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UT 1.

Patrones para calibración y análisis


Ensayos físicos
2º LACC

UT 1. PATRONES PARA CALIBRACIÓN Y ANÁLISIS

Índice:
1. Necesidad de patrones en los laboratorios de análisis y ensayos
2. Comprobación de la exactitud de instrumentos
3. Los patrones en el análisis químico clásico: Volumetrías y Gravimetrías
4. Métodos de calibración
5. Validación de métodos analíticos
6. Materiales de referencia certificados (CRMs)
7. Cuestionario

1. Necesidad de patrones en los laboratorios de análisis y ensayos


Al realizar una medida en un análisis químico (como masa, concentración, volumen, etc)
rara vez se mide el contenido de forma directa. Las concentraciones químicas se
determinan por mediciones indirectas, que se basan en mediciones directas junto con
calibraciones. Calibración, en el contexto químico, significa comprobación de la relación
entre el contenido de la muestra y la respuesta del instrumento o método de ensayo.
Los patrones, sustancias patrón o estándar, son compuestos o materiales cuyo valor de
cierta propiedad se acepta que es exacto. Existen patrones químicos que son sustancias
puras, mezclas, soluciones, gases, o materiales como aleaciones, o sustancias biológicas que
se emplean para calibrar y validar toda la metodología de un análisis o parte de ella.
También hay patrones físicos que se emplean como referencia de las características de los
materiales como, elasticidad, color, viscosidad y también de las unidades fundamentales
de masa, tiempo, longitud y voltaje.
El análisis químico, tanto clásico como instrumental, se lleva a cabo con disoluciones
diluidas. Las sustancias patrón también deben diluirse, y las soluciones patrón o estandar
en realidad son las que intervienen en los procesos y reacciones químicas. En su
preparación, la concentración se trata de ajustar tan cuidadosamente, que se puede
aceptar que el error es despreciable.

2. Comprobación de la exactitud de instrumentos. Calibración


En el laboratorio, cada cierto tiempo es necesario chequear los instrumentos y los métodos
para constatar su precisión y exactitud, y es la forma de conseguir trazabilidad.
La exactitud es una medida de la proximidad del valor medido al valor verdadero y deriva
de los errores sistemáticos de las medidas, que son aquellos que afectan de forma
constante y previsible a todas las medidas y por ello puede ser detectado y corregido. La
calibración de instrumentos trata de evitar este tipo de errores o bien indicar qué
correcciones hay que hacer al valor de la medida y supone el uso de patrones.
La calibración de un instrumento significa chequear su respuesta frente a un patrón, con el
fin de obtener siempre la misma respuesta. Si la calibración revela que el equipo no se

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encuentra dentro de unos niveles de funcionamiento aceptables, entonces se tiene que


emprender alguna acción correctora.
Por ejemplo, si se usa un pHmetro, que no ha sido calibrado correctamente, se comete un
error sistemático. Supongamos que se cree que el pH del tampón usado para calibrar el
equipo es 7, pero en realidad es 7,08. Todas las lecturas siguientes serán 0,08 unidades de
pH erróneas por defecto. Si se lee un pH 5,60, el pH real de la muestra es 5,68. Este error
sistemático se podría descubrir usando un segundo tampón de pH conocido (patrón), para
comprobar el aparato.
Otro ejemplo sería una balanza que da un peso erróneo sistemáticamente. Puede calibrarse
usando como referencia una pesa patrón; o si la experiencia demuestra que siempre da las
pesadas con un error por exceso de 0,2 g, bastará con hacer una corrección en cada pesada
restando 0,2.
La frecuencia con que se debe realizar la calibración depende de:
a. Tipo de instrumento: cuanto más sofisticado sea más calibraciones requiere. Ejemplos
de equipos robustos son el pHmetro y la balanza.
b. Frecuencia de uso: si se utiliza muy de tiempo en tiempo debe calibrarse cada vez que
se usa y si se usa continuamente ya depende de la robustez del instrumento.
c. Ubicación e instalación: si el instrumento está sometido a vibraciones, humedad, polvo,
altas temperaturas, etc . requerirá mayor frecuencia de calibraciones.
d. Requerimientos de la metodología analítica: un equipo que se está usando en medios
agresivos, como pueden ser ácidos concentrados o disolventes orgánicos, necesitará una
calibración frecuente.

3. Los patrones en el análisis químico clásico: Volumetrías y Gravimetrías.


Los patrones utilizados como referencia en los métodos de análisis volumétrico y
gravimétrico pueden ser primarios o secundarios. La exactitud del método analítico
depende críticamente de estos.
Los patrones primarios son compuestos de elevada pureza y cuyo valor se acepta sin hacer
referencia a otro patrón. Se caracterizan por ser compuestos:
• De elevada pureza, del 99,9% o más.
• De gran estabilidad atmosférica
• Que en su molécula no contienen agua de hidratación para que la composición del
sólido no cambie con las variaciones en la humedad relativa.
• Baratos y se puedan conseguir con facilidad.
• De solubilidad razonable en el medio de titulación.
• Con una masa molar razonablemente grande para reducir al mínimo el error relativo
asociado a la operación de pesada.
Muy pocos reactivos cumplen con todos estos criterios, por esta razón, a veces es necesario
utilizar compuestos menos puros, o patrones secundarios, en lugar de uno primario; los
patrones secundarios son patrones cuya pureza o cualquier otra propiedad de interés, se
obtiene por comparación con un patrón primario.
La solución patrón ideal para un análisis volumétrico deberá:

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• Ser suficientemente estable para que solo sea necesario determinar una vez su
concentración.
• Reaccionar rápido con el analito para reducir al mínimo el tiempo requerido entre las
adiciones del reactivo.
• Reaccionar completamente con el analito para que se alcance satisfactoriamente el
punto final.
• Reaccionar en forma selectiva con el analito para que esta reacción pueda describirse
por una simple ecuación balanceada.
Las soluciones patrón pueden prepararse por disolución directa del patrón primario,
pesando muy cuidadosamente la cantidad exacta que se disuelve en el disolvente adecuado
y se lleva, exactamente, a un volumen final en un matraz aforado; o preparando una
disolución de un patrón secundario que se valora o contrasta su concentración con una
disolución de un patrón primario, esta se conoce como solución patrón secundaria.

4. Métodos de calibración.
Los métodos instrumentales de análisis se basan en la medida de la respuesta del aparato a
cantidades conocidas de analito (patrones), y basándose en ellas se puede interpretar la
respuesta a una muestra de contenido desconocido, de modo que permiten comprobar el
contenido de analito y asegurar la exactitud de la metodología.
A la aplicación de los patrones para relacionar la respuesta del aparato con la
concentración de analito se llama calibración.
Los métodos de calibración utilizados son: del patrón externo y de patrones agregados;
el método de los patrones agregados a su vez se dividen en dos categorías: de patrón
interno y de adición estandar, ambas se basan en añadir una cantidad conocida (spike, en
inglés) de un patrón a cada muestra que se analiza.
En el método del patrón externo se analizan los patrones y el problema por separado. Se
preparan una serie de patrones que contienen diferentes cantidades de analito junto con
una matriz (matriz es todo lo que hay en la muestra problema menos el analito) semejante
o idéntica a la de las muestras. Si el análisis es confiable y la muestra sencilla se puede
eliminar la matriz y puede ser suficiente con un patrón y un blanco (el blanco tiene la
misma composición que la muestra a excepción del analito).
Los métodos de patrones agregados se utilizan cuando la matriz de la muestra se
desconoce o es tan compleja que no es posible utilizar un patrón externo con confianza;
cuando la química de la preparación o del método de ensayo son complejas o muy
variables; y cuando el ensayo depende de condiciones instrumentales de alta precisión y
difíciles de controlar. Por ejemplo, en los análisis por cromatografía pequeñas variaciones
de caudales de gas o líquido podrían variar la respuesta del detector.
El método de la adición estandar consiste en realizar una medición inicial del problema sin
adición estándar y después agregar una cantidad de analito a cada muestra problema
repitiendo la medición tras cada adición estandar. Por lo general las adiciones y las
mediciones se realizan una o dos veces y la cantidad de analito presente originalmente en
la muestra se encuentra mediante extrapolación.
El método del patrón interno consiste en agregar una cantidad conocida de un
compuesto, diferente del analito, a cada réplica problema y al blanco. La señal del analito
se compara con la del patrón interno, y de ese modo se determina el analito presente en el
problema. El patrón agregado debe diferir lo suficiente del analito, desde el punto de vista

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químico, como para que no interfiera en el ensayo, y al mismo tiempo ser lo


suficientemente similar, de modo que su respuesta refleje la respuesta del analito y
permita compensar cualquier pérdida.
4.1. Aplicación de patrones externos a la calibración: curva de calibrado
El patrón externo se utiliza para calibrar métodos de ensayo cuando los componentes de la
matriz y los reactivos adicionados, no provocan interferencias con el analito. También
cuando el analista tiene suficiente control de las condiciones y puede mantener constantes
las contribuciones de las interferencias a la medición.
La calibración externa de la respuesta del instrumento se realiza con patrones que
contengan diferentes concentraciones de analito en soluciones con la matriz igual a la del
problema. En los patrones, es importante mantener constantes las concentraciones de
aquellas especies que contenga la matriz que ejerzan influencia en la medición, para que
solo se modifique la concentración de las especies analizadas.
Consiste en preparar varios patrones de concentración xi y medir la señal del instrumento,
yi, para cada patrón.
Señal del Y1 Y2 Y3 Y4
instrumento
Concentración X1 X2 X3 X4
Así se obtiene un conjunto de pares (yi , xi) cuya representación gráfica es a menudo una
línea recta ya que la relación entre la señal y la concentración suele ser lineal (y = mx + b,
donde m y b son constantes, m es la pendiente de la recta y b la ordenada en el origen), y
si no lo fuese suele ser posible encontrar condiciones experimentales (bajas
concentraciones) o hacer tratamientos matemáticos para lograrlo.
Los puntos experimentales obtenidos nunca se adaptan exactamente a una línea recta,
siempre hay algunos que quedan fuera debido a errores en la medida. Existen varios
métodos para averiguar la recta que mejor se ajusta al conjunto de puntos, que será
aquella que pase lo más cerca posible de todos los puntos dejando unos por arriba y otros
por abajo. El método de los mínimos cuadrados es el más empleado y se obtiene una recta
de regresión de y sobre c, con su coeficiente de correlación o grado de proximidad de los
puntos a esa recta y cuyo valor es 1 cuando todos los puntos están exactamente dentro de
la recta.

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4.1.1. Cálculo de concentraciones en la curva de calibrado


La ecuación y = mx + b corresponde a la curva de calibrado y permite determinar la
concentración de un analito en una muestra, basta con sustituir en la ecuación calculada el
valor de la señal medida (yi) y despejar xi.
Esto puede hacerse de forma aproximada por interpolación gráfica: se trazan una paralela
al eje X que pase por el punto y de la señal de la muestra y una paralela al eje Y que pase
por el punto de corte de la primera recta trazada con la recta de ajuste. La intersección de
esta segunda recta con el eje X da la concentración.
La gran ventaja de la curva de calibración es que proporciona una relación empírica entre la
señal y la concentración que se adapta a cada sistema. Es decir, la señal analítica se ve
influida por muy diversos factores como la naturaleza del disolvente y sus impurezas, el pH,
la presión, la temperatura, etc; algunos métodos incluso requieren el cálculo previo de una
constante que es característica de cada aparato, mientras la curva de calibrado da cuenta
implícitamente de todos estos factores específicos del experimento y por ello permite
minimizar muchos errores.
Para construir la curva de calibrado se adopta el siguiente procedimiento:
Paso 1. Preparar muestras conocidas de analito que cubran un intervalo adecuado de
concentraciones y medir a respuesta del procedimiento analítico a estos patrones. Este
procedimiento genera los datos de la mitad izquierda de la tabla.
Paso 2. Restar la absorbancia media de los tres blancos (0,099) de la absorbancia medida
para obtener la absorbancia corregida. El blanco mide la respuesta del procedimiento
cuando no hay proteína presente.
Paso 3. Trazar un gráfico con las absorbancias corregidas frente a la cantidad de proteína
analizada. Hallar la recta que mejor se ajusta a los datos situados dentro del tramo lineal, es
decir hasta el punto de 20 µg de proteína inclusive, descartando los puntos incoherentes
como el de 0,392 para la muestra de 15 µg. Hallar la ecuación de la recta de regresión y su
coeficiente de correlación.
Paso 4. Preparar la muestra desconocida y un blanco, realizar las medidas. Restar la
absorbancia del nuevo blanco de la absorbancia obtenida para obtener la absorbancia
corregida e interpolar en la curva de calibrado.
Ejemplo. En un análisis de proteínas mediante la formación de un producto coloreado, por
espectrofotometría que da una señal de absorción de la luz que atraviesa la muestra
proporcional a la cantidad de proteína, se obtuvieron los siguientes registros:

Cantidad Absorbancia de replicas Absorbancia corregida


de independientes
proteína
R1 R2 R3 R1 R2 R3
(mg)

0 0.099 0.099 0.100 0.000 0.000 0.000


5.0 0.185 0.187 0.188 0.085 0.087 0.088
10.0 0.282 0.272 0.272 0.182 0.172 0.172
15.0 0.345 0.347 (0.392) 0.245 0.247 _
20.0 0.425 0.425 0.430 0.325 0.325 0.330
25.0 0.483 0.488 0.496 0.383 0.388 0.396

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4.2. Adición estándar.


Este método de calibrado es especialmente apropiada cuando la composición de la
muestra desconocida o compleja y afecta a la señal analítica.
Por ejemplo, en análisis por emisión atómica se aspira una disolución de analito en una
llama muy caliente que lo descompone en átomos energetizados. Los átomos emiten luz a
frecuencias características de cada elemento. Ciertos componentes de la matriz pueden
reaccionar con los átomos del analito y convertirlos en moléculas que no emiten luz a la
longitud de onda de trabajo. La composición de la matriz afecta por lo tanto a la señal
analítica. Puede ser que la matriz contenga elementos desconocidos que sea imposible
incluir en las disoluciones patrón al construir la curva de calibrado. Si se añade un pequeño
volumen de disolución concentrada de patrón a una muestra desconocida, no cambia
mucho la concentración de la matriz, pero el efecto que la matriz ejerce sobre el analito del
patrón será el mismo que el de la muestra problema. La relación entre la respuesta
obtenida en la muestra con adición estándar con la concentración de analito en el patrón
nos servirá para determinar la concentración de la muestra problema.

Expresando la concentración diluida del analito (disolución final) en términos de la


concentración inicial del analito, se puede obtener la concentración de la muestra
problema.
Ejemplo. El contenido en Na+ de un suero dio una señal de 4,27 mV en un análisis por
emisión atómica. A continuación se añadieron 5,00 ml de NaCl 2,08 M a 95,0 ml de suero.
Este suero enriquecido dio una señal de 7,98 mV. Hallar la concentración original de Na+ en
el suero.
SOLUCIÓN: los moles de Na Cl añadidos son (0.0500 l) x (2.08 M) = 0.014 mol, y la
concentración final de NaCl añadido es 0.014 mol/0.100 l = 0.104 M. Aplicando la ecuación
anterior:

=  = 0.113 M
A menudo debemos calcular la concentración de una muestra, después de diluirla desde
un volumen inicial Vi a Vf. En el ejemplo anterior la disolución de Na Cl 2.08 M se diluyó
desde un Vi =5 a un Vf = 5.00 + 95.0 = 100.0 ml. La concentración del NaCl se diluye, pues,
de 2.08 M a (Vi/Vf) x (2.08 M) = 0.104. La cantidad (Vi/Vf) se llama factor de dilución y se
suelen usar para facilitar los cálculos.
4.2.1. Procedimiento gráfico para la adición estándar
Este método se ilustra en la figura siguiente (fig. 4.2.1.):

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Se pipetea en cada matraz volumétrico volúmenes iguales de la muestra desconocida. A


continuación se añaden volúmenes crecientes de patrón a cada matraz. Finalmente, se
diluye cada matraz hasta el enrase. Cada frasco contiene, pues, la misma concentración de
muestra desconocida y diferentes concentraciones de patrón.
El siguiente paso es analizar cada disolución y construir el gráfico. El eje x representa la
concentración de patrón añadido después de haber sido mezclado con la muestra. La abcisa
en al origen de la recta extrapolada con signo cambiado es la concentración desconocida
después de diluir la muestra al volumen final. En nuestro gráfico este valor es de 0.042 M.,
si la muestra original se diluyó en un factor de 10.0 (de 5.00 a 50.00 ml) durante la adición
de estándar, la muestra original tenía una concentración de analito de (0.042 M) x (10.0 ) =
0,42. El intervalo más útil de adiciones de patrón debe aumentar la señal analítica entre 1,5
y 3 veces el valor original.

4.3. Patrón interno

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Este método es especialmente útil cuando la cantidad de muestra analizada o la respuesta


del instrumento varía algo de una experiencia a otra, por razones que son difíciles de
controlar y la curva de calibrado no se puede utilizar ya que esta solo es válida cuando las
condiciones permanecen constantes durante todo el ensayo.
Los patrones internos son muy utilizados en cromatografía, porque la pequeña cantidad de
muestra introducida en el cromatógrafo no es muy reproducible. También son útiles
cuando se pueden dar pérdidas de muestra durante los pasos de preparación de la
muestra para el análisis. Si se añade una cantidad conocida de patrón a la muestra
desconocida antes de cualquier tratamiento, la relación de patrón a analito se mantiene
constante, porque se pierde la misma fracción de ambos en cualquier operación.
Para usar un patrón interno, se prepara primero una mezcla conocida de patrón y analito,
para medir la respuesta relativa del detector a las dos especies. En el cromatograma de la
figura, el área bajo cada uno de los picos es proporcional a la concentración de las especies
inyectadas en la columna.

Sin embargo, el detector de ordinario da una respuesta diferente frente a cada


componente. Por ejemplo, si tanto el analito (X) como el patrón interno (S) tienen
concentraciones de 10.0 mM, el área bajo el pico del analito puede ser 2.30 veces mayor
que el área bajo el pico del patrón. En este caso se dice que el factor respuesta, F, de X es
2.30 veces mayor que el de S. El factor respuesta se calcula:

=F
La concentración de analíto y patrón a que se refiere la ecuación, es después de mezclados.
Para calcular la concentración inicial se aplica el factor de dilución.

Ejemplo.

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5. Validación de métodos analíticos


La validación consiste en comprobar si una metodología analítica específica resulta
satisfactoria para ser empleada por un analista y también por los diversos analistas de
varios laboratorios. Esto supone que la metodología analítica seguida es exacta, específica,
reproducible y robusta, dentro del intervalo específico en que el analito será analizado.
Es necesario validar los métodos analíticos porque cualquier operación de un
procedimiento de medida supone introducir errores aleatorios y puede que también
sistemáticos, debido a defectos de la instrumentación, defectos en el operador y defectos
en el método de análisis. De hecho, validar un método supone investigar las posibles
fuentes de error de cada una de las etapas del procedimiento.
La calibración que es el origen de un gran número de errores. Algunos ejemplos son:
equivocaciones en los cálculos de las concentraciones, utilización de patrones que no lo son
por no conocerse su pureza y estequiometría, empleo de patrones deteriorados debido a

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una mala conservación, no realizar la medida de un “blanco de reactivos” para comprobar


el nivel de contaminación procedente de reactivos, medio ambiente y material utilizado,
desprecio del efecto matriz
La validación de un método analítico alcanza tanto a la instrumentación utilizada como el
método de análisis en toda su extensión, es decir, desde la toma de muestra hasta la etapa
de detección final, sin olvidar comprobar su idoneidad o adecuación para el fin previsto
(por ejemplo, un método poco preciso puede ser válido cuando el problema analítico no
requiera gran precisión, como ocurre en muchos análisis clínicos).
La validación comienza por la instrumentación, primero se comprueba el estado en que se
encuentra la instrumentación a utilizar. La regulación estipula cuatro requerimientos para
la validación de un instrumento:
a. Asegurar la idoneidad del instrumento para la tarea encomendada: se realiza por
lectura cuidadosa de las especificaciones del mismo.
b. Demostrar que cumple las especificaciones del fabricante: comprobar que responde
adecuadamente a las prestaciones exigidas.
c. Conformidad demostrable con los patrones establecidos: calibración.
d. Documentación que evidencie su operatividad y la obtención de datos fiables:
comprobar que el instrumento está operativo cuando trabaja bajo las condiciones
específicas exigidas y sigue funcionando como originalmente. Siempre que tenga lugar
una incidencia, como por ejemplo, el cambio de una lámpara en un espectrofotómetro,
debe registrarse y comprobar el funcionamiento del equipo.
La segunda fase consiste en validar el método analítico, mediante la evaluación de seis
parámetros incluidos en la norma ISO 3534-1:
1. Precisión
2. Exactitud
3. Límite de detección y de determinación
4. Selectividad
5. Intervalo de linealidad
6. Robustez
En algunas áreas es importante incluir otra serie de parámetros, tales como la
recuperación, estabilidad del analito, costo, seguridad, etc.
En el caso de utilizar un método estándar u oficial, el proceso de validaciones rápido ya que
bastará con calcular su precisión analizando varias replicas y comprobar su exactitud por
medida de un patrón. Si se desea validar un método propio se lleva a cabo la validación
completa evaluando todos los parámetros incluidos en la norma y estudiando todos los
pormenores de cada etapa.
La exactitud resultado debe demostrarse utilizando alguna de las siguientes técnicas:
análisis de diversas réplicas, estudios de recuperación, comparación con métodos
alternativos, comparación con otros laboratorios y uso de materiales de referencia
certificados.
A. Análisis de diversas réplicas: lo más sencillo es realizar análisis repetidos a partir de
muestras diferentes (no sobre diferentes alícuotas de la disolución final). La obtención
de resultados repetidos garantiza que no existe error de muestreo, probablemente no
haya errores personales, pero no garantiza que no haya errores sistemáticos, como
pérdida de analito en la etapa de mineralización. El número de réplicas suele ser de 10.

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B. Estudios de recuperación: consisten en añadir a la muestra el analito en concentración


perfectamente conocida y similar a la que se presupone encontrar en el problema y
aplicar el procedimiento completo de análisis a las muestras sin adición de analito y a
las muestras adicionadas. A partir del resultado se evalúa el porcentaje recuperado del
analito añadido. Una elevada recuperación, alrededor del 100% implica una correcta
aplicación del método y ausencia de errores sistemáticos para el analito adicionado.
Sin embargo la respuesta no siempre es satisfactoria para el analito presente en la
muestra sin adicionar porque una recuperación alta y reproducible a veces no
garantiza un resultado exacto debido a que la adición del analito a la muestra no
reproduce la situación real del analito en la misma y se pueden cometer errores como
por ejemplo, de adición de una forma distinta de la forma química del analito original
por desconocimiento de esta.
C. Comparación con métodos alternativos: supone la comparación estadística, por
ejemplo de análisis de la varianza, entre el resultado obtenido mediante el método
que se pretende validar y el obtenido mediante otro método alternativo. Cuanto más
difieran los fundamentos y las etapas de preparación de ambos métodos, tanto más
fiable será el proceso de comparación.
D. Comparación con otros laboratorios: consiste en realizar el estudio entre diversos
laboratorios en el que cada laboratorio utiliza el mismo método analítico sobre las
mismas muestras. Este procedimiento es caro, complicado y consume mucho tiempo
por lo que no se suele usar para validar un método.
Los ejercicios inter-laboratorios de utilizan para el autocontrol de la calidad del
laboratorio, para la elaboración de un material de referencia, etc. En general sirven
para mejorar la calidad de trabajo de cada laboratorio
E. Uso de materiales de referencia certificados: consiste en aplicar todas las etapas del
método propuesto al material de referencia y comparar estadísticamente el resultado
obtenido con el valor de referencia. El material de referencia debe tener una matriz
similar a la de la muestra a analizar y la concentración del analito debe estar lo más
cercana posible a la presente en la muestra.
La robustez del método es otro de los parámetros que debe ser evaluado para validar un
método, para ello se modifican las variables críticas del método: pH, fuerza iónica, tipo de
columnas cromatográficas, pureza de los reactivos, etc. Cuanto más robusto sea el método,
menos diferirán los resultados estadísticamente.
Un método normalizado debe validarse cuando se aplica por primera vez en el laboratorio,
cuando se aplica a muestras o analitos diferentes para los que ha sido establecido, si se
modifica alguna etapa o si se detecta alguna situación fuera de control. Un método propio,
que se ha desarrollado en el laboratorio completa o parcialmente siempre debe validarse.
Todos los métodos de análisis, aunque validados deben someterse cada cierto tiempo a
sistemas de control que permitan detectar la evolución de la propiedad medida con el
tiempo. De esta forma, se podrá detectar rápidamente la presencia de errores y aplicar las
medidas correctoras adecuadas.

6. Materiales de referencia certificados (CRMs)


Son patrones que tienen certificados uno o varios de sus valores de una o más de sus
propiedades por procedimientos técnicamente válidos llevados a cabo por un organismo
competente. No se trata únicamente de un certificado, sino que este certificado garantiza

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que un CRM sea, desde el punto de vista práctico, la mejor referencia posible en la
verificación de la trazabilidad de un método analítico.
Por lo tanto, un CRM es un material, similar a las muestra reales que estamos analizando en
nuestro laboratorio, y que un organismo competente nos certifica y garantiza el valor de la
propiedad que nos interesa (por ejemplo a concentración de un analito).
6.1. Propiedades de los CRMs
Para que un material pueda ser considerado como CRM debe cumplir una serie de
requisitos:
A. Trazabilidad: el valor de la propiedad certificada se ha obtenido utilizando diversos
métodos analíticos cuyos principios de medida sean completamente diferentes y
haciendo un ejercicio de inter-laboratorios.
B. Homogeneidad: es indispensable y significa que debe presentar el mismo valor de la
propiedad certificada dentro de la misma unidad y en todas las unidades del CRM.
Puede ser homogéneo respecto a la propiedad de interés aunque no lo sea respecto a
otras, siempre que no influya en la primera.
C. Estabilidad: el material debe ser estable en las condiciones de envío y se debe conocer
durante cuanto tiempo permanece estable el CRM desde su recepción y desde que se
abre el recipiente. La estabilidad debe referirse tanto a las propiedades certificadas
como a la matriz. Si los CRMs se ven afectados por factores como la luz, la tª o la
exposición al oxigeno de la atmósfera, el fabricante debe indicar las condiciones de
transporte, manejo y almacenamiento recomendadas.
D. Similitud con muestras reales: tanto la matriz como el valor de la propiedad a medir
deben ser lo mas parecido posible a las muestras reales que serán analizadas con ese
método analítico. Por ejemplo: si mi laboratorio analiza plomo a nivel de µg/L en agua
del rio Segura, el mejor CRM es el agua del rio Segura. Como, probablemente, no
exista como tal hemos de utilizar uno parecido que puede ser el CRM 1640-NIST, en el
cual se encuentra certificado el plomo en aguas naturales recogidas en Clear Creek
(Colorado, EEUU).
E. Incertidumbre: los valores certificados de la propiedad deseada deben ir acompañados
por sus valores de incertidumbre. Esto informa de la calidad del CRM y es importante
que se adecue a cada necesidad.
Los CRMs no siempre están disponibles, se calcula que solo hay entre un 5 y un 10 % de
CRMs para los análisis que actualmente se hacen en todo el mundo, además son muy
caros, por ejemplo el CRM 1515-NIST, elementos traza en 50 gramos de hojas de manzana
cuesta 342 dólares. En la siguiente tabla aparecen una serie de CRMs.

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⋅ SRMs son materiales bien caracterizados y certificados que se producen en suficiente cantidad,
es la caracterización que usa el National Institute of Standards and Technology (NIST) para un
CRM.
⋅ E significa patrón de contenido elemental y M patrón de ajuste de matriz
Los organismos productores de CRMs son principalmente el NIST de
EEUU(http://www.nist.gov) y en Europa el IRMM (Institute for Reference Materials and
Measurments, http://www.irmm.jrc.be). Otros productores de reconocido prestigio son la
IAEA (International Atomic Energy Agency, http://iaea.org ) , el NCR (National Research
Council de Canadá, http://www.nrc-cnrc.gc.ca y el LGC (Laboratory of the Government
Chemist del Reino Unido, http://www.lgc.co.uk)

7. Cuestionario
1. Un procedimiento normal para determinación de proteínas es el ensayo de porción de
colorante de Bradford. Según ese método, la proteína se trata con un colorante que, al
unirse a ella cambia su color de pardo a azul. La intensidad del color azul (medido por
absorción de la luz a una longitud de onda de 595 nm) es proporcional a la cantidad de
proteína presente.
Proteína (µg) 0.00 9.36 18.72 28.08 37,44
Absorbancia a 0.466 0.676 0.883 1.086 1.280
595 nm

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a) Determinar mediante la hoja de cálculo la ecuación de la recta determinada por esos


puntos con un número razonable de cifras significativas.
b) Una muestra problema de proteína dio una absorbancia de 0.973. calcular el número
de microgramos de proteína en el problema.
2. Considerar la curva de calibrado lineal de la figura 4.1.1. y suponer que se miden los
siguientes valores de absorbancia: 0,265; 0.269; 0.272; 0.258 para cuatro muestras
idénticas del problema, y 0.099; 0.091; 0.101; 0.097 para cuatro blancos.
a) Hallar la media y la desviación estándar de la absorbancia del problema y del blanco.
b) Hallar la absorbancia corregida (y su incertidumbre) restando la media de los blancos
de la absorbancia media del problema.
c) Calcular la concentración de la muestra en mg
3. Una muestra desconocida de Cu+2 dio una absorbancia de 0.262 en un análisis por
absorción atómica. Después se mezclaron 1.00 ml de una disolución que contenía 100.0
ppm ( microgramos / l) de Cu+2 con 95.0 ml de problema, diluyendose la muestra a 100.0
ml en un matraz volumétrico. La absorbancia de la nueva disolución fue 0.500.
a) Escribir la expresión de cálculo para la concentración final de Cu+2 después de la
dilución. Las unidades de concentración son ppm.
b) Calcular la concentración de Cu+2 en el problema.
4. Gráfico de adición estandar. El ensayo de una sustancia X se basa en su capacidad para
catalizar una reacción que produce la sustancia Y radiactiva. La cantidad de Y producida en
un tiempo prefijado es proporcional a la concentración de X en La disolución. Un problema
que contiene X enana matriz compleja desconocida, y con un volumen inicial de 50.0 ml, se
trató con incrementos de un patrón de X 0.531 M, y se obtuvieron los siguientes
resultados:
Volumen 0 100.0 200.0 300.0 400.0
añadido de X
(µl)
Cuentas/minuto 1084 1844 2473 3266 4010
de Y radiactivo
Preparar un gráfico como el de la figura 4.2.1. y hallar la concentración de X en el
problema original.
5. Patrón interno. El cloroformo se usa como patrón interno en la determinación del pesticida
DDT en un análisis polarográfico, mediante el cual ambos se reducen en la superficie de un
electrodo. Una mezcla que contiene cloroformo 0.500 mM y DDT 0.800 mM dio una señal
de 15,3 µA para el cloroformo y 10.1 µA para el DDT. Se introdujeron 10 ml de una
disolución problema, que contenía DDT, en un matraz aforado de 100 ml, se añadieron
10,2 µl de cloroformo (PM=119,39; densidad=1,494 g/ml), y la mezcla se diluyó hasta el
enrase con un disolvente adecuado. Las señales polarográficas observadas para el
cloroformo y el DDT fueron 29,4 y 8,7 µA, respectivamente. Hallar la concentración de DDT
en el problema.

REFERENCIAS: Análisis químico cuantitativo (D.C. HARRIS, Ed. Reverte); Análisis Instrumental
(SKOOG/LEARY, Ed. McGraw Hill); Química analítica contemporanea ( Rubinson, Ed. Pearson
Educación), y otros.

Mª José Fernández Simarro 16