rganos incluyendo el corazn, el pulmn y el hgado (Kulkarni, 1993). El TGF-p puede promover normalmente la tolerancia a lo propio regulando la maduracin de los limocitos CD4+ y CD8+ de modo que clones aulorreactivos sufren apoptosis. En la periferia, una poblacin de TGF-|i producidos por las clulas Th2 mantienen la tolerancia perifrica promoviendo la anergia clonal. El TGF-p suprime la respuesta inflamatoria y promueve la curacin a travs de la inhibicin de la proliferacin de clulas T y B. la inhibicin de la funcin de las clulas NK, la induccin de los antagonistas de citocinas, la regulacin a la baja de la expresin de integrinas, y la inhibicin de la liberacin de IgG. Sin embargo, la sobreproduccin de TGF-p no solo acaba con la respuesta inflamatoria sino que produce una "excesiva" curacin, provocando una fibrosis exuberante y una excesiva cicatriz (Wahl, 1994). Se ha propuesto un papel para el TGF-p en la aterosclerosis, en donde el TGF-ji insuficiente puede permitir la formacin de la placa arteriosclerlica. En esta via, la formacin de la placa en algunos ratones seleccionados es inhibida por la administracin de tamoxifeno, que aumenta el TGF-p circulante.

lnterleucina-18
Llamada originalmente factor inductor de IFN-y (IFIF), la IL-18 es una proleina de aproximadamente 18 kDa producida por los macrlagos activados, las clulas de Kupffer, los osteoblastos y los queratinocitos (Torigoe, 1997). La formacin de la IL-18 biolgicamente activa requiere el procesamiento del precursor de 24 kDa por la caspasa-1 (ICE) en las clulas de Kuplfer. El receptor de la IL-18 (IL-18R) es idntico a la protena relacionada con el IL-1R (IL-1 Rrp) (Torigoe, 1997), y cuando se une a su ligando el IL-18R induce la unin del ADN NF-vp. Se han identificado IL-18Rs de alta y baja afinidad, pero sus papeles en la transduccin de seal no estn claros. La funcin primaria de la IL-18 parece ser la induccin del IFN-y en las clulas Th1 activadas y en las clulas B anti-CD40 activadas (en presencia de IL-12). La IL-18 tambin induce la sntesis por las clulas T de CM-CSF e IL6. y promueve la cilotoxicidad sobre las clulas NK permitiendo la exocilosis de perforinas y granzima A (Ushio. 1996). Los estudios in vitro sugieren un papel para la IL-18 fuera del sistema inmune (Udagawa, 1997; Stoll. 1997; Conti. 1997). Los papeles fisiolgicos de la IL-18 pueden incluir la defensa contra la infeccin, y un papel en el rechazo de tumores. A travs de la supresin de la produccin de IgE. la IL-18 puede abortar la respuesta alrgica (Yoshimoto, 1997), pero la produccin no regulada de IL-18 est asociada con el dao del parnquima heptico en modelos animales. La IL-18 puede participar en la patognesis de la linlohistiocitosis hemolagoctica (HL) a travs de la induccin de clulas Th1. La medicin de los niveles de IL-18 en la sangre perilrica de los pacientes afectos puede facilitar un medio para la monitorizacin de la actividad de la enfermedad HL latente (Takada, 1999).

Factor transformante del crecimiento [i


El TGF-p es una citocina de 25 kDa definida en un bioensayo por su capacidad para mantener la formacin de colonias por los fibroblastos del rion de ralas normales (NRK) en presencia de tactor de crecimiento epidrmico (Clark, 1998). En mamferos, son producidas tres isoformas de TGF-|i (TGF-(11. TGF-|12 y TGF-P3) (McCartney-Francis, 1998). El TGF-|i bioactivo es un homo- o heterodimero del pptido TGF-p de 12.5 kDa degradado por endopeptidasas desde el pro- TGF-p. Antes de su secrecin, el dimero TGF-p de 25 kDa se une al pptido de unin latente del TGF-p de 75 kDa (TGF-(3-lpb), y juntos se unen al pptido de latencia asociado al TGF-|J de 135 kDa (TGF-(i-lap) form a n d o el complejo TGF-ji latente (TGF-(i-lc). El TGF-p-lc se encuentra en grandes cantidades en los granulos a de las plaquetas. Una vez liberado, el TGF-p-lc se puede unir a los receptores de superficie celulares para el TGF-p o puede adherirse a los componentes ECM y permanecer latente. Alternativamente, puede degradarse a su forma activa una vez secretado a travs de las sern proteasas liberadas ya sea por la misma clula o por clulas vecinas. EL pptido de degradacin bioactivo se

Factor de necrosis tumoral


El TNF es una citocina proinflamatoria de 17 kDa (Beutler, 1995) que puede existir como forma transmembrana de 26 kDa, o como pptido soluble que se homotrimenza para formar la citocina fisiolgicamente activa de

922

SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGIA

52 kDa. Su nombre deriva de su capacidad para malar clulas tumorales y para inducir la necrosis hemorrgica en tumores trasplantados a ratones. Es un miembro de la familia de los ligados parecidos al TNF. formados todos por tres cadenas polipeptdicas y capaces lodos de unirse a miembros de una lamilia de receptores de TNF relacionados estructuralmente (Beutler, 1994). La mayora de los efectos del TNF estn mediados a travs de dos receptores de superficie celular de alta afinidad: el TNFR-I (CD120a, 55 kDa) y el TNFR-II (CD120b, 75 kDa) (Hohmann. 1989). Cuando son ligados, estos receptores median seales para la proliferacin y muerte celular programada (apoptosis), con evidencias que muestran que esto ltimo est mediado a travs de la induccin de la prdida de la integridad de la membrana mitocondrial y la liberacin de protenas del especio intermembrana. En relacin con esto, el TNFR-I tiene en su dominio mtracelular un residuo denominado "dominio mortal" que es necesario para la transduccin de la seal apopttica. Principalmente, producen TNF los macrfagos y los monocitos. pero otras clulas incluyendo los linfocitos, los mastocitos, los neutrfilos, los queratinocitos. los astrocitos, las clulas microgliales, las clulas del msculo liso y las clulas tumorales tambin lo producen. El TNF puede actuar localmente en una funcin paracrina, pero tambin acta en lugares distantes a modo de hormona. Los efectos biolgicos del TNF-a son numerosos (Kollias, 1999) e incluyen un efecto citotxico directo, la modulacin del crecimiento y diferenciacin tisular, y un papel en las situaciones de inflamacin e infeccin crnica. Adems, el TNF-a es responsable del sndrome de caquexia tumoral y de la mayora de las infecciones parasitarias. A travs de la estimulacin de los neutrfilos. el TNF-a aumenta la fagocitosis, la degranulacin y la actividad de la cadena respiratoria. Los efectos proinflamatorios adicionales incluyen la induccin del aumento de la formacin del factor activador de plaquetas (PAF) en los neutrfilos, la estimulacin de la secrecin de cido araquidnico, el aumento de la citotoxicidad anticuerpo dependiente mediada por clulas, y el aumento de la adherencia de los neutrfilos al endotelio activado por TNF a travs de la regulacin a la alta de la E-selectina; los efectos muestran el papel proinflamatorio del TNF. Los modelos animales implican al TNF en la AF y en la enfermedad inflamatoria intestinal donde el TNF ejerce un efecto proinflamatorio a travs de la activacin de las clulas endoteliales y de la induccin de las quimiocinas quimotcticas de neutrfilos. Adems, se ha propuesto un papel para el TNF en las enfermedades desmielinizantes inflamatorias del SNC sobre la base de mltiples estudios de esclerosis mltiple (EM) en humanos (Kollias, 1999). En pacientes que sufren de fiebre recurrente transmitida por piojo (infeccin por Borrelia recurrenlis), la administracin de anticuerpos bloqueantes anli-TNF ha demostrado suprimir la reaccin de Jarisch-Hexheimer (hipotensin persistente) que acompaa a la administracin del antibitico (Fekade, 1996).

MOLCULAS DE ADHESIN CELULAR


El pegamento que une los tejidos vivos en complejos organismos multicelulares est compuesto en parte de molculas de adhesin que se describen a continuacin. Estas compleas glicoproteinas permiten la migracin celular durante la embriognesis y cicatrizacin de heridas, y gobiernan el trfico de leucocitos, que es de importancia clave en la linfopoyesis y en la respuesta inmune. Las molculas de adhesin se dividen convencionalmente en cinco grupos basados en su homologa estructural: cadherinas, mucinas, integrinas, selectinas y molculas de la superfamilia de inmunoglobulmas. Las cadherinas son expresadas en su mayora en las clulas epiteliales e interaccionan con las otras de forma calcio-dependiente Las mucinas son protenas m u y glicosiladas que interactan principalmente con las selectinas. Los miembros de la superfamilia de inmunoglobulinas tienen dominios semejantes a las mmunoglobulnas e interaccionan con las mtegrmas. las selectinas. y una con la otra. Las integrinas y las selectinas se discuten ahora.

Integrinas
La familia de molculas de adhesin de las integrinas (revisadas en Gonzalez-Amaro. 1999) proporciona una unin fsica crtica entre los elementos externos a la clula (otras clulas y el ECM) y los elementos del interior de la clula (el citoesqueleto, las molculas intracitoslicas y el ncleo). Cada miembro de la familia de las integrinas est compuesto de un heterodimero d e subunidades a y p unidas no covalentemente (Tabla 39-1). Actualmente, estn completamente descritas las 16 subunidades a y las ocho |1 pudiendo originar ms de 22 combinaciones de heterodmeros. Las 14 principales integrinas se dividen en cuatro subfamilias, difiriendo en los patrones de expresin y en la especificidad de ligando. Las integrinas (i, (las integrinas de la activacin final [VLAsJ) se crean por la asociacin de una subunidad de cadena |i, (CD29) con cualquiera de las subunidades de la cadena o (CD49a a CD49f). Son expresadas en todas las clulas que requieren un firme anclaje al ECM, y en los leucocitos, plaquetas y algunas clulas tumorales circulantes. Las integrinas p , que tienden a ser expresadas principalmente por los leucocitos y las clulas mieloides, resultan de la asociacin de la subunidad de la cadena p (CD18) con cualquiera de las mltiples subunidades rx Cuando se combinan con la subunidad a, (CD11a), se forma la integrina p LFA-1 (CD11a'CD18). La LFA-1 juega un papel crucial en la adhesin leucocitana al endotelio vascular durante la migracin transendotelial. La subunidad de
? 2

Tabla 39-1

Principales integrinas: estructura molecular e interaccin

Interfern -y
El IFN--/ (Samuel, 1991) es una proteina homodimera de 40 a 70 kDa, 143 aminocidos, detectada por primera vez como un inhibidor derivado de las clulas T de la replicacin viral en cultivos de fibroblastos. Est codificado por una gen simple que est mapeado en el cromosoma 12. La clulas T y las clulas NK son las nicas fuentes conocidas de IFN. Las clulas T lo producen en respuesta a la estimulacin antignica o mitognica, y las clulas NK lo producen en respuesta a IL-2, anticuerpos anti-CD16, o en presencia de macrfagos activados (Carson, 1995). In vilro, el IFN es un potente estimulador de los macrfagos y aumenta fuertemente su actividad tumoricida. Origina una regulacin a la alta de las molculas MHC en muchos tipos celulares incluyendo las APCs. Adems, regula la produccin de anticuerpos por las clulas B (Snapper, 1987). y estimula a las clulas Thl. En respuesta a la infeccin, el IFN induce a los macrfagos a matar a los microorganismos intracelulares a travs de la produccin de metabolitos oxidativos y proteasas. Clnicamente, el IFN se ha empleado para aumentar la capacidad bactericida de los fagocitos en los que tienen enfermedades granulomatosas crnicas (Bolinger, 1992). Se ha mostrado poco prometedor como agente antitumoral.

L M N = laminina F B N = tibronectma F B G N librinogeno. VN = vitronectina. vWF = factor de von Willebrand. VCAM = molcula de adhesin celular, L F A= antigeno linfocitico funcional: ICAM= molcula de adhesin mtracelular

CAPTULO 39
? M

CITOCINAS Y MOLCULAS DE ADHESIN

923

la cadena p en asociacin con la subunidad (CD11b) forma el Mac-1 (CD11b/CD18), una integrina expresada en las clulas mieloides y en los fagocitos mononucleares. Las subunidades a. de las integrinas son protenas de membrana con 120 a 180 kDa con dominios intracitoplasmticos cortos, un fragmento extracelular largo con siete dominios homlogos, y muchos residuos de unin para iones metales (lugares de adhesin dependientes de iones metales [MIDAS]) que se cree que funcionan convirtiendo la integrina de una conformacin inactiva a una activa. Tanto la subunidad a como la |i se unen a un ligando, pero se cree que generalmente la subunidad a proporciona especificidad de ligando. Los tallos intracitoplasmticos de las subunidades de las integrinas a y p se asocian con los componentes del citoesqueleto para transducir seales mtracitoplsmicas. En el proceso de transduccin de la seal, las integrinas se asocian e interaccionan con las otras protenas asociadas a la membrana, con los componentes del citoesqueleto y con los componentes citoplsmicos no citoesquelticos. La proteina asociada a integrinas (IAP o IAP 50) designada como CD47, miembro de la superfamilia de inmunoglobulinas, es una de las protenas asociadas a la membrana que a travs, sobre todo, de su asociacin con las integrinas (5-, puede funcionar como un transductor de seal. Otras protenas asociadas a la membrana implicadas en la sealizacin de integrinas incluyen la caveolina-1 y el CD9, que estn implicados en la formacin de picnosomas de la membrana celular y en la agregacin plaquetaria. respectivamente. Las molculas citoslicas incluyendo la protena asociada a dominios citoplasmticos de integrinas (ICAP-1) ayudan a orquestar la compleja actividad de la migracin de clula mediada por integrina p,. Quizs las asociaciones intractoplasmticas de las molculas de integrinas mejor estudiadas son aquellas asociadas con las protenas del citoesqueleto rx-actinina, talina filamina, vinculina, tensina y paxilina. Estas protenas del citoesqueleto a travs de su asociacin con las subunidades de las integrinas p,, |1 , y p , unen la integrina al citoesqueleto y dirigen la migracin celular, la fagocitosis, la formacin de fibras de estrs en los lugares de contacto, la transduccin de seal intracelular, y unen las protenas del citoesqueleto separadas.
2 3

integrinas que median la unin a los componentes menos ampliamente distribuidos, la distribucin tisular est ms restringida. La expresin de las molculas de integrina depende de la activacin celular, y puede estar regulada a la alta o a la baja en respuesta a estmulos especficos del ambiente externo, incluyendo la estimulacin local por citocinas o la interaccin inmune. La interaccin de las integrinas leucocitarias con las clulas endoteliales es crtica para la evolucin de las respuestas inflamatoria e inmune. Adems, el trasporte de las clulas linfoides a sus lugares de residencia y la diseminacin intravascular de las metstasis implican similares interacciones endoteliales mediadas a travs de las integrinas de superficie y otras poblaciones de molculas de adhesin, las selectinas y sus ligandos. La extravasacin de leucocitos ocurre durante el transporte celular como el trfico de las clulas T y/6 a las placas de Peyer, y como parte de la respuesta inflamatoria. Ambos procesos implican etapas similares, empleando diferentes molculas de adhesin. En la inflamacin el proceso comienza con la liberacin local de citocinas proinflamatorias como el TNF-ot, la IL-1 y el IFN-y, que activan el endotelio local para aumentar la expresin en su superficie de molculas de adhesin incluyendo miembros de la superfamilia de inmunoglobulinas, el VCAM-1 y el ICAM-1. Adems, las clulas endoteliales liberan agentes quimiotcticos incluyendo la IL-8, formando una superficie de unin y un gradiente quimiotctico soluble reconocible por la transmigracin de clulas inflamatorias, que las localiza en los focos inflamatorios. Este proceso para los linfocitos y los eosinfilos (Fig. 39-1) implica: (1) unin de los leucocitos circulantes a la superficie endotelial principalmente por las selectinas endoteliles (selectinas E y P) y sus ligandos leucocitarios; y (2) movimiento leucocitario {rolling), en donde a travs de la expresin rpida secuencial, principalmente de la integrina leucocitaria VLA-4 y u p , la fuerza de cizallamiento (shean forc) proporcionada por el torrente sanguneo mueve los leucocitos a lo largo de la superficie endotelial, permitiendo poner estas integrinas en contacto con sus ligandos endoteliales, el VCAM-1 y el MAdCAM-1. respectivamente. En el caso de los neutrfilos, el movimiento o rodamiento est mediado solo por las selectinas. A medida que ruedan, las molculas de adhesin celular leucocitarias desencadenan acontecimientos bioqumicos conduciendo a (3) la activacin leucocitaria y a la conversin de sus integrinas en estados activados. La ahora aumentada avidez y afinidad de, principalmente, LFA-1 e ICAM-1 lleva a aumentar la adhesin celular
4 ?

El patrn de distribucin de las integrinas es amplio, especialmente entre aquellas integrinas (principalmente las |5,) implicadas en anclar las clulas a los componentes del ECM general como el colgeno y la laminina. Para estas

5. M i g r a c i n quimiotctica Figura 39-1. El movimiento de los linfocitos del torrente sanguneo hacia los tejidos est regulado por la interaccin de la adhesina de la superficie del leucocito y de la superficie de la clula endotelial a travs de un proceso de varias etapas que incluye el atrapamiento, laminacin, aplanamiento y transmigracin (o diapdesis) cuya direccin la proporciona el gradiente quimiotctico.

924

SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOIOGA de los niveles de citocinas seleccionadas y administrando las citocinas apropiadas. En la actualidad, mientras no est claro, los ensayos clnicos continuados y las mejoras en los ensayos con citocinas dilucidarn finalmente qu intervenciones y mediciones de laboratorio son realmente tiles en la prctica clnica. BIBLIOGRAFA Alexandrow MG. Moses HL: Transforming g r o w t h lactor-beta and cell cycle regulation. Cancer Res 1995; 55 1452-1457. Anderson DM. Johnson L, Glaccum MB, et al: Chromosomal assignment and genom i c structure o f1 1 1 5 Genomics 1995a; 25:701-706. Anderson DM. K u m a k i S. A h O i e h M. et al: Functional characterization of the h u m a n interteukin-15 receptor alpha chain and close linkage ol I L 1 5 R A and I L 2 R A genes. 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leucocitaria endotelial, y a la larga (4) a detener el movimiento leucocitario, y (5) la transmigracin leucocitaria del endotelio, aunque siguiendo a un gradiente quimiotclico. Es todava tema de debate si los leucocitos pasan directamente a travs de las clulas endoteliales individuales, o simplemente pasan entre las clulas endoteliales adyacentes. Una vez atravesado el endotelio, la migracin celular mediada por integnnas a travs de la matriz extracelular por medio de un gradiente quimiotctico completa el viaje de los leucocitos a los focos de inflamacin. Los estados de deficiencia para las integrinas |l, (deficiencia de adhesin leucocita tipo I) y los defectos congnitos en la expresin de las selectmas y de los ligandos demuestra el papel indispensable que juegan estos receptores en producir la respuesta inflamatoria y en el trfico linfocita. En estos pacientes los neutrfilos son incapaces de salir del torrente sanguneo y de migrar a los lugares de inflamacin o infeccin, creando en efecto un estado de supresin inmune con aumento de la susceptibilidad a las infecciones bacterianas y un neutrofilia perifrica paradjica (Bullard, 1996). Los eventos que acontecen en el choque sptico, en la trombosis, en la lesin de reperfusin y en las metstasis tambin requieren la actividad de las integrinas y las selectinas. Este conocimiento ha llevado al empleo teraputico de anticuerpos monoclonales, ligandos de molculas de adhesin solubles y otras intervenciones, incluyendo los oligonucleticos antisensibilizantes para superar la enfermedad mediada por las molculas de adhesin (Gonzalez-Amaro. 1998: Buckley. 1997).

Selectinas
La familia de las selectinas (Gonzalez-Amaro. 1999) contiene tres protenas homologas. La L-selectina (CD62L) es expresada por la mayora de los leucocitos y se cree que juega un importante papel en el transporte o trfico de los linfocitos nativos y de memoria. La P-selectina (CD62P) es almacenada en los granulos </ y en los cuerpos de Weibel-Palade de las plaquetas y de las clulas endoteliales. respectivamente, y es expresada en la superficie celular Iras la activacin celular. La E-selectina (CD62E) se encuentra en la superficie de las clulas endoteliales activadas. Las selectinas interaccionan con los grupos carbohidrato como el sialil-Lewis" y el sialil-Lewis* y posiblem e n t e con otros ligandos incluyendo las integrinas y los glicolpdos. No se ha determinado la total extensin de ligandos fisiolgicos de las selectinas, pero se espera que la lista incluya molculas expresadas en los leucocitos y el endotelio, ya que las selectinas son importantes para las interacciones leucocito-leucocito y leucocito-endotelio. El papel de las selectinas es doble: mediar la interaccin clula-clula y contribuir a la activacin celular a travs de la sealizacin intracitoplasmtica. Al igual que las integrinas, las selectinas son crticas en el contacto y movimiento (rolling) inicial de los leucocitos sobre el endotelio activado antes de la extravasacin. Tras la unin a la forma soluble de la glicoproteina similar a la mucina GlyCAM-1 (un produelo de alta expresin endotelial), la L-selectina es capaz de mediar la activacin de las integrinas B, y su adhesin a la fibronectina. La P y la E selectina tambin pueden servir como molculas receptoras de transduccin de seal, ya que producen un aumento del Ca2+ mtracelular libre en los leucocitos que se adhieren a las clulas endoteliales (Huang, 1993).

PERSPECTIVAS
Claramente, muchas de las citoemas y molculas de adhesin presentadas aqu juegan un papel en los estados de enfermedad. Los mdicos esperan que un da se estimule la remisin de las lesiones patolgicas mediadas por citocinas a travs de la manipulacin tn vivo de los niveles y proporciones de las citocinas pro y antiinflamatorias. Antes de que esto se pueda considerar seriamente, los investigadores y los laboratorios deben continuar descifrando el lenguaje de las citocinas en las clulas, y desanoliando y retinando los ensayos significativos de stas. De momento es posible monitorizar la enfermedad subclinica (IL-18), identificar poblaciones de nesgo para la sepsis (IL-6). predecir la progresin de la enfermedad (IL-10) y disminuir los efectos adversos de la enfermedad (TNF) a travs de la monitorizacin

CAPTULO 39

CITOCINAS Y MOLCULAS DE ADHESIN

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SECCION V

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C A P T U L O

40

Antigene leucocitario humano: compie mayor de h istocompatibiIidad del hom


Armead H. Johnson, Ph.D. Carolyn Kafovich Hurley, Ph.D. Robert J. Harfzman, Capt, MC, USN, M.D. Judith A. Wade, B.Sc.
GENTICA DEL COMPLEJO MAYOR DE HISTOCOMPATIBILIDAD Gentica bsica Composicin del MHC Localizacin de los genes del MHC Herencia Desequilibrio de unin Variacin tnica MOLCULAS DE CLASE I: SUBREGIONES HLA-A. -B. -C Estructura de las molculas de clase I Organizacin de los genes de clase I Regulacin de la expresin de los genes de clase I Funcin de las molculas de clase I Otros genes de clase I MOLCULAS DE CLASE II: SUBREGIONES HLA-DR. -DQ, -DP Estructura de las molculas de clase II Organizacin de los genes de clase II Desequilibrio de unin de los genes en la regin de la clase II Regulacin de la expresin de los genes de clase II Funcin de las molculas de clase II Otros genes de clase II CARACTERSTICAS DE LOS FRAGMENTOS ANTIGNICOS UNIDOS POR LAS MOLCULAS MHC DE CLASE I Y CLASE II NOMENCLATURA HLA Especificidades serolgicas y celulares 930 Designaciones allicas basadas en el ADN TCNICAS PARA LA IDENTIFICACIN DEL POLIMORFISMO DEL HLA Tipificacin basada en el ADN de los alelos de clase I y clase II Deteccin serolgica de las molculas de clase I y clase II 934 Deteccin celular de las molculas de clase II TRASPLANTE DE RGANOS/TEJIDOS Bases genticas del trasplante Concordancia de histocompatibilidad Trasplante renal Trasplante de rganos no renales Trasplante alognico de clulas progenitoras hematopoylicas RESUMEN 936 BIBLIOGRAFA 946 946 941 938 937 MOLCULAS DE HISTOCOMPATIBILIDAD MENOR 936 928 RECONOCIMIENTO DE LAS MOLCULAS MHC EXTRAAS REPETICIN EN TNDEM Y POLIMORFISMO NUCLETIDO SIMPLE EN EL MHC

936

936

La supervivencia depende de la capacidad del sistema inmune de reconocer y responder a una multitud de sustancias extraas (antgenos). Aunque este mecanismo de defensa es bsico para la supervivencia en un mundo de microorganismos hostiles, este mismo sistema de defensa tiene un impacto negativo cuando se trasplantan tejidos de uno a otro individuo o cuando su mal funcionamiento dispara las reacciones autoagresivas. Los genes del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) codifican protenas esenciales en el reconocimiento inmune: las molculas de clase I y clase II (Fig 40-1). En el hombre, las molculas de clase I incluyen el antigeno leucocitario comn (HLA-) HLA-A. HLA-B y HLA-C. y las molculas de clase II incluyen el HLADR, HLA-DQ y HLA-DP. Estas molculas son los clsicos antigenos del trasplante. Otras molculas codificadas en el MHC son las molculas de clase III (vase Cap. 41). Estas incluyen los componentes del complemento ligados al MHC (C2, C4 y Bl), la 21-hidroxilasa (CYP21), la protena 70 del golpe de calor (Hsp70) y el factor de necrosis tumoral (TNF).

Durante una infeccin, los microorganismos invasores pueden tanto infectar como ser ingeridos por las clulas y entonces ser degradados a fragmentos peptidicos. Dentro de la clula, las molculas del MHC de clase I o de clase II se unen a los fragmentos antignicos derivados de los microorganismos. Una vez que los fragmentos antignicos se han unido a las molculas del M H C y han sido translocados a la superficie celular, los receptores de los linfocitos T interaccionan con el complejo fragmento antigenico-molcula de MHC, disparando tanto la respuesta inmune humoral como la celular (Fig. 40-2). Las molculas de superficie celular especficas de las clulas T, CD4 y CD8. actan para potenciar esta interaccin celular y para transmitir las seales de activacin. Otras molculas de superficie celular actan para aumentar la afinidad de las interacciones celulares (p. ej.. el CD2 y su ligando, el CD58 [LFA-3] o el CD11a/CD18 (LFA-1J y su ligando, el CD54 [ICAM-1]) y para transmitir las seales coestimuladoras (p. ej., el CD28 y sus ligandos, el CD80/CD86 [B7j y el CD40 y su ligando, el CD154) (vase Cap. 39). El polimorfismo de los genes que especifican las molculas

928

SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA

Regin HLA clase II

Figura 40-1. M a p a del compiejo de genes del MHC en el c r o m o s o m a 6. El HLA-DPB2 en la regin H L A clase II est localizado c e r c a del centrmero. El HLA-F es el ms leiomnco. La regin entre el HLA-DRA y el HLA-B no se muestra. (De T h eA n t h o n yN o l a n B o n eM a r r o w Trust: w w w . a n t h o n y n o lanorg.uk/HlG. c o n permiso.)

MHC de clase I y clase II afecta a la especificidad de unin al antigeno de las molculas, originando diferencias en las respuestas inmunes sobre los miembros de las especies. El mismo patrn de interacciones entre el exterior celular y el complejo MHC clase I o clase ll-antgeno y un linfocito T ocurre no solo en el reconocimiento de los patgenos invasores, sino tambin en el reconocimiento de las molculas extraas de clase I y clase II (aloantigenos) y en el reconocimiento de los antigenos propios (autoantgenos) (vase Cap. 41). Y a que las molculas MHC extraas de clase I y clase II son reconocidas c o m o antigenos "de trasplante", es beneficioso garantizar que el donante y el receptor son hislo- (es decir. Tejido) compatibles (es decir. HLA emparejado). Las molculas de clase I y clase II tienen mltiples alelos posibles en la poblacin. Por ello, garantizar la compatibilidad es a menudo una tarea difcil, que requiere la colaboracin del personal mdico, del personal clnico que tipifica el HLA, y de los coordinadores del tejido donante (p. ej., redes de donantes de rganos y registros o bancos de donantes de clulas hematopoyticas). En este captulo se trata la gentica, estructura, luncin, nomenclatura y las tcnicas de deteccin de los productos gnicos del MHC humano, el HLAA, -B y -C (clase I) y el HLA-DR, -DQ y -DP (clase II). Tambin se discute la importancia de la concordancia del HLA en el trasplante. Adems de las listas de referencia del final del capitulo, en la Tabla 40-1 se nombran pginas web tiles que proporcionan tanto material de referencia como actualizaciones de resmenes clnicos.

cromosomas (es decir, un nmero haploide) se transmite por cualquiera de los gametos dados. El doble, o nmero diploide de cromosomas, se restablece cuando se fusionan los gametos masculino y femenino para formar el cigoto. De este modo, para un rasgo determinado por un gen, siempre habr cuatro combinaciones genticas posibles en la descendencia, cada una con una probabilidad de incidencia igual. Estas leyes de la segregacin y de divisin aleatoria se aplican a los genes del sistema MHC. Las definiciones para trminos genticos que sern empleados este captulo se dan a continuacin (Crow. 1976; www.nhgri.nih.gov).

GENTICA DEL COMPLEJO MAYOR DE HISTOCOMPATIBILIDAD Gentica bsica


La primera ley de Mendel, la ley de la segregacin, esl basada en el principio de que los rasgos hereditarios estn determinados por factores que estn distribuidos en la progenie. En cualquier individuo, estos factores, o genes como ahora se llaman, estn presentes en los cromosomas (vase Cap. 62). Cada gen tiene mltiples formas (esto es. alelos). Como los humanos son diploides. hay dos genes por cada par de cromosomas homlogos. En la meiosis. los cromosomas se separan al azar durante la formacin de los gametos (ovocito y espermatozoide) de modo que solo ur,o de cada par de

Figura 40-2. Modelo de las interacciones moleculares implicadas en el reconocimiento antignico.

CAPTULO 40

ANTGENO LEUCOCITARIO HUMANO: COMPLEJO MAYOR DE HISTOCOMPATIBILIDAD...

929

Tabla 40-1

Sitios web sobre HLA y trasplante Direccin Informacin Sociedad Amencada para la Histocompatibilidad e inmunogentica. tipificacin estndar del HLA Base de datos de la secuencia HLA, herramientas para la presentacin de alelos y para la manipulacin de secuencias Informacin de nomenclatura de la Organizacin Mundial de la Salud Taller Internacional de Histocompatibilidad Programa Nacional de Donantes de Mdula sea Informacin para el Trasplante de Mdula sea Banco de Donantes de Mdula sea Asociacin Mundial de Donantes de Mdula Registro Internacional de Trasplante de Medula sea Estudio Colaborador de Trasplante United Network lor Organ Sharing Instituto de Investigacin Nacional del Genoma Humano

w w w swmed edu/horne_pages/ashi/ashi.htm w w w wbi.ac.uk/imgi/hla/ w w w anlhonynolan org uk/hig w w w ihwc org o ww ihwg.org w w w marrow.org www.bml.org wwwbmdw.org w w w worldmarrow org www.ibmtr.org www.ctstransplant.org wwwunos.org w w w nhgn.nih.gov

Gen El factor unitario de la herencia. Cromosoma Transportador de los factores unitarios de la herencia. Locus Posicin de un gen en un cromosoma. Alelo Forma alternativa de un gen en un locus nico. Homocigoto Tener idnticos alelos en un locus, uno en cada cromosoma. Heterocigoto Tener diferentes alelos en un locus. uno en cada cromosoma. Codominancia Estado en el que el alelo de cada locus expresa su efecto caracterstico igualmente en el heterocigoto. Genotipo Composicin gentica de un organismo o individuo. Fenotipo Caractersticas observables producidas por los genes. Polimrfico Tener dos o ms genotipos frecuentes distintos mantenidos en la poblacin. Cromosomas homlogos Los dos miembros de un par de cromosomas que tienen su correspondiente locus gnico, uno derivado de cada progenitor. Entrecruzamiento Cambio de segmentos entre cromosomas homlogos. Este proceso tambin puede llamarse recombinacin. Alo- (antgeno. injerto) Se refiere a diferencias antignicas entre individuos de la misma especie. Auto- (antgeno, injerto) Se refiere a tejidos o antigenos del mismo individuo (es decir, propios).

decir, estudios de entrecruzamiento en familias) y por tcnicas de biologa molecular incluyendo la clonacin gnica. la secuenciacin de ADN y elecIroforesis en gel con campo pulstil. La ltima tcnica detecta la presencia de genes en grandes fragmentos simples de ADN El orden de mapeo de los genes en el MHC es HLA-A. -B. -C. -DR. -DO. -DP. siendo el HLA-A distal al centrmero (Fig. 40-1).

Herencia
Los genes del MHC estn muy ligados, esto es, se segregan en bloque a la descendencia. El complejo de genes ligados que reside en uno del par de cromosomas homlogos y que se segrega en bloque a la descendencia se denomina "haplotipo". Cada individuo hereda dos haplotipos M H C (uno de cada progenitor) y por ello tiene dos alelos para cada uno de los genes. Esos alelos se expresan codominantemente. La herencia de los genes del M H C sigue las reglas de la segregacin definidas por Mendel. En una familia, cada nio hereda un haplotipo del MHC de la madre y otro del padre. Por convencin, los haplotipos paternos se designan como a y y los haplotipos maternos como c y d. Por ello, hay cuatro genotipos posibles del MHC en el descendiente: ac. ad. be y bd. Ya que la posibilidad de heredar un haplotipo determinado es aleatoria, la probabilidad de incidencia de cualquiera de los cuatro genotipos es una entre cuatro para cada emparejamiento. En una familia con cinco hijos, al menos dos de los nios tendrn un HLA idntico (asumiendo que no hay entrecruzamiento). En la Figura 40-3 se da un ejemplo de emparejamiento y de los cuatro posibles genotipos. Aunque los genes del M H C estn muy ligados, hay casos de familias en las que se ha producido un entrecruzamiento (Fig. 40-4). Se pens en la frecuencia de entrecruzamiento entre dos genes ligados como medida de la distancia de separacin entre los genes; sin embargo, los datos moleculares han sugerido la existencia de puntos calientes de recombinacin en el ADN implicado que puede aumenlar o disminuir la probabilidad de recombinacin durante la meiosis (Uematsu, 1988)

Composicin del MHC


El complejo de genes de histocompatibilidad mayor en humanos est localizado en el brazo corto del cromosoma 6 (es decir, 6p2l). Abarca 3.600 kb (kilobases) e incluye 224 locus gnicos identificados, de los que 128 est previsto que se expresen. Se estima que aproximadamente el 40% de los genes expresados tienen una funcin en el sistema inmune (Aguado. 1999). L o s genes HLA del MHC estn localizados en seis subregiones: HLA-A. HLA-C. HLA-B. HLA-DR. HLA-DOy HLA-DP (Fig. 40-1). Cada subregn codifica un mnimo de una glucoprotena de superficie celular. Con una nica excepcin, los genes del HLA son altamente polimrficos. esto es, cada uno de los genes del HLA tiene mltiples alelos en la poblacin humana. De hecho, los genes del HLA son los locus ms polimrficos conocidos en el hombre (Parham, 1995; Tabla 40-1, www.anthonynolan.org/uk/hig). Debido a que los genes del HLA especifican molculas que tienen un papel importante en la respuesta inmune, se cree que el polimorfismo es esencial para la supervivencia de las especies y para mantenerse en la poblacin por la seleccin.

Desequilibrio de unin
La observacin de que alelos en diferentes locus genticos ocurren en la poblacin en el mismo haplotipo significativamente ms frecuentemente de lo que cabria esperar sobre la base de la posibilidad aislada se denomina desequilibrio de unin. La frecuencia esperada de que ocurran a la vez dos alelos (f 1. f2) es el producto de la frecuencia gnica de cada alelo en dicha poblacin ([Lju, = f1 x f2]). La frecuencia observada se determina por estudios familiares en la misma poblacin. El desequilibrio de unin es una caraclers-

Localizacin de los genes del MHC


Los genes del MHC fueron asignados al brazo corto del cromosoma 6 (6p) sobre la base de estudios citogenticos de cromosomas aberrantes (esto es, cromosomas que han sufrido una traslocacin). El orden y la posicin de mapeo de los genes del MHC fue determinada por anlisis de unin meitica (es

930

SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPAIOLOGA

tica del MHC humano y se extiende desde el HLA-A hasta el HLA-DQ. El ejemplo mejor conocido de desequilibrio de unin es el haplotipo A1, Cw7. B8, DR17(3), DR52, DQ2 en caucasianos que es observado aproximadamente cuatro veces ms frecuentemente de lo esperado. El significado del desequilibrio de unin como aplicacin a la competencia inmune y a la enfermedad se discute posteriormente en el Captulo 41 en el apartado Haplotipos extendidos.

Variacin tnica
Los datos acumulados del estudio de los grupos de poblacin mundial (Dausset. 1973; Imanishi, 1992; Cadavid, 1997; Bugawan. 1999) demuestran que las frecuencias de los alelos del HLA difieren significativamente entre los grupos de poblacin tnica. Los haplotipos del MHC y el desequilibrio de unin de los alelos tambin difieren. Estas observaciones deben tenerse en cuenta cuando se desarrollan alotrasplantes de clulas progenitoras hematopoyticas de registros y bancos de donantes no relacionados como en el Programa Nacional de Donantes de Mdula de los Estados Unidos (NMDP) (Perkins. 1994). Tanto la frecuencia de los alelos como de los haplotipos dictan el nmero de voluntarios requeridos para encontrar un donante HLA-idntico no emparentado para cualquier paciente. Algunos pacientes (i.e., aquellos con tipos raros o inusuales) no pueden encontrar donantes idnticos no emparentados de entre ms de 6 millones de voluntarios listados en todos los registros de donantes mundiales (Beatty 1995; Mori, 1997). La mejora en los mtodos para el injerto de clulas progenitoras de donantes parcialmente HLA-idnticos puede permitir el trasplante en pacientes para los que no se pueden encontrar combinaciones cercanas (vase Cap. 33).

cacin de acontecimientos recombinacionales que separaban las dos series allicas. Estas dos series allicas fueron llamadas la primera o LA (ahora HLA-A) y la segunda, o cuatro series (ahora HLA-B). Estos nombres derivaban de la descripcin de las series allicas LA 1, 2, 3 hecha por Payne en 1967 y de las series allicas 4a, 4b de van Rood en 1969. Un tercer locus fue propuesto por primera vez en 1970; sin embargo, no se confirm hasta 1975, cuando se identific una familia con recombinacin entre el HLA-B y el nuevo locus. Este tercer locus fue designado HLA-C tras el Taller Internacional de Histocompatibilidad de 1975. Dausset (1981) recibi el Premio Nobel de Medicina en 1980 por su original trabajo sobre el sistema HLA humano.

Estructura de las molculas de clase I


Las molculas clsicas de clase I, denominadas HLA-A, HLA-B y HLA-C en el hombre, son heterodmeros formados de un polipptido glicosilado transmembrana (cadena pesada, 44 kDa) asociado no covalentemente con la |3microglobulina (12 kDa) (Fig. 40-5) (Bjorkman, 1990). La cadena pesada de la molcula de clase I se ancla a la membrana celular y est orientada con sus aminos terminales en el exterior celular. La p^microglobulina est asociada con la regin extracelular de la cadena pesada y es necesaria para la expresin de la superficie celular.
;

MOLCULAS DE CLASE I: SUBREGIONES HLA-A, -B, -C


Las molculas HLA-A y -B fueron las primeras molculas del MHC descritas en humanos (Dausset, 1981; van Rood, 1993). Y a que estas molculas fueron definidas por respuestas de anticuerpos frente a los glbulos blancos (WBCs), son denominadas "antgenos" leucocitarios humanos. Los anticuerpos leucocitarios fueron observados en humanos m u y pronto, en los aos 20, pero no fue hasta los aos 50 cuando comenz el estudio sistemtico. En 1952, Dausset demostr convincentemente la existencia de los anticuerpos leucocitarios (leucoaglutininas). Y a que estas leucoaglutninas no reaccionan con los leucocitos del anticuerpo productor pero reaccionan con un porcentaje de leucocitos del grupo de O de los eritrocitos de individuos no emparentados, sugiri que estas leucoaglutninas eran aloantjcuerpos. Poco despus, Payne (1964) inform de que el suero de pacientes que tenan reacciones febriles no hemolticas a la transfusin de sangre contenia frecuentemente leucoaglutninas que demostraban la aloespecificidad. En 1958, Dausset describi el primer aloantgeno HLA "MAC* (ahora HLA-A2+HLA-28) y mostr que estaba genticamente determinado. Originalmente, se pens que las especificidades de leucocito eran producto de un locus simple. Se estableci un modelo de dos locus, cada locus con mltiples alelos, a travs de los estudios HLA en familias mediante la identifiFigura 40-5. Modelo esquemtico de la estructura de las molculas de clase I y clase II.

CAPTULO 40

ANTGENO LEUCOCITARIO HUMANO: COMPLEJO MAYOR DE HISTOCOMPATIBILIDAD...

931

Tabla 40-2

Ejemplos d e antigenos H L A r e c o n o c i d o s por la O M S (especificidades) definidos por tipificacin serolglca y alelos HLA definidos por secuenciacin d e A D N ' '
A n t g e n o s HLA-DQ Alelos' HLA-A A0101-0I04N A 02011-0230 A 03011-0304 A1101-1105 A2301 A2402101-2420 A2501-2502 A2601-2612 A 2901-2904 A 3001-3007 A 31012-3104 A3201-3203 A3301-3304 A3401-3402 A3601 A4301 AGG01--6603 A68011-'6809 A6901 A7401-7403 A 8001 Alelos* HLA-DQ A1 DOA1 0101-0105 Alelos HLA-DBQI DOB 10501-0504 DOB 1 06011-0615 DQB1 0201-0203 DOB 1 03011-0309 DOB 1'0401-0402

A n t g e n o s HLA-A

A1 A2 A203' A2I0 A3 A9 A10 A11 A19 A23(9)' A24(9) A2403 A25(10) A26(10) A28 A29(19) A30(19) A31(19) A32(19) A33(19) A34(10) A36 A43 A66(I0) AG8(?8) A69(28) A74(19) A80

DOI DQ2 DQ3 DQ4 DQ5(1) DQ6(I) DQ7(3) DQ8(3) DQ9(3)

DOA 10201
DOAI03011-0303 DQA 10401 DQA1 05011 - 0505 DOAI06011-06012

Adoptado de w w w anlhonynolan org uk/HIG con permiso de SGE Marsh Cada columna de la tabla es independiente. Lsatelos HLA-A especilican los antgenos HLA-A. El antigeno A1 se especilica por lsatelos A'0101 o AVI 02 o A 0103. El AOfONesun alelo nulo o no expresado Los alelos HLA-DQ) y HLA-DOBl especifican los antigenos HLA-DQ. El antigeno D05 (I) es especilicado por mltiples combinaciones diferentes del DOAI y el DOB1 incluyendo (1) los alelos DOA1V101 y DAB1V501 y (2) DOAV0101 y DOB10502 En el pasado las designaciones de la divisin seroigica eran dadas a especificidades que parecan identificar el antigeno especificado por un alelo HLA simple (p ej. A2 se divide en A203. A210. B7 se divide en B703: B39 se divide en B3901 y B3902) Ahora se ha reconocido que otros telos pueden tambin codificar anli genos que llevan estas especificidades serctgicas y Comit de Nomenclatura de la OMS ha recomendado que se desechen estas divisiones Los nmeros entre parntesis indican la viea especificidad seroigica El tipo seroiogico puede listarse sin la vieja especificidad Por ejemplo, tanto A23(9) como A23 son designaciones correctas
!

Las cadenas pesadas del HLA estn codificadas en el MHC en el cromosoma 6 (Fig. 40-1) (Shiina, 1999) y son altamente polimrficas. mientras que la IVmicroglobulina est codificada en el cromosoma 15 y no se conoce que sea polimrfica en humanos. El gen tpico de clase I est codificado por ocho Nuevas perspectivas en la estructura de la molcula del HLA llegan cuando exones que corresponden a los segmentos de la molcula recin descrita se define la estructura tridimensional de la molcula de clase I utilizando crista(Fig. 40-7). El primer exn codifica la regin 5 no traducida y el pptido hidrolografa con rayos x (Bjorkman. 1987). La estructura de la porcin extracelular se fbico lder. Los exones 2 a 4 codifican los tres dominios extracelulares: el muestra en la Figura 40-6A La molcula est formada por dos pares de domiexn 5 codifica la regin transmembrana. Los exones sexto y sptimo codifinios estructuralmente similares: el u, tienen la misma conformacin terciaria que can la regin citoplasmlica y el exn octavo codifica la regin 3' no traduciel it, mientras que el u- y la |5,-microglobulina lienen similares conformaciones da incluyendo el lugar de adicin poly(A). Las secuencias intermedias (llamaterciarias. Los dominios a, y [5,-microglobulina estn formados cada uno por dos hojas 3 plegadas antiparalelas. una con cuatro cadenas y otra con tres cadenas, das mtrones) entre los exones son transcritas a cido ribonucleico (ARN) pero son eliminadas durante el corte y empalme del mensajero (ARNm). conectadas por un puente disulfuro. Los dominios (t, y ix interaocionan uno con

La regin extracelular de la cadena pesada de clase I est dividida en tres dominios llamados (/.,, u y a , teniendo cada uno alrededor de 90 residuos de aminocidos. El dominio a, aminoterminal contiene un lugar de glicosilacin en el residuo asparragina en la posicin 86. El segmento transmembrana (TM) de aproximadamente 24 aminocidos es el ms hidrofbico. mientras que el segmento intracelular carboxiterminal de la molcula est formado principalmente por residuos hidrofilicos con un grupo de residuos bsicos adyacentes a la superficie citoplsmica (CY) de la membrana celular. El polimorfismo de las molculas de clase I (Tabla 40-2) (Bodmer, 1997. 1999) se define por el empleo de (1) anticuerpos especficos de clase I (anticuerpos aloantisuero y monoclonales) que se unen a las molculas del HLA: (2) lnfocitos T citotxcos (LTCs) que reconocen y destruyen en respuesta a la estimulacin in vitro por molculas de clase I extraas o alogenicas; (3) imagen isoelctrica de las molculas de clase I aisladas: (4) reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) basada en la tipificacin del ADN de los alelos de clase I; y (5) secuenciacin de los nucletidos de los alelos de clase I. La mayor parte del polimorfismo de la clase I proviene de las diferencias en las secuencias de aminocidos encontradas en los dominios ot, y ce, de la cadena pesada. El dominio (,es altamente conservado entre las molculas HLA de clase I.
3

otro a travs de estas hojas plegadas (i y su estructura simula mucho la desenta para el dominio de la regin constante de la inmunoglobulina. Los dominios a, y a estn unidos para formar hoja plegada |5 de 8 cadenas. Esta hoja se detiene por dos hlices c t formando una ranura en la parte alta de la molcula. Esta ranura es el sito para la unin de los fragmentos peptidicos antignicos por la molcula de clase I (Fig. 40-6S). Los lados y el fondo de la ranura estn formados por cadenas laterales de aminocidos que componen las hlices y las hojas plegadas |i Muchos de los aminocidos que alinean esta ranura son polimrficos. creando diferencias alelo-especficas en la especificidad de unin al antgeno entre los diferentes productos allicos de clase I (Stern, 1994). Otros residuos en las regiones helicoidales de la ranura interaccionan con el receptor de clulas T durante el reconocimiento del complejo clase l-fragmento antignico por el linfocito T (vase Fig. 40-2).

Organizacin de los genes de clase I

932

SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA

Figura 40-6. A. Modelo tridimensional de la porcin extracelular de l a molcula de clase I. B. Vista superior de la m i s m a molcula mostrando la ranura de unin al pptido (De Bjorkman PJ, Saper M.A, SamraouiB, el al: Structure of the human Class I histocompatibility antigen, H L A A2. Nature 1987; 329:506. con permiso.)

antignicos en los linlocilos T (vase Cap. 36). La presentacin del antgeno por las molculas de clase I permite a las clulas T detectar y crear una Las molculas HLA de clase I son expresadas como glucoprotenas transrespuesta citotxica contra el material extrao (p. ej., un virus o protenas membrana en la superficie de muchos tipos celulares. Sin embrago, el nivel de anormales de clulas malignas). En el citosol. los antigenos mtracelulares expresin de superficie puede variar importantemente (Singer, 1990). El nivel (incluyendo las protenas propias y las protenas virales o anormales) son basal de molculas de clase I es mayor en las clulas linfoides; las molculas degradados en fragmentos peptidicos (Rock, 1999). Los fragmentos peptdide clase I son indetectables en la membrana de otros tipos celulares como las cos son transportados al retculo endoplasmtico donde se unen a la ranura clulas del cerebro, las clulas musculares y los espermatozoides. La secuende la parle alta de las recientemente sintetizadas molculas de clase I y cia de elementos localizados por encima de los genes de clase I se unen a facentonces son transportadas a la superficie celular (Pamer. 1998; T.H.Hansen, tores reguladores que controlan la expresin en la superficie celular de las 1997) (Fig. 40-2). Cuatro genes, localizados en la regin de clase II del MHC molculas de clase I. Durante una respuesta inmune, la expresin en la super(Figs. 40-1 y 40-8), estn implicados en este proceso. Dos de estos genes ficie celular de los genes de clase I puede ser regulada al alza por las citocinas (LMP2 y LMP7) codifican componentes del complejo del proteosoma. una (p. ej., el interfern-Y y el TNF) unindose a los elementos reguladores supeestructura macromolecular que degrada las protenas en el cilosol (Tanaka, riores. Los tumores y ciertos virus (p. ej., virus de la inmunodeficiencia humana 1997). Los otros dos genes {TAP1 y TAP2) codifican componentes de los [VIH]) pueden suprimir la expresin de clase I (Brodsky, 1999). transportadores peptidicos que mueven los pptidos del citosol al retculo endoplasmtico (Momburg, 1998).

Regulacin de la expresin de los genes de clase I

Funcin de las molculas de clase I


Las molculas HLA-A, -B y -C juegan papeles clave en la respuesta inmune. Primero, en la respuesta inmune adaptaliva, las molculas de clase I se unen a pptidos derivados de protenas sintetizadas en el citosol y las presenta en la superficie celular para que sean reconocidas por los receptores

Los LTC CD8+ reconocen el pptido procesado en conjunto con la molcula de clase I (Jorgensen, 1992). En el sistema experimental empleado para determinar este mecanismo, los LTCs fueron generados por la estimulacin in vitro con clulas autlogas infectadas con virus. El reconocimiento y la lisis de la clula diana fue especfica para cada cepa de virus preparada. El recono-

CAPTULO 40

ANTGENO LEUCOCITARIO HUMANO: COMPLEJO MAYOR DE HISTOCOMPATIBILIDAD...

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Figura 40-8. M a p a de la regin de clase II del MHC humano. Los producios gnicos codificados por cada regin se nombran debajo No estn incluidos lodos los genes.

HLA-G. El HLA-G se expresa principalmente en las clulas extravellositarias del citotrofoblasto en la inlertase feto-materna, donde se cree que |uega un papel en la tolerancia matemofetal (Le Bouteiller. 1999). El HLA-G. como ligando para al menos tres N K y otros receptores de inhibicin celular, protege el tejido placentano de la accin citolitica de las clulas NK. Aunque el HLA-G tiene la capacidad de unirse y presentar el antgeno procesado (es decir, pptidos) a las clulas T, la diversidad de pptidos unidos parece ser menor que la diversidad de pptidos unidos por las molculas de clase I clsica. La reguHay dos grupos de receptores de NK: (1) el receptor tipo C lectina CD94/NKG2 lacin de la expresin del HLA-G tambin difiere de la de los genes de clase I cuyos genes residen en el cromosoma 12. y (2) los receptores de clula aseclasicos, ya que el gen no contiene una seal de respuesta al interiern; por sina similares a inmunoglobulinas (KIR) codificados por genes del cromosoma ello, no es interiern mducible. Finalmente, las transcripciones del HLA-G son 19. La funcin de las clulas N K parece ser regulada por un equilibrio entre los unidas alternativamente originando al menos cuatro isoformas de unin a la receptores de seal positivos que inician y los receptores inhibidores que membrana y dos isoformas solubles de HLA-G. Se ha hipotetizado que las forsuprimen la activacin celular. Ambos grupos de receptores reconocen los mas solubles pueden actuar como inmunosupresores especficos durante el ligandos HLA de clase I. Por ejemplo, los receptores KIR2D diferencian entre embarazo (Le Bouteiller, 1999). los ligandos del HLA-C basndose en la presencia de residuos de aminocidos especficos en los codones 77 y 80 (i.e.. asn77lys80 frente a ser77asn80). HLA-E. El HLA-E puede jugar un papel en la proteccin de la clula diana Otro receptor de NK. el KIR3D. reconoce el polimorfismo del HLA-Bw4/Bw6 de la lisis mediada por la clula NK. Las molculas de HLA-E se unen a un (Fig. 40-9). Un lercer receptor NK. el CD94/NKG2. reconoce la molcula de grupo de pptidos hidrolbicos bastante idnticos derivados de las secuencias HLA-E en complejo con el pptido lder HLA de algunos de los productos allider de las cadenas pesadas de la clase I clsica y del HLA-G. El HLA-E prelieos de las molculas del HLA-A, -B. -C y -G (Brooks 1999). Las clulas N K pueden reconocer especficamente y lisar clulas alognicas que no expresan las molculas especficas de clase I expresadas por la clula efeclora (i.e.. "prdida de lo propio") (Valante, 1997). Esto puede ocurrir potencialmente incluso en pares de trasplantes aparentemente HLA idnticos donde un miembro de la pareja es homocigotico y el otro es heterocigtico (p. ej., donante: Bw4, Bw6: receptor: Bw6). Por ello las clulas N KB w 4 especficas del donante pueden lisar las clulas sin B w 4 del receptor en un injerto de progenitor celular hematopoytico. Esta respuesta puede ser unidireccional en algunas situaciones. En el ejemplo, el donante no pierde ninguna molcula HLA presente en el receptor, por ello, las clulas N K del receptor no detectan ninguna prdida de lo propio. Y a que las clulas N K son relativamente radiorresistentes y comprenden una subpoblacin de alrededor del 10% al 15% de los lintocitos de sangre perifrica, la respuesta N K puede ser sustancial: sin embargo, no se conoce hasta el momento el papel absoluto de la actividad N K en la alectacin al trasplante (Ruggeri, 1999).

cimiento tambin estaba afectado por el polimorfismo allico de las molculas de clase I. ya que slo las clulas diana infectadas viralmente que compartan el producto(s) allico de clase I apropiado con el que responda fueron U s a d a s (Zmkemagel. 1997a. 1997b). El ltimo requerimiento se denomina "restriccin MHC". Znkernagel y su colaborador Doherty recibieron el Premio Nobel de Medicina en 1996 en reconocimiento a la importancia del concepto de la restriccin MHC en la inmunologa. Segundo, la molcula de clase I tiene una funcin protectora en la respuesta inmune innata previniendo la lisis de la clula diana efectuada por las clulas asesinas naturales (NK). A diferencia de los LTC. las clulas N K no requieren la activacin a travs del reconocimiento de pptidos unidos a la molcula de clase I sino que pueden lisar y destruir las clulas diana que han perdido la expresin de la molcula del HLA clase I clsica en la superficie celular. A travs de este mecanismo innato, las clulas N K juegan un importante papel en la supervivencia frente a los virus y a las clulas tumorales quo regulan a la baja la expresin de la molcula de clase I para evitar el reconocimiento por los LTC (Lainer. 1998: Long, 1999).

taliva como en la innata (O Callaghan. 1998) Sus genes son homlogos a los genes de la clase I clsica en estructura y los polipplidos codificados por estos locus tambin se asocian con la |i,-microglobulina. Sin embargo, al igual que un nivel alto de polimorfismo allico es un marcador de los locus del HLAA, HLA-B y HLA-C, un nivel ba|o de polimorfismo del locus del HLA-E. HLA-F y HLA-G es una caracterstica definitoria de estos genes. Adems, en comparacin con las molculas de clase I clsicas, la expresin en la superficie celular de molculas de clase I no clsicas es baja y la distribucin de estas molculas de clase Ib en los tipos celulares especilicos varia.

A2 + B17

A2 - A69

Otros genes de clase I


Al menos se han identificado 20 genes adicionales no clsicos o de clase Ib en la regin de clase I del cromosoma 6p por clonacin de genes (Aguado. 1999) Muchos de estos son seudogenes; sin embargo, muchos codifican y expresan ARNm de tipo clase I y/o molculas. HLA-E. HLA-F y HLA-G. Estas molculas pueden ser mediadores clave tanto en la respues'a inmune adapFigura 40-9. Vista superior de la molcula de clase I con sus residuos aminocidos polimrticos indicados por las especificidades B w 4yB w 6 y las especificidades d e reactividad cruzada A2 * A28 A2 - A69, y A2 + B17. (Modificado de Parham P. y col: HLA-A. B. C: Patterns of polymorphism m peplide-bindmg. proteins. En D u p o n t B [ed]: Immunobiology of HLA. Vol 1 N e w York. Springer-Verag. 1989, pg. 17. con permiso.)

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SecciN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA

senta estos pptidos de unin a la superficie celular para el reconocimiento por las clulas NK. proporcionando un chequeo para la integridad de la va de presentacin antgnica (Lee, 1998a, 1998b; O'Callaghan, 1998). Los injertos cutneos en modelos de ratones transgnicos sugieren que el HLA-E puede ser reconocido como un antgeno de trasplante (Pacasova. 1999). HLA-F. El papel del HLA-F es desconocido. Los modelos por ordenador predicen que ciertos residuos de aminocidos del HLA-F pueden contribuir a una unin del pptido putativo en la hendidura, lo que indica un papel en la presentacin antignica del HLA-F (O'Callaghan, 1998). La expresin del HLA-F en la superficie celular no ha sido detectada en reproducciones.

MOLCULAS DE CLASE il: SUBREGIONES HLA-DR, -DQ, -DP


Las molculas de clase II en humanos fueron reconocidas por primera vez por su capacidad para estimular a las clulas T alognicas en los cultivos mixtos de leucocitos (CfvlL). Durante el Taller Internacional de Histocompatibilidad de 1975, los CML fueron empleados para definir las series allicas del HLA-D (Thorsby, 1975). Ya que los cullivos mixtos de leucocitos requieren siete das antes de que se puedan obtener los resultados, se busc una deteccin serolgica rpida del HLA-D. En 1975, se determin que el aloantisuero contena anticuerpos reactivos con las molculas muy asociadas con las especificidades previamente identificadas como HLA-D por tcnicas celulares (Dausset, 1981). Tras el Taller Internacional de Histocompatibilidad de 1977, estas especificidades serolgicas fueron denominadas DR, de especificidades D relacionadas, ya que se observ que el HLA-D y el HLA-DR estaban asociados pero no eran idnticos el uno al otro. Los test serolgicos desarrollados con estudios genticos e inmunoquimicos identificaron molculas adicionales de clase II. el DR52, el DR53, el DR51 y el DQ. Las tcnicas celulares identificaron an otra molcula de clase II a finales de los aos 70 (Shaw, 1981). Esta molcula (ahora llamada HLA-DP) fue descrita inicialmente como un antgeno secundario de la clula B (SB) ya que normalmente era muy baja o indetectable en CML primarios y requera una segunda fase de estimulacin en el cultivo para la deteccin. Posteriormente, se sigui con la caracterizacin de las secuencias codificantes del ADN y las localizaciones de estos genes en el MHC empleando tcnicas de biologa molecular (Beck, 1999).

alta. Al igual que en las de clase I, muchos de las aminocidos que alinean la ranura de unin al pptido antignico son polimrficos, creando diferentes especificidades de unin al pptido para los diferentes productos allicos de clase II. Al igual que las molculas de clase I, las molculas de clase II son altamente polimrficas (Tabla 40-2) (Bodmer, 1997, 1999). El polimorfismo de clase II est definido por 1) anticuerpos especificos de clase II (anticuerpos aloantisuero y monoclonales), que se unen a las molculas de clase II; 2) clulas T aloproliferativas que reconocen y proliferan in vitro en respuesta a molculas extraas de clase II; 3) electroforesis en gel bidimensional de molculas de clase II aisladas; 4) hibridacin por endonucleasa que difiere el ADN codificante de los genes de clase II empleando sondas especificas de locus (una tcnica que detecta el polimorfismo ligado a los fragmentos de restriccin [RFLPIJ; 5) tipificacin del ADN basada en PCR de los alelos d e clase II: y 6) secuenciacin de nucletidos de los genes de clase II. La mayor parte del polimorfismo de clase II deriva de las diferentes secuencias de aminocidos localizados en los dominios a, y p, de las dos cadenas polipeptdicas.

Organizacin de los genes de clase II


En contraste con las molculas de clase I, tanto la cadena u c o m o la P de las molculas de clase II estn codificadas en una seccin de 1100-kb de la regin MHC (Figs. 40-1 y 40-8) (Beck, 1999). La regin de clase II incluye tres subregiones -DR, DQ y DP- cada una de las cuales codifica al menos un gen expresado A (codificando una cadena ) y uno B (codificando una cadena [}). Las comparaciones de secuencias sugieren que ambos genes de clase I y de clase II surgen de sucesivas seres de duplicaciones gnicas durante la evolucin de este complejo gnico. La duplicacin original en la regin de clase II origina con mayor probabilidad los genes A y B primordiales. Duplicaciones gnicas ms recientes generan las subregiones DR. DQ. y DP que contienen mltiples genes. Un gen A tpico contiene cinco exones codificando: 1) la regin 5' aminoterminal no traducida y la secuencia lder; 2) el dominio a,; 3) el dominio tt 4) el pptido de conexin, la regin transmembrana, el residuo citoplasmtico, y una porcin de la regin 3' no traducida; y 5) el resto de la regin 3' no traducida incluyendo la seal de adicin poly(A). Un gen tpico de cadena | 3 es similar al gen de la cadena a pero tiene un exn extra para el residuo citoplasmtico. Subregin DR La subregin DR codifica una o dos molculas DR. dependiendo del haplotipo (Bodmer. 1997. 1999). La subregin contiene un gen simple expresado DRA que es similar en diferentes haplotipos difiriendo solo en la sustitucin de un aminocido simple conservativo en el dominio citoplasmtico. El gen ms centromrico DRB, DRB1 (Fig. 40-8), codifica una cadena p altamente polimrfica que, cuando se asocia con la cadena a, exhibe especificidades serolgicas desde DR1 a DR18 (Tabla 40-3). Esta molcula es la molcula de clase II predominante en la superficie celular, constituyendo al menos ms de la mitad de la superficie celular total de las molculas de clase II. Hay mltiples cidos nucleicos y, por ello, diferencias en la secuencia de aminocidos entre los alelos DRB1. El segundo gen expresado DRB, presente solo en algunos haplotipos de clase II, est localizado entre el locus DRB1 y el locus DRA (Fig. 40-8). En

Estructura de las molculas de clase II


Las molculas de clase II HLA-DR. -DQ y -DP son heterodmeros formados por dos glicoprotenas transmembrana no asociadas covalentemente, la cadena a (33 a 35 kDa) y la cadena |i (26 a 28 kDa) (Fig. 40-5) (Gorga. 1992). Ambas cadenas polipeptdicas atraviesan la membrana celular y estn orientadas con sus amino-terminales hacia el exterior celular. Las regiones extracelulares de los polipptidos u y | 3 estn divididas cada una en dos dominios, denominados a, y a y P, y P , y cada dominio contiene aproximadamente 90 residuos aminocidos. La cadena a tiene dos grupos carbohidrato, uno rico en maosa y un complejo tipo glicano, en los aminocidos 78 y 118, respectivamente. Las cadenas p tienen un complejo tipo oligosacrido en el aminocido 19. Los dominios amino-terminales (/., y p, de las cadenas a y p contienen los residuos polimrficos, mientras que los dominios de membrana proximales a y p son altamente conservados y son homlogos a los dominios de la regin constante de la inmunoglobulina. Una regin de aproximadamente 12 aminocidos de tamao conecta el segundo dominio extracelular a la regin hidrofbica transmembrana (23 aminocidos) y al pequeo dominio intracitoplasmtico (8 a 15 aminocidos).
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Basndose en la cristalografa, la molcula de clase II es similar en estructura a la molcula de clase I (Brown. 1993) (Fig. 40-6). En la molcula de clase II, los dominios a, y p, de las cadenas a y p forman una cadena |5 plegada de ocho filamentos unida a dos hlices u para formar la ranura de unin al antgeno en la parte alta de la molcula. Los dominios a ? y p forman cada uno dos cadenas p plegadas antiparalelas que soportan la ranura en la parte
?

CAPTULO 40

ANTGENO IEUCOCITARIO HUMANO: COMPLEJO MAYOR DE HISTOCOMPATIBILIDAD..

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Desequilibrio de unin de los genes de la regin de clase II


Las combinaciones especficas de los alelos DRB1/DRB3, DRB1/DRB4. DRB1/DRB5y DOA1/DQB1 son frecuentes. Las combinaciones encontradas del DQA1/DQB1 pueden controlarse en parte por la capacidad de las cadenas a y |i de aparearse (Kwok. 1993). Adems, ciertos alelos DR y DQ son heredados conjuntamente ms frecuentemente de lo esperado, originando un desequilibrio de unin en la poblacin. La frecuencia de estas combinaciones difiere importantemente entre los diferentes grupos tnicos de la poblacin. Por ejemplo, tanto los haplotipos DRBVttOI. DOBV0501 (DR11 [5]), DQ5[1yel DRB V0901. DOBT0303 (DR9, DQ9 [3)) se encuentran frecuentemente en las poblaciones de descendientes africanos directos; mientras tanto, estas combinaciones DR-DQ se encuentran raramente en poblaciones descendientes de caucsicos. El entrecruzamiento entre locus DP y locus DR'DO es frecuente. Por ello, hay un mnimo desequilibrio de unin entre los alelos DR/DO y los DP. Se han publicado las listas de los haplotipos DRB1/DOA1DOB1 frecuentes (Begovich. 1992: Imanishi, 1992)

Regulacin de la expresin de los genes de clase II


Las molculas de clase II, HLA-DR, -DQ y -DP, se expresan constilutivamente en las clulas presentadoras de antgenos (APCs) del sistema inmune incluyendo los monocitos, los macrfagos, las clulas dendrilicas y los linlocitos B. Las secuencias de ADN encontradas por encima de las secuencias codificantes de los genes de clase II son criticas para la expresin. La unin de las protenas a estas regiones regula la expresin de los genes de clase II. Las alteraciones en la capacidad de las protenas de unin al ADN de interaccionar con las secuencias de ADN 5' reguladoras que eliminan la expresin de los genes de clase II lleva a una inmunodeliciencia denominada "sndrome del linlocito desnudo" (Kovats. 1994: Mach, 1996). Los genes de clase II son inducibles por el interfern-y (IFN-y) en muchos tipos de clulas (Mach, 1996; Glimcher, 1992) y la expresin puede afectarse por otras citocinas (vase Cap. 39) (Guardiola, 1993). La expresin de molculas de clase II en las APCs puede modularse, particularmente en las clulas dendrticas, tras el depsito antignico y la inflamacin. El nivel de expresin del complejo antgeno peptdico-clase II asi como la presencia de una seal coestimuladora en las APC maduras puede tener un importante papel en el trasplante y en las enfermedades autoinmunes (Nepom, 1991: Banchereau. 1998) (vase Cap. 41).

Figura 40-10. Modelo de las asociaciones as y trans de las cadenas DQu. y DQp\

las clulas que expresan los alelos DR. DRBV03. '11, '12. '13. '14. el segundo gen DRB se denomina DRB3 (la nomenclalura HLA se describe a continuacin). El gen DRB3 es polimrfico, aunque hasta el momento el nmero de alelos identificados es aproximadamente 10 veces menor que el nmero de alelos DRB1. El producto del DRB3 se combina con el producto DRA para formar la molcula DR, que transporta la especificidad serolgica del DR52 (Tabla 40-3). En las clulas que expresan los alelos DRB1 4, 7 y '09. el segundo gen DRB se denomina DRB4. El producto DRB4 combinado con el producto DRA forma la molcula que trasporta la especificidad serolgica del Df?53 (Tabla 40-3). Finalmente, en las clulas que expresan los alelos DRBV15 y '16. el segundo gen DRB es denominado DRB5. Este producto DRB5 combinado con el producto DRA transporta la especificidad serolgica del DR51 (Tabla 40-3). Los haplotipos que expresan los alelos DRBV01. '08 o '10 normalmente no transportan un segundo locus del DRB expresado. Hay excepciones a estas asociaciones. Por ejemplo, se ha descrito un haplotipo que transporta DRBT15 sin un locus DRB5 (Wade. 1993). Subregin DO. U n grupo de genes A y B. DOA1 y DQB1. codifican el heterodmero DO que transporta la especificidad serolgica DQ1-9 (Tablas 40-2 y 40-3 y Fig. 40-3) (Bodmer, 1997, 1999). Las molculas DO representan aproximadamente del 15% al 20% del total de molculas de clase II expresadas en la superficie celular. Los locus del DOAJ y del DQB1 son polimrficos y debido a que sus productos proteicos pueden asociarse tanto en trans como en cis. los heterocigotos pues expresar potencialmente cuatro molculas DQ diferentes en sus superficies celulares (Fig. 40-10). Oros genes A y B tipo DQ en la subregin DQ como el DQA2 y el DQB2 son muy similares a los genes DQA1y DQB1; sin embargo, no expresan ninguna protena funcional. Subregin DP. La subregin DP contiene dos grupos de genes A y B (Tabla 40-3 y Fig. 40-8). Un grupo, el DPA1 y el DPB1. codifica el producto proteico DP; el otro grupo est constituido por seudogenes. Tanto el gen OPA i como el DPB1 son altamente polimrficos (Bodmer, 1997,1999). El nivel de expresin del DP en la superficie celular es muy pequeo.

Funcin de las molculas de clase II


Las molculas de clase II actan como receptores antignicos en la respuesta inmune (Fig. 40-2), unindose a fragmentos peptidicos antignicos procesados de antgenos exgenos como las bacterias. Los antgenos exgenos entran en la clulas a travs de la va de endocitosis y son degradados en fragmentos peptidicos en los ltimos endosomas donde se encuentran y se unen a las nuevas molculas de clase II ensambladas (Watts, 1997). La unin de los fragmentos proteicos procesados a las molculas de clase II se facilita por dos protenas codificadas en la regin de clase II del MHC. la DM y la DO (Fig. 40-8). El pptido de unin est afectado por residuos polimrficos localizados en la ranura de la molcula de clase II. El complejo del fragmento antignico unido a la molcula de clase II es transportado entonces a la superficie celular para su presentacin y reconocimiento por las clulas T circulantes. Los receptores antignicos de los linfocitos T CD4+ interaccionan con el complejo clase ll-fragmento antignico disparando la activacin de la clulas (Jorgensen, 1992). En el sistema experimental empleado para dilucidar este mecanismo, los linlocitos T electores fueron estimulados in vitro con APCs autlogas previamente incubadas con el antgeno. Como se observ para la clase I, el reconocimiento del fragmento antignico por las clulas T electoras est influenciado por el polimorfismo allico del MHC. La clula T efectora es especifica para el pptido antignico promotor en conjuncin con el producto allico particular de clase II que originalmente present el antigeno (restriccin MHC) (Rosenthal. 1973).

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SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPAIOLOGA

Cada clula T activada por el reconocimiento del complejo del fragmento antignico unido a la molcula de clase II puede desenpear una o varias funciones (Paul, 1994), La clula T CD4+ puede ayudar a los linfocitos B a diferenciarse a clulas plasmticas productoras de anticuerpo, o puede ayudar a otros linfocitos T a diferenciarse a clulas citotxicas o clulas con funcin supresora. Adems, la clula T puede por s misma funcionar como clula citotxica, matando directamente clulas con la diana apropiada (p.ej.. clulas que expresan complejos de molculas de MHC de clase II con el antgeno especfico), o como clula con funcin supresora, originando un debilitamiento de la respuesta inmune. Las clulas T tambin producen un nmero de molculas biolgicamente importantes (como el IFN-yj que aumentan la respuesta inmune e incrementan la expresin de molculas de MHC en las clulas diana. Adems, las clulas T producen factores de crecimiento como la interleucina-2 (IL2). Estos factores de crecimiento afectan a un amplio rango de clulas de las clulas progenitoras hematopoyticas para madurar a linfocitos.

motivo peptdico se unen a la molcula de MHC en los bolsillos que se encuentran en la ranura de unin al antgeno (Stern. 1994). Los aminocidos polimrficos de las molculas de MHC rodean esta ranura y crean asi diferencias en las especificidades de unin a los pptidos para las diferentes molculas del MHC. Los pptidos unidos a las molculas de clase I tienen una longitud de 9 a 10 aminocidos. Tanto los extremos carboxi- como aminoterminal del pptidos son atrapados en la ranura de unin de clase I formando un complejo pptido-MHC "cerrado". Los pptidos unidos a las molculas de clase II varan en longitud de 12 a 30 aminocidos. A la vez que mantienen requerimiento para los residuos especficos que se encuentran la porcin central del pptido. tanto los extremos carboxi- como amino-terminal del pptido se extienden fuera de la ranura de unin de clase II formando un complejo pptidoMHC "abierto" (Stern, 1994).

Otros genes de clase II


Al menos han sido descritos otros cuatro genes de clase II, DOA. DOB. DMA y DMB. que expresan sus productos proteicos (Fig. 40-8). Las protenas codificadas por los genes DMA y DMB forman el heterodmero DM. Las protenas codificada por los genes DOA y DOB forman el heterodmero DO. Estos productos gnicos no son detectados en la superficie celular pero son expresados posteriormente dentro de la clula, localizados en compartimentos intracelulares especializados donde las nuevas molculas de clase II sintetizadas (DR. DO, DP) se unen con sus pptidos antignicos. La molcula DM regula la unin al pptido del HLA-DR. -DQ. -DP, teniendo una luncin de tipo acompaante o corrector (Morris, 1994) que favorece la presentacin de los pptidos estables unidos. La molcula DO regula negativamente la funcin del DM (van Ham, 1997).

RECONOCIMIENTO DE LAS MOLCULAS MHC EXTRAAS


El alo-reconocimiento implica el reconocimiento por un linfocito T de una molcula de MHC extraa en una clula por un segundo individuo (alognico). Una vez reconocido, la interaccin dispara una serie de acontecimientos originando la activacin de la clulas T y la iniciacin de una respuesta inmune no m u y diferente al reconocimiento de los patgenos (vase Cap. 36). Basndose en los datos de los modelos de trasplante de rganos vascularizados, se han propuesto dos vas de alo-reconocimiento (Sayegh. 1996). L a va directa para el alo-reconocimiento implica la estimulacin de las clulas T receptoras por un complejo MHC-pptido del donante (es decir, reconocimiento directo de las molculas MHC extraas intactas). La segunda ruta de alo-reconocimiento, la va indirecta, implica la estimulacin de las clulas T receptoras por las molculas de MHC propias a travs de la presentacin de los fragmentos peptdicos de las clulas donante. La presentacin indirecta ocurre cuando las clulas presentadoras de antigenos del receptor ingieren material celular del tejido injertado, degradan el material intracelularmente. y presentan el pptido(s) alognico en complejo con las molculas de MHC propias. Los pptidos derivados de las regiones polimrficas de las molculas MHC del donante son los principales candidatos para la estimulacin de la respuesta inmune indirecta (Suciu-Foca. 1998; Gould, 1999; Harris, 1999).

CARACTERSTICAS DE LOS FRAGMENTOS ANTIGNICOS UNIDOS POR LAS MOLCULAS MHC DE CLASE I Y CLASE II
L a funcin de las molculas de clase I y clase II como receptores de unin a antigenos es similar; sin embargo, los pptidos que unen tienen diferentes caracteristicas (Cresswell, 1994; Engelhard. 1994). Los pptidos derivados de las protenas sintetizadas de novo en la clula (antigenos endgenos como los antgenos virales), se asocian con las molculas de clase I en el retculo endoplasmtico. En contraste, los pptidos de los antgenos solubles y particulados captados por la clula por la va de la endocitosis (antigenos exgenos) se unen con las molculas de clase II en el compartimento endosomal. Tanto las molculas de clase I como las de clase II pueden unirse alternativamente a pptidos propios encontrados en estos compartimentos. Los pptidos surgen de la degradacin normal de las protenas celulares. Algunos de estos pptidos propios son fragmentos de las propias molculas de histocompatibilidad. Normalmente, los pptidos propios unidos a las molculas del MHC no activan a los linfocitos T. ya que son molculas a las que el sislema inmune del individuo es tolerante. Esos pptidos propios pueden, sin embargo, disparar la respuesta inmune iniciando un proceso autodestructivo que conduce a la autoinmunidad (Nepom, 1991 ) (vanse Caps. 43-45). La unin del pptido a las molculas del MHC ocurre solo cuando el fragmento peptdico es de un tamao adecuado y contiene una secuencia particular de aminocidos o un motivo que le permite unirse a una o ms molculas del MHC expresadas en dicho individuo. Un ejemplo de un motivo para un pptido que se une a la molcula del HLA codificada por el A'0201 es la leucina (o metionina o isoleucina) en el residuo 2 del pptido. un aminocido hidroflico en el residuo 3, y una valina (o leucina o isoleucina o alanina) en el residuo 9. Los aminocidos que forman el motivo se denominan residuos de "anclaje" del pptido. Las diferentes molculas del HLA. ya sean las molculas codificadas por diferentes alelos en el mismo locus {HLA-A'0203. '0211. o '0301) o las molculas codificadas por diferentes locus (B'4001 o DRBV0406) se unen a pptidos con diferentes motivos. Los aminocidos que forman el

REPETICIN EN TNDEM Y POLIMORFISMO NUCLETIDO SIMPLE EN EL MHC


Ms de 300 repeticiones en tndem cortas (STRs) han sido identificadas en la regin MHC humana (Foissac, 1997). Tambin estn presentes mltiples polimorfismos de nucletidos simples (SNPs). Un estudio de Abbal (1997) examin seis locus STR en el MHC en una poblacin de individuos no relacionados y encontr un fuerte desequilibrio de unin entre los haplotipos HLA especificos y los marcadores STR. Ya que estos marcadores cubren una regin del MHC mayor que los marcadores del HLA clsico empleados ahora, pueden proporcionar una aproximacin ms amplia para identificar a los individuos MHC idnticos. Estos marcadores pueden, por ejemplo, ser utilizados para identificar un haplotipo MHC recombinante en una familia (Carrington, 1996) y aumentar la probabilidad de encontrar genes de histocompatibilidad del MHC apareados. Se han desarrollado mtodos moleculares seguros y reproducibles para identificar tanto las STR como las SNP (Carrington, 1998).

MOLCULAS DE HISTOCOMPATIBILIDAD MENOR


Los antgenos de histocompatibilidad menor (mHag) son pptidos inmunogenticos que se unen a las molculas de MHC y pueden ser reconocidos por las clulas T. En las clulas progenitoras de injertos MHC idnticos, se puede inducir una enfermedad injerto contra husped (EICH) por las diferencias

CAPTULO 40

ANTGENO LEUCOCITARIO HUMANO: COMPLEJO MAYOR DE HISTOCOMPATIBILIDAD.

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Tabla 40-4

G e n e s H menores y sus eptopos e n las clulas T


mHag H-Y H-Y H-Y H-Y H-A-2 H-A-1" H-A-1" Secuencia p e p t d i c a SPSVDKAPAEL" FIDSYICQV IVDCLTEMY Desconocido YIGEVSVSV VLHDDLEA VLRDDLLEA

M o l c u l a s de r e s t r i c c i n HLA-B7 HLA-A2.1 HLA-A1 HLA-B60 HLA-A2.1 HLA-A2.1

" Derivado de una proteina evolucionanamenlo conservada codificada en el cromosoma Y Derivado de un miembro de la familia miosina de clase I no formadora de fila mentos Tres ag menores estn en el articulo de levisiOn de Goulmy de 1997. pero esta tabla completa nos la proporcion Els Goulmy No esta publicada y fue usada por la autora en su charla en el ASHI. Comunicacin personal de Goulmy (2000)

entre el mHag del receptor y del donante (Mutis, 1999). Las mHag pueden ser cualquier producto gnico polimrfico codificado fuera del MHC que difiriera entre el donante y el receptor y que estimule la respuesta T celular (Goulmy, 1997; Simpson, 1998). En la Tabla 40-4 se dan ejemplos de mHag. Como otras protenas antignicas, las protenas polimrficas deben ser procesadas en fragmentos antignicos y el fragmento(s) peptidico polimrfico debe unirse con la ranura de las molculas del MHC. Debido al requerimiento para la presentacin antigmca por las molculas del MHC, cualquier pptido polimdico debe transportar un motivo apropiado de unin especfica al MHC. Por ello, no todos los individuos pueden presentar una respuesta a todas las mHag incluso aunque exista una diferencia entre el donante y el receptor. Muchas mHag son presentadas a las clulas T CD8+ por las molculas MHC de clase I. Las respuestas de las clulas T son iniciadas cuando el receptor de clula T reconoce los complejos formados por los pptidos polmrticos de las mHag unidos a las molculas de MHC expresadas en las APC. Las mHag fueron definidas originalmente por el rechazo de injerto cutneo y por ensayos citotxcos con clones de clulas T. Estos pptidos polimrficos tienen una unin restringida a las molculas MHC de clase I, de modo que la definicin bioqumica de los componentes del pptido antignico de histocompatibilidad menor fue determinada por la elucin, purificacin y secuenciacin del pptido del mHag unido a una molcula del MHC especifica (den Haan 1995). Estudios recientes han demostrado el significado potencial de las mHag en el trasplante clnico (Goulmy, 1997.1996; Martin. 1997: Dupont. 1998). Se han demostrado linfocitos T con citotoxicidad especfica para las m H a g en pacientes con EICH (Mutis. 1999). La disparidad del receptor para una mHag (HA-1) se asoci con un aumento del riesgo de EICH tras el trasplante de mdula sea empleando donantes hermanos genotpicamenle HLA idnticos La importancia del apareamiento para otras mHag (HA-2. HA-3. HA-4, HA-5, H- Y) est menos clara. Se han desarrollado tcnicas basadas en el ADN para detectar diferencias en las mHag (Wilke. 1998: Tseng. 1998) y se han empleado en estudios para medir el impacto de estas disparidades en los resultados del trasplante.

cin se hizo ms discriminatoria. La definicin ms corta de la especificidad es llamada la especificidad subtpica o privada. Las especificidades extensas y compartidas se denominan especificidades supertpicas. Por ejemplo, el B44 y el B45 son especificidades subtipicas de la especificidad supertipica B12 Por ello, una clula que es tanto B44+ como B45+ tambin debera ser positiva para B12. La Tabla 40-5 enumera ejemplos de los equivalentes supertipicos para las "divisiones" En los tests serolgicos. algunos aloantisueros se unen a mas de un producto allico del HLA. un fenmeno denominado reactividad cruzada. Esta reactividad cruzada serolgica entre los productos allicos de los locus HLA-A y HLA-B ha sido extensamente estudiada y se ha empleado para agrupar molculas en grupos antignicos de reactividad cruzada (CREG) (Rodey, 1987). Las molculas de clase I en un CREG comparten uno o ms determinantes que no son compartidos por molculas de otro CREG En la Tabla 40-6 se enumeran ejemplos de CREG. Un determinante antignico (eptopo) compartido entre los miembros de un CREG se denomina especificidad pblica. Parte de la reactividad del CREG puede explicarse porque se comparten secuencias de aminocidos entre las molculas HLA en un CREG (Terasaki. 1992) La inclusin de especificidades HLA en un CREG no est estandarizada, ya que diferentes grupos de anticuerpos producen un nico patrn de reaccin y dos investigadores diferentes con distintos grupos de reactantes pueden identificar grupos de CREG ligeramente diferentes. Sin embargo, los grupos CREG se solapan considerablemente (Ellison. 1994). Las especificidades HLA-Bw4 y Bw6 son epitopos amplios, pblicos, que residen en la misma molcula como las especificidades subtipicas del locus HLA-B. pero estn en lugares diferentes. Por ello el Bw4 y el Bw6 son un sistema diallico. y todas las molculas del locus (y algunas del locus A) transportan tanto la especificidad Bw4 como la Bw6. La regin de la molcula del H L A que transporta las especificidades Bw4'Bw6 ha sido identificada en la hlice (/.. entre los residuos aminocidos 77 y 83 (Tabla 40-7 y Fig. 40-9) (Parham. 1991). Las especificidades serolgicas designadas por la OMS. localizadas en las molculas de clase II, HLA-DR y -DQ. han sido asignadas c o m o se describi para las molculas de clase I (Bodmer. 1999, 1997) (Tabla 40-2). Originalmente se definieron por tcnicas celulares seis tipos de HLA-DP. Las molculas HLA-DP de clase II no se delinen adecuadamente por serologia. Hay 26 especificidades del HLA-D que fueron identificadas en cultivos mixtos de leucocitos. Todas las especificidades HLA-D mantienen la designacin

Tabla 40-5

Ejemplos de divisiones* serolgicas


Divisiones A23.A24 A25.A26,A34,A66 A29.A30.A31. A32. A33. A74 A68.A69 B51.B52 B44.B45

Especificidades originales amplias A9 A10 A19 A28 B5 B12 B14 B15 B16 B17 B21 B22 B40 B70 DR2 DR3 DR5 DR6 DQ1 DQ3

B64.B65
B62.B63.B75.B76.B77 B38.B39 B57.B58 B49.B50.B4005 B54.B55.B56 B60.B61 B71.B72 DR15.DR16 DR17.DR18 DR11.DR12 DR13.DR14 DQ5.DQ6 D07.D08.D09

NOMENCLATURA HLA Especificidades serolgicas y celulares


La terminologa HLA est designada por el Comit de la Organizacin Mundial de la Salud (OMS) para la Nomenclatura HLA (Tabla 40-2) (Bodmer 1999. 1997). Histricamente, las especificidades serolgicas y celulares definidas localizadas en las molculas proteicas del HLA fueron asignadas en base a los resultados de los talleres internacionales durante los cuales los reactivos de tipificacin fueron intercambiados entre los laboratorios participantes (sitio web del Taller Internacional de Histocompatibilidad. 13 edicin, Tabla 40-1). Las asignaciones incluyen el nombre de la molcula de HLA y una designacin numrica basada en el orden en que su especificidad serolgica fue definida. Por ejemplo, el HLA-A1 (o solo A1) fue la primera especificidad HLA-A asignada y el HLA-A80 fue la ms reciente. A lo largo del tiempo las especificidades definidas serolgicamente lueron "divididas" a medida que la defini4

En el pasado, las designaciones de divisiones serolgicas eran dadas a especilicidades que parecan idcnlilicar el antgeno especilico por un alelo HLA simple (p ei. A2 se divida en A203. A210 B7 se divide en B703: B39 se divide en B390I y B3902) Ahora se reconoce que otros alelos tambin pueden codilicar antigenos que llevan estas especificidades serolgicas y el Comit de Nomenclatura de la OMS ha recomendado que no se hagan estas divisiones Datos de Bodmer (1997)

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Tabla 40-6 Creg A01C A10C A02C B5C B07C B08C B12C B21C Bw4 Bw6

SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA

C R E G y antgenos a s o c i a d o s Antgenos asociados

Al, A3. Al 1. A29. A30, A31, A36, A80 A10, A11. A19. A25, A26, A32. A33. A34. A43, A66, A74 A2, A9. A23. A24, A28. A68, A69, A203 A210, A2403, B17, B57. B58 B5. B18, B35, B51, B52, B53, B78, B5102. B5103 B7, B8. B13. B22, B27. B40. B41, B42. B47, B48, B54, B55, B56. B59. B60, B61. B67, B81, B82. B703 B8, B14. BI6, B18, B38, B39, B59. B64. B65. B67. B3901. B3902 B12. B13 B21. B37. B40 B41, B44, B45, B47, B49. B50. B60. B61. B400b B5, B15, B17, B21, B35. B46. B49. B50. B51, B52. B53. B57. B58. B62, B63. B70, B71. B72. B73. B75, B76, B77. B78, B4005, B5102. B5103 A9, A23. A24, A25. A32, B5. B13. B17, B27. B37, B38. B44, B47, B49, B51. B52. B53. B57, B58 B59. B63. B77 A2403. B5102, B5103 B7. B8. B14, B18. B22. B35 B39. B40, B41. B42, B45. B48. B50, B54, B55, B56, B60. B61, B62, B64. B65. B6, B70, B71, B72. B73, B75, B76, B78, B81, B82, B703, B3901. B3902. B4005

tific una nica especificidad serolgica, al antgeno DR determinado por el DRBV10103 se le dio la designacin serolgica DR103. El tercer y cuarto nmero en la designacin allica se refieren al orden en que el alelo fue descrito. Por ejemplo, el A'0201 fue el primer alelo A2 secuenciado y el A"0203 fue el tercero. Algunos alelos pueden diferir en la secuencia de ADN de sus regiones codificantes pero su secuencia de aminocidos predecida no difiere (a menudo llamada sustitucin imperceptible o sinonmica). Estas combinaciones de alelos son identificadas por designaciones de cinco dgitos. Los primeros cuatro nmeros son compartidos, mientras que el quinto dgito se utiliza para distinguir las secuencias de cido nucleico nicas de los alelos (p. ej., B'27051 y B'27052). Adems, dos o ms alelos pueden tener un nombre de siete dgitos en el que se comparten los primeros cuatro dgitos (p. ej., DRB4'0103101 y DRB4'0103102). Los dgitos cinco a siete indican que los dos alelos difieren slo fuera de la regin codificante de la proteina. En el ejemplo nombrado aqu, la diferencia afecta al lugar del empalme del ARN del DRB4'0103102 originando la prdida de la expresin del alelo (Sutton, 1989). Finalmente, los alelos que no son expresados como protenas en la superficie celular pueden tener aadida una Na sus nombres (p. ej A'0215N, DRB4'0103102N) para indicar "nulo". Y a que cada alelo tiene una nica designacin numrica, la designacin N no se escribe siempre (i.e., A'0215 y A'0215N son el mismo alelo). Se describen nuevos alelos en las publicaciones habituales del Comit de Nomenclatura HLA de la OMS (Tabla 40-1, www.anthonynolan.com/HIG/ nomenc.html; Bodmer, 1999), y las secuencias de nucletidos de todos los alelos estn depositadas en un banco de datos computerizado (bases de datos GenBank. EMBL, IMGT/HLA). Actualmente, hay, por ejemplo, ms de 140 alelos HLA-A designados. Continuamente se estn identificando nuevos alelos y puede accederse a ellos a travs del sitio web.

Datos de Ellison (1994).

V, ya que estas especificidades son definidas funcionalmente por la medicin de la estimulacin de la clula que responde. La estimulacin se genera por diferencias en las molculas DR expresadas en las clulas estimuladoras y. en menor medida, por estimulacin adicional por las molculas DQ y DP.

Designaciones allicas basadas en el ADN


Se ha utilizado la secuenciacin de nucletidos para identificar los muchos alelos diferentes que codifican las molculas HLA. Actualmente, la especificidad simple serolgicamente definida puede residir en dos o ms de 25 productos allicos diferentes (Tabla 40-2). Cada alelo HLA es designado por el nombre del locus gnico seguido por un asterisco y un nmero de cuatro a siete dgitos que indica el alelo. Por ejemplo, el A"0221 es un alelo del gen HLA-A. el B'1510 es un alelo del gen HLA-B; el DPBV0101 es un alelo del gen HLA-DPB1 y el DQAV0601 es un alelo del gen HLA-DQA1. Los primeros dos nmeros en la designacin numrica de cada alelo se basan frecuentemente en el tipo serolgico de la molcula resultante y/o de la secuencia nucleotdca similar a otros alelos del grupo. Por ejemplo, la molcula de HLA-A expresada por el alelo A'0201 porta la especificidad serolgica A2 definiendo el antgeno HLA-A2. Sin embargo, la molcula de HLA-B expresada por el alelo B'1510 no tiene la especificidad serolgica asociada al B15 pero porta la especificidad serolgica que define al antgeno B71. Se design B'1510 por su secuencia de aminocidos prevista similar a los antigenos B15. Las clulas que expresan DRB1 '1003 fueron definidas serolgicamente como DR-blank, DR1, o incluso DR13. Las secuenciacin de nucletidos identific un alelo con similar estructura de ADN a los alelos que portan la especificidad serolgica DR1 (p. ej., DRBV01Q1 y '0102) y el nombre de este alelo se bas en su similitud estructural. Cuando posteriormente se den-

TCNICAS PARA LA IDENTIFICACIN DEL POLIMORFISMO DEL HLA


Las pruebas de histocompatibilidad o la tipificacin del HLA o la tipificacin tisular se desarrolla en un nmero limitado de laboratorios ya que utiliza tcnicas y reactantes especializados. Existen disponibles en el mercado equipos para las pruebas basadas en ADN y serolgicas; sin embargo, la interpretacin de los resultados de la prueba requiere una considerable experiencia y conocimiento. Los laboratorios de histocompatibilidad normalmente se encuentran en centros mdicos que tienen programas de trasplantes de rganos y/o de clulas progenituras hematopoyticas. En esta seccin las tcnicas de identificacin del HLA se tratan de forma general. Para tcnicas detalladas, se remite al Laboratory Manual (2000) de la Sociedad Americana de Histocompatibilidad e Inmunogentica (ASHI) (en la Tabla 40-1 se incluye la pgina web de la ASHI). Los laboratorios de identificacin del HLA estn acreditados por la ASHI, por la Fundacin Europea de Inmunogentica (EFI) y por otras organizaciones.

Tipificacin basada en el ADN de los alelos de clase I y clase II


Aunque la tipificacin serolgica y celular de los antgenos HLA ha sido muy til, hay un nmero de inconvenientes en estas tcnicas. Con la llegada de los mtodos rpidos y fiables del aislamiento y caracterizacin de los genes de clase I y II y la determinacin de las secuencias de nucletidos de los alelos de clase I y II, ha surgido la posibilidad de utilizar mtodos basados en el ADN para la tipificacin del HLA. La tipificacin basada en el ADN de los alelos HLA es ahora una tcnica utilizada Irecuentemente en los laboratorios de tipificacin del HLA (Middleton, 1999: Hurley, 1997a). 1. Es especifica. La especificidad de cada reactante tipificante de ADN (p. ej.. sondas y cebadores de oligonucletdos sintticos) se define claramente y est basada en una secuencia de nucletidos especfica conocida. Como los oligonucletdos empleados como reactantes en la tipificacin del ADN son sintticos, los reactantes no estn limitados y no debera existir variacin entre lotes en la especificidad.

/"

Tabla 40-7 Secuencias d e aminocidos q u e definen los eptopos Bw4 y Bw6 y ejemplos de alelos q u e especifican estas secuencias Bw4 Secuencia*
NLARIALR NLRTALR DLRTLLR SLRTLLR SLRIALR

Bw6 Alelo'
B'5301 B'2701 B-2705 B"2704 A'2501

Secuencia' SLRNLRG GLRNLRG

Alelo'
-3501 B'7301

' Codones 77-83. vase Figura 40-9. Solo se da un ejemplo de cada alelo

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2. Es flexible. Los nuevos reactantes pueden designarse a medida que se descubran los nuevos alelos y se identifiquen las secuencias de nucletidos nicas. Las pruebas pueden llevarse a cabo en muchos niveles de resolucin dependiendo de los requerimientos de tipificacin y del tiempo disponible para hacer las pruebas. 3. Es ms robusta que otras tcnicas. La tipificacin del ADN no requiere linfocitos viables y no est influenciada por la salud del paciente. Adems, las pruebas basadas en el ADN son altamente reproducibles cuando se usan metodologas estandarizadas como el test con una secuencia especfica de una sonda oligonucleotdica (SSOP) usan en conjunto un protocolo de test estndar (Ng, 1996; Hurley. 2000a). 4. Puede utilizarse para grandes escalas de tipificacin. La cantidad de muestras facilitada por las metodologas automticas y computerizadas reduce el coste y los errores. Los mtodos basados en el ADN son particularmente aplicables a la tipificacin HLA de grandes nmeros de voluntarios para los registros de donantes. 5. Puede ser discriminativa detectando toda la diversidad del HLA. Los alelos del HLA pueden especificar protenas HLA que son indistinguibles empleando tipificacin serolgica. Por ejemplo, un individuo que transporte el alelo DRBV0401 tendr el mismo tipo serolgico (DR4) que un individuo que transporte el alelo DRBV0412 (DR4). Por ello, DRBt'0401 y DRBV0402 son divisiones de la amplia especificidad DR4. Estas divisiones son identificadas por la tipificacin del ADN. No estn disponibles reactantes serolgicos suficientemente especficos para definir esta divisin. Hasta ahora, se han definido 30 subdivisiones del DR4. Hay otros muchos ejemplos de divisiones definidas utilizando tipificacin del ADN que no pueden identificarse empleando tipificacin serolgica; algunas se enumeran en la Tabla 40-2. Los problemas de la tipificacin serolgica son particularmente agudos cuando hay que tipificar algunos grupos de poblaciones. Por ejemplo, las poblaciones de origen directamente africano pueden expresar antgenos de clase I y clase II que son difciles de identificar con los reactantes serolgicos disponibles actualmente (Mytilineos. 1998; Yu. 1997; Bozon, 1997). La tipificacin del HLA basada en el ADN ha mejora muchsimo la capacidad de definir los tipos de H L A en estas poblaciones. Preparacin y amplificacin del ADN. Cualquier clula con ncleo puede utilizarse como tuente de ADN. Mientras que los eritrocitos (RBC) no tienen ncleo, otras clulas de la sangre como los linfocitos son bunas fuentes de ADN. Las lineas celulares como los linfocitos B transformados por el virus de Epstein Barr tambin son buenas fuentes de ADN. A medida que las clulas transformadas pueden crecer en un cultivo de laboratorio, proporcionan un suplemento de ADN que se puede reponer y son empleadas para proporcionar un ADN de referencia para el control de calidad de las tcnicas de tipificacin, El ADN normalmente se prepara de una pequea cantidad (0,2 mi a 1 mi) de sangre total. Se puede emplear muchos protocolos diferentes para aislar el ADN de las clulas, y tambin hay equipos disponibles en el mercado para la preparacin del ADN. La sensibilidad de la deteccin de los tipos del HLA aumenta considerablemente con la amplificacin del ADN que codifica los genes HLA utilizando la tcnica de la PCR (Saiki, 1998). Se debe complementar con un par de oligonucletidos sintticos (cebadores) a las secuencias alrededor de un gen especfico HLA para generar millones de copias de dicho gen para su uso en la reaccin de tipificacin del ADN. Algunas reacciones de tipificacin emplean secuencias promotoras que son compartidas por todos los alelos de un locus HLA: otras tcnicas de tipificacin emplean grupos de promotores que son compartidos slo por un grupo de alelos del locus. El fijado de los cebadores a la muestra de ADN durante la reaccin PCR usa las condiciones de la reaccin que garantizan que los promotores se unirn a las secuencias perfectamente apareadas (secuencias diana) y no a secuencias de otros locus o de otros alelos que no estn apareadas. Ajustando la temperatura del componente de fijado de la reaccin PCR, el laboratorio de tipificacin puede controlar la especificidad de la amplificacin. Promotor especfico de secuencia. Un mtodo de identificacin de los alelos HLA utiliza promotores especficos de secuencia (SSP) en la reaccin PCR (Olerup, 1992; Bunce. 1995). Los promotores se aaden para desnatu-

ralizar el ADN que contienen los alelos HLA de los que derivaban las secuencias promotoras. En ia subsiguiente reaccin PCR. solo estos alelos seleccionados son amplitcados. El ADN amplificado por los promotores es identificado por electroforesis en gel o, si el ADN es marcado con un colorante durante la amplificacin, por fluorescencia. Este procedimiento es de utilidad en la tipificacin de un pequeo nmero de muestras en un corto periodo de tiempo. Hay equipos disponibles en el mercado. Hibridacin oligonucleotdica especfica de secuencia. Ha sido posible el empleo de la hibridacin de SSOPs con ADN amplificado para identificar alelos (Gao, 1991; Cao, 1999; Williams, 1997). Suele requerirse el empleo de mltiples sondas de oligonucletidos diferentes para definir un alelo HLA especfico o el empleo de un promotor especifico de secuencia unido con hibridacin con paneles de sondas. Un grupo de oligonucletidos capaz de identificar cada alelo es hibridado a ADN amplificado desnaturalizado por PCR unido a un soporte slido. Las condiciones de hibridacin se ajustan de modo que las sondas se aadan al ADN desnaturalizado que contenga los alelos HLA de los que deriv la secuencia del oligonucletido. Los oligonucletidos se encuentran marcados con una terminacin para detectar la hibridacin. Por ejemplo, el oligonucletido puede asociarse a una enzima como la fosfatasa alcalina. Tras la adicin de un sustrato, la losfatasa alcalina degrada el sustrato para producir un componente coloreado o para producir luz (quimioluminiscencia). Tras la visualizacin. puede leerse el patrn de hibridacin para determinar los alelos presentes. La Figura 40-11 ilustra la aproximacin con el empleo de una sonda de oligonucletido para el alelo DOS?, DQBV0302, para identificar pacientes con diabetes dependiente de insulina que tienen este alelo (Todd, 1987). El mtodo SSOP es muy exacto, especfico y fiable (Ng, 1996; Hurley, 2000a). A menudo es utilizado en situaciones donde se tipifican muchas muestras en grandes grupos. Estn disponibles kits comerciales que utilizan este mtodo. En una tcnica relacionada, llamada el formato reverso, las sondas de oligonucletidos se unen a un soporte slido (Bugawan, 1994). El ADN de las muestras que va a ser analizado es amplificado empleando iniciadores marcados con, por ejemplo, biotina. Entonces el ADN amplificado se hbrida a sondas inmovilizadas, que contienen las secuencias encontradas en los alelos presentes en el ADN. Tras la visualizacin (empleando un sistema de deteccin unido a la avidna), se puede leer el patrn de hibridacin para determinar los alelos presentes. Esta tcnica es til para la tipificacin tanto de un nmero de muestras pequeo como grande. Hay equipos disponibles en el mercado que utilizan este mtodo. Polimorfismo conformacional de secuencia especfica (SSCP) o anlisis heterodoble. Otro mtodo, aunque poco usado, de identificacin de los alelos HLA analiza la movilidad del ADN amplificado, ya sea desnaturalizado (SSCP) o como ADN doble renaturalizado (anlisis heterodoble), tras la electroforesis (Arguello. 1996). La movilidad del ADN es comparada con la movilidad del ADN amplificado de los alelos HLA para definir un alelo HLA. Esta tcnica es til en la tipificacin de un pequeo nmero de muestras y particularmente en las comparaciones entre individuos, por ejemplo, en una familia. Secuenciacn del cido nucleico. Un mtodo final de identificacin de alelos HLA implica la determinacin directa de las secuencias de ADN de los alelos HLA transportados por un individuo (tipificacin basada en la secuencia [SBT]). Los alelos son identificados ya sea tras la amplificacin PCR para separar los alelos basados en SSP o como una mezcla de dos alelos. La secuenciacn es una labor intensa y altamente compleja pero puede usarse frecuentemente para determinar el HLA emparentado en un nivel allico entre los pacientes de trasplantes de clulas progenituras hematopoyticas y sus futuros donantes (Petersdorf, 1995a; Rozemuller. 1996; Scheltinga. 1997). Resolucin de la tipificacin basada en el ADN. El nivel de resolucin (i.e., la capacidad de discriminar entre alelos) obtenido por los mtodos de tipificacin de ADN esl controlado por la eleccin y el nmero de iniciadores y/o sondas empleados en el ensayo y por el mtodo de tipificacin. Esta eleccin puede depender del tiempo disponible para el desarrollo de la tipificacin, del coste de la tipificacin, de la experiencia del personal de laboratorio y del pro-

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SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA

Figura 40-11. 4, Secuencias de nuclelidos de mltiples aletas D0B1. Las secuencias presentadas cubren los codones para los aminocidos 50 a 60. Una raya indica que el nucle2 3 4 5 7 9 10 tido es idntico a l a secuencia d e la pade superior. En un rectngulo est un oligonucleotide que es especifico para la se U I I H I I I I M B M W H M T I I I U B H H H H M H H H M H H U cuencia DQBI'0302. B. Anlisis de transferencia en m a n c h a (oof blot) con oligonucleotides de 17 pacientes IDDM (DMI19) y un control. BML. El ADN amplificado q u e contiene secuencias DQBf de clase II de los pacientes le unido a la membrana e hibridado para el oligonucleotide especfico marcado para la secuencia DQB1 '0302 (descrita previamente). Las seales de hibridacin positiva indican los pacientes que tienen esta secuencia gnica DQB! (pacientes DM1. 2. 4,7,10-16,19). (De Todd JA. Bell J, McDevitt HO: HLA-DQB gene contributes to susceptibility and resistance to insulindependent diabetes mellilus. Nature 1987; 329-599. con perII 12 1 3 14 1 5 16 17 IS 1') UML

psito de la tipificacin. Normalmente la tipificacin para registros de donantes a gran escala se lleva a cabo con una resolucin baja-intermedia, mientras que la tipificacin de un posible donante de clulas progenituras hematopoyticas para un paciente especfico se realiza a un nivel de resolucin allica. A menudo se utiliza un abordaje con mltiples pasos para identificar los alelos HLA por tipificacin basada en el ADN. Por esta razn, los tipos de HLA definidos por la tipificacin basada en el ADN pueden mostrarse con diferentes niveles de resolucin. El nivel de resolucin bajo (o genrico o seroigico) de tipificacin basada en el ADN produce un resultado similar en apariencia y en detalle a un tipo seroigico. Por ejemplo, un tipo definido por ADN. el DRBI'tl o el DRBV11XX. es el equivalente aproximado del tipo seroigico DR11. El "XX" indica que el alelo no fue definido. En este nivel de resolucin, no es posible determinar cul de los ms de 30 alelos DRBI'11 tiene el individuo que est siendo analizado. Aunque la tipificacin serolgica pues ser tan informativa como la tipificacin de baja resolucin, los resultados son ms fiables con el anlisis basado en el ADN. El nivel intermedio de resolucin de tipificacin basada en el ADN puede reducir las opciones enumerando mltiples posibilidades diferentes para el tipo de un individuo, (p. ej., DRBV1101 o DRBl'1104). Finalmente, el nivel de resolucin alto (o a nivel allico) de la tipificacin basada en el ADN identifica el alelo especifico que transporta un individuo (p. ej.. DRBV1104). Ya que la identificacin de los alelos HLA puede basarse en la secuencia de informacin parcial, es posible que la interpretacin de los resultados pase por alto alelos que eran desconocidos en el momento de la tipificacin (Hurley. 1997b). Por esta razn, los laboratorios tienen cuidado de mantener sus datos de tipificacin brutos (p. ej., qu promotores y qu sondas fueron positivos y negativos y las secuencias de nucieotidos de los reactantes) de modo que los resultados puedan reinterpretarse a mediada que se describan los nuevos alelos.

los ndices de error (Bozon, 1997; Yu, 1997). La reproductibilidad para especificidades determinadas serolgicamente del HLA-C y clase II es m u c h o menor. El HLA-DP normalmente no se define por serologia. El ensayo seroigico de microcitotoxicidad todava se utiliza ampliamente para las especificidades de clase I (HLA-A, -B) pero ha sido sustituido por el anlisis basado en el ADN para las especificidades HLA-C y de clase II (HLA-DR, -DQ, -DPj en muchos laboratorios de tipificacin. El anlisis basado en el ADN con su mayor resolucin se utiliza para determinar el tipo de HLA de individuos n o emparentados y de miembros de una familia especialmente si la segregacin del HLA no puede discriminarse con seguridad por serologia (p ej.. familias donde los padres no estn disponibles o familias donde los padres comparten un antgeno HLA). Por eiemplo. un descendiente hereda un DR4 de cada pariente y por eso el es homocigotico para el antigeno DR4 (DR4. DR4). Sin embargo, la tipificacin del ADN de alta resolucin puede identificar dos alelos distintos del antgeno DR4, el DRBf040t y el Dfl8r0403(heterocigtico para el alelo DRBV04), proporcionando datos informativos para los anlisis de segregacin del haplotipo. Preparacin de los linfocitos. Los linfocitos utilizados rutinariamente en los ensayos de tipificacin serolgica del HLA se obtienen rpidamente de la sangre total perifrica sedimentndola con un gradiente de Ficoll-Hypaque para separar los eritrocitos por densidad de centrifugacin. Los linfocitos de sangre perifrica separados (PBLs) pueden emplearse para la tipificacin del HLA-A. -B. -C. Para analizar las especificidades serologicas del HLA-DR. DQ. es necesario o enriquecer los linfocitos B o utilizar una tcnica de fluorescencia de dos colores especial para diferenciar simultneamente las clulas B y las clulas T no separadas. Ensayo de microcitotoxicidad linfocitica. El fenotipo HLA se determina analizando la preparacin de linlocilos no separados (PBL) o los linfocitos T (para el HLA-A. -B. -C) o los linfocitos B enriquecidos (para el HLA-DR, DQ) frente a un panel de aloantisuero HLA bien caracterizado. El ensayo es un test de dos etapas. Durante la etapa de de sensibilizacin, los linfocitos son incubados con el antisuero. Se aade suero de conejo en exceso preanalizado y estandarizado como fuente de complemento y la mezcla se incuba durante un periodo adicional. Si los linfocitos llevan una molcula de superficie celular reconocida por los anticuerpos fijadores del complemento del aloantisuero, los anticuerpos se unen a las clulas y las clulas son usadas subsiguientemente tras la adicin del complemento. El ensayo termina con la adicin diacetato de fluoresceina y de bromato de elidi para las tcnicas de deteccin

Deteccin serolgica de las molculas de clase I y clase II


El anlisis de la microcitotoxicidad de los linfocitos. que ongnalmente se utilizo en el sistema del ratn por Gorer y Amos y despus fue modificado por Terasaki y McClelland para el empleo en el sistema humano, ha sido usado para la tipificacin del HLA desde los aos 60. El anlisis seroigico del HLAA, -B, puede reproducirse en condiciones controladas y estandarizadas; sin embargo, los anlisis a gran escala (p, ej., para registros), pueden aumentar

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ANTGENO LEUCOCITARIO HUMANO: COMPLEJO MAYOR DE HISTOCOMPATIBILIDAD.

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fluorescentes, o tanto con eosina y formalina como con trypan azul y cido actico etilendiamineter (EDTA) para las tcnicas de visualizacin de colorantes. Las reacciones se leen en porcentaje de lisis y se gradan numricamente. Cubetas de suero para tipificacin del HLA. Los reactantes de tipificacin del HLA derivan del suero de individuos aloinmunizados (mujeres multparas, receptores de trasplantes, pacientes multitransfundidos e inmunizacin planificada en humanos). Las placas con mltiples pocilios de aloantisuero humano (esto es. cubetas de tipificacin del HLA) estn disponibles en el mercado. Debido a la complejidad antignica de los anlgenos HLA. deben utilizarse mltiples antisuero para definir cada especificidad. Muchos de los laboratorios utilizan cubetas de al menos dos vendedores diferentes o pueden utilizar aloantisuero obtenido localmente. Como muchos aloantisueros no son verdaderamente monoespeclicos y muchos presentan alguna reactividad cruzada, la reactividad de cada antisuero debe analizarse cuidadosamente y conocerse para la interpretacin de los resultados. Esto requiere un estrecho control de calidad de cada nuevo lote de cubetas de tipificacin con clulas de referencia bien caracterizadas. Como el titulo y la especificidad del anticuerpo formado por un individuo sensibilizado puede no ser constante con el tiempo, los suplementos de anlisuero son limitados. En un intento de crear un suplemento consistente y no limitado de reactantes, algunas compaas han producido anticuerpos monoclonales. Estos reactantes monoclonales no estn disponibles para todas las especificidades HLA. Reactividad cruzada. El aloantisuero HLA puede reaccionar con ms de un producto allico HLA. Este fenmeno puede proceder de la poliespecificidad del antisuero y/o de la reactividad cruzada y es responsable de los complejos patrones de reactividad de algunos aloantisueros. El suero poliespecfico contiene dos o ms anticuerpos, que pueden ser adsorbidos para retirar uno, con pequeo efecto sobre la reactividad del otro(s). El antisuero con reactividad cruzada contiene, ms frecuentemente, un anticuerpo simple que reacciona con un determinante antignico compartido entre mltiples productos allicos HLA diferentes (p. ej., CREG o determinantes amplios, como se trat previamente) (Rodey, 1994). Las reacciones cruzadas ocurren ms frecuentemente entre los productos allicos codificados por el mismo locus pero pueden ocurrir entre productos allicos codificados por locus diferentes (p. ej., A2 + B17). En la Figura 40-9 y en la Tabla 40-6 se dan ejemplos y la localizacin de los determinantes de la reactividad cruzada.

con los subsiguientes acontecimientos, como la extensin de la EICH. todava son controvertidas.

TRASPLANTE DE RGANOS/TEJIDOS
La supervivencia a largo plazo de rganos slidos y de los injertos de clulas progenitoras hematopoyticas representa uno de los retos ms importantes de la ciencia mdica. El trasplante renal es la terapia de eleccin para la mayora de los pacientes con enlermedad renal en fase terminal. El trasplante de progenitores celulares hematopoytcos, de corazn, de pulmn, de higado y de pncreas est ganando una amplia aceptacin como tcnicas teraputicas con resultados satisfactorios. El principal obstculo al trasplante de rganos slidos y de progenitores de clulas hematopoyticas es el rechazo mediado inmunolgicamente al tejido extrao. Por lo tanto, el xito de un aloinjerto depende de la capacidad para detener la reaccin inmune, lo cual puede realizarse por: 1) concordancia de histocompatibilidad entre el donante y el receptor; 2) terapia inmunosupresora del receptor (Suthanthiran, 1996); y 3) lograr que el receptor no responda al aloantgeno o aloantigenos del donante (esto es, tolerancia) (Remuzzi, 1995).

Bases genticas del trasplante


Las bases genticas del trasplante fueron determinadas por primera vez en 1916 como resultado de experimentos de trasplantes tumorales en ratones y posteriormente se extendi a trasplantes de tejido normal (Snell, 1981). Se demostr que los injertos cutneos en linajes nativos que eran homocigotos en el locus de histocompatibilidad (esto es, injertos singnicos) tenan xito, pero los injertos entre dos linajes nativos diferentes (alotrasplantes) eran rechazados. Adems, los aloinjertos de cualquier linaje nativo emparentado (dos copias de los mismos genes MHC; homocigotos) o de la primera generacin (F1) hibridada (una copia de cada uno de los dos grupos diferentes de genes MHC de dos padres homocigotos) sobrevivan en animales; mientras tanto, los injertos de descendientes F1 hbridos de cualquier progenitor (un haplotipo no emparentado) no sobrevivan. Estas observaciones establecieron las leyes del trasplante. En 1948, Gorer (Snell, 1981) delini el locus d e histocompatibilidad mayor en el ratn, el H-2. Hay otros antigenos de histocompatibilidad o H, que son denominados mHag. Aunque son llamados menores, la discordancia para estos antgenos puede tener efectos importantes (Goulmy. 1997: Dupont, 1998).

Deteccin celular de las molculas de clase II


L a respuesta de una clula en el cultivo tisular a los aloantgenos en la superficie de una segunda clula se denomina cultivo mixto de leucocitos (CML) o reaccin linfocitica mixta (MLR) (Hartzman. 1971). El CML es considerado una medida in vitro de la disparidad de clase II entre individuos que reconocen determinantes encontrados en las molculas de clase II. que son conocidos colectivamente como HLA-D. La respuesta de las clulas T se produce unidireccionalmente impidiendo que se dupliquen las clulas de uno de los dos individuos tratando dichas clulas con radiacin o mitomicina-C antes de su adicin al cultivo. El CLM representa una respuesta sumatoria de una clula respondedora a las diferencias en los mltiples determinantes en las molculas HLA de clase II (DR, DQ y DP) codificadas por los haplotipos de clulas estimuladoras irradiadas. La respuesta a las molculas DR parece predominar.

A medida que existan evidencias convincentes en modelos animales experimentales de que las molculas codificadas por el MHC representan la mayor barrera gentica del xilo del aloinjerto. la tipificacin del HLA fue utilizada en humanos para determinar y para optimizar la compatibilidad entre el injerto del donante y el receptor. Inicialmente, la influencia de los antgenos HLA en la supervivencia del injerto fue investigada injertando piel no vascularizada entre miembros de una familia. Como en los estudios de ratones hijos, los injertos cutneos entre hermanos HLA idnticos sobrevivieron significativamente ms que los injertos entre hermanos padres o donantes no relacionados con un haplotipo emparentado. Estas observaciones se extendieron al trasplante renal durante los ltimos aos de la dcada de los 60 y los primeros de la de los 70. Los datos ms recientes del Estudio Colaborador Internacional de Trasplante (CTS) en Heidelberg y de la United Network for Organ Sharing (UNOS) Registry en los Estados Unidos (analizado en UCLA), confirEl empleo del CLM en los laboratorios clnicos para determinar la histoman que el MHC es la principal barrera gentica en el trasplante de injertos compatibilidad ha declinado debido a las limitaciones inherentes a la tcnica. El CLM puede estar influenciado por la salud del paciente, por el tipo de enfer- renales (Cecka, 1999; Opelz. 1999) (Fig. 40-12; para datos actuales vanse las pginas web sealadas en la Tabla 40-1). Los datos para el trasplante de medad y por la historia de una transfusin previa (Mickelson, 1996). Por estas clulas progenitoras hematopoyticas tambin reafirma el papel del MHC en razones el ensayo CLM se ha reemplazado por mtodos de tipificacin basala evolucin del trasplante determinado por la supervivencia del paciente y por dos en el ADN, ms precisos. Actualmente, en algunos centros de trasplanla EICH (Hansen, 1999) (Fig. 40-13). tes, el cultivo mixto de leucocitos se emplea para identificar receptores de aloinjerto renal con hiporreactividad especifica a las molculas HLA del donante tras el trasplante como una guia para reducir la inmunosupresin Concordancia de histocompatibilidad (Reinsmoen, 1993). Concordancia de HLA. Aunque el nivel de concordancia del HLA es un elemento importante en el resultado del trasplante, la concordancia de la histocompatibilidad significa diferentes cosas en diferentes situaciones y las estrategias para determinar esto varan. Los criterios difieren con variables

Se ha utilizado el anlisis de dilucin limitada para definir la frecuencia de los linfocitos T citotxicos (LTC ) o coadyuvantes (LTC) para predecir la extensin del alorreconocimiento en trasplantes de clulas progenitoras hematopoyticas (Madrigal, 1997). Las correlaciones de estas frecuencias
P p

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INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA

100,

Tabla 40-8 E j e m p l o s d e asociaciones entre los alelos HLA y sus tipos serolgicos Alelos HLA A'0201 A '2603 A-660V B'2702 B'2708' B'1502 B-1503 B' 1536' DRBV0301 DRB1V404 Antigenos HLA

A2 A26 A26 A66 B27 B7 B27 B75(15) B72 (70) No definido DR17(3) DR4 ' El laboratorio puede asignar A66. o ms recuentemente. 26 a las clulas que transportan este alelo. ' Muchos laboratorios tipan serologicamente una clulas con este alelo c o m o B7: sin embargo, la reactividad serolgica sugiere que la tipificacin difiere levemente del B7 "estndar' Las clulas que transportan este alelo no han sido carcter i/adas soioiog camenle
1

dantes para cuatro de seis alelos o anligenos se denominan 4/6 concordancias. Las diferencias aparentes en el nivel de concordancia pueden surgir a causa de la metodologa de tipificacin empleada para asignar los tipos de HLA (p. ej tipificacin serolgica frente a basada en el ADN). Las nomenclaturas serolgicas y ADN, aunque estn relacionadas, pueden diferir. En la Figura 40-12. Supervivencia a cinco aos de aloinjerto renal (primer trasplante) de Tabla 40-8 se dan ejemplos de estas relaciones y se ha publicado una lista tres categoras de histocompalibilidad: hermanos HLA idnticos; un haplolipo d e vida relacionado: donante de cadver, llenos de hermanos donantes HLA idnticompleta (Schreuder. 1999). La definicin de una concordancia tambin puede cos ( a m b o s con cromosomas H L A concordantes) tienen los mejores resultados Se variar dependiendo del tipo de resolucin. Un paciente y un donante pueden indica el numero de trasplantes estudiados (regresin p < 0.0001) (De Opelz G, parecer ser concordantes en el nivel serolgico (p. ej.. receptor: A2. A26: Wujoak T, Dohler B. y col: H L A compatibility and organ transplant survival. Rev donante: A2. A26): sin embargo, la pareja puede ser discordante en el nivel de Inmunogenet 1999; 1:334, con permiso) alelos HLA (p. ej., receptor: A'0201. A'260l: donante: A'0205. A'6601). El nivel de concordancia allico para las molculas de HLA clsicas puede optimizar el resultado de todos los injerios, tanto de rganos vasculares como de clulas progenituras hematopoyticas (Opelz, 1999; Petersdori, 1998). Sin que incluyen el tipo de injerto (p. ej., rgano slido vascularizado frente a proembargo, debido al gran nmero de alelos HLA, el nivel de concordancia algenitor de clula hematopoytica), la enfermedad (p. ej.. leucemia mielode lico es difcil. Por lo tanto, debe considerarse un nivel de concordancia que crnica (rente a anemia aplsica), la edad del paciente y el protocolo clnico garantice un buen resultado para el mximo nmero de pacientes de todas las (p. ej., sangre de mdula frente a sangre de cordn umbilical: deplecin poblaciones tnicas. medular de clulas T frente a no deplecin de clulas T) (vase Cap. 33). La concordancia normalmente incluye la evaluacin de al menos tres locus, Tras el trasplante de clulas progenitoras hematopoylicas, los determiel HLA-A. el HLA-B y el HLA-DR. Los individuos concordantes, en cualquier nantes subtipicos o las diferencias allicas inician una importante respuesta resolucin, para los tres locus se denominan 6/6 concordancias o 0 discorcitotxica de clulas T conduciendo al rechazo del injerto y a la EICH. De dancias. Cero discordancias (un trmino empleado en el trasplante de rganos hecho, los estudios han mostrado que la concordancia de alta resolucin para slidos) tambin puede referirse a pares de donante/receptor, donde el donanlos alelos de clase I y clase II del donanle y el receptor puede mejorar el resulte no tiene diferencias HLA detectables con el receptor, esto es, donde el tado tras el trasplante de mdula no emparentado. Los datos recientes sugiedonante es homocigoto para los alelos en uno o ms de los locus (p. ej., donan- ren que mltiples discordancias son malas para el resultado; sin embargo, el te homocigoto: A'0101: B'0801: DRBT0301: receptor heterocigoto: A'0101: impacto tanto de las discordancias simples como del locus especifico todava A'0301: B'0801: B'0702: DRBV0301. DRBV1501). Los individuos concorno est bien definido (Petersdorf, 1998: Sasazuki. 1998: Hansen. 1999). Solo HLA-ID III RMANO n 4.343 1 -IIAPI. PARIATI-.se n- 18.071 CADVER n 105.360

Figura 40-13, Probabilidad de EICH aguda grados ll a IV en hermanos HLA idnticos (concordancia genotpica HLA) y variabilidad en trasplantes de donantes medulares haploidnticos emparentados con concordancia para el HLA-A. -B o DR/Dw (discordancia HLA: 3 locus, 2 locus, 1 locus o 0 locus). La concordancia para el HLA-A, -B y -DR fue definida por seroiogia. y la concordancia para el H L A D w fue definida p o rC M Lo por tipificacin de los alelos HLA-DRBl con SSOP. Todos los pacientes recibieron mdula no modificada (sin deplecin de clulas T) tras un rgimen de preparacin que incluy la irradiacin corporal total. Se dieron ciclosporina y metotrexato para la profilaxis de la EICH (De Hansen JA. Y a m a m o t o K. Petersdori E. y col: T h e role of H L A matching in hematopoietic cell transplantation. Rev I m m u n o g e n e t 1999; 1:359, copyright 1999 Munksgaard International Publishers Ltd. Copenhagen. Denmark, con permiso.)

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una minora de pacientes que estn esperando el trasplante recibirn injertos de donantes totalmente concordantes (Hurley, 2000b). Para permitir a todos los pacientes beneficiarse de trasplantes que salven la vida, la identificacin de los alelos no emparentados que son bien tolerados permitir la seleccin de donantes no emparentados estableciendo prioridades de acuerdo con el riesgo biolgico de los HLA especficos no concordantes. La concordancia ptima para los injertos de rganos slidos puede diferir de los requerimientos de concordancia para el trasplante de clulas progenituras hematopoylicas. Los datos recientes sugieren que tanto el locus HLA emparentado como el nivel de resolucin del anlisis del HLA contribuyen al resultado del injerto renal (Opelz. 1999). Actualmente la UNOS facilita la comparacin de rones de cadveres basndose en las especificidades subtipicas. Ya que las concordancias subtipicas se identifican infrecuentemente, se ha propuesto que las molculas HLA de clase I sean emparentadas para los amplios determinantes CREG. El CREG puede definir los determinantes mmunodominantes reconocidos en la respuesta inmune humoral. Rodey (1994) mostr que del 80% al 90% de los aloanticuerpos HLA formados por el receptor tras el trasplante de rion estn dirigidos contra los determinantes CREG. Los determinantes CREG son compartidos entre las dilerentes molculas HLA de clase I y. en contraste con las especificidades subtpicas. tienen una distribucin similar entre los grupos de poblacin tnica. En el CREG se incluyen especificidades subtpicas raras. Y a que el nmero de CREGs es menor que el nmero de especificidades subtpicas. la probabilidad de emparentar un nivel CREG es mayor que para un nivel subtpico o allico de HLA clase I. Por lo tanto, la distribucin de rganos basndose en la concordancia CREG debe originar una alta probabilidad de que se distribuyan equitativamente injertos emparentados a receptores de todas las poblaciones tnicas. Un anlisis retrospectivo de los datos de la UNOS corrobora estas predicciones sobre la distribucin (Ellison, 1994), aunque los estudios todava estn en progreso. El impacto de la concordancia CREG en el resultado del injerto es desconocido, pero se est evolucionando. En Europa, una estrategia para eliminar el excesivo tiempo de espera de los receptores con fenotipos HLA raros se implant en 1996 mientras se mantena la distribucin de los injertos bien emparentados (Opelz. 1999). Otras estrategias se centran en la concordancia de los fragmentos biolgicamente relevantes de las molculas del MHC (p. e| concordancia de eptopo) (Suciu-Foca, 1998; Harris, 1999). Hasta hace poco, el reconocimiento directo de los aloantgenos se pens que era la principal via de respuestas de los injertos. Sin embargo, los estudios sugieren que la respuesta indirecta juega un papel significativo en el rechazo del injerto, al menos en los injertos de rganos slidos (Sayegh, 1996). Si se activa la via indirecta, entonces los epitopos peptidicos generados por la ruptura proteolitica de la molcula HLA y no por la molcula HLA en si misma sern el estmulo inmunognico. Por ello pueden disearse nuevas estrategias innovadoras para la definicin de las discordancias deducbles basndose en el reconocimiento de los fragmentos peptidicos. Por ejemplo, una estrategia puede considerar si las molculas HLA del donante no emparentado sern interpretadas como inmunognicas en el receptor (es decir, si las molculas HLA del receptor se unirn y presentarn estos epitopos). Tericamente, uno puede identificar secuencias peptdicas de HLA extrao no presentado por las molculas HLA especficas del receptor y por ello definir las discordancias deducbles para las molculas HLA dadas. La complejidad inherente en la interpretacin de los resultados de la tipificacin del HLA y en la seleccin de un donante hace crtico incluir un experto en los anlisis de hislocompalibilidad. Los expertos en la tipificacin del HLA conocern las ventajas y las limitaciones de cada mtodo de tipificacin asi como la frecuencia de los alelos y los haplotipos en la poblacin, informacin importante tanto en la bsqueda como en la seleccin de un donante adecuado. Deteccin de anticuerpos especficos del HLA en el suero del receptor. Los pacientes pueden sensibilizarse a molculas H L A extraas especficas a travs de una transfusin, el embarazo, o trasplantes anteriores. La evaluacin de la compatibilidad entre el receptor y el posible donante incluye el anlisis para esta sensibilizacin. El suero del receptor es analizado antes del trasplante en un panel (linfocitos o molculas de HLA solubles inmovilizadas) de un perfil HLA conocido para medir la reactividad anticuerpo panel (PRA). En el momento del trasplante, el suero del receptor es analizado con

los linfocitos prospectivos del donante para identificar la reactividad especfica para el donante potencial en la prueba cruzada especfica de donante. Aunque las tcnicas utilizadas para detectar el anticuerpo de unin pueden diferir entre los laboratorios, los propsitos siguen siendo obtener un perfil de factores de riesgo inmunolgico del receptor en la lista de espera, que ser de ayuda al equipo mdico tanto en las decisiones pretrasplante como en las postrasplante. La unin del anticuerpo en el suero actual del receptor a los linfocitos Tdel donante es una contraindicacin para el trasplante renal Anlisis del suero (PRA). La caracterizacin cuidadosa del perfil de anticuerpo de los pacientes en espera de un trasplante es de ayuda en la interpretacin de las concordancias cruzadas especificas de donante pretrasplante. Los objetivos del anlisis PRA son: 1. Identificar el nivel de presensibilizacin del paciente a los antgenos HLA. Un paciente con un exceso de PRA del 60% (i.e., el suero del paciente reacciona con especificidades encontradas en al menos el 60% del panel) tiene una menor probabilidad de concordancia cruzada donante-especfica negativa y, por ello, de recibir un trasplante de un trasplante no emparentado. 2. Identificar la especificidad HLA de los anticuerpos para predecir el antigeno(s) HLA que sern evitados cuando se seleccionen los donantes. 3 Identificar pacientes con anticuerpos irrelevantes (p. ej.. IgM autoanticuerpos) de modo que se puedan seleccionar las tcnicas apropiadas para evitar falsos positivos en la lectura en el momento de la concordancia cruzada donante-especfica. La caracterizacin del anticuerpo HLA especfico presente en el suero del receptor requiere un anlisis en un panel seleccionado de especificidades HLA bien definidas. Se deben incluir en el panel de control los linfocitos o los antgenos solubles de un nmero suficiente de individuos para asegurarse de que se detectarn todos los anticuerpos dirigidos contra el HLA salvo los ms raros. En la medida de lo posible, el panel de control debe permanecer igual de modo que los resultados sean comparables en el tiempo. El receptor de un trasplante renal forma frecuentemente anticuerpos frente a CREGs ms que frente a especificidades subtpicas (Rodey. 1994,1997) de modo que el anlisis de la reactividad del panel debe considerar la identificacin de CREG asi como la de especificidades subtpicas. La identificacin de especificidades de anticuerpo en los pacientes que esperan el trasplante ayuda a la preseleccin de un donante potencial del que el receptor tendr una concordancia cruzada final negativa. Los programas de ordenador ayudan en la seleccin (Claas, 1999: Duquesnoy, 1999). La frecuencia del control y la seleccin de los ensayos empleados para el control son decisiones basadas en el perfil inmunolgico del individuo receptor. El descenso del empleo de las transfusiones sanguneas ha hecho innecesaria la necesidad de un control mensual de las muestras de suero de todos los pacientes (pgina web ASHI: Tabla 40-1). La presencia tanto de anticuerpos especficos HLA de clase I como de clase II es detectada por el anlisis del suero en un panel de linfocitos (p. ej., por citotoxicidad directa dependiente del complemento o por ensayos de citotoxicidad aumentados con antiglobulina) o en un panel de molculas HLA soluble inmovilizadas con placas (es decir, ensayo con enzima unida mmunoabsorbente [ELISA]) o en gotas (es decir citometra de flujo). (Los ensayos se describen con detalle en el manual ASHI [2000].) Una ventaja del ensayo con antigeno soluble de fase slida es que puede ser diseado para detectar solo IgG. anticuerpos especlicos frente al HLA de clase I. Las muestras de suero de los receptores potenciales deben almacenarse a -70 C y protegerse del dixido de carbono y de la evaporacin Las muestras de suero caracterizadas almacenadas sern utilizadas en la prueba cruzada especifica de donante para evaluar la compatibilidad con un donante prospectivo. Prueba cruzada especfica de donante. L a concordancia cruzada de linfocitos analiza la presencia de anticuerpos, si los hay, en el suero de un receptor potencial que reaccionan con los linfocitos del donante especfico. En el test de reactividad cruzada, el linfocito es la clula diana de eleccin, ya que expresa altos niveles de molculas HLA y es fcil de aislar. Este test es probablemente la contribucin ms importante de los laboratorios de tipificacin de tejido HLA al trasplante renal. El propsito de la reactividad cruzada es prevenir el rechazo hiperagudo y detectar anticuerpos que identifiquen fac-

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SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOIOGA

lores de riesgo inmunolgico en pacientes que esperan un trasplante. La aparicin del rechazo hiperagudo se correlaciona significativamente con la reactividad cruzada de la citotoxicidad directa dependiente del complemento positiva (CDC) entre los linfocitos T del donante y el suero del receptor en el momento del trasplante. La reactividad del suero vlido actual del receptor a los linfocitos T del donante es una contraindicacin para el trasplante de injerto renal. La deteccin de anticuerpos reactivos al donante en muestras anteriores de suero de receptores no es una contraindicacin pero puede representar un nesgo para la prdida del injerto distinto del rechazo hiperagudo inmediato (Cardella, 1982; Geddes. 1999). La reactividad cruzada especifica de donante tambin se utiliza en algunos centros para predecir el fallo del injerto de clulas progenitoras hematopoyticas (Hansen, 1997). Los requerimientos u mtodos para la reactividad cruzada especifica de donante estn determinados en los estndar de la Sociedad Americana de Histocompatiblidad e Inmunogentica (Tabla 40-1) y en el manual de tcnicas ASHI (2000). Las tcnicas aceptadas hasta el momento incluyen el Amos modificado CDC, la extensin del tiempo de incubacin de la CDC. la CDC aumentada con antiglobulina y la citometria de flujo. Tcnicas de deteccin de anticuerpos. Diferentes laboratorios pueden utilizar diferentes combinaciones de ensayos para detectar anticuerpos. El nivel de sensibilizacin detectado variar con el ensayo. El anticuerpo especifico detectado variar con la clula diana. Citotoxicidad directa dependiente del complemento (CDC). La CDC directa incluye todos los ensayos que utilizan la adicin de complemento para detectar la unin directa del anticuerpo con los linfocitos. La fijacin del complemento por los complejos anticuerpo-antigeno sobre la superficie de las clulas originar la muerte celular o la citotoxicidad. Los mtodos de CDC incluyen la tcnica bsica (no hay periodo de lavado antes de aadir el complemento), la tcnica Amos modificada (etapa de lavado aadida antes de la adicin del complemento) y tcnicas de aumento del tiempo de incubacin La etapa de lavado elimina el suero que puede contener sustancias que dificultan la activacin del complemento. Las ventajas de las tcnicas de CDC directa son que son reproducibles y que la correlacin con la incidencia de rechazo hiperagudo es excelente. Tcnicas de reactividad cruzada indirecta. Las tcnicas indirectas incluyen la citotoxicidad aumentada con antiglobulina (AHG) y la citometria de flujo. Ambas utilizan un reactante especifico para la inmunoglobulina humana para aumentar la deteccin de anticuerpos dirigidos contra el HLA. Las tcnicas indirectas detectan la presencia de anticuerpos especficos frente a antigenos de reactividad cruzada (CREG) que frecuentemente no son detectados en los ensayos CDC. Las ventajas del ensayo por citometria de flujo incluyen la discriminacin de las subclases de clulas unidas a las inmunoglobulinas (IgG frente a IgM) y la caracterizacin de la clula diana que se une al aloanlicuerpo (linfocito T frente a linfocito B frente a monocito). Autoanticuerpos. Se sabe que la presencia de autoanticuerpos circulantes en el receptor es nociva. Por ello, debe llevarse a cabo una autorreactividad cruzada, preferiblemente cuando el paciente se incluye en la lista de espera del trasplante. Si estn presentes autoanticuerpos. el suero utilizado para la reaccin cruzada con el donante debe tener la autorreactividad eliminada. Los autoanticuerpos son primariamente IgM y los anticuerpos HLA especficos son primariamente IgG (Barger, 1989) Tanto la inactivacin con calor a 63 1 C o la reduccin con los agentes qumicos ditioeritrtol (DTE) o ditiotreitol (DTT) de cualquiera de los anticuerpos IgM potencales se utiliza para diferenciar entre anticuerpos IgM e IgG en las muestras de suero. Si la muestra de suero inactivada con calor o tratada con DTT es negativa, aun cuando la muestra no tratada sea positiva, la mayora de los centros seguirn adelante con el trasplante. Sin embargo, el DTT o la inactivacin con calor deben emplearse con precaucin, ya que no todos los anticuerpos HLA especficos son IgG y por ello, si no se controla correctamente, ambas tcnicas pueden eliminar la actividad IgG y la IgM. Anticuerpos frente a las clulas B. En algunos centros puede llevarse a cabo una reactividad cruzada utilizando linfocitos B del donante (reactividad cruzada de clula B) en los pacientes sensibilizados. Una prueba de reactividad cruzada positiva frente a clulas B especficas del donante no es una contraindicacin para el trasplante. El significado clnico todava no se

ha resuelto, pero la prueba positiva puede ser un factor de riesgo, particularmente en pacientes que han sido trasplantados previamente. Los anticuerpos detectados en la reactividad cruzada de clula B pueden ser (1) especficos de clase II, HLA-DR. -DQ. (2) anticuerpos de baja especificidad para el HLA-A. -B. -C (las clulas B tienen una alta densidad de molculas de clase l y son ms sensibles a los ensayos dependientes del complemento que las clulas T). y/o (3) anticuerpos no especficos del HLA (p. ej., autoanticuerpos). Para interpretar una reactividad cruzada de clula B positiva, puede ser necesario juntar el suero del receptor con plaquetas antes de desarrollar la reactividad cruzada con el donante. (Las plaquetas expresan molculas de clase I pero no de clase II.) Las dos tcnicas de reactividad cruzada de clula B utilizadas ms frecuentemente son el CDC y los ensayos de citometria de flujo. Seleccin de las muestras de suero del receptor para la reactividad cruzada con el donante. En pacientes con sensibilizacin no detectable (es decir. 0% PRA). puede usarse la muestra de suero disponible ms reciente para la reactividad cruzada especifica de donante. Si el paciente tiene anticuerpos preexistentes o ha tenido un acontecimiento sensibilizante reciente, debe recogerse una muestra de suero en el momento (Le., en las 48 horas antes del trasplante). En receptores sensibilizados, las muestras representativas, incluyendo la ms reactiva o muestra de suero "pico", son analizadas en muchos centros ya que una muestra positiva de donante anterior puede ser considerada un factor de riesgo particularmente en el paciente que rechaz precozmente un injerto anterior en el periodo postrasplante (Mahoney, 1996).

Trasplante renal
La prctica actual es seleccionar donantes para receptores que son ABO compatibles, tienen reactividad cruzada especfica de donante de clulas T negativa con un suero receptor adecuado y la mejor concordancia HLA disponible. El hallazgo original de que los injertos de rion entre hermanos HLA idnticos sobrevivan significativamente ms que los injertos transplantados entre hermanos HLA no emparentados o combinaciones de hermanos-parientes se ha confirmado consistentemente. La Figura 40-12 muestra el anlisis ms reciente de supervivencia a cinco aos de aloinjertos renales del registro internacional CTS entre tres categoras de donantes: (1) hermano HLA idntico, 84% de supervivencia; (2) pariente vivo con un haplotipo, 73% de supervivencia; (3) todos de cadver. 66% de supervivencia. El impacto de la concordancia para el MHC en trasplantes de parientes vivos se observa claramente comparando las categoras 1 y 2. Resultados similares se observan en la base de datos de la UNOS (Cecka, 1999). Aunque los resultados de los anlisis sobre injertos de parientes vivos confirman el papel del MHC como la mayor barrera gentica en el xito del resultado del injerto, la demostracin y la aceptacin de la influencia positiva de la concordancia HLA en el resultado del injerto en los trasplantes de cadver no emparentados ha sido ms controvertida. Sin embargo, los datos de la supervivencia a largo plazo de estudios multicntncos colectivos son consistentes a la hora de mostrar un efecto altamente significativo de la concordancia del HLA en la supervivencia del trasplante renal de cadver (Fig. 40-14) (Opelz. 1999; Cecka. 1999). Ms an, dos estudios de centros independientes, uno de Europa (Oslo) y otro del norte de Amrica (Toronto) han informado de una mejora significativa en la supervivencia del injerto como una funcin de la concordancia del HLA (Fig, 40-15) (Leivestad, 1999: Geddes, 1999). Un centro aislado puede requerir la priorizacin basada en la concordancia HLA para trasplantar a suficientes receptores con injertos bien emparentados para mejorar la significacin estadstica en el resultado de los anlisis. Aunque los nmeros son pequeos, se ha observado una influencia altamente significativa de la concordancia del HLA en el resultado de los injertos de rion de donantes vivos no emparentados (Opelz, 1999). Los injertos con cero discordancias (0 MM) de donantes cadver sobreviven significativamente mejor y aproximadamente tan bien como los injertos de hermanos HLA idnticos (Figs. 40-12 y 40-14): por ello, la UNOS ordena compartir de 0 MM rones La supervivencia del injerto en pacientes tras los primeros trasplantes de rion disminuye proporcionalmente a medida que aumenta el nmero de discordancias de 0 MM a 6 MM (Cecka, 1999; Opelz, 1999). Sin embargo, para asegurar la distribucin equitativa de

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ANTGENO LEUCOCITARIO HUMANO: COMPLEJO MAYOR DE HISTOCOMPATIBILIDAD.

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rganos a lodos los receptores, incluyendo aquellos con haplotipos HLA raros, se han adoptado por los programas de distribucin de rganos nuevos algoritmos para la priorizacin de receptores en lista de espera (Opelz, 1999). Los resultados de los datos ms recientes tanto de supervivencia de injerto como de paciente pueden verse a travs de pgina web de la CTS (Tabla 40-1). La concordancia del injerto inicial no solo aumenta el tiempo de supervivencia del injerto, sino que disminuye la probabilidad de sensibilizacin del receptor y facilita el retrasplante. La acumulacin de pacientes altamente sensibilizados en la lista de espera es un problema significativo en muchos centros, ya que los pacientes esperan durante largos perodos de tiempo y pueden presentar problemas clnicos de difcil tratamiento (Sanfilippo, 1992).

Trasplante de rganos no renales


La supervivencias de los injertos de corazn, hgado, pulmn y pncreas es buena, con entre un 58% y un 67% de supervivencia de los primeros injertos en cinco aos (Fig. 40-16). Los donantes normalmente no tienen concordancia en el tipo de HLA. y no se hace rutinariamente una reactividad cruzada pretrasplante con el donante. Se recomiendan los controles de anticuerpos sricos para identificar el estado de sensibilizacin como un factor de riesgo inmunolgico para el receptor. Si es posible, los receptores de injerto y los donantes cadveres de injertos vascularizados no renales deben ser clasificados para el HLA para permitir anlisis retrospectivos. Los datos recientes de la CTS internacional no muestran el efecto de la concordancia HLA en el resultado del trasplante de hgado: sin embargo, los datos de la CTS muestran un impacto significativo de la concordancia del HLA-A. -B y -DR en el resultado de los primeros trasplantes de corazn (Opelz, 1999). El perodo aceptable para la preservacin de la isquemia fra puede limitar la extensin de la posible concordancia HLA en el trasplante cardaco.

Figura 40-15. Supervivencia a c i n c o aos de injerto cadavrico c o m o una (uncin del nmero de antigenos HLA discordantes. El anlisis Kaplan-Meier de la supervivencia del injerto con respecto a los antigenos discordantes H L A no se m u e s t r ap e r o fue estadsticamente significativo (p = 0,01). (De Geddes CC, Cole E. W a d e J. y col: Factors influencing long-term primary cadaveric kidney transplantation-importance of functional renal m a s s versus avoid-ance of a c u t e rejections- t h eT o r o n t oH o s p i t a experience 1985-1997. En C e c k a M, T e r a s a k i P [eds]:Clinical Trasplants 1998. Copyright U C L A Tissue Typing Laboratory. Los Angeles. CA. 1999. c o n permiso.)

Trasplante alognico de clulas progenituras hematopoyticas


El trasplante de clulas progenituras hematopoyticas alognicas se lleva a cabo en neoplasias malignas y trastornos hematolgicos, en el fallo de la medula sea, en ciertos trastornos metablicos heredados, como las enfermedades de depsitos de lpidos. y en el sndrome de inmunodeficiencia congnita. A partir de una histocompatibilidad inicial, el mejor donante es o uno m i s m o (trasplante autlogo) si la neoplasia maligna no implica a la mdula sea o si la

Figura 40-14. Electo combinado de las discordancias serolgicas para el HLA-A. HLA-B y HLA-DR en la supervivencia de los primeros injertos de rion de cadver. (MM = discordante). La asociacin de la concordancia con el resultado del injerto fue estadsticamente signilicativa (regresin p < 0. 0001). El anlisis fue restringido a los trasplantes para los que se inform la divisin de especificidades HLA-A y H L A B al centro de estudio para el receptor y el donante (De Opelz G. Wujciak T. Dohler B. y col: H L A compatibility and organ transplant survival. R e vI m m u n o g e n e t 1999; 1:334. c o n permiso.)

Figura 40-16. Supervivencia a cinco aos del injerto de los primeros trasplantes para el trasplante de rganos vascularizados en injertos de corazn, rion de cadver, hgado, pncreas, pulmn y cardiopulmonar. (Del Collaborative Transplant Study, proporcionado p o ryc o n permiso del Dr.Gerhardt Opelz y tratado en Opelz, 1999.)

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SECCIN V

INMUNOLOGA E INMUNOPATOLOGA

enfermedad no es gentica, o un gemelo idntico (trasplante smgnico). Las clulas progenitoras de donantes hermanos HLA idnticos son una fuente frecuente. Estas clulas donantes normalmente sern genticamente idnticas a las del paciente a lo largo de toda la regin MHC. El empleo de un hermano donante tambin aumenta la probabilidad de que los genes no HLA que pueden afectar el xito del trasplante y que no estn bien definidos (i.e., genes de histocompatibihdad menor) sean concordantes (Goulmy. 1997). Los miembros de una familia haploidnticos tambin pueden ser elegidos como donantes (Aversa, 1998), aunque hay un mayor riesgo de EICH severa que en los donantes HLA no emparentados. Basndose en los datos del Registro Internacional de Trasplantes de Mdula sea (IBMTR) (Tabla 40-1; www.ibmtr.org). se llevaron a cabo ms de 16.000 trasplantes alognicos de mdula osea desde 1996 hasta 1997: el 75% utilizaron donantes emparentados. Muchos pacientes (-70%) no tienen hermanos HLA concordantes y se puede considerar el trasplante con clulas de un HLA concordante, de donante no emparentado. Para facilitar la bsqueda de un donante concordante, se han desarrollados registros nacionales de donantes no emparentados alrededor del mundo (Hansen, 1996), El NMDP en los Estados Unidos es uno de estos registros y contiene ms de 3,9 millones de donantes HLA tipados, siendo el mayor registro de donantes no emparentados del mundo (Perkins, 1994; vase Tabla 40-1; www.marrow.org). Aproximadamente, el NMDP ha facilitado 8.100 (en el ao 2000) trasplantes de donantes no emparentados desde que el registro comenz en 1987. Los injertos de clulas progenitoras hematopoyticas estn entre los ms difciles de todas las tcnicas clnicas por varias razones (Madrigal. 1997; Hansen. 1997). Primero, en el momento del trasplante, los receptores estn casi totalmente inmunodeficientes. ya sea debido a la deficiencia heredada (inmunodeficiencia combinada severa [IDCS]) o a causa del acondicionamiento pretrasplante (quimioterapia citotxica y radiacin). El acondicionamiento se requiere para eliminar las clulas malignas y para prevenir al sistema inmune del receptor del rechazo de las clulas progenitoras del donante que son infundidas muchos das despus del acondicionamiento. La cantidad de pretratamiento citotxico es suficiente para eliminar los leucocitos circulantes, casi eliminar las plaquetas, y abrogar la produccin de nuevos eritrocitos. Por ello, el receptor es profundamente susceptible a todo tipo de infecciones y ciertamente morir si no se le rescata con cuidados mdicos extraordinarios y con translusin de clulas progenitoras. El segundo nesgo es el potencial del ataque inmunolgco del receptor por las clulas progenitoras alognicas trasplantadas originando una EICH. La EICH tiene muchas formas y puede ser letal. A pesar de las dificultades, algunos centros de trasplantes han obtenido un xito excepcional. Los recientes informes de instituciones determinadas y la IBMTR sugieren una supervivencia libre de leucemia del 40% al 60% a los cinco aos tras el trasplante de clulas progenitoras hematopoyticas no emparentadas a pacientes con leucemia mieloide crnica en fase crnica (Tabla 40-1, www.ibmtr.org) (Hansen. 1998). La supervivencia de los pacientes con anemia aplsica severa trasplantados con clulas de donantes no emparentados vara de un 30% a un 50% a los cinco aos dependiendo de la edad del paciente (vase Tabla 40-1, NMDP en www.marrow.org y www.ibmtr.org) y se ha informado en algunos centros de ndices de supervivencia cercanos al 90% (Deeg. 1998). Adems de mdula como fuente de clulas progenitoras hematopoyticas. la obtencin de clulas progenitoras hematopoyticas de sangre perifrica movilizadas con factor de crecimiento (Anderlini. 1997) o de clulas progenitoras de sangre de cordn umbilical (Cairo, 1997) aumenta la disponibilidad de donantes no familiares. Las nuevas aproximaciones a la inmunosupresin. incluyendo protocolos de acondicionamiento menos agresivos (p. ej., "minitrasplantes") (Storb, 1999). pueden aumentar la disponibilidad del trasplante de clulas progenitoras como tcnica teraputica en pacientes actualmente excluidos por su edad o por su disfuncin orgnica. El trasplante de clulas progenitoras hematopoyticas puede usarse tambin para generar respuestas inmunes dirigidas contra las clulas tumorales. La recada de la enfermedad tras el trasplante es mayor en pacientes que han recibido un injerto HLA concordante, lo que sugiere que algn grado de discordancia puede ser beneficioso en la estimulacin de la respuesta inmune contra las clulas tumorales (Beatty, 1993). A medida que se vayan resolviendo los problemas de esta tcnica tan difcil, el trasplante de clulas progenitoras hematopoyticas puede convertirse en uno de los mtodos ms

ampliamente utilizados para el tratamiento de una gran variedad de enfermedades (vase Cap. 33). Tipificacin HLA para el trasplante de clulas progenitoras. Muchos factores, incluyendo la histocompatibilidad. influyen en el resultado del trasplante de clulas progenitoras hematopoyticas (Madrigal. 1997). El trabajo pretrasplante incluye la tipificacin del HLA-A. -B y -DR de todos los miembros disponibles de los familiares ms cercanos para identificar un donante concordante relacionado y para establecer la herencia de los haplolipos. Tambin puede ser apropiada la tipificacin basada en el ADN de los genes de dase II. que se ha convertido en un estndar, y la tipificacin basada en el ADN de los genes de clase I se ha incorporado en muchos centros. La tipificacin de la familia completa, la tipificacin del nivel allico (i.e.. alta resolucin) de los locus especficos HLA de clase I y II. la tipificacin de otros locus en el MHC (repeticiones en tndem cortas o locus complementario), o el empleo de otras pruebas (p. ej., reactividad cruzada: mediciones de precursores de clulas T citotxicas) para medir la compatibilidad (Hurtey. 1999) tambin puede ser adecuado. El nivel de resolucin de la tipificacin del HLA requerido difiere para el trasplante de clulas progenitoras hematopoyticas y renal. Parece que para el trasplante de clulas progenitoras se necesita una alta resolucin de tipificacin HLA. mayor de la que es necesana para el trasplante renal, debido a que el trasplante de clulas progenitoras incluye la transferencia de un sistema inmune completo al paciente. Las investigaciones actuales se centran en definir los locus que deben considerarse en la seleccin del donante, el nivel de resolucin que debe emplearse para la concordancia, y el efecto aditivo de las mltiples discordancias. El nivel de concordancia requerido puede variar en cada enfermedad o protocolo. Las evidencias sugieren que la concordancia de un donante y un receptor no emparentados para los alelos HLA-A. -B y -DRB1 est relacionada con una mejora del resultado. El impacto de la concordancia en el otro locus HLA (p. ej.. HLA-C y HLA-DQ) est bajo estudio. Las discordancias aisladas pueden ser toleradas; sin embargo, las discordancias mltiples parecen tener un impacto negativo en el resultado (Sasazuki, 1998; Petersdorf, 1998,1995b: Madrigal, 1997; Hansen. 1997). Adems, el efecto positivo de la concordancia de histocompatibilidad en el resultado debe evaluarse por el impacto positivo del trasplante precoz en el curso de la enfermedad. Los datos de la IBMTR y de la NMDP muestran que la supervivencia tras el trasplante est reducida a medida que avanzan las lases de la enfermedad (dalos en las pginas web sealadas en la Tabla 40-1).

RESUMEN
Las molculas HLA de clase I y clase II codificadas en el complejo mayor de histocompatibilidad tienen un papel significativo en la especificidad y en el carcter de las respuestas inmunes. El extenso polimorfismo de estas molculas proporciona la diversidad necesaria para asegurar la supervivencia en un ambiente de patgenos hostiles y adaptativos. Desgraciadamente, esta capacidad del sistema inmune de distinguir lo propio de lo extrao se extiende al reconocimiento de las molculas de HLA extraas tras el trasplante tsular. La definicin y la caracterizacin de los alelos y las molculas del HLA se han combinado con los protocolos clnicos para maximizar la compatibilidad y minimizar el impacto de la respuesta inmune sobre el tejido extrao. Estos avances han contribuido al desarrollo del trasplante como una modalidad de tratamiento con xito en la sustitucin del tejido enfermo.

BIBLIOGRAFA
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CAPTULO 40

ANTGENO LEUCOCITARIO HUMANO: COMPLEJO MAYOR DE HISTOCOMPATIBILIDAD..

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SECCIN V

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