BIOLOGIA VIRUSURILOR. DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL VIROZELOR.

1. 2. 3. 4. 5. 6. 7.

Particularitile virusurilor Reprezint structuri acelulare cu potenial infecios Sunt lipsite de metabolism propriu, fiind parazii obligai intracelulari Nu cresc pe medii artificiale, numai pe celule vii Genomul viral este constituit dintr-un singur tip de AN (ADN sau ARN) Nu cresc i nu se divid, ci se reproduc n celule vii Dimensiuni de rangul nm (20-400 nm) Rezisten natural la antibiotice

CLASIFICAREA VIRUSURILOR
Dup tipul AN (cu genom ARN/ADN) Dup dimensiuni (mici 20-50 nm, medii 50-150 nm, mari peste 150 nm) Dup tipul de simetrie a capsidei (helicoidal, cubic, mixt) Dup gazd (om, animal, insect, bacterie) Dup sensibilitatea n mediul extern, etc

Virusuri ADN : Parvoviridae, Hepadnaviridae, Adenoviridae, Herpesviridae, Poxviridae Virusuri ARN+: Picornaviridae, Caliciviridae, Togaviridae, Flaviviridae, Coronaviridae, Retroviridae Virusuri ARN- : Rhabdoviridae, Paramyxoviridae, Orthomyxoviridae, Bunyaviridae, Arenaviridae, Filoviridae Virusuri ARNd.c. : Reoviridae Virion unitate structural infecioas a virusului Viroid ARNm.c., circular, asociat cu boli la plante Prion protein termostabil infecioas, cauzeaz la om boala Kuru, Creutzfeldt-Jacob, sindromul Gerstmann-Straussler, scrapie la oi

COMPOZIIA CHIMIC I STRUCTURA VIRIONULUI

Virusurile simple AN i nveli proteic capsida (nucleocapsid) Virusurile complexe nucleocapsid i un nveli extern, lipoglicoproteic (supercapsid, peplos) AN ADN sau ARN, mono- sau bicatenar, linear, circular sau fragmentat. ARN monocatenar : ARN+ (caten cu sens, ARNm) sau ARN- (caten fr sens)

Funcia AN asigurarea replicrii i expresia genomului pentru sinteza proteic Capsida format din uniti proteice, capsomere, aranjate simetric. 1. Simetrie helicoidal capsomerele se fixeaz pe catena de AN, form de bastona 2. Simetrie cubic (icosaedric) capsomerele se aranjeaz n jurul AN, formnd un icosaedru (poliedru regulat cu 20 fee triungiulare i 12 vrfuri), eikos=20 3. Simetrie mixt (bacteriofagii, poxvirusurile) Funcia protecia AN, rol antigenic, adeziune

Supercapsida structur glucido-lipido-proteic, derivat din membrana celulei gazd (lipidele din membrana celular, glicoproteinele proprii) Funcie protecie, antigene de suprafa, adeziune Unele virusuri conin enzime polimeraze, transcriptaze, etc. Aciunea factorilor fizici, chimici Virusurile sunt foarte sensibile la cldur, desicare, UV. Detergenii i solvenii inactiveaz virusurile cu supercapsid. Pot fi conservate prin liofilizare sau la -80 C

REPRODUCEREA VIRUSURILOR
I ADSORBIA virusului la celula-gazd prin intermediul receptorilor specifici (tropism) II PENETRAREA virusului n celul a) Pinocitoz (viropexis) b) Fuziunea membranelor c) Translocare d) Injectarea AN n citoplasm III DECAPSIDAREA (enzime celulare)

IV BIOSINTEZA (sinteza proteinelor i replicarea AN) Are loc n citoplasm (virusuri cu ARN) sau nucleul celulei (virusuri cu ADN) Biosinteza virusurilor ADN ADNdc transcrierea ARNm translaia (precoce, tardiv), replicarea sinteza proteic Biosinteza virusurilor ARN ARN+ translaie, replicare sinteza proteic ARNtranscriere ARNm translaie, replicare sinteza proteic Retrovirusuri (ARN+) transcriere ADNADNdc transcriere ARNm replicare, translaie, sinteza pr. (sau integrare n cromosom)

RNA VIRUSES THAT DO NOT HAVE A DNA PHASE RNAdependent RNA polymerase (=transcripta se) in virion No Yes Yes

Genome

Infectivity of Initial event in RNA cell

RNA + RNA RNAd.c.

Infectious Noninfectious Noninfectious

Translation Transcription Transcription

RETROVIRUSES
RNAdependent RNA polymerase (=transcriptas e) in virion Yes

Genome

Infectivity of RNA

Initial event in cell

RNA +

Non-infectious

Reverse transcription

V. MORFOGENEZA (asamblarea) virionilor Proteinele capsidale particip la formarea nucleocapsidei (nucleu,citoplasm), glicoproteinele sunt inserate n MCP, substituind proteinele celulare. Contribuie la apariia incluziunilor sau a corpusculilor elementari. VI. ELIBERAREA virionilor (liza celulei, nmugurire, exocitoz) Interferena viral fenomen n care, consecutiv infeciei unei celule cu 2 virusuri, multiplicarea unuia este inhibat (virus interferat / virus interferent)

CULTIVAREA VIRUSURILOR
Virusurile sunt cultivate pentru: Stabilirea diagnosticului etiologic Testarea infeciozitii virusurilor Testarea preparatelor antivirale Producerea vaccinurilor SISTEME DE CULTIVARE 1. Culturi de celule 2. Ou embrionat de gin 3. Animale de laborator

Animalele de laborator se utilizeaz limitat (receptivitate selectiv, preexistena infeciilor, cost avansat). Se recurge numai cnd nu exist alte posibiliti (VHB, HIV, Coxsackie, etc). Constituie modele de cercetare sau de control al vaccinurilor. Animalele utilizate curent oriceii albi nou-nscui, dar pot fi utilizai obolani, cobai, maimue, etc. Regulile de lucru cu animalele de laborator (selectare, inoculare, examinare) sunt identice cu cele din infeciile bacteriene.

Oul embrionat de gin (5-13 zile) reprezint un mediu de celule nedifereniate, cu multiplicare activ, steril i lipsit de mijloace de aprare antiinfecioas. Se utilizeaz n prepararea unor vaccinuri virale (ex.: gripal) - Iniial se verific viabilitatea embrionului la ovoscop n camera obscur. - Prelevatul se inoculeaz steril cu seringa n cavitatea amniotic sau alantoidean, sau pe membrana chorioalantoidean (utiliznd metoda deschis sau nchis). - Orificiul se parafineaz i se incubeaz la 35-37 C timp de 48-72 ore

Culturile de celule (1949 - Enders, Weller, Robbins). Celulele provenite din esuturi adulte sau embrionare, normale sau tumorale, plasate ntr-un mediu adecvat (nutrieni, pH, t) rmn viabile i se multiplic. Pentru cultivarea virusurilor se utilizeaz culturile n monostrat celular. Tipurile de culturi de celule: Culturi primare (primar tripsinizate). Sunt obinute din esuturi adulte sau embrionare de origine animal sau uman. Suport 4-6 pasaje (subcultivri) Culturi diploide. Obinute din esut embrionar (MRS5, fibroblaste umane). Pot fi subcultivate 40-50 generaii Linii continui de celule. Obinute din esut tumoral. Pot fi subcultivate nelimitat. HeLa carcinom de col uterin KB tumoare a rinofaringelui Hep-2 tumoare canceroas a laringelui

Obinera culturilor de celule primar tripsinizate: - Prelevarea esutului (ex.: rinichi de maimu) - Fragmentarea i splarea cu sol fiziologic - Dezagregarea tisular cu enzime proteolitice - Separarea celulelor prin centrifugare - Dozarea suspensiei 105 106 celule/ml - ntroducerea celulelor n mediu nutritiv i repartizarea n recipiente sterile - Incubarea pn la formarea monostratului celular (inhibiie de contact) - Monostratul poate fi infectat cu virus sau servete drept surs de celule pentru o nou cultivare (pasaj)

Mediile de cultur pentru culturi de celule conin AA, Vit, factori de cretere, sruri minerale (Eagle, Hanks, 199, hidrolizat de lactalbumin, etc), rou fenol pentru monitorizarea pH (vireaz n galben n mediu acid) 1. Mediile de cretere sunt mbogite cu ser sangvin (uman, animal) pentru cultivarea CC 2. Mediile de ntreinere se utilizeaz pentru meninerea monostratului n procesul reproducerii virale. Nu conin ser. CC reprezint sistemul virus-gazd predilect n virologia clinic i cercetare.

Inocularea CC - Se aleg tuburi cu monostrat bine format - Se nltur mediul de cretere, se spal cu sol. Hanks - Se inoculeaz 0,1 0,2 ml de prelevat - Peste 30-60 min n tuburi se toarn cte 1 ml mediu de ntreinere - Se ntroduc n termostat la t adecvat 3-4 zile

DIAGNOSTICUL DE LABORATOR AL VIROZELOR

Indicaii: - Boli cu msuri terapeutice sau profilactice speciale (SIDA, hepatite, rubeola, etc) - Elucidarea etiologiei virale a unor izbucniri epidemice (meningite, gastro-enterite, pneumonii, etc) - Supravegherea epidemiologic Prelevate: LCR, snge, exsudate, secreii nazale, rino-faringiene, mase fecale, urin, vezicule i ulceraii cutaneo-mucoase, bioptate, etc.

Eficacitatea diagnosticului este condiionat de: 1. Alegerea corect a prelevatelor, calitatea lor i transportarea n laborator 2. Examinarea precoce (la debutul bolii) 3. Transportarea rapid a probelor sau utilizarea mediului de transport 4. Respectarea regulilor de autoprotecie i de protecie a anturajului la recoltare, transportare i examinarea probelor

METODELE DE DIAGNOSTIC AL VIROZELOR

METODE DIRECTE - Examenul virusoscopic (evidenierea direct a virionului sau a componentelor lui n prelevate) - Examenul virusologic (izolarea i identificarea virusului) - Detectarea Ag virale n prelevat - Identificarea genomului viral (hibridizarea AN, amplificarea genic PCR) METODE INDIRECTE - Serodiagnosticul (creterea de cel puin 4 ori a titrului Ac n dinamic)

EXAMENUL VIRUSOSCOPIC
1.

2. 3.

4.

Microscopia optic depistarea n prelevat a incluziunilor virale specifice (corpusculii Guarnieri n variol, Babe-Negri n rabie) sau nespecifice, citoplasmatice sau nucleare. Se prepar frotiuri sau frotiuri-amprente colorate Romanovschi-Giemsa sau cu fluorocrom Microscopia electronic Imunoelectronomicroscopia mai sensibil, mai specific. Se examineaz complexele imune virus Ac Imunofluorescena (direct i indirect) utilizat n diagnosticul rapid al virozelor

EXAMENUL VIRUSOLOGIC
Prelucrarea prealabil a prelevatelor: - Omogenizarea (dup necesitate) - nlturarea elementelor celulare, inclusiv bacteriene (centrifugare, ultrafiltrare) - Tratarea cu antibiotice pentru prevenirea creterii bacteriilor i fungilor contaminani (penicilin - 500 UA/ml, streptomicin - 500 UA/ml, nistatin - 20 UA/ml)

Etapele diagnosticului virusologic 1. Izolarea virusului 2. Evidenierea (indicarea) reproducerii virale 3. Identificarea virusului Izolarea virusului se realizeaz prin inocularea cu material de examinat a animalelor de laborator, embrionilor de gin sau a culturilor de celule. Alegerea sistemului de cultivare se efectueaz n funcie de particularitile biologice ale agentului etiologic probabil i posibilitile laboratorului.

INDICAREA VIRUSULUI
n culturi de celule 1. ECP modificri degenerative i distrugere celular, rezultat al multiplicrii virale (rotunjire sau retracie celular, citoliz, apariia vacuolelor sau granulelor n citoplasm, picnoza nucleului, fuziunea membranelor, etc). ECP poate fi studiat la microscopul optic pe celule necolorate sau colorate cu hematoxilin-eozin, Giemsa, fluorocrom.

2. Incluziuni virale Reprezint acumulri paracristaline de virioni sau de componente virale n aria de replicare i asamblare a virusurilor (citoplasm, nucleu). Coloraia Giemsa, hem-eozin, fluorocrom. Localizarea, forma i afinitatea tinctorial (bazofile, acidofile) sunt particulariti diagnostice pentru unele viroze. 3. Interferena Ex.: V.rubeolic nu produce ECP, dar determin fenomenul de interferen. Pentru detectarea V.rubeolei se infecteaz CC cu virus citopatogen. Lipsa multiplicrii acestui virus confirm prezena V.rubeolei.

4. Hemadsorbia (RHAd) pentru virusuri cu HA Unele virusuri posed n componena capsidei, n special supercapsidei, glicoproteine care pot adera la suprafaa hematiilor HA. n timpul eliberrii din celul prin nmugurire a acestor virusuri, HA lor se afl deja nserate n MCP la nivelul mugurelui. Dac la aceasta etap n recipientul cu monostrat celular se adaug suspensie de hematii i se menine 15-20 min la t caracteristic fiecrui virus, la microscop pot fi urmrite hematiile fixate la suprafaa celulelor infectate (RHAd).

5. Hemaglutinarea (RHA) Pentru virusurile cu HA acumulate n mediul de ntreinere. n acest caz mediul de ntreinere aglutineaz eritrocitele unor specii de mamifere sau psri. 6. Formarea plajelor Reprezint focare de celule alterate n monostratul celular acoperit cu agar. Numrarea plajelor permite cuantificarea virusului infectant. 7. Proba culorii - Metabolismul celular neafectat virajul culorii mediului din rou n galben (pH acid) - Metabolismul celular inhibat culoarea mediului nu se modific

Indicarea virusului n oul embrionat de gin Oule se rcesc 18 ore la +4 grade C pentru o vazoconstricie maxim, apoi aseptic se taie coaja, se recolteaz lichidul alantoic sau amniotic, iar MCA i embrionul se ntroduc n cutii Petri sterile. Se observ: 1. Moartea embrionului 2. Apariia modificrilor (hemoragii, pustule) pe MCA 3. Acumularea de HA n lichide

 1. 2. -

Indicarea virusului pe animale de laborator Boala manifest a animalului, deces Urmrirea virusului n organele-int: Hemaglutinare Infeciozitatea omogenatelor Examene histopatologice (leziuni inflamatorii, degenerare, incluzii virale specifice: corp. Babe-Negri n neuronii infectai cu V.rabic, etc)

Identificarea virusurilor
Determinarea genului, speciei i serotipului de virus prin stabilirea structurii antigenice. Se efectueaz cu ajutorul serurilor imune specifice antivirale n diferite reacii serologice: - RN - RIHA/RIHAd - RFC - RIF - RIE (ELISA) - ARI, etc

DETECTAREA AG VIRALE N PRELEVATE Avantaje: simplitatea i rapiditatea examenului, nu necesit meninerea infeciozitii virusului Dezavantaje: sensibilitate direct proporional cu cantitatea virusului din prelevat Se utilizeaz Ac policlonali de origine uman (seruri imune) sau Ac monoclonali (de origine murin) Reacii: RHAI, RLA, RIF, RIE, Western-blot, ARI, etc.

IDENTIFICAREA GENOMULUI VIRAL (punerea n eviden a AN virali din prelevate n cursul infeciilor virale acute sau cronice i monitorizarea tratamentului). Pot fi examinate toate esuturile i lichidele biologice. Hibridizarea acizilor nucleici fr amplificare Hibridizarea dup amplificare (PCR i variantele ei)

DIAGNOSTICUL SEROLOGIC
Esena: depistarea Ac sintetizai de gazd n rspuns la o infecie viral. Dup o primo-infecie are loc inducerea formrii Ac, iar dup o reinfecie sau reactivare titrul Ac crete n dinamic. n serodiagnosticul virozelor este obligator de a examina 2 probe de ser de la bolnav : prima prelevat la debutul bolii, al doilea prelevat peste 15 zile.

Ac sunt depistai n ser, uneori n LCR, exsudate, lichid articular, etc. Pentru depistarea Ac se utilizeaz Ag virale de referin (suspensie viral inactivat, proteine virale native sau recombinante, oligopeptide sintetice). Tehnici utilizate: RFC, RIHA, RHAI, RN, RIFI, ARI, AIE (ELISA), etc. Semnificaie diagnostic prezint trecerea titrului de Ac de la 0 la pozitiv (seroconversie, primo-infecie) sau creterea titrului Ac de cel puin 4 ori n cursul infeciei. Ambele seruri vor fi testate n aceeai zi, prin tehnici identice i n acelai laborator.

RELAII VIRUS-CELULA GAZD

Infecie viral productiv, citocid Virusul este infecios iar celula permisiv. La nivelul ma/o corespunde infeciilor acute, aparente sau inaparente (grip, rujeol) Infecii virale persistente Celulele infectate supravieuiesc cu producerea permanent sau intermitent a virusului. 1. Infecii abortive cu virioni defectivi infecia nu se exprim, are loc transformarea celulelor prin proteine virale. Ele devin int pentru efectorii imunitii (macrofage, T-limfocite) n cursul unor infecii cronice (PESS post-rujeolic)

2. Infecii integrate (virusuri ADN sau copii ADN ale Retrovirusurilor) - Transformarea malign a celulei gazd - Manifestarea infeciei dup o perioad de incubaie ndelungat cu expresia integral a genomului viral (HIV-SIDA) infecii lente - Reactivri ocazionale, repetate ale infeciei cu exprimarea integral a informaiei genetice virale (infecia herpetic) infecii latente - Infecii cronice perioade de remisie i acutizare, virusul este prezent permanent, chiar n absena simptomelor (hepatita viral B)

TERAPIA ANTIVIRAL
Dificulti: - Toxicitate (imposibil de a distruge virusul fr afectarea celulei!) - Apariia mutantelor rezistente - Activitate asupra virusului n faz de multiplicare - Costul avansat al tratamentului Primele preparate antivirale anticanceroase. Preparatele antivirale contemporane: - Nu manifest activitate virucid, doar inhib reproducerea viral - Sunt dirijate contra etapelor reproducerii virale

Adeziunea virusului la celul Mecanismul blocarea receptorilor celulari (HIVoligopeptidul T, care reproduce gp120; CD4 solubili) Dificulti: afinitate redus, degradare rapid Fuziunea, penetrarea Reprezint peptide sintetice (pentafuzida-T20, T1249) blocheaz fuziunea virusului HIV cu membrana celular (dificultate injecii s/c zilnice) Decapsidarea Amantadina, rimantadina inhib decapsidarea virusului gripal A Utilizare limitat dezvoltarea rezistenei

Replicarea Mecanismul blocheaz activitatea enzimelor virale de reproducere (transcriptaze, polimeraze, replicaze) Avantaj nu influeneaz componentele celulei-gazd 1. Analogi nucleozidici Se disting de nucleozidele naturale prin modificarea componentului glucidic sau a bazei purinice sau pirimidinice. Blocheaz elongarea catenei de ADN n curs de formare. Antiherpetice (aciclovir, ganciclovir, penciclovir, idoxuridin) Anti-HIV (zidovudin, didanozin, zalcitabin, stavudin, lamivudin, etc) Anti-HBV (entecavir, LdT, LdC faz de cercetare)

2. Analogi nucleotidici - Cidofovir-CMV, HSV - adefovir- HIV, HBV, HSV, CMV - tenofovir HIV, HBV 3. Analog al pirofosfatului - Foscarnet HSV, CMV (HIV, HBV -?) 4. Inhibitori nenucleozidici ai RT HIV (nevirapin, delavirin, efavirenz)

Blocarea activitii polimerazelor virale se realizeaz prin: 1. Competiie cu substratul natural al enzimei 2. ngrmdirea steric a centrului activ al enzimei 3. Incorporarea n catena de ADN n curs de sintez 4. Blocarea procesului de elongare a catenei de ADN prin incapacitatea de a fixa un alt nucleozid pe analogul su artificial

Asamblarea, eliberarea - Inhibitori ai proteazei HIV (sanquinavir, ritonavir, indinavir, amprenavir, lopinavir, nelfinavir, etc) toxicitate, rezisten - Inhibitori ai neuraminidazei virusurilor gripale (zanamivir, oseltamivir). Activ contra gripei A i B (efect preventiv, curativ, rezisten rar)

INTERFERONII (IFN)
IFN ansamblu de proteine capabile s confere celulelor o stare de rezisten la o infecie viral. IFN tip 1 (clasic, antiviral): 1. IFN-alfa (leucocitar) 2. IFN-beta (fibroblastic) Inductori: virusuri, LPS, ARN bicatenar IFN-gama, tip 2, imun, produs de LT activate, NK. Manifest activitate imunomodulatoare

IFN acioneaz asupra ciclului de replicare viral prin intermediul celulei: interaciunea IFN-alfa cu receptorul su induce sau stimuleaz expresia unor gene celulare, rezultnd o activitate antiviral (blocarea translaiei ARNm viral, degradarea ARNm viral). Este posibil i blocarea asamblrii i nmuguririi virusului (HIV) IFN mresc expresia moleculelor clasa I a CMH, iar IFN-gama i a celor de clasa II IFN mresc activitatea intrinsec i extrinsec a macrofagelor i manifest activitate antiproliferativ IFN-gama activeaz celulele NK

Utilizarea terapeutic a IFNhepatite B i C cronice, infecii herpetice, sarcomul Kaposi, limfome, leucemii Alte citokine (TNF-a, IL-2, IL-4, IL-10, IL-12) sunt la etapa de testare in vitro.

TERAPIA CELULAR (CMV, EBV) Fondat pe administrarea CTL (limfocite Tc) autologe. - Prelevarea sngelui de la bolnav - Izolarea CTL specifice - Clonarea i proliferarea CTL in vitro - Reinjectarea la pacient VIITOR: fototerapia, imunizarea intracelular (introducerea unei gene ce codific un anticorp antiviral)