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UNIVERSIDAD NACIONAL AUTNOMA DEMXICO FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES ZARAGOZA

Gua para la preparacin y uso de medios de Cultivo en placa para el Laboratorio de Microbiologa I.

TESIS QUE PARA OBTENER EL TTULO DE: QUMICO FARMACUTICO BILOGO

PRESENTA MARTHA GARCA LPEZ

DIRECTOR: ENRIQUE ESCALERA ZIGA

2011

Es bueno dar gracias a Jehov Salmos 92:1 a

Los momentos ms difciles, a tu lado son y sern los ms bellos de mi vida. Gracias por ser mi mejor amigo y mi gran compaero en la vida. Beny Mi vida es hermosa cuando te veo sonrer. Jael La ternura de tus manos son la fuerza de mi vida. Dany La fortaleza y el aguante son tu gran escuela. Gracias por ser mi refugio en todo momento. A mi madre En lo bueno y en lo malo, en lo dulce y en lo amargo, siempre unidos siempre a mano. Daniel El trabajo y la honestidad tu forma de vida, Gracias mi viejo. A mi padre

AGRADECIMIENTOS
Mi agradecimiento a cuantas personas han hecho posible la realizacin del presente trabajo, especialmente al Q.F.B. Enrique Escalera Ziga por su gran apoyo, confianza, as como todo el tiempo que me dedic y a sus valiosas recomendaciones para mi trabajo. Mi gran admiracin a su calidad humana y perseverancia. Universidad Nacional Autnoma de Mxico No solo por los conocimientos brindados, sino por los valores adquiridos y las experiencias vividas en esta gran institucin. Facultad de Estudios Superiores Zaragoza Educar no es dar carrera para vivir, sino templar el alma para las dificultades de la vida." Pitagoras. Mtra. Dora A. Prez Gonzlez por sus amables y valiosas sugerencias.

Q.F.B. Carina Gutirrez Iglesias, Q.F.B. Ma. De Las Mercedez Zamudio Durn y Q.F.B. Gabriel A. Romero Daz.

Y a todos mis profesores que me brindaron su cario y confianza durante toda mi formacin.

Tabla de contenido
INTRODUCCIN.....................................................................................................................4 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA .................................................................................5 OBJETIVOS ..............................................................................................................................6 FUNDAMENTACIN TERICA ...........................................................................................7 Captulo I. Medios de cultivo .....................................................................................................7 1.1 Generalidades ...................................................................................................................7 1.2 Nutricin...........................................................................................................................8 1.3 Sustancias qumicas y compuestos usados en la formulacin de medios.......................10 1.4 Clasificacin de medios de cultivo.................................................................................17 Captulo II. Aislamiento y medios especiales ..........................................................................20 2.1 Aislamiento de microorganismos en cultivo puro..........................................................20 2.2 Medios empleados para aislamiento de bacterias Gramnegativas..................................23 Agar MacConkey..............................................................................................................23 Agar EMB ........................................................................................................................26 Agar Salmonella y Shigella ..............................................................................................30 Agar Verde Brillante ........................................................................................................33 2.3 Medios empleados para aislamiento de bacterias Grampositivas ..................................36 Agar para Estafilococos No.110.......................................................................................36 Agar Sal Manitol ..............................................................................................................39 2.4 Medio de apoyo ..............................................................................................................42 Agar Nutritivo ..................................................................................................................42 2.5 Medios de enriquecimiento y selectivos.........................................................................44 Agar Base Sangre ............................................................................................................44 Agar Chocolate .................................................................................................................50 Agar Mueller Hinton ........................................................................................................54 Agar Leche .......................................................................................................................59 Agar Tioglicolato..............................................................................................................62 2.6 Medios cromognicos.....................................................................................................64 Captulo III. Preparacin y control de calidad..........................................................................66 3.1 Preparacin de medios y control de calidad ...................................................................66 3.2 Almacenamiento de medios de cultivo...........................................................................72 Anexo 1 ....................................................................................................................................73 Rutas Metablicas ..............................................................................................................73 Anexo 2 ....................................................................................................................................80 Normas Oficiales Mexicanas................................................................................................80 Anexo 3 ....................................................................................................................................97 Escala de MacFarland...........................................................................................................97 Anexo 4 ....................................................................................................................................99 Esterilizacin por autoclave..................................................................................................99 CONCLUSIONES .................................................................................................................103 REFERENCIAS ....................................................................................................................104

INTRODUCCIN
Sobre la base de su etimologa, la Microbiologa podra definirse como la ciencia que estudia a los seres vivos muy pequeos, concretamente a aquellos cuyo tamao se encuentra por debajo del poder resolutivo del ojo humano. Los inicios de la Microbiologa se remontan a pocas muy antiguas, es hasta el siglo XVII con la invencin del microscopio cuando esta ciencia comienza a desarrollarse, La implementacin de nuevos instrumentos y tcnicas permite que hacia finales del siglo XIX se le considere como una ciencia especializada. La Microbiologa abarca una enorme heterogeneidad de tipos estructurales, funcionales y taxonmicos, por lo que su estudio es extenso, aunque con una gran coherencia interna. As pues esta disciplina estudia a los microorganismos como seres de tamao microscpico dotados de individualidad, con una organizacin biolgica sencilla, que necesitan para su estudio de una metodologa propia y adecuada a sus necesidades. La necesidad de estudiar a estos microorganismos obliga al desarrollo de cultivos nutritivos donde se aslen y den paso a una adecuada identificacin, la cual permite al microbilogo realizar un informe al personal especializado para tomar acciones en contra o a favor del crecimiento de las bacterias. La implementacin de los cultivos en placa, ha posibilitado lo sealado anteriormente. El presente trabajo plasma los conceptos sobre el desarrollo, aislamiento e identificacin de algunas de las bacterias utilizadas en el laboratorio de Microbiologa General I, as como la tcnica de preparacin y el control de calidad de los medios de cultivo en placa.

PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA


El mdulo de Microbiologa General I es una incursin en los conocimientos bsicos que preparan al alumno para la amplia gama de aplicaciones de sta rea en el mundo laboral. Especficamente la prctica sobre preparacin de medios de cultivo es para ellos el primer contacto con la seleccin, preparacin, uso e interpretacin de los medios de cultivo, a fin de realizar una correcta identificacin de los microorganismos estudiados. Si bien el mdulo de Microbiologa General I cuenta con un manual que apoya al alumno con el propsito antes sealado es necesario realizar un documento que tenga la finalidad de dar una informacin ms detallada de los fundamentos tericos, la preparacin, aplicaciones e interpretacin de los medios de cultivo, as como las especificaciones que estipula la Secretara de Salud en la Norma Oficial Mexicana, para este rubro. Por lo tanto este trabajo tiene como propsito presentar dicha informacin de la forma ms concisa posible para que el alumno la emplee como una gua para la preparacin e interpretacin de resultados.

OBJETIVOS

Elaborar un manual para el rea de Microbiologa General I, el cual permita al alumno: 1. Conocer los medios de cultivo empleados comnmente para el aislamiento de las bacterias grampositivas y gramnegativas estudiadas en el mdulo. 2. Familiarizarse con su clasificacin, fundamentos, principios y usos. 3. Conocer las recomendaciones y control de calidad para la preparacin y conservacin de los medios de cultivo en placa.

FUNDAMENTACIN TERICA Captulo I. Medios de cultivo 1.1 Generalidades


La Microbiologa es la ciencia que estudia a los microorganismos, sta comienza su desarrollo en el siglo XVII con la invencin del microscopio por Leewenhoek, su avance paulatino a lo largo de los siguientes siglos permite que otras ciencias ayuden a conformar los conocimientos sobre las caractersticas de tipo bioqumico, estructural, fisiolgico, taxonmico, gentico, etc. de los microorganismos que estn estrechamente relacionados con los seres humanos, los cuales pueden traer beneficios o problemas que influyen directamente con su entorno, social, econmico y de salud, por mencionar algunos. Por lo cual se han desarrollado tcnicas y metodologas experimentales, del manejo y control de los microorganismos, as como de aislamientos e identificaciones de agentes patgenos que causan en el hombre mltiples enfermedades, ya sea por colonizacin en el cuerpo humano o por contaminacin de vehculos como alimentos de origen animal o vegetal. As como el control a nivel industrial de productos de consumo humano. Fue el microbilogo Robert Koch (1843-1910) quien realiz aportaciones para el aislamiento de cultivos puros de microorganismos en placas de gelatina slida (base del mtodo actual), otros grandes investigadores a principio del siglo XX desarrollaron los medios de cultivo selectivos y especficos, que hoy da la Microbiologa mdica, alimenticia e industrial emplean para el aislamiento de microorganismos patgenos que desean identificar (1). Existen datos que sealan a Fannie Hesse, como la mujer de un colaborador de Koch de nombre Walter Hesse quien hacia finales del siglo XIX sugiri este medio para el cultivo de bacterias; ella utilizaba un polvo de algas que empleaba para espesar las mermeladas, tcnica que aprendi de sus amigos holandeses de Batavia, la cual result decisiva para obtener cultivos puros y que permiti un rpido progreso en el campo de la Microbiologa (2). El trabajo de Koch consisti en apartarse de los cultivos lquidos, con sus meticulosas diluciones y frecuente contaminacin, y adaptar una

simple pero poderosa tcnica que usaba un medio slido. Al agregar gelatina, y posteriormente agar, a su caldo de extracto de carne cre la placa rayada. Ms tarde demostr que al mezclar de forma cuidadosa material sospechoso dentro del medio fundido y verterlo en una placa se produca una valoracin cuantitativa de los nmeros bacterianos, una tcnica utilizada, en la forma de placa rayada. Richard Julius Petri uno de los asistentes de Koch, reemplaz la placa de vidrio de Koch cubierta con una campana, por la placa de Petri. Este diseo permaneci sin cambio por ms de 100 aos. Koch fue consciente de que un medio universal para bacterias patgenas era imposible. Mostr tambin que Mycobacterium tuberculosis no poda crecer sobre el medio de agar de infusin de carne, para ste microorganismo utiliz suero coagulado, huevo o papa rebanada. La adicin ms importante al caldo de infusin de carne de Koch fue la peptona, un digerido pptico de protena que sugiri Loeffler(3). ste ltimo tambin incorpor 0.5% de peso/volumen de cloruro de sodio y su medio nutritivo, sigue siendo hasta la fecha uno de los medios de cultivo complejos e indefinidos para microorganismos quimiohetertrofos (aquellos que requieren utilizar compuestos de carbn orgnico, en oposicin a las bacterias auttrofas, las cuales no requieren nutrientes orgnicos para crecer).

1.2 Nutricin
Se llama cultivo al proceso de multiplicar microorganismos mediante las condiciones ambientales adecuadas. Los microorganismos en crecimiento realizan copias de s mismos y requieren los elementos que se encuentran en su composicin qumica, los nutrientes deben proporcionar estos elementos de manera metablicamente accesible. Adems, dichos microorganismos requieren energa metablica para sintetizar macromolculas y conservar los gradientes qumicos esenciales a travs de sus membranas. Los factores que se deben controlar durante el crecimiento son nutrimentos, pH, temperatura, aireacin, concentracin de sales y potencial inico del medio. Requerimientos para el crecimiento. La mayor parte del peso seco de los microorganismos consiste en materia orgnica que contiene carbono, hidrgeno, nitrgeno, oxgeno, fsforo y azufre. Adems, se requieren iones inorgnicos como potasio, sodio, hierro, magnesio, calcio y cloro para facilitar la catlisis enzimtica y conservar los gradientes qumicos a travs de la membrana celular.
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Para que un microorganismo crezca, se requieren todos los elementos contenidos en su materia orgnica y el complemento total de iones necesarios para la produccin de energa y la catlisis. Adems debe haber una fuente de energa que establezca la fuerza motriz de los protones y que permita la sntesis macromolecular. Los microorganismos varan ampliamente en cuanto a sus demandas nutricionales y sus fuentes de energa metablica. Los tres mecanismos principales para generar energa metablica son fermentacin1, respiracin y fotosntesis. Para poder crecer, el microorganismo debe utilizar por lo menos uno de estos mecanismos.
Nutrientes en el medio de cultivo

Los nutrientes en el medio de cultivo deben contener todos los elementos necesarios para la sntesis biolgica de nuevos microorganismos. En la siguiente descripcin se clasifican segn los elementos que aportan (4). Fuentes de carbono. La glucosa puede apoyar el crecimiento fermentativo o respiratorio de muchos microorganismos. Es importante que se proporcionen los sustratos del crecimiento en las concentraciones adecuadas para la cepa microbiana en desarrollo, las concentraciones que apoyan el crecimiento de un microorganismo pueden inhibir el de otro. Se requiere dixido de carbono (CO2) para diversas reacciones biosintticas. Muchos microorganismos respiratorios producen dixido de carbono en cantidad ms que suficiente para satisfacer sus requerimientos, pero otros necesitan una fuente del mismo en su medio de crecimiento. Fuentes de nitrgeno. El nitrgeno es un componente esencial de protenas, cidos nuclecos y otros compuestos, llegando a representar aproximadamente 5% del peso neto de una clula bacteriana tpica, ste puede ser suministrado de diferentes maneras y los microorganismos varan en su habilidad para asimilar nitrgeno (NO3-, NO2, N2O, NH4+, RNH2).

Ver anexo 1.

Fuentes de azufre. Al igual que el nitrgeno, el azufre es un componente de muchas sustancias celulares orgnicas. Constituye parte de la estructura de diversas coenzimas y se encuentra en las cadenas laterales de cisteinilo y metionilo de las protenas. El azufre en su forma elemental puede ser oxidado por algunas bacterias auttrofas a sulfato (SO42-). La mayor parte de los microorganismos puede utilizar el sulfato como fuente de azufre mediante la reduccin del primero al nivel del cido sulfhdrico (H2S). Algunos microorganismos pueden asimilar H2S directamente del medio de cultivo, pero este compuesto puede ser txico para muchos de ellos. Fuentes de minerales. Se requieren numerosos minerales para la funcin enzimtica. Los iones magnesio (Mg 2+) y ferroso (Fe2+) se encuentran tambin en los derivados de las porfirinas; el magnesio en la molcula de clorofila y el hierro como parte de las coenzimas de los citocromos y de las peroxidasas. Tanto el Mg2+ como el K+ son esenciales para la funcin y la integridad de los ribosomas. Se requiere Ca 2+ como constituyente de las paredes celulares de las bacterias grampositivas, aunque es innecesario en las bacterias gramnegativas. Muchos microorganismos marinos requieren Na+ para crecer. Al formular un medio para el cultivo de la mayor parte de los microorganismos es necesario brindarles fuentes de potasio, calcio, magnesio y hierro, por lo general en forma de iones (K+, Mg2+, Ca2+, y Fe2+) Se requieren tambin otros minerales (por ejemplo Mn2+, Mo2+, Co2+, Cu2+ y Zn2+), stos se encuentran a menudo en el agua ordinaria del grifo o como contaminantes de otros ingredientes del medio de cultivo.

1.3 Sustancias qumicas y compuestos usados en la formulacin de medios


Las formulaciones empleadas para los diversos medios pueden contener tan poco como tres ingredientes (caldo nutriente de Loeffler) o hasta 10, como muchos medios para microorganismos exigentes. El nmero de ingredientes tiene poca relacin con su crecimiento. Un cultivo simple puede ser complejo y del todo indefinido. Una estructura comn de los medios de cultivo para agentes patgenos quimiohetertrofos es la siguiente.

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Base amina - nitrgeno (Hidrolizados de protenas). Mezcla de aminocidos libres, pptidos y proteosas que pueden permanecer en solucin despus de ser calentadas a 100 C. Existen una gran variedad de stas debido a las diferentes demandas de los microorganismos para ciertos aminocidos y pptidos. En general las protenas empleadas para la produccin de peptonas son de dos tipos, protenas animales (incluyendo casena, gelatina y carne) y protenas vegetales (soya). Las peptonas se obtienen por diferentes tipos de digestin ya sea cida, alcalina o enzimtica para obtener aminocidos y pptidos que pueden ser transferidos dentro de la clula y usarse como fuentes de carbn para energa o polimerizacin de las protenas funcionales.
Tabla 1 Principales hidrolizados de protenas empleados en las formulaciones de medios de cultivo Hidrolizados de protenas Extracto de carne Caractersticas Se emplea en varias frmulas especiales como cultivo de estreptococos y medios para produccin de antgenos febriles. Debido a su alto contenido de azufre es adecuada para pruebas de formacin de sulfuro de hidrgeno. Promueve el desarrollo abundante de una amplia variedad de microorganismos. Adecuado para el cultivo de muchos grupos de bacterias incluyendo ciertos microorganismos exigentes. Por su alto contenido de carbohidratos es adecuada para el cultivo de una gran variedad de microorganismos. Contiene un alto nivel de vitaminas especialmente de Tiamina.

Peptona de carne

Peptona de casena Peptona de soya

Fuentes de energa (Hidratos de carbono). Proporcionan una rpida fuente de carbono como energa, adems de servir como sustratos de reacciones bioqumicas para la identificacin de microorganismos desconocidos. Los disacridos ms utilizados son: lactosa, sacarosa y maltosa; las pentosas y hexosas comnmente empleadas son la dextrosa y la xilosa. Algunos alcoholes y carbohidratos complejos.

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Sales amortiguadoras. Proporcionan un pH estable para el ptimo crecimiento de microorganismos, as como pH de referencia estndar para aquellos medios en los cuales se usan reacciones cidas o alcalinas para la identificacin de los mismos. Suelen agregarse a las formulaciones con grandes cantidades de carbohidratos (por ejemplo los que contienen peptona de soya), Desafortunadamente muchos amortiguadores tienden a quelar metales esenciales y deben utilizarse con cautela. Los pptidos y aminocidos pueden actuar como agentes amortiguadores a travs del efecto zwitterion de las agrupaciones NH2/COOH. Los ms usados para este fin son los fosfatos de potasio y de sodio, adems de citratos y acetatos. Factores de crecimiento suplementarios (Enriquecedores). Se emplean para recuperar microorganismos exigentes como Neisseria sp., Bordetella sp. y Legionella sp., que necesitan factores de crecimiento adicionales. El considerable beneficio de la sangre entera en estos microorganismos se atribuy con anterioridad a los factores de crecimiento agregados. Se considera ahora que el papel principal de la sangre entera es proteger a los agentes patgenos vulnerables de los procesos txicos de la oxidacin. Se emplean comnmente la sangre, suero, hemoglobina, suplementos vitamnicos, nucletidos y extractos de levaduras. Agentes selectivos (Inhibidores). El principal propsito al aadirse a un medio selectivo es el de inhibir el crecimiento de determinadas especies bacterianas no deseadas y su concentracin es de suma importancia para determinar la selectividad del medio. Todos los agentes selectivos poseen cierta toxicidad para algunas especies y es posible que de forma ocasional no supriman a todas las especies indeseables. Una regla general es que cualquier incremento de los nutrientes en el medio requiere un aumento del agente selectivo y viceversa. Los agentes selectivos pueden interactuar en forma mutua para acentuar o atenuar su selectividad, por ejemplo, las sales biliares disminuyen la toxicidad de los colorantes. Los agentes selectivos pueden tambin afectarse por sustancias que secuestran cationes, por ejemplo, ciertos colorantes, sales biliares pueden volverse ms txicos y casi todos los amortiguadores. Este efecto puede revertirse con la adicin de cationes (Mg+/Ca2+). En general se identifican como colorantes de anilina, metales pesados, agentes antimicrobianos, as como ciertas sustancias qumicas.

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Indicadores de pH. Son indispensables para medir los cambios de pH en medios de prueba resultantes del metabolismo bacteriano de determinados sustratos (fermentacin, desaminacin o descarboxilacin) tambin se incluyen otros indicadores en un medio para detectar productos bacterianos especficos por ejemplo en H2S. Los medios de cultivo cromgenos desarrollados para indicar colonias que producen actividades enzimticas especificas son casi siempre mezclas de colorantes indicadores. Todos los colorantes requieren cuidadosa dosificacin para evitar la inhibicin selectiva. Algunos son fucsina, azul de metileno, rojo neutro, rojo fenol, prpura de bromocresol, iones frricos y ferrosos. Otros compuestos y sustancias qumicas: Se emplea el agar como agente solidificante, para medios slidos y semislidos, adems de sustancias como el tiosulfato de sodio como fuente primordial de azufre. Agar. Etimolgicamente la palabra Agar debe su origen al vocablo malayo con que se designan las algas rojas del gnero Eucheuma. El agar es una sustancia coloidal desecada que se extrae de algunas especies marinas de algas rojas (divisin Rhodophyceae), particularmente de los gneros Gelidium, Gracilaria, Phteroclaida y Acanthopeltis. Por su calidad y uso existen dos grupos de agares: Industriales y Bacteriolgicos. La pared celular de estas algas est diferenciada en una capa interna de celulosa y una externa amorfa de naturaleza pptica, rica en coloides gelificados. Estas sustancias son indigeribles y constituyen fibra de tipo soluble. Agar industrial. El empleo del agar en las industrias alimentarias (conservas crnicas y vegetales, dulces, chocolates, pasteles, helados, jarabes, sopas, flanes, jaleas etc.) es enorme debido a sus propiedades como agente dispersante, estabilizador, espesante o gelificador, etc. Substituye con muchas ventajas a la pectina y al ser una gelatina vegetal de origen marino, viene a ser un perfecto substituto de las gelatinas de origen animal puesto que el poder gelificante del primero es ocho veces superior al de las segundas. Agar bacteriolgico. Es un agar especialmente refinado al que se le ha reducido a un grado ptimo su contenido en sales minerales, est libre de metales txicos y posee una gran fuerza de gel. Se pueden obtener geles bien formados y consistentes a la concentracin del 1.0 al 1.5% (m/v). No contiene las impurezas encontradas en los agares

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comerciales (gomas, compuestos nitrogenados, sales insolubles, azcares libres, microorganismos muertos, bacterias termfilas, ni pigmentos). Qumicamente el agar es una mezcla de dos polisacridos agarosa y agaropectina (polmeros de la galactosa). La proporcin de agarosa/agaropectina es variable, con valores extremos de 75% de agarosa y 25% de agaropectina, segn la clase de algas utilizadas. El agar es tambin una buena fuente de magnesio y hierro, tambin se encuentran calcio, potasio y yodo. La agarosa es un polmero lineal, compuesto de unidades alternadas de D-galactosa y de 3-6 anhidro L-galactosa, enlazadas por uniones alfa-1,3 y beta 1,4 alternadamente.

Fig. 1
Estructura molecular de la agarosa.

La agaropectina es una cadena ramificada, por uniones de Dextro y Levo galactosa esterificada por grupos sulfato y que contiene tambin cidos gulurnico y pirvico. El agar puede contener una variedad de impurezas particularmente sales inorgnicas que varan segn la fuente del mismo y el mtodo de extraccin. Por ejemplo, el agar mexicano (producido en las costas de Baja California) es ms rico en ciertas sales que el agar espaol, lo que les confiere una cierta diferencia en sus propiedades, esto les permite tener la facultad de emplearse en los medios de cultivo especiales para grmenes exigentes y de difcil desarrollo.

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Con agua destilada fra, el agar tiene un poder de hinchamiento superior a 3000%. Esta capacidad de absorcin puede alterarse fcilmente por diversos factores fsicos tales como la desecacin excesiva, calentamiento prolongado, etc. Producidos unas veces durante el proceso de fabricacin y otras durante su preparacin en el laboratorio, causando modificaciones estructurales. Algunos agentes modificadores de la naturaleza qumica de la capacidad de hinchamiento del producto final, son los cambios de pH, las sales disueltas, la temperatura, etc. La temperatura influye en el caso de la velocidad de hinchamiento, cuando el agua es calentada (entre 40 50 C) cambia, y las partculas que se mantenan separadas en fro, tienden a unirse, ms rpidamente. En agua hirviendo el agar se disuelve en pocos minutos en su totalidad. Produciendo un gel perfectamente limpio y transparente, la viscosidad del gel aumenta poco a poco a medida que la solucin se enfra, gelificando entre los 35 40 C. La gelificacin bajo un punto de vista coloidal, se genera cuando las molculas de agua se fijan a la micela, ocasionando con la solvatacin un incremento de masa de esta. El gel de agar, al igual que los dems coloides gelificados, tiene tendencia a encoger y a liberar gotitas de agua que arrastran los componentes solubles del medio de cultivo existentes en l (agua de condensacin). Esta propiedad sinresis, es inversamente proporcional a la concentracin. Los cidos diluidos en un medio fro, no alteran sensiblemente el agar, limitando su accin a ligeros cambios en la dureza del gel obtenido. Pero al contrario, operando en caliente o con cidos concentrados, el agar puede hidrolizarse total o parcialmente perdiendo su capacidad gelificante. Que solo puede recuperarse parcialmente neutralizando con una base, pero generando productos de mala calidad. Las propiedades pticas de los geles de agar se manifiestan fundamentalmente por la transparencia. Esta propiedad depende de la
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mayor o menor simetra de hidratacin con que se solvatan las micelas durante la gelificacin. Las caractersticas que confiere el agar a los medios de cultivo le permite ser hasta este momento insustituible en el rea de bacteriologa, algunas de ellas son: Su estructura le permite tener una gran estabilidad frente a enzimas microbianas, muy pocas bacterias (prcticamente solo algunas bacterias marinas como Pseudomonas carragenomora) son capaces de hidrolizar los enlaces de la molcula de agarosa y agaropectina. Por lo tanto con el resto de las bacterias, las molculas permanecen intactas y por ser insoluble en fro, ste polisacrido no puede ser utilizado por los microorganismos como fuente de carbono y el o los nutrientes adicionados actan nicamente como tales y sin ninguna interferencia del agente gelificante. Su estabilidad qumica, le permite mantener el medio en estado slido (prcticamente en cultivos de cualquier bacteria) lo cual no ocurre con ningn otro de los geles que puedan utilizarse con ste fin. Su punto de fusin, superior a 80 C, permite cultivar en medio slido bacterias termfilas que se incuban hasta temperaturas de 65 C, y que por lo tanto no podran ser cultivadas en medios slidos con otros gelificantes con menor punto de fusin. Su temperatura de gelificacin, inferior a los 39 C, permite mezclarlo en forma lquida sin que ello suponga la destruccin de protenas complejas y de factores termolbiles (como en el caso de la sangre, y sin que se produzca la coagulacin de la misma). Su elevado poder gelificante permite su utilizacin a muy bajas concentraciones, alrededor del 1 1.5% (m/v), permitiendo obtener geles firmes y consistentes, sobre los cuales se realiza el aislamiento de bacterias o purificacin de cultivos. El empleo en concentraciones muy bajas permite la obtencin de medios semislidos en los cuales se pueden realizar con excelentes resultados los controles de movilidad en las bacterias.

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Su contenido en sales minerales es controlado escrupulosamente lo que permite obtener resultados confiables y reproducibles en las pruebas de antibiogramas (impidiendo la formacin de quelatos u otra clase de complejos).

1.4 Clasificacin de medios de cultivo


Hasta mediados del siglo XX los microbilogos aceptaron que los medios de cultivo eran ms bien un preparado culinario y no formulaciones cientficas. Casi sin excepcin todos los ingredientes empleados eran materiales naturales variables indefinidos. El comportamiento del crecimiento vari en grado amplio y esto suscit el deseo de crear medios que reprodujeran un comportamiento estndar (5). Entre 1950 y 1975 los microbilogos intentaron fusionar aminocidos nucletidos, vitaminas, minerales y metales seleccionados para que crecieran agentes quimiohetertrofos al mismo ritmo y con las mismas caractersticas que en medios indefinidos lo que permiti el desarrollo de los medios sintticos o qumicamente definidos. Con este avance en la formulacin de los medios de cultivo se puede sealar la siguiente clasificacin2.
Por su composicin qumica

Medios sintticos o qumicamente definidos. La naturaleza qumica y la concentracin de los nutrientes es conocida, son medios de eleccin para el desarrollo y aislamiento de microorganismos con requerimientos especficos para su crecimiento. Medios semisintticos. El gran nmero de factores de crecimiento exigidos para ciertos grmenes hace que la fabricacin de un medio sinttico para estos grmenes sea imposible o demasiado cara. En este caso se aportan los factores de crecimiento bajo la forma de un extracto orgnico complejo (extracto de levadura, extracto de tejidos, etc.). Ciertos
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La clasificacin de acuerdo a la Secretara de Salud se encuentra en el anexo 2 en la Norma Oficial Mexicana NOM-065-SSA1-1993, Que establece las Especificaciones Sanitarias de los Medios de Cultivo.

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grmenes no crecen en ningn medio por muy enriquecido que est, hacindolo exclusivamente en clulas vivas con unas caractersticas determinadas. Ejemplos de este tipo son, aparte de los virus, las Chlamydias, Rickettsias, etc. Medios complejos o naturales. Son llamados complejos debido a que no se conoce con certeza la composicin y la concentracin exacta de sus nutrientes. El caldo de infusin de carne es un ejemplo. En este tipo de medios no se identifica cual es la fuente de energa, ni los factores de crecimiento presentes (6).
Por su aspecto fsico

Medios lquidos. En los medios lquidos los nutrientes se disuelven en agua y el crecimiento bacteriano se manifiesta con un cambio en el aspecto del caldo, de lmpido a turbio. Se emplean fundamentalmente para: Cultivar los microorganismos o bien para obtener la produccin de metabolitos especficos. Estimular y promover la seleccin de algn o algunos microorganismos e impedir que otros se multipliquen. Identificar al microorganismo estudiado mediante pruebas bioqumicas. Medios semislidos. Se utilizan para identificaciones bioqumicas y averiguar si el germen estudiado es mvil. Los medios semislidos tienen una consistencia blanda. Medios slidos. Se elaboran agregando un agente solidificante a los nutrientes y al agua. El agregado de agar permite la preparacin de un medio slido. Se utilizan para obtener colonias aisladas de microorganismos. Los medios slidos constituyen la mayor parte de los medios de cultivo que se emplean en Microbiologa.(7)
Por su uso

Es importante destacar que muchos medios utilizados en el diagnstico bacteriolgico cumplen ms de una funcin.
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Medios de apoyo. Contienen nutrientes que favorecen el desarrollo de la mayora de los microorganismos sin requerimientos especiales y sin brindar ventaja alguna en el crecimiento de un microorganismo en particular. Medios selectivos. Contienen uno o ms agentes que inhiben el desarrollo de algunos microorganismos, pero en una flora mixta permiten el aislamiento y recuperacin del germen o grupo de grmenes de inters. Los agentes inhibidores utilizados para este propsito son colorantes, sales biliares, alcoholes, cidos y antibiticos. Medios de enriquecimiento. Contienen nutrientes especficos requeridos para preparar el medio de cultivo y reproducir el ambiente natural del microorganismo deseado, a partir de una mezcla de microorganismos. Medios diferenciales. Emplean un factor (o factores) que permite que las colonias de una especie o tipo bacteriano exhiban ciertas caractersticas metablicas o de cultivos que pueden utilizarse para diferenciarlas de otras bacterias que crecen en el mismo medio, pueden contener indicadores de cido base, redox o sustancias que detecten los cambios en el medio o en las caractersticas tpicas de las colonias. Medios para cultivar grmenes anaerbicos. Son medios de cultivo para aquellos grmenes que requieran condiciones de anaerobiosis o de microaerofilia. Medios de transporte. Sirven para transportar los especmenes que contienen a los microorganismos, del sitio de la toma del producto hasta el laboratorio donde va a efectuarse el estudio. Estos medios impiden que se altere la proporcin original de la flora microbiana en los especmenes.

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Captulo II. Aislamiento y medios especiales 2.1 Aislamiento de microorganismos en cultivo puro
Para estudiar las propiedades de una bacteria es necesario manejarla en cultivo puro, libre de otros microorganismos. Para hacer esto, debe aislarse una sola clula de todas las dems y cultivarse de tal manera que su progenie tambin permanezca aislada. Para esto se dispone de varios mtodos (8).
Inoculacin en placa

El mtodo por estriado en placa, requiere de un alambre de Nichrome o platino, con una punta en asa o recta y el otro extremo insertado en un mango cilndrico para un uso sencillo. Estriado en cuatro cuadrantes. La inoculacin primaria (fig. 2) puede hacerse con un asa, hisopo estril u otro dispositivo adecuado, seguido de la diseminacin del material con un alambre en asa o recto. El inculo se disemina con un movimiento hacia atrs y hacia delante en cada uno de los cuatro cuadrantes girando la placa a 90. El asa o alambre debe esterilizarse entre cada diseminacin hacia un cuadrante (el alambre debe calentarse al rojo vivo y para enfriarse se recomienda picar en el contorno de la superficie del agar). Se pretende con esta tcnica diluir el inculo lo suficiente como para obtener colonias aisladas las cuales puedan subcultivarse de forma individual en otros medios, para llegar a obtener aislamientos puros. Estriado para recuento semicuantitativo. Se requiere de asas de inoculacin de Nichrome o platino (evitar las de tipo ferrosas), calibradas para contener 0.01 o 0.001 mL de lquido (fig. 3), 1) se sumerge en la muestra y se retira con la precaucin de llevar todo el volumen a la superficie del agar, realizando una estra a travs del centro, 2) el inculo se disemina en ngulos rectos con respecto a la estra primaria, 3) se gira la placa 90 y se continua hasta cubrir la superficie.

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Patrn en estras para inocular medios para aislamiento de colonias bacterianas


Figura modificada de Pollack R A (9)

Fig. 2

1)

Inoculacin primaria

2) Estras en ngulos rectos

Dilucin por

3)Estras en ngulos rectos para producir un crecimiento en enrejado extincin

Patrn en estras para inocular medios para recuento semicuantitavo de colonias bacterianas

Fig. 3

21

Este mtodo es menos seguro ya que de la suspensin de la muestra se hacen diluciones seriadas y se siembra cada una en placa. Si slo algunos inculos de una dilucin particular tienen desarrollo, se presume que alguna de las colonias partieron de clulas nicas. Este mtodo no se usa a menos que por alguna razn sea imposible la siembra en placa. Una desventaja de este mtodo es que slo se puede utilizar para aislar el tipo de microorganismo predominante en una poblacin mixta.

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2.2 Medios empleados para aislamiento de bacterias Gramnegativas Agar MacConkey


El agar MacConkey (10) es un agar moderadamente selectivo (primario) y diferencial, empleado principalmente para la deteccin y aislamiento de organismos gramnegativos de muestras clnicas, productos lcteos, alimentos, agua y muestras de origen industrial o farmacuticas. Es utilizado para el aislamiento y diferenciacin de enterobacterias fermentadoras de la lactosa y las no fermentadoras (11). El agar MacConkey es usado con un carbohidrato adicionado para la diferenciacin de coliformes, basado en las reacciones de fermentacin. Las peptonas son fuentes de nitrgeno y otros nutrientes. La lactosa es el carbohidrato fermentado. Cuando la lactosa es fermentada baja el pH del medio que es detectado por el indicador (rojo neutro) dando colonias rojo ladrillo a rosadas y se observa la precipitacin de la bilis. Las sales biliares y el cristal violeta son agentes selectivos que inhiben el crecimiento de microorganismos grampositivos. El agar es el agente gelificante.

Frmula
Frmula aproximada para 1 L
Peptona Mezcla de peptonas Lactosa Mezcla de sales biliares Cloruro de sodio Agar Rojo neutro Cristal violeta Solucin a 25 C pH 7.0 0.2 17.0 3.0 10.0 1.5 5.0 13.5 0.03 1.0 g g g g g g g mg

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Usos
Medio empleado ampliamente para aislar e identificar selectivamente a enterobacterias como salmonellas, shigellas y coliformes a partir de heces, orinas, aguas negras y diversos alimentos.

Inoculacin
El espcimen puede sembrarse directamente en la placa por estra superficial o bien inocularlo en medios lquidos de enriquecimiento tales como Caldo tetrationato o Caldo selenito-cistina, incubar los caldos a 35 2 C de 18 a 24 h. Hacer resiembras de estas en placas de agar MacConkey y volver a incubar.

Medios Alternos
Se recomiendan los siguientes medios que pueden ser ptimos para la recuperacin de enterobacterias: Agar Agar Agar Agar Agar Agar Agar EMB SS Tergitol 7 XLD Entrico Hektoen Sulfito de Bismuto (altamente especfico para Salmonella typhi) Verde brillante especial para salmonellas, entre otros.

Resultados
Los microorganismos fermentadores de la lactosa intensos, como Escherichia sp., Klebsiella sp. y Enterobacter sp. crecen como colonias rosas - rojo ladrillo, con o sin una zona de precipitado biliar mientras que los fermentadores lentos o dbiles de lactosa, como Citrobacter sp., Providencia sp., Serratia sp., y Hafnia sp. pueden aparecer como colonias incoloras despus de 24 h o levemente rosadas en 24 48 h. Las colonias no fermentadores crecen incoloras o claras tal es el caso de las Pseudomonas que presentan colonias incoloras caf verdosas, con olor dulzn caracterstico, Proteus, Edwarsiella, Salmonella y Shigella sp. Producen colonias incoloras o transparentes, con raras excepciones.

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Tabla 2 Interpretacin en Agar MacConkey Microorganismo


Escherichia coli

Cepa
ATCC 25922

Caractersticas de las colonias


De rojas a rosadas. No son mucoides. Pueden rodearse de un precipitado opaco de sales biliares. Incoloras y transparentes (puede observarse un patrn de swarming). Incoloras, trasparentes o ambarinas. Incoloras, transparentes o rosa muy tenue. Crecimiento inhibido o colonias puntiformes, rosa plido, opacas y escasas. Crecimiento inhibido o colonias escasas, puntiformes, rojas opacas y con un halo claro como de 1 mm de dimetro alrededor de la colonia.

Proteus mirabilis Salmonella typhimurium Shigella flexneri Staphylococcus aureus

ATCC 12453 ATCC 14028 ATCC 12022 o 9199 ATCC 25923

Enterococus faecalis

ATCC 29212

Limitaciones
Aunque el medio es selectivo para bacilos gramnegativos entricos, se recomienda realizar las pruebas bioqumicas para tener una identificacin completa. En este medio crecen tambin bacilos gramnegativos que no pertenecen a la familia Enterobacteriaceae como Pseudomonas y Aeromonas. As mismo pueden desarrollarse algunas colonias de Enterococcus faecalis (enterococos) y estafilococos. El Agar MacConkey sin sal y sin cristal violeta, puede usarse en la diferenciacin de las especies Mycobacterium fortuitum y Mycobacterium chelonae.

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Agar EMB
Es un medio selectivo y diferencial para el aislamiento de microorganismos entricos gramnegativos de diversas muestras. En 1904, Endo (11) desarrolla un medio de cultivo para el aislamiento de bacilos causantes de la fiebre tifoidea en heces, este medio fue utilizado por muchos aos. Segn Holt-Harris y Teague, consideraron como principal desventaja que en el Agar de Endo las colonias de coliformes desarrollaban un color rojo el cual se difunda a travs del medio y cuando se presentaba un desarrollo abundante de estas, se enmascaraba el crecimiento de las colonias incoloras (no fermentadores de la lactosa), impidiendo su identificacin. En 1916 estos dos cientficos reportan el desarrollo de un nuevo medio en el cual se incorporan los colorantes: eosina Y y azul de metileno, su adicin permiti la diferenciacin entre las bacterias fermentadoras y las no fermentadoras, eliminando la difusin del colorante a travs del agar. La formulacin original del Agar EMB de Holt-Harris y Taegue fue modificada por Levine en 1918. Levine simplifica la frmula original adicionando una peptona simple y fosfato dipotsico como solucin amortiguadora, eliminando la sacarosa e incrementando la concentracin de lactosa. La concentracin de azul de metileno fue reducida incrementando la pureza del colorante. El medio Levine EMB se ha convertido en el medio predominante para el aislamiento de enterobacterias que emplea colorantes como agentes selectivos, estos colorantes tambin juegan un papel en la diferenciacin de las bacterias fermentadoras de la lactosa y los no fermentadores. Los microorganismos fermentadores de la lactosa se visualizan como colonias azules a negras, mientras que las no fermentadoras como Salmonella y Shigella dan colonias incoloras a ambarinas y transparentes. Suelen crecer algunas bacterias grampositivas como enterococos, estafilococos y algunas levaduras, formando colonias puntiformes. Ciertas bacterias patgenas no fermentadoras de lactosa se pueden desarrollar en este medio y deben distinguirse por pruebas bioqumicas adicionales.

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Frmula
Frmula aproximada para 1 L.
Peptona de gelatina Lactosa Fosfato dipotsico Agar Eosina Y Azul de metileno Solucin a 25 C pH 7.1 0.2 10.0 10.0 2.0 15.0 400 65 g g g g mg mg

Usos
Adems de emplearse en Microbiologa mdica, se utiliza en las tcnicas recomendadas por la Sociedad Americana de Bacterilogos, en el anlisis microbiolgico de productos lcteos, aguas y alimentos destinados al consumo humano. As como pruebas de lmite microbiano.

Inoculacin
El espcimen puede sembrarse directamente en la placa por estra superficial, incubar a 35 2 C durante 18 a 24 h, protegida de la luz. En caso negativo despus de 24 h reincubar por 24 h adicionales.

Medios Alternos
Se recomiendan los siguientes medios que pueden ser ptimos para la recuperacin de enterobacterias: Agar Agar Agar Agar Agar Agar MacConkey SS Tergitol 7 XLD Entrico Hektoen Verde brillante, entre otros.

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Resultados
Las bacterias que producen cidos fuertes forman colonias que tienen un brillo metlico, esta aparicin es debido a la precipitacin del colorante en las colonias tpicas de Escherichia coli. Los fermentadores dbiles, incluyendo Klebsiella sp. y Enterobacter sp. producen colonias grandes de 4 a 6 mm de dimetro, elevadas y mucoides con tendencia a unirse, usualmente no presentan brillo metlico, a la luz transmitida muestran un centro azul-negro de azul a negro sin brillo metlico. Los no fermentadores de lactosa, incluyendo Proteus sp., Salmonella sp. y Shigella sp. producen colonias incoloras y transparentes. En este medio tambin es posible la identificacin rpida de Candida albicans. Despus de 24 a 48 h de incubacin en atmsfera de un 10% de CO2 a 35 36 C y a veces se logra aislar a Nocardia sp.
Tabla 3 Interpretacin en Agar EMB Microorganismo
Escherichia coli

Cepa
ATCC 25922

Caractersticas de las colonias


Elevadas o ligeramente convexas. De 2 a 3 mm de dimetro. Presentan a la luz transmitida un centro azul-negro y brillo metlico azul verdoso a la luz reflejada. Algunas cepas no muestran brillo metlico. Pueden presentar colonias rosa plido plumosas semejantes a telaraas (atpicas). Crecimiento parcialmente inhibido o colonias puntiformes incoloras. Crecimiento parcialmente inhibido o colonias puntiformes incoloras. Colonias incoloras a ambarinas, transparentes. Colonias incoloras a ambarinas, transparentes Cuando no hay swarming semejantes a Salmonella y Shigella, incoloras.

Candida albicans Staphylococcus aureus Enterococcus faecalis Salmonella typhimurium Shigella flexneri Proteus vulgaris

ATCC 10231 ATCC 25923 ATCC 29212 ATCC 14028 ATCC 12022 o 9199 ATCC 9484

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Limitaciones
Aunque es un medio selectivo para bacilos gramnegativos entricos, se recomienda realizar las pruebas bioqumicas para tener una identificacin completa. En este medio crecen tambin colonias de Enterococcus faecalis (enterococos) y estafilococos, as como levaduras, por lo que es necesario tener en cuenta las caractersticas especficas de cada una de las colonias.

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Agar Salmonella y Shigella


El agar Salmonella y Shigella es un medio moderadamente selectivo y medianamente diferencial para el aislamiento de bacilos entricos patgenos especialmente los que pertenecen al gnero Salmonella. Aunque este medio no es recomendable para realizar aislamientos primarios de Shigella ya que hay cepas ms exigentes que crecen poco o nada. El agar Salmonella y Shigella (11) es sealado como moderadamente selectivo por el grado de inhibicin de los microorganismos grampositivos estos son inhibidos por la gran concentracin de sales biliares, los citratos y el verde brillante. La diferenciacin de los microorganismos entricos se logra por la adicin de la lactosa al medio. Los organismos que fermentan la lactosa producen cido, en la presencia de indicador rojo neutro, obtenindose colonias rojas. Los no fermentadores de la lactosa forman colonias incoloras o transparentes. El ltimo grupo incluye a la mayora de los patgenos intestinales, la Salmonella y Shigella forman parte de este. El tiosulfato de sodio y el citrato frrico permiten la deteccin de sulfuro de hidrgeno producido, observndose colonias con centros negros.

Frmula
Frmula aproximada para 1 L.
Extracto de carne Mezcla de peptonas Lactosa Mezcla de sales biliares Citrato de sodio Tiosulfato de sodio Citrato frrico Agar Rojo neutro Verde brillante Solucin a 25 C pH 7.0 0.2 5.0 3.0 10.0 8.5 8.5 8.5 1.0 13.5 25.0 0.33 g g g g g g g g g mg

Usos
Este medio es empleado en Bacteriologa sanitaria para aislar Salmonella sp. y Shigella sp. a partir de heces, orina y alimentos diversos, tanto frescos como enlatados, anlisis de agua potable y residuales.
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Inoculacin
Debido a su gran poder de inhibicin, este medio puede sembrarse con una buena cantidad del material en estudio, directamente en la placa por estra superficial a 35 2 C de 18 a 24 h protegida de la luz.

Medios Alternos
Se recomiendan los siguientes medios que pueden ser ptimos para la recuperacin de enterobacterias: Agar Agar Agar Agar Agar MacConkey Tergitol 7 XLD Entrico Hektoen de Desoxicolato, entre otros.

Resultados
Las bacterias no fermentadoras de la lactosa (presuntamente patgenas) dan colonias claras, transparentes e incoloras, en cambio los coliformes que son bastante inhibidos, forman colonias pequeas que varan del rosa al rojo. Tal es el caso de la Enterobacter y Klebsiella que presentan colonias de crema plida a roja, siendo mucosas y de mayor tamao que las de Escherichia coli. Algunas cepas de Salmonella arizonae son fermentadoras de la lactosa y pueden simular E. coli. Las bacterias formadoras de sulfuros dan colonias que presentan un centro negro y un halo claro alrededor como Proteus (no se observa swarming) y algunas especies de Salmonella. En la siguiente tabla se describen las caractersticas especficas de las colonias de algunas cepas de referencia.

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Tabla 4 Interpretacin en Agar Salmonella y Shigella Microorganismo


Shigella flexneri Escherichia coli

Cepa
ATCC 12022 o 9199 ATCC 25922

Caractersticas de las colonias


Colonias pequeas, incoloras transparentes. Marcada inhibicin o colonias pequeas rosa intenso a rojo, con halo de precipitacin. Colonias pequeas, incoloras transparentes con o sin centro negro. Colonias medianas, incoloras y transparentes, con un centro negro si producen H2S. Crecimiento inhibido.

Salmonella typhi

ATCC 19430

Salmonella typhimurium

ATCC 14028

Staphylococcus aureus

ATCC 25923

Limitaciones
Debido a que es un medio con un alto nivel de inhibicin, algunas cepas de Shigella no crecen en Agar Salmonella-Shigella, por lo cual no es recomendado para el aislamiento primario de Shigella, el medio recomendado par a este aislamiento es Agar Entrico de Hektoen y XLD.

Nota: Este medio no requiere esterilizacin, durante su preparacin

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Agar Verde Brillante


El agar Verde Brillante (11) fue descrito por primera vez por Kristensen y colaboradores en 1925. En 1935 Kauffmann modifica la formulacin. Este medio se clasifica como un medio altamente selectivo para la recuperacin de Salmonella con la excepcin de la fiebre tifoidea y paratifoidea. Se incluye en la USP. para su uso en el ejercicio de lmite microbiano. El colorante verde brillante inhibe las bacterias grampositivas y la mayora de los bacilos gramnegativos, el rojo fenol sirve como un indicador de pH, cuando la lactosa y la sacarosa son fermentadas se detecta la produccin del cido por un cambio de coloracin en el medio, a un color amarillo.

Frmula
Frmula aproximada para 1 L
Mezcla de peptonas Extracto de levadura Lactosa Sacarosa Cloruro de sodio Agar Rojo fenol Verde brillante Solucin a 25 C pH 6.9 0.2 10.0 g 3.0 g 10.0 g 10.0 g 5.0 g 20.0 g 0,08 g 12.5 mg

Usos
Medio altamente selectivo empleado para aislar Salmonella (excepto S. typhi y Shigella), de heces, orina, leche y productos lcteos y de otros alimentos de importancia sanitaria.

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Inoculacin
Debido a que es un medio fuertemente inhibidor, se recomienda inocular las placas con una asada bien cargada con el material en estudio. Cuando se sospecha que el material en estudio contiene bajas concentraciones de Salmonella es necesario inocular la muestra inicialmente en Caldo tetrationato o Caldo selenito-cistina, para su enriquecimiento. Sembrar el medio de cultivo con la muestra de ensayo por estra cruzada. Incubar a 35 2 C de 24 a 48 h protegido de la luz. En caso negativo despus de 24 h, reincubar por 24 h ms.

Medios Alternos
Paralelamente se recomienda sembrar en otros medios selectivos menos inhibidores como: Agar Desoxicolato SS XLD MacConkey EMB Agar Tergitol 7 Agar Entrico de Hektoen

Resultados
El medio presenta una coloracin marrn verdoso al principio, pasa a rojo durante la incubacin a 35 2 C, los microorganismos que degradan la lactosa son inhibidos completamente, presentando algunas de las cepas no inhibidas, colonias verde amarillentas, opacas y rodeadas de un halo amarillento. Los microorganismos lactosa negativos como Salmonella y ocasionalmente Proteus forman colonias de color rosa plido transparentes y rodeadas de un halo rojo brillante, algunas colonias de Proteus se observan rojas.

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Tabla 5 Interpretacin en Agar Verde Brillante Microorganismos


Escherichia coli Salmonella enteritidis Salmonella typhi Salmonella typhimurium Staphylococcus aureus

Cepa
ATCC 25922 ATCC 13076 ATCC 19430 ATCC 14028 ATCC 25923

Caractersticas de las colonias


Colonias de color amarillo amarillo verdoso, rodeado de una zona de color amarillo verde. Colonias de color blanco rojo, opacas y rodeadas por una zona roja. No hay crecimiento. Colonias de color blanco rojo, opacas y rodeadas por una zona roja. No hay crecimiento.

Limitaciones
Debido a que es un medio altamente selectivo para salmonellas su uso se limita a esta especie.

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2.3 Medios empleados para aislamiento de bacterias Grampositivas Agar para Estafilococos No.110
Este medio es empleado por ser altamente selectivo para el aislamiento y diferenciacin de estafilococos. Se fundamenta en la fermentacin del manitol y la actividad de la gelatinasa. En 1935 Store describe a estafilococos que dan positiva a la prueba de gelatinasa. Chapman y colaboradores, reportan que la especie patognica de estafilococos fermenta el manitol, formando pigmentos y producen gelatinasa (11). En 1945 Chapman propone adicionar a el Agar rojo fenol y manitol una concentracin de 7.5% de NaCl para hacer un medio de aislamiento selectivo para esta especie de estafilococos. En estudios posteriores Chapman desarrolla en medio Agar Estafilococos No.110, este medio es recomendado para el aislamiento selectivo de estafilococos patgenos. El agar S-110 contiene peptona como fuente, nitrgeno, vitaminas y minerales, el extracto de levadura suministra las vitaminas del complejo B, las cuales estimulan el crecimiento bacteriano. El cloruro de sodio en altas concentraciones inhibe otras bacterias. La lactosa y el D-manitol son la fuente de carbohidratos. La gelatina es adicionada para la prueba de licuefaccin y el agar es el agente solidificante. Los estafilococos patgenos coagulasa positivo resisten las altas concentraciones de sales y forman colonias con una pigmentacin que va del amarillo al anaranjado. Estos microorganismos son fermentadores del manitol y producen cido, licuan la gelatina produciendo zonas claras alrededor de las colonias.

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Frmula
Frmula aproximada para 1 L
Peptona de casena Extracto de levadura Gelatina Lactosa D-Manitol Cloruro de Sodio Fosfato dipotsico Agar Solucin a 25 C pH 7.0 0.2 10.0 2.5 30.0 2.0 10.0 75.0 5.0 15.0 g g g g g g g g

Usos
Para el aislamiento selectivo de cepas de estafilococos a partir de diversas muestras clnicas como procesos purulentos, casos de neumona, meningitis, forunculosis, uretritis, vaginitis etc. Tambin se emplea este medio para aislar estafilococos que contaminan alimentos diversos y que producen intoxicaciones alimentarias (12).

Inoculacin
Sembrar el medio de cultivo con la muestra de ensayo por estra cruzada. Incubar a 35 2 C de 24 48 h protegindolo de la luz.

Medios Alternos
Agar Sal y Manitol Agar Vogel Johnson Base de Agar Baird-Parker Existen reportados cerca de 20 medios para el aislamiento de estafilococos (13).

Resultados
Observar la fermentacin del manitol, remover la colonia del medio y adicionar una gota de azul de Bromotimol al 0.04% en el rea donde la

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colonia fue removida. Observar la formacin del color amarillo (reaccin positiva). Observar la reaccin de la gelatinasa, cubrir la placa con 5 mL de solucin de sulfato de amonio e incubar por 12 minutos para apreciar la hidrlisis de la gelatina. Observar las zonas claras alrededor de las colonias (Reaccin de Stone).
Tabla 6 Interpretacin en Agar Estafilococos No. 110 Microorganismos
Escherichia coli Staphylococcus aureus

Cepa
ATCC 25922 ATCC 25923

Caractersticas de las colonias


Crecimiento inhibido. Colonias amarillas anaranjadas, fermentan la lactosa y presentan hidrlisis de la gelatina. Colonias blancas crema, no fermentan la lactosa y la hidrlisis de la gelatina es lenta.

Staphylococcus epidermidis

ATCC 12228

Limitaciones
El Enterococcus faecalis puede desarrollarse en este medio formando colonias muy pequeas que fermentan el manitol. Para diferenciar estos microorganismos de los estafilococos se debe realizar la tincin de Gram y la prueba de catalasa. La produccin de pigmento no es un criterio confiable para la diferenciacin de las especies de estafilococos. Si se tiene sospecha de estafilococos, se debe realizar un subcultivo en caldo nutritivo, agar sangre, caldo BHI o caldo de fosfato triptosa y obtener la muestra necesaria para poder realizar la prueba de coagulasa, si se obtiene el cultivo del agar Estafilococos-110 puede interferir con los resultados, debido al alto contenido de sal.

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Agar Sal Manitol


Medio selectivo empleado para aislamiento de estafilococos a partir de diversas muestras. En 1942 Koch reporta que los estafilococos crecen solo en medios de cultivo que contienen de cloruro de sodio 7.5%. Chapman estudi con ms detenimiento y concluy que la adicin de cloruro de sodio al 7.5% al Agar Rojo fenol y manitol mejora el aislamiento de estafilococos coagulasa positiva, este medio es considerado como un medio selectivo para el aislamiento de estafilococos coagulasa positivos (11). El agar Sal manitol es un considerado como medio selectivo y nutritivo, debido a su contenido de peptonas y extracto de carne que proporciona factores de crecimiento esenciales como: el nitrgeno, carbono, azufre y oligoelementos. La elevada concentracin de cloruro de sodio inhibe a la mayora de las bacterias que son halo-sensibles y favorecen a los estafilococos halo-resistentes. La fermentacin del manitol, se observa por un cambio en el indicador rojo fenol, con produccin de cido cambia el color del medio, de rosado a amarillo.

Frmula
Frmula aproximada para 1 L.
Peptona Extracto de carne D-manitol Cloruro de sodio Agar Rojo fenol Solucin a 25 C pH 7.0 0.2 10.0 1.0 10.0 75.0 13.5 25.0 g g g g g mg

Usos
Medio empleado para aislar estafilococos patgenos de materiales clnicos (orina, genitales, heridas, exudados farngeos y otros). Se emplea en la industria alimenticia de productos lcteos, crnicos y conservas de pescado. Tambin se utiliza en la industria cosmtica y la USP. recomienda su uso para las pruebas de lmite microbiano (12).

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Inoculacin
El espcimen puede sembrarse directamente en la placa por estra superficial, incubar a 35 2 C de 18 a 24 h protegindolo de la luz. Aunque tambin se recomienda una siembra masiva del material de estudio y esperar la incubacin hasta unas 36 h. En una atmsfera aerbica.

Medios Alternos
Se recomienda como medios alternativos para el aislamiento de Staphylococcus aureus los medios: Agar Vogel Johnson Agar Estafilococos 110 Base de Agar Baird Parker entre otros.

Resultados
La formacin de colonias de estafilococos no patgenos es de tamao pequeo rodeada de una zona roja. Los estafilococos patgenos producen cido del manitol, desarrollan colonias ms grandes rodeadas de una zona amarilla. Si se agrega a cada litro de medio, una yema de huevo en condiciones de esterilidad, los estafilococos, que adems de fermentar el manitol producen lipasa, darn un precipitado amarillento de cidos grasos alrededor de la colonia. Este fenmeno comprueba la propiedad de coagular el plasma que presentan los estafilococos patgenos coagulasa positivos. Los micrococos se desarrollan en este medio y se observan como colonias grandes de color blanco naranja. Los estreptococos presentan crecimiento inhibido.

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Tabla 7 Interpretacin en Agar Sal Manitol


Microorganismo Escherichia coli Enterobacter aerogenes Proteus mirabilis Staphylococcus aureus Cepa ATCC 25922 ATCC 13048 ATCC 12453 ATCC 25923 Caractersticas de las colonias Crecimiento inhibido. Crecimiento inhibido. Inhibicin parcial. Colonias con pigmento amarillo caracterstico y halo de color amarillo (manitol positivo) pequeas a grandes. Colonias blancas, sin halo amarillo (manitol negativo).

Staphylococcus epidermidis

ATCC 12228

Limitaciones
Debido a que es un medio altamente selectivo para estafilococos, su uso es limitado y especfico.

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2.4 Medio de apoyo Agar Nutritivo


A principios del siglo XX, la American Public Health Association publica la frmula de este medio de uso general que permite el crecimiento de una gran variedad de microorganismos poco exigentes. Este fue reconocido como un medio estandarizado para el uso del anlisis de agua potable y aguas residuales, productos lcteos y otros alimentos. Esta frmula relativamente simple ha sido reconocida con el nombre de Agar Nutritivo y se emplea en el laboratorio para el cultivo y mantenimiento de especies no exigentes (12). Esta frmula relativamente simple proporciona los nutrientes necesarios para el crecimiento de varios microorganismos. El extracto de carne contiene: carbohidratos, vitaminas, nitrgeno y sales. Las peptonas son la principal fuente de nitrgeno orgnico, particularmente de aminocidos y pptidos de cadenas largas. El agar es el agente solidificante.

Frmula

Frmula aproximada para 1 L.


Peptona Extracto de carne Agar Solucin a 25 C pH 6.8 0.2 5.0 3.0 15.0 g g g

Usos
Medio utilizado para el cultivo de microorganismos poco exigentes. Se emplea en bacteriologa sanitaria (para el recuento de bacterias en agua potable y agua residuales), bacteriologa mdica e industrial (leche y otros alimentos), en pruebas de esterilidad y para multiplicar microorganismos en la produccin de vacunas y antgenos. Tambin se emplea como base para preparar medios de cultivo ms ricos adicionados con otros nutrientes especficos. Lo mismo que en pruebas bioqumicas, por ejemplo indol - descarboxilasa y lisina descarboxilasa (12).

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Inoculacin
En tubo inclinado es utilizado mantenimiento de cultivos puros. para el cultivo primario y

El espcimen puede sembrarse directamente en la placa por siembra masiva o por estra superficial, incubar a 35 2 C de 18 a 48 h protegido de la luz.

Medios Alternos
Sin sugerencias.

Resultados
Tabla 8 Interpretacin en Agar Nutritivo Microorganismo
Escherichia coli Enterococcus faecalis Staphylococcus aureus

Cepa
ATCC 25922 ATCC 19433 29212 ATCC 25923

Caractersticas de las colonias


Colonias grandes, crema brillante y lisas. Colonias pequeas, crema opacas y lisas. Colonias grandes ligeramente amarillas, brillantes y lisas.

Limitaciones
nicamente puede emplearse para mantenimiento y cultivo de microorganismos poco exigentes.

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2.5 Medios de enriquecimiento y selectivos Agar Base Sangre


El Agar base sangre con la adicin de sangre estril desfibrinada, es un medio empleado para el aislamiento primario (11), cultivo y deteccin de la actividad hemoltica de los estreptococos y otros microorganismos exigentes (bacilos tuberculosos). Este medio se ha empleado como una base para la preparacin de agar sangre. En un estudio de la viabilidad de los estreptococos, Snavely y Brahier realizaron estudios comparativos con sangre de caballo, conejo y carnero en agar base sangre y encontraron que la sangre de carnero tiene las mejores caractersticas de hemlisis, las colonias son claras y ms confiables en 24 y 48 h. En el curso de la investigacin, alrededor de 1,300 aislamientos de estreptococos fueron hechos con agar base sangre y 5% de sangre de carnero desfibrinada. El agar base sangre es un medio nutritivo en donde; las peptonas, la infusin de msculo cardiaco, casena y el extracto de levadura, proporcionan las fuentes de nitrgeno, carbono, aminocidos y vitaminas, contiene cloruro de sodio para mantener el equilibrio osmtico y el agar es el agente solidificante. El suplemento con sangre (5 10%) desfibrinada provee de factores de crecimiento para microorganismos exigentes, y es la base para la determinacin de reacciones hemolticas. Las concentraciones de sangre menores producen reacciones hemolticas difciles de distinguir, en tanto que las mayores pueden ocultar totalmente la hemlisis. La actividad hemoltica puede variar por la sangre de animal utilizado y la base del medio empleado (11). Las siguientes frmulas son empleadas para la preparacin del Agar sangre en agares comerciales, dependiendo de los laboratorios que los distribuyan (13).

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Frmula
Agar Sangre Frmula aproximada para 1 L
Peptona de casena Peptona de soya Cloruro de sodio Agar Sangre de carnero desfibrinada Solucin a 25 C pH 7.6 0.2 15.0 5.0 5.0 15.0 50.0 g g g g mL

Base de agar sangre Frmula aproximada para 1 L


Peptona Extracto de carne Cloruro de sodio Agar Sangre de carnero desfibrinada Solucin a 25 C pH 7.3 0.2 10.0 10.0 5.0 15.0 50.0 g g g g mL

Agar Sangre No. 2 Frmula aproximada para 1 L


Proteosa peptona Infusin de hgado Extracto de levadura Cloruro de sodio Agar Solucin a 25 C pH 7.4 0.2 15.0 2.5 5.0 5.0 12.0 g g g g g

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Base de agar sangre (Agar Infusin) Frmula aproximada para 1 L


Infusin de msculo cardiaco Peptona de casena Extracto de levadura Cloruro de sodio Agar Solucin a 25 C pH 7.3 0.2 2.0 13.0 5.0 5.0 15.0 g g g g g

Agar Infusin (FDA medio M21) Frmula aproximada para 1 L


Infusin de msculo cardiaco Peptona de carne Cloruro de sodio Agar Solucin a 25 C pH 7.3 0.2 375.0 10.0 5.0 15.0 g g g g

Usos
Este medio de cultivo adicionado de sangre de carnero desfibrinada estril es adecuado para el aislamiento de bacterias exigentes a partir de diversas muestras e investigar su actividad hemoltica.

Inoculacin
Sembrar las placas sobre la superficie del medio de cultivo por estra cruzada y picadura sobre las estras, lo que permite observar con mayor claridad la actividad hemoltica como resultado de la accin bacteriana. Incubar a 36 C 2 de 24 a 48 h protegido de la luz.

Medios Alternos
Base de Agar Sangre con bajo pH, es un agar con un pH de 6.8, adicionado con 1% de glicerol y de un 15 20% de sangre desfibrinada proporciona un medio excelente para el

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aislamiento de neumococos, gonococos, meningococos. Tambin est indicado para estudiar reacciones de hemlisis. Para el aislamiento de Mycobacterium tuberculosis, la base de agar sangre con 0.1% de glicerol, 2.5% de sangre humana y 100 unidades por mililitro ha sido empleada con buenos resultados. Base de Agar Sangre con azida, es un medio selectivo para aislar estreptococos y estafilococos. Puede ser usado solo o con adicin de sangre de carnero desfibrinada (5%) para estudiar simultneamente las reacciones hemolticas, este medio puede usarse para la preparacin de cultivos primarios en placa, para descubrir y aislar estreptococos y estafilococos en aguas de drenaje, aguas de albercas, alimentos y otras fuentes con flora mixta. La azida sdica inhibe los microorganismos gramnegativos.

Resultados
Despus de 18 a 24 h de incubacin, las colonias de estreptococos del grupo A tienen aproximadamente 0.5 mm de dimetro, son translcidas o transparentes y tienen una superficie lisa o mate. El halo de -hemlisis es habitualmente igual a 2 4 veces el dimetro de la colonia. Las colonias son convexas y con bordes enteros. Los grupos C y G tienen un aspecto similar, aunque las colonias de algunas cepas del grupo G pueden tener una coloracin dorada, los halos de hemlisis son muy grandes. Los estreptococos grupo B forman colonias ms grandes, el halo de hemlisis es comparativamente menor para los estreptococos grupo B que para los dems estreptococos -hemolticos, y la hemlisis es en general ms dbil y menos evidente. Una proporcin importante de estreptococos grupo B (11 % aproximadamente) pueden ser no hemolticos. Las colonias del grupo D tienden a ser ms grandes de 0.5 1.0 mm Despus de 12 h de incubacin, son -hemolticos o no hemolticos. Las colonias son grises, lisas y con bordes enteros.

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Los estreptococos del grupo F forman colonias muy pequeas en punta de alfiler con un gran halo de -hemlisis. Estas colonias extremadamente pequeas de denominan colonias diminutas. Streptococcus pneumoniae presenta diferentes tipos de colonias, cuyo aspecto depende del grado de capsulacin. Estas colonias se encuentran en general rodeadas por un gran halo de -hemlisis intensamente verde. Las colonias de cepas con grandes cpsulas pueden tener varios milmetros de dimetro, son de aspecto mucoides, grisceo y pueden parecerse a gotas de aceite sobre la superficie del agar. Las colonias de cepas con cpsulas ms pequeas son ms chicas. Por incubacin prolongada, la zona central de la colonia puede colapsarse y adoptar la caracterstica forma de ficha de damas, algunas pueden colapsarse en su totalidad y aparecern como la cabeza de una tachuela sobre la superficie del agar.
Tabla 9 Interpretacin en Base de agar sangre Microorganismo
Streptococcus pyogenes Streptococcus pneumoniae Staphylococcus aureus Haemophilus influenzae

Cepa
ATCC 19615 o 12375

Caractersticas de las colonias


Ccolonias grisceas, translucidasopacas, pequeas (1mm), o colonias mate, mucoides (2 4mm) rodeada por una zona de - hemlisis. Colonias planas, lisas, translucidas grisceas y pueden ser mucosas, rodeada por una zona de -hemlisis. Colonias cremosas opacas, de blanco amarillo dorado con o sin una zona de -hemlisis. No hay desarrollo.

ATCC 6305 o 6301 ATCC 25923 ATCC 19418

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Tabla 10 Identificacin de la hemlisis (7). Tipo de hemlisis Caractersticas


Lisis parcial de los eritrocitos que rodean una colonia, produciendo un cambio de color gris verdoso o amarronado del medio de cultivo. Lisis completa de los glbulos rojos que rodean una colonia, produciendo la eliminacin total de la sangre del medio de cultivo. Ausencia de hemlisis y en consecuencia, no se observa alteracin del color del medio que rodea a una colonia. Los microorganismos que no producen hemlisis se denominan habitualmente no hemolticos. Un pequeo halo de eritrocitos intactos, adyacentes a la colonia, con un halo de hemlisis completa que rodea el halo de eritrocitos intactos. Este tipo de hemlisis puede confundirse con la hemlisis. Se denomina tambin hemlisis de halo amplio.

Limitaciones
Las colonias de Haemophilus haemolyticus son -hemolticos en agar sangre de caballo y agar sangre de conejo, en ambos se distinguen las colonias de estreptococos -hemolticos. Debido a que la sangre de carnero es deficiente en nucletidos de piridina y no soporta el crecimiento de esta especie bacteriana.

Observaciones
La sangre humana (de bancos de sangre) deben evitarse por los efectos posibles: antibiticos, anticuerpos (antiestreptolisina) y anticoagulantes, los cuales pueden causar inhibicin total o parcial de los microorganismos aislados. Se recomienda el uso de sangre desfibrinada ya que el empleo de la sangre no coagulada por el uso de citrato como anticoagulante, puede inhibir a los estreptococos.

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Agar Chocolate
Es un medio desarrollado para el aislamiento y cultivo de microorganismos exigentes, especialmente del gnero de Neisseria y Haemophilus as como de otras especies, las cuales no se desarrollan en agar sangre de carnero. El agar chocolate mantiene el mismo principio que el agar sangre excepto que durante la preparacin los glbulos rojos son lisados cuando se agrega el agar base fundido. Esta lisis libera nutrientes intracelulares como hemoglobina, y otros factores para ser utilizadas por las bacterias exigentes. La lisis de los glbulos rojos otorga al medio un color castaochocolate que da su nombre a este agar. Carpenter y Morton describen un medio mejorado para el aislamiento de los gonococos en 24 h (11). La eficiencia de este medio, Agar GC con un suplemento de hemoglobina y concentrado de levadura, fue demostrado en un estudio de doce medios hasta entonces usados para el aislamiento de los microorganismos. El medio fue mejorado al remplazar el concentrado de levadura con un aditivo qumico IsoVitale3 (BBL Microbiology Systems, MD) y Supplement B (Difco Laboratories, MI), definido qumicamente como un suplemento que provee del factor V (la coenzima nicotinamida adenina dinucletido o NAD), vitaminas (B12, clorhidrato de tiamina) coenzimas, dextrosa, minerales (hierro, magnesio) y otros factores (cistena y glutamina), especiales para el desarrollo de Neisseria gonorrhoeae. La Base de Agar contiene nutrientes nitrogenados en la forma de casena y peptona de carne, solucin amortiguadora de fosfatos que mantienen la estabilidad del pH y almidn de maz, el cual neutraliza los cidos grasos txicos que puede presentarse en el agar. La hemoglobina es la fuente del factor X (hemina) necesario para el desarrollo de especies de Haemophilus. Y los aditivos de polienriquecimiento se mencionaron con anterioridad. Existen varias frmulas de base de agar para la preparacin del Agar chocolate se enlistan algunas de ellas que pueden encontrarse en forma comercial (13).

ISOVITALE Y SUPPLEMENT B son marcas registradas.

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Frmula
Agar Chocolate Frmula aproximada para 1 L
Peptona proteosa No.3 Agar Cloruro de sodio Fosfato dipotsico Almidn de maz Fosfato monopotsico Hemoglobina Suplemento de enriquecimiento Solucin a 25 C pH 7.0 0.2 15.0 10.0 5.0 4.0 1.0 1.0 100.0 10.0 g g g g g g mL mL

Agar Chocolate enriquecido


Medio base GC Solucin de hemoglobina Suplemento 740.0 250.0 10.0 mL mL mL

Medio base GC Frmula aproximada para 1 L


Peptona proteosa No.3 Agar Cloruro de sodio Fosfato dipotsico Glucosa Almidn de maz Fosfato monopotsico Solucin a 25 C pH 7.0 0.2 15.0 20.0 5.0 4.0 1.5 1.0 1.0 g g g g g g g

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Agar Chocolate II con Hemoglobina e Iso Vitale X


Agar base GCII Iso Vitale X 990.0 10.0 mL mL

Agar Base GCII Frmula aproximada para 1 L


Agar Hemoglobina Casena pancretica Peptona de carne Cloruro de sodio Fosfato dipotsico Almidn de maz Fosfato monopotsico Solucin a 25 C pH 7.3 0.2 12.0 10.0 7.5 7.5 5.0 4.0 1.0 1.0 g g g g g g g g

Usos
Los medios de cultivo elaborados a partir de sta base, se utilizan para el aislamiento de bacterias de los gneros Neisseria, Haemophilus y Gardnerella.

Inoculacin
Sembrar en la superficie del medio de cultivo una zona pequea masivamente y a partir de sta aislar por estra cruzada, en forma suave y ligera a fin de obtener colonias aisladas. Incubar en atmsfera parcial de CO2 (Tcnica de la vela) a 35 C 2de 24 a 48 h protegido de la luz.

Medios Alternos
Los medios recomendados son: Agar de Thayer-Martn modificado (MTM)

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Resultados

Agar Martn-Lewis (ML) Agar NYC entre otros

Una prueba que contribuye a identificar las colonias del gnero Neisseria consiste en demostrar la produccin de oxidasas, vertiendo unas gotas de solucin al 0.5% de N:N: dimetilparafenilendiamina. Una reaccin positiva se manifiesta por la aparicin de una coloracin rosada que posteriormente se oscurece, dando lugar a la muerte de las bacterias en la colonia.
Tabla 11 Interpretacin en Agar Chocolate

Microorganismo
Haemophilus influenzae Streptococcus pneumoniae Neisseria gonorrhoeae

Cepa
ATCC 49247 ATCC 6305 o 6301 ATCC 49226

Caractersticas de las colonias


Pequeas (1mm), hmedas, perladas con olor caracterstico. Buen desarrollo. Pequeas, blancas a grisceas, mucoides.

Limitaciones
En este medio no se pueden determinar las propiedades hemolticas de H. haemolyticus y el H. parahaemolyticus, lo que elimina una forma importante a travs de la cual estos microorganismos pueden diferenciarse del H. influenzae. Tambin se requiere experiencia para diferenciar visualmente colonias de Haemphilus de otras bacterias que crecen en cultivos mixtos.

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Agar Mueller Hinton


En la dcada de 1960 en los laboratorios de Microbiologa clnica se utilizaban una amplia variedad de procedimientos para la determinacin de la sensibilidad de las bacterias a los antibiticos y compuestos quimioteraputicos, Kirby-Bauer y otros colaboradores desarrollaron un procedimiento en el cual el Agar Mueller Hinton fue seleccionado como el medio ms apropiado. Un estudio posterior confirm el valor de este agar para el propsito requerido; la simplicidad de la frmula, una buena reproducibilidad y el valor de los datos experimentales obtenidos les permite emplearlo como medio de pruebas de susceptibilidad. El mtodo de Kirby-Bauer, es uno de los mtodos que el CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute) recomienda para la determinacin de la sensibilidad bacteriana a los antimicrobianos (11). El procedimiento de Kirby-Bauer es recomendado para las pruebas de crecimiento rpido de bacterias patgenas aerobias y anaerobias facultativas tales como estafilococos, enterobacterias, bacilos aerobios gramnegativos, por ejemplo Pseudomonas sp. y Acinetobacter sp., Vibrio cholerae y enterococos. El procedimiento es modificado para especies exigentes con sangre de carnero al 5%. El hidrolizado cido de la casena y el extracto de carne suministran aminocidos y otras sustancias nitrogenadas, minerales, vitaminas, carbono y otros nutrientes que permiten el crecimiento de los microorganismos. El almidn acta como un coloide protector contra sustancias txicas que pueden estar presentes en el medio. La hidrlisis del almidn durante el tiempo de esterilizacin en el autoclave proporciona una pequea cantidad de dextrosa, que es una fuente de energa. El agar es el agente solidificante. El procedimiento de KirbyBauer (14) se basa en la difusin a travs de un gel de agar de sustancias antimicrobianas que se impregnan en discos de papel. En contraste con los mtodos anteriores que empleaban discos con concentraciones altas y bajas de antibiticos y se interpretaban por la presencia o ausencia de zonas de inhibicin. La concentracin del antibitico en la interface entre bacterias en crecimiento y bacterias inhibidas se conoce como concentracin crtica y se aproxima a la Concentracin Inhibitoria Mnima (CIM). Obtenida por mtodos de dilucin.

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En este mtodo se utiliza una muestra del microorganismo, se aplica sobre toda la superficie del medio. Los discos impregnados de los antibiticos o agentes antimicrobianos se colocan en la superficie del medio, tan pronto estos entran en contacto con la humedad del agar, el filtro absorbe agua y el antibitico difunde radialmente a travs del espesor del agar a partir del disco, formndose un gradiente de concentracin. Transcurridas de 18 a 24 h de incubacin, los discos aparecen rodeados por una zona de inhibicin. La determinacin de la sensibilidad, sensibilidad intermedia o la resistencia a un agente se realiza mediante la comparacin de tamaos de zonas obtenidos a los criterios de la CLSI M-100. En el trabajo de laboratorio de rutina los discos se adquieren comercialmente y el fabricante proporciona los criterios para la lectura de los resultados. Se han identificado a diversos factores que influyen en la difusin del disco. Estos son el medio, el exceso de humedad en la superficie del medio, la profundidad de agar, la potencia del disco, la concentracin del inculo, pH y la produccin de -lactamasas.

Frmula
Frmula aproximada para 1 L
Extracto de carne Peptona de casena cida Almidn Agar Solucin a 25 C. pH 7.3 0.1 2.0 17.5 1.5 17.0 g g g g

Usos
El agar Mueller Hinton es recomendado para pruebas de sensibilidad a antibiticos de uso frecuente (antibiograma), el crecimiento rpido de las bacterias en este medio fue originalmente desarrollado para el cultivo de microorganismos patgenos como Neisseria. Sin embargo este microorganismo puede ser aislado con medios selectivos especficos (12).

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Procedimiento
1. Preparar el medio de Mueller Hinton y depositar aproximadamente 25 mL del medio sobre las placas estriles de 90 mm de dimetro (si las placas son de mayor dimetro, calcular el volumen necesario para obtener un grosor del agar de 4 mm aproximadamente). Las placas pueden guardarse en refrigeracin hasta su uso evitando en lo posible almacenen agua de condensacin. 2. Recoger con una asa bacteriolgica 3 a 5 colonias iguales de la placa de cultivo de 18 a 24 h de incubacin y sembrarlas en 5 mL de medio lquido (Infusin cerebro corazn, Caldo Todd Hewitt, Caldo soya tripticasa, etc.) e incubar a 35 C durante 2 a 6 h, hasta conseguir o superar una turbidez del 0.5 de la escala de MacFarland4, si la turbidez es superior, se realiza el ajuste necesario con solucin salina estril. 3. Antes de que transcurran 15 minutos de haber ajustado el inculo, introducir un hisopo de algodn estril dentro de la suspensin y al retirarlo rotar varias veces contra la pared del tubo por encima del nivel del lquido con la finalidad de eliminar el exceso de inculo. 4. Inocular las placas de agar Muller Hinton completamente sin dejar ninguna zona libre. Esto se consigue deslizando el hisopo por la superficie del agar tres veces, rotando la placa unos 60 cada vez y pasndola por ltimo por la periferia del agar para conseguir una siembra uniforme. Dejar secar de 3 a 5 minutos antes de colocar los discos. 5. Colocar los discos5 con dispensadores o manualmente con pinzas estriles. Es necesario asegurarse de hacer un contacto completo con la superficie del medio, por lo que deben presionarse ligeramente sobre la superficie del agar. No deben colocarse a menos de 15 mm del borde de la placa, y deben distribuirse de forma que no se produzca superposicin de los halos de inhibicin. 6. Antes de transcurrir 15 minutos de la aplicacin del disco invertir la placa e incubar a 35 C 7. Revisar las placas despus de 16 18 h de incubacin.
4 5

ver anexo 3 La FDA recomienda las siguientes especificaciones para los discos: deben medir 6.5 0.5 mm de dimetro y el peso del papel debe ser de 30 mg 4 cm2.

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Medios Alternos
Sin sugerencias.

Resultados
Despus de 18 h de incubacin leer el dimetro de las zonas completas de inhibicin con una regla. Las zonas de los medios transparente se miden sobre el reverso de la placa y los medios que contienen sangre, sobre la superficie del agar. Cuando aparecen colonias dentro del halo de inhibicin, puede tratarse de mutantes resistentes, contaminaciones, poblaciones heterogneas o cultivos mixtos y conviene volver a identificarlas y realizar otra vez el ensayo de sensibilidad antimicrobiana. Comparando los dimetros del halo de inhibicin con las CMIs y estableciendo las correspondientes rectas de regresin, se han fijado unos criterios para clasificar las cepas estudiadas. De esta forma se han fijado tres categoras: Sensible (S), Intermedia (I) y Resistente (R). Las interpretaciones estn establecidas por el CLSI, pero por regla general, un dimetro de inhibicin de 3035 mm es indicativo de una cepa altamente sensible mientras que dimetros de zona de inhibicin inferiores a 15 mm son los que presentan las cepas resistentes.

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Tabla 12 Clasificacin de la sensibilidad de los halos de inhibicin


Clasificacin Sensible Resultados Indica que la infeccin ocasionada por la cepa para la que se ha determinado la CMI o su correspondiente halo de inhibicin puede tratarse de forma adecuada empleando las dosis habituales del antimicrobiano. Indica que el halo traducido en valores de CMI se aproxima a las concentraciones de antimicrobiano alcanzables en sangre y que puede esperarse eficacia clnica en aquellas localizaciones en que se alcanzan altas concentraciones de antimicrobiano o cuando se emplean dosis ms elevadas de lo habitual. Aquellos microorganismos que no se inhiben por las concentraciones habitualmente alcanzadas en sangre/tejidos del correspondiente antimicrobiano, o aquellos microorganismos en los que existen mecanismos de resistencia especficos para el agente estudiado.

Intermedio

Resistente

Limitaciones
Un gran nmero de factores pueden afectar los resultados: el tamao del inculo, la tasa de crecimiento del microorganismo, la formulacin del medio, el pH, el contenido del disco y el tipo de frmaco, el tiempo de incubacin, la velocidad de difusin y la lectura del punto final. Por lo tanto es indispensable se realice el mtodo sealado por el fabricante del medio y de los discos. Es recomendable utilizar el mtodo de suspensin directa de colonias para el estudio de microorganismo de crecimiento difcil en medios lquidos (Haemophilus sp., Neisseria sp. y estreptococos) y en estafilococos en los que se requiera detectar la resistencia a oxacilina.

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Agar Leche
El agar Leche es recomendado por la British Standards Institute para el recuento de microorganismo en la leche lquida, helados, leche en polvo y suero (11). La leche lquida es un alimento altamente perecedero con una vida til de slo 5 -10 das Despus de la pasteurizacin. La contaminacin puede surgir por diversos factores, la suciedad o las ubres enfermas de los bovinos, inadecuada limpieza en el ordeo y equipos de almacenamiento. La mastitis o inflamacin de la ubre puede causar contaminacin con Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae, Escherichia coli o ms raramente, Yersinia enterocolitica y Leptospira especie. La excrecin de estos organismos puede aumentar la leche a granel hasta en una cuenta de 105 organismos/mL. La limpieza deficiente de las instalaciones de ordeo puede causar contaminacin con micrococos, estreptococos, coliformes o cepas de Bacillus, dando un aumento del recuento de leche a granel de 5 104 organismos/ mL. El deterioro de la leche pasteurizada o cruda por bacterias psicrfilas proteolticas puede ocurrir en almacenamientos prolongados por debajo de 7 C. La peptona y el extracto de levadura proporcionan los nutrientes esenciales y la leche descremada en polvo es una fuente de casena. La dextrosa es la fuente de carbono. El agar es el agente solidificante. Las bacterias proteolticas pueden rodearse por una zona clara debido a la conversin de la casena en compuestos nitrogenados solubles.

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Frmula
Frmula aproximada para 1 L.
Triptona Extracto de levadura Dextrosa Leche en polvo descremada(s/antibiticos) Agar Solucin a 25 C pH 6.9 0.1 5.0 2.5 1.0 1.0 12.5 g g g g g

Usos
El Agar Leche es empleado para realizar recuentos de bacterias en leche, helados, productos lcteos y aguas de lavado de equipo empleado en su fabricacin.

Inoculacin
Este medio puede sembrarse con una buena cantidad del material en estudio, directamente en la placa por estra superficial o bien pueden prepararse diluciones de 1/10, 1/100, 1/1000 en solucin de Ringer. Se distribuyen en las placas 1 mL de cada dilucin y se adiciona de 10 12 mL de Agar Leche a una temperatura de 45 C, se mezcla y se distribuye homogneamente en toda la caja, esperar a solidificar e incubar a 30 2 C por 72 h protegida de la luz.

Medios Alternos
No hay sugerencias.

Resultados
Se seleccionan las placas que contengan de 10 a 300 colonias. Los resultados se expresan como colonias por mL de producto probado.

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Las colonias se pueden observar mejor inundando las placas con una solucin de cido clorhdrico al 1% o cido actico al 10% y se retirando el exceso de la misma. Se realiza el recuento de las colonias rodadas de zonas claras. En la siguiente tabla se describen las caractersticas especficas de las colonias de algunas cepas de referencia.
Tabla 13 Interpretacin en Agar Leche

Microorganismo
Lactobacillus rhamnosus Lactococcus lactis Staphylococcus aureus Streptococcus thermophilus

Cepa
ATCC 9595 ATCC 19435 ATCC 25923 ATCC 19258

Caractersticas de las colonias


Buen desarrollo. Buen desarrollo. Buen desarrollo. Buen desarrollo.

Limitaciones
Empleado nicamente para productos lcteos.

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Agar Tioglicolato
El medio lquido de tioglicolato fue diseado por Brewer para el cultivo rpido tanto de anaerobios como aerobios. La incorporacin de peptona de casena fue introducida por Vera en 1944. En el caso del agar Tioglicolato se aumenta la cantidad de agar pero el fundamento es similar (15). Las peptonas, la levadura y la dextrosa proporcionan los factores de crecimiento necesarios para el desarrollo bacteriano, El tioglicolato sdico y la L-cistina son agentes reductores que previenen la acumulacin de perxidos, que son letales para algunos microorganismos. La resazurina es un indicador de oxido reduccin, presenta un color rosa con la muestra oxidada y es incolora cuando est reducida (15). Frmula aproximada para 1 L.
Agar Hidrolizado de casena Dextrosa Extracto de levadura Cloruro de sodio Tioglicolato de sodio L-cistina Resazurina Solucin a 25 C pH 7.2 0.2 20.0 15.5 5.5 5.0 2.5 0.5 0.5 0.001 g g g g g g g g

Usos
Recomendado para el cultivo de microorganismos aerobios y anaerobios en pruebas de esterilidad.

Inoculacin
La muestra puede sembrarse directamente en la placa por estra superficial, incubar a 35 2 de 40 a 48 h en condiciones anaerobias.

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Medios Alternos
No hay sugerencias.

Resultados

Tabla 14 Interpretacin en Agar Tioglicolato

Microorganismo
Clostridium perfringens Clostridium sporogens Clostridium botulinum

Cepa
ATCC 12924 ATCC 11437 ATCC 25763

Caractersticas de las colonias


Desarrollo abundante. Desarrollo abundante. Desarrollo abundante.

Limitaciones

Empleado anaerobias.

para

pruebas

de

esterilidad

bajo

condiciones

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2.6 Medios cromognicos


En los ltimos aos, se han producido avances importantes en la formulacin de los medios de cultivo diferenciales con la aparicin de medios cromognicos, los cuales posibilitan un diagnstico ms rpido y con mayor eficiencia. Los mismos poseen combinaciones de sustratos cromognicos y fluorognicos, que permiten la deteccin de actividades enzimticas especficas de ciertos microorganismos, eliminando la necesidad de subcultivos y pruebas bioqumicas adicionales para lograr una identificacin precisa. De ese modo, se mejora tambin la sensibilidad y especificidad del diagnstico con respecto a los medios convencionales. Estos medios incluyen en su composicin sustratos cromognicos de enzimas especficas bacterianas. Cuando la enzima acta sobre estos cromgenos, estos sufren un cambio en su estructura, formndose una nueva estructura molecular coloreada. La interaccin entre los microorganismos y los sustratos cromognicos, depende del tipo de sustrato usado, pues la sustancia coloreada producida puede quedar absorbida en el interior de la clula bacteriana coloreando la colonia o difundir en el medio de cultivo produciendo un cambio de color. Los O-glicsidos derivados de cumarinas e indoles son muy usados como sustratos fluorognicos y cromognicos para detectar la presencia de bacterias patgenas (coliformes, E. coli, Enterococcus sp.) tanto en la clnica como en diferentes productos para el consumo humano: agua, alimentos, etc. Los siguientes cromognos son utilizados a nivel mundial (16). El 4-metilumbeliferil--D-glucopiransido. El cido 4-metilumbeliferil--D-glucopiranosidurnico. El 5-bromo-4-cloro-1H-indol-3-il -D-galactopiransido. El 6-cloro-1H-indo-3-il--D-galactopiransido. La sal de ciclohexilamonio del cido 5-bromo-6-cloro-1H-indo-3-il-D-glucuronido.

La intensidad y la especificidad de dichos colores en las colonias cultivadas en los medios cromognicos optimizan la enumeracin haciendo ms fcil la rpida identificacin de las colonias bacterianas. Los resultados se pueden obtener en 24 48 horas y la interpretacin resulta ms fcil mediante el color de las colonias.

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Actualmente casi todos los fabricantes a nivel mundial ya comercializan este tipo de medios de cultivo que sin duda optimiza el tiempo y costo para los laboratorios de Microbiologa que dependen de diagnsticos rpidos y precisos. Algunos de los medios encontrados en el mercado se enlistan y tal como es el caso de los medios de cultivo tradicionales cada fabricante tiene diferentes denominaciones. Identificacin para estafilococos. Identificacin de especies de Candida. Identificacin de Salmonella sp. y sus serotipos. Identificacin de patgenos del tracto urinario. Identificacin del grupo de bacterias: Klebsiella sp., Enterobacter, Serratia y Citrobacter. Identificacin de Clostridium perfringens en agua. Identificacin de E.coli. y coliformes.
Recomendaciones

El almacenamiento de los medios de cultivo deshidratados es hasta de 2 aos, pero se recomienda almacenar las placas preparadas hasta 3 meses y placas de filtracin hasta 6 meses en temperaturas de 2 8 C, protegidas de la luz y fuentes de calor. Sin embargo es necesario observar las especificaciones de cada fabricante. Despus de usar, las placas deben tratarse como material contaminado y deben eliminarse segn la buena praxis microbiolgica. Esto puede hacerse mediante autoclave o bien de acuerdo a la norma vigente.

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Captulo III. Preparacin y control de calidad 3.1 Preparacin de medios y control de calidad
La preparacin de medios

Es de suma importancia el que se proteja la calidad de los medios de cultivo con la finalidad de obtener buenos resultados en el laboratorio microbiolgico. La preparacin de los medios, el almacenamiento apropiado y las pruebas de control de calidad pueden asegurar medios de cultivo de buena calidad. La eleccin de los medios de acuerdo a la necesidad propia de cada laboratorio implica la adquisicin de medios deshidratados o medios previamente fabricados, estos se acompaan con la frmula e instrucciones de preparacin de cada fabricante, es de especial inters para el presente trabajo hacer hincapi en que los distintos tipos de medios pueden tener diferentes requisitos de preparacin (calentamiento, aditivos, ajustes de pH etc.) y es importante seguir las instrucciones para asegurar la preparacin de medios de buena calidad. En el caso de los medios fabricados deben estar acompaados de un certificado de anlisis donde se encuentren los siguientes datos: fecha de caducidad y condiciones sugeridas de almacenamiento, en ciertos casos algunos proveedores incluyen en sus resultados los organismos de control de calidad empleados para la promocin de crecimiento y pruebas de selectividad para esos medios.
Mtodo

Todos los fabricantes de medios de cultivos tienen especificadas las cantidades reales para la preparacin de un litro del medio, por lo cual se debe considerar la cantidad que se necesite preparar y realizar los clculos necesarios. Para disolver el medio se recomienda adicionar el polvo al matraz Erlenmeyer6 e inclinarlo, adicionar el agua fra por las paredes procurando girar el matraz para ir resuspendiendo todo el slido7, dejar reposar de 10 15 minutos hasta que se hidrate completamente, aadir la cantidad de agua necesaria de acuerdo a los clculos realizados y
6

Con una capacidad de ms del 50% de la cantidad a preparar, esto con la finalidad de realizar una buena agitacin sin la preocupacin de derrames. 7 Evitar que el agua caiga sobre el polvo, ya que se generaran grumos imposibles de solubilizar.

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agitar. Es posible emplear agua caliente en vez de fra, esto acelera la solubilizacin del medio.8 Se recomienda el uso de guantes de carnaza para evitar quemaduras y trabajar en una mesa con un rea de no menor a un metro, para tener el espacio y la libertad de manipular el material necesario. El siguiente paso de acuerdo con las instrucciones de los fabricantes es calentar a ebullicin por un minuto, aunque no existe documentada una razn especfica para realizar este paso, pudiera influir en la calidad de la transparencia y limpieza de los medios resultantes.9 Este paso tiene que realizarse con sumo cuidado, acercando por unos instantes el matraz a la llama del mechero Fisher y retirando, con la finalidad de mantenerlo en ebullicin por un minuto pero evitando los derrames que se presentan cuando hay un calentamiento permanente y brusco, esto se debe realizar con una agitacin continua para evitar quemar el medio. Colocar la torunda de algodn forrada con gasa en la boca de matraz, procurando quede fijo pero no apretado y cubrir con un gorro de papel Kraft e identificar el medio. Esterilizar en autoclave o en olla de presin bajo las condiciones requeridas 121 C (15 lbs. de presin) por 15 minutos (en algunos medios no es necesario este paso, por lo cual siempre se tiene que revisar las indicaciones del fabricante). Enfriar el medio a temperatura ambiente hasta 45 C aproximadamente (se puede comprobar esta, acercando el matraz a la mejilla, cuando la temperatura es tolerable en este momento se puede vaciar el medio). Vaciar en las cajas estriles, en condiciones aspticas (la zona de trabajo previamente sanitizada y en la proximidad de la llama de dos mecheros Bunsen o en campana de flujo laminar, as como proteccin con cubre bocas y cofia por parte del usuario), aproximadamente 30 mL
8

la tcnica que sugiere la F.E.S. Zaragoza para cantidades mayores a 300 mg es hervir tres cuartas partes de agua destilada y suspender el medio deshidratado en el resto de agua fra, teniendo cuidado de que todo el medio sea suspendido uniformemente, entonces la suspensin se aade al agua hirviendo hasta que la solucin sea completa (17). 9 la tcnica de preparacin de los medios de cultivo de la Facultad de Qumica de la UNAM indica que se puede realizar la disolucin calentando a bao mara (18).

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del agar. Es necesario realizarlo con rapidez para evitar la solidificacin del medio, si esto sucediera basta con calentarlo ligeramente. Las cajas se mueven en forma de ocho para distribuir uniformemente el medio y una vez solidificadas se invierten. Conservar las cajas apiladas una sobre otra y envolverlas con pelcula de plstico adherente Ega Pack (empleado para cubrir alimentos) a una temperatura de 2 8 C. NOTA: Cada medio requiere de indicaciones especficas, en el caso del agar chocolate y el agar sangre, la adicin de la sangre se realiza a los 80 y 45 C respectivamente Despus de la esterilizacin por lo que es necesario que se revise las indicaciones del fabricante.
Control de Calidad

La preparacin uniforme de medios requiere de algunos cuidados en el procedimiento (19). El agua empleada en los medios es agua destilada o desionizada, siempre es necesario registrar el volumen de agua empleada. El peso de los medios deshidratados o de exactitud, los utensilios y recipientes de para evitar contaminaciones que alteren la terminados, adems de llevar registros de los los constituyentes requieren pesado deben estar limpios composicin de los medios pesos de cada componente.

Los medios deshidratados deben disolverse bien en agua antes de su esterilizacin y dispensacin. En algunos casos se necesita calentamiento para disolver los medios, se debe tener cuidado de no sobrecalentar, puesto que todos los medios de cultivo, en mayor o menor medida son sensibles al calor, adems de que se podra presentar un burbujeo que derramara parte de la mezcla. Es recomendable seguir exactamente las instrucciones especificadas por el fabricante impreso en las etiquetas de los envases. Una indicacin general de sobrecalentamiento es el oscurecimiento de los medios (reaccin tipo Maillard), reaccin no enzimtica que produce la aparicin de un color amarronado. Otro factor importante es la mezcla adecuada del medio Despus de agregar los suplementos requeridos. Por lo tanto los equipos utilizados en la preparacin de estos deberan ser los adecuados para controlar el calentamiento, la agitacin y la mezcla de los medios.
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El material de vidrio utilizado para la preparacin de medios que no estn completamente limpios, puede ocasionar la introduccin de sustancias que sean inhibitorias, stas pueden originarse si quedan residuos del detergente Despus del lavado de los recipientes de vidrio o a partir de materiales usados previamente en los recipientes. En la limpieza de los recipientes de vidrio se recomienda remover todos los materiales o sustancias extraas y enjuagar bien el detergente con agua purificada. La esterilizacin10 de los medios debe realizarse dentro de los parmetros provistos por el fabricante o validados por el usuario. La tcnica de esterilizacin empleada es el autoclave por calor hmedo, excepto para casos en los que se requiere ebullicin para evitar el deterioro de los componentes termolbiles de los medios, la esterilizacin por filtracin puede ser tambin apropiada para algunas formulaciones. Los medios preparados comercialmente deben proveer documentacin acerca del mtodo de esterilizacin empleado. Idealmente el fabricante debera proveer el nivel de garanta de esterilidad de los medios contra un indicador biolgico conocido, SAL por sus siglas en ingls (Sterility Assurance Level). Los efectos del mtodo de esterilizacin y las condiciones en los medios deben validarse mediante pruebas de esterilidad y de promocin de crecimiento de los medios. Adicionalmente, si se esterilizan por calor hmedo el ciclo del autoclave debe validarse para asegurar la distribucin adecuada de calor para cargas y volmenes seleccionados. Por lo general los fabricantes recomiendan que se use un ciclo de 121 C (15 lbs. de presin) por 15 minutos empleando un equipo validado. Estas condiciones refieren al tiempo en el que el medio permanece a la temperatura indicada. Como la capacidad de la carga del autoclave influye en la velocidad del calentamiento, puede que se necesiten ciclos ms largos para cargas de mayor tamao. Sin embargo, el tiempo de esterilizacin depender del volumen de los medios y de la carga del autoclave. Los ciclos de esterilizacin en los que el autoclave se calienta despacio puede ocasionar el sobrecalentamiento de los medios. En consecuencia, se debe tener cuidado al validar un ciclo de esterilizacin para que se genere el mnimo requerido de un SAL, balanceando la necesidad de obtener un medio estril contra la tendencia de los medios a degradarse debido al excesivo calentamiento. Despus que se hayan
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Ver anexo 4.

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enfriado no es recomendable almacenar medios en el autoclave tras completarse el ciclo de esterilizacin ya que se pueden daar los medios. El calentamiento o condiciones de esterilizacin inadecuados para medios preparados en el laboratorio o comercialmente pueden originar diferencias, cambio de color, prdida de transparencia, consistencia alterada del gel o variacin de pH del intervalo recomendado por el fabricante. Despus de que se hayan enfriado a temperatura ambiente (25 C) se debera confirmar el pH de cada lote del medio mediante la extraccin asptica de una muestra para la prueba. Para superficies de agar, se recomienda usar una sonda plana para medir el pH y un dispositivo de inmersin para medir los lquidos. El pH de los medios debera estar en un intervalo de 0.2 del valor indicado por el fabricante, a menos que el mtodo del fabricante o el mtodo validado por el laboratorio acepte un intervalo mayor. Los medios preparados deben revisarse mediante una inspeccin adecuada de las placas y tubos en los siguientes aspectos: Envases y cierres rotos Cumplir con el volumen de llenado Deshidratacin que genere grietas o hundimientos (hoyuelos) en la superficie de un medio slido Hemlisis Oscurecimiento excesivo o cambio de color Formacin de cristales debido a posible congelamiento Cantidad excesiva de burbujas Contaminacin microbiana Estado de indicadores redox (si corresponde) Verificacin y registro del nmero y fecha de caducidad del lote Esterilidad de los medios.

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Causas probables de error en la preparacin de medios de cultivo deshidratados FALLA Problemas de pH y cambios de color en el medio de cultivo CAUSA PROBABLE Sobrecalentamiento. Mezclado inadecuado. Exceso de tiempo al esterilizarlo. Recipientes y material de vidrio contaminados. Agua con impurezas y de mala calidad. Fundicin del medio en varias ocasiones. Almacenamiento a temperaturas altas. Hidrlisis de los ingredientes.
Calentamiento inadecuado. Mezclado incompleto por lo que se sobrecalientan algunas porciones del medio. Agua de mala calidad. Recipientes demasiado pequeos, por lo que no es posible homogeneizar el lquido. NOTA: En ciertos casos, existe un precipitado despus de esterilizar el medio, por lo que es necesario agitar suavemente el matraz antes de vaciarlo en las cajas. (Ejemplo: Agar EMB, agar de Mueller Hinton). Sobrecalentamiento al disolver el agar o al esterilizarlo. Mezclado ineficiente. Pesado errneo del polvo deshidratado. pH demasiado cido. Ejemplo: Agar Extracto de Malta, con un pH muy cido no permite la gelificacin del medio. Por fundir el agar varias ocasiones. Por fundir el agar en varias ocasiones Calentamiento prolongado o excesivo, Material quemado en las paredes del recipiente. Mezcla inadecuada.

Solubilidad incompleta

Oscurecimiento (reaccin tipo Maillard) Falta de dureza en el agar

Prdida de las propiedades nutricionales o cambios en las caractersticas del crecimiento.

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3.2 Almacenamiento de medios de cultivo


En el caso de los medios de cultivo deshidratados, los frascos con el polvo deben almacenarse en un lugar fresco y seco evitando la luz directa. Todos los medios de cultivo son higroscpicos por lo que una vez que han sido abiertos, tienden a tomar la humedad del medio ambiente. Es particularmente importante cerrar lo antes posible el tapn interior y la tapa exterior firmemente despus de usar cada frasco. Se recomienda no colocar los frascos en lugares en donde se encuentren aparatos de calentamiento o ventanas, ya que esto puede provocar reacciones indeseables. Para los medios de cultivo en placa se deben etiquetar adecuadamente con el nmero de lote, fecha de preparacin y de caducidad e identificacin de los mismos. Los medios se deben almacenar conforme a las instrucciones del fabricante en el caso de los medios ya preparados. Los medios preparados en el laboratorio deben almacenarse bajo condiciones validadas de 2 8 C, empaquetadas en pelcula de plstico adherente Ega pack (empleado para cubrir alimentos). Esta es preferible a las bolsas de polietileno que retienen la humedad en la forma de acumulaciones de lquido en cada bolsa. No almacenar un agar a temperaturas iguales o bajo cero ya que el congelamiento podra perjudicar la estructura del gel. Proteger a los medios almacenados de su exposicin a la luz y temperaturas excesivas. Si los medios estn bien empaquetados y en la temperatura correcta, la vida til de estantera puede ser de muchos meses. No deben conservarse o usarse las placas tras ese lapso. Una inspeccin til consiste en medir la prdida de agua durante el almacenamiento. Una prdida de peso de 5% sugiere que las placas alcanzaron un estado terminal. Para eliminar los medios de cultivo usados as como los medios caducos se beben seguir los procedimientos de seguridad de riesgo biolgico de la norma vigente.11

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Ver anexo 2: NORMA OFICIAL MEXICANA NOM-087-ECOL-SSA1-2002, PROTECCIN AMBIENTAL - SALUD AMBIENTAL - RESIDUOS PELIGROSOS BIOLGICO-INFECCIOSOS - CLASIFICACIN Y ESPECIFICACIONES DE MANEJO.

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Anexo 1 Rutas Metablicas


Los hidratos de carbono (20) se clasifican en: Monosacridos, aldehdos polhidroxilados o cetonas. Polisacridos u oligosacridos, productos de condensacin de dos o ms monosacridos (polmeros de monosacridos). Alcoholes polihdricos y ciclitoles, productos de la reduccin de monosacridos. Un monosacrido o azcar simple por lo comn contiene entre 1 y 6 tomos de carbono: 1. Tetrosa (C4H8O4), la eritrosa es un azcar de 4 carbonos. 2. Pentosas (C5H10O5), son azcares de 5 carbonos: la ribosa, ribulosa, xilosa y arabinosa. 3. Hexosas (C6H12O6), son azcares de 6 carbonos: la glucosa (dextrosa), galactosa y manosa, son aldosas y la fructosa (levulosa) es un compuesto cetosa. Los disacridos (C12H22O11) son polisacridos (oligosacridos) compuestos por dos unidades de monosacridos, glucosa ms otro monosacrido.

Glucsido es un trmino general que denota un disacrido, sin tener en cuenta el azcar presente.

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El trisacrido contiene tres monosacridos, la rafinosa (C18H32O16) est compuesta por glucosa, fructosa y galactosa. Un polisacrido est compuesto por muchos polmeros monosacridos un ejemplo es la inulina, su unidad es la fructosa. de

Los alcoholes que se denominan en conjunto azcares son alcoholes polihdricos (productos de la reduccin de un monosacrido), entre ellos estn el adonitol, dulcitol, manitol y sorbitol. El inositol es un sustrato orgnico que no pertenece a los hidratos de carbono. Los polisacridos, trisacridos y disacridos son demasiado complejos para penetrar en una clula bacteriana para su degradacin, Si pueden ser metabolizados por una especie bacteriana particular, primero son catabolizados a monosacridos menos complejos por enzimas exocelulares (permeasa) para que puedan ser incorporados al interior de la clula. La fermentacin es un proceso metablico anaerobio de oxidacinreduccin, en el cual un sustrato orgnico acta como el aceptor final de hidrgeno (aceptor de electrones) en lugar de oxgeno. La fermentacin de sustratos orgnicos como los hidratos de carbono da por resultado productos finales reducidos y oxidados. Los productos finales provenientes de las fermentaciones de hidratos de carbono dependen de varios factores: a) el microorganismo que lleva a cabo el proceso de fermentacin, b) el sustrato a ser fermentado, y c) en algunas ocasiones factores ambientales como la temperatura y la acidez. Los hidratos de carbono y alcoholes, en conjunto denominados azcares, rinden pocos productos finales de fermentacin: dos gases, hidrgeno y dixido de carbono, unos pocos cidos, unos pocos alcoholes y una cetona. Algunas bacterias pueden fermentar la glucosa en anaerobiosis, otras oxidan la glucosa (21). Algunas pueden utilizar ambos mecanismos para su metabolismo, mientras que otras no pueden utilizar la glucosa por ningn mecanismo. No todos los monosacridos son degradados por todas las especies bacterianas, sus patrones de fermentacin difieren, lo que ayuda a la identificacin en grupos, gneros o especies. Las bacterias tambin difieren en las vas metablicas utilizadas para fermentar el mismo sustrato, lo que da por resultado distintos productos
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finales, la manera y la magnitud por las cuales un sustrato es catabolizado dependen de las especies bacterianas y de las condiciones de cultivo. El proceso de fermentacin ms comn produce como producto final cido lctico, sin embargo, ocurren otras vas de fermentacin, que difieren con respecto al sustrato metabolizado o al producto final producido. Se pueden utilizar pruebas de hidratos de carbono para revelar los patrones de fermentacin de una especie bacteriana particular por la observacin de: a) la ausencia de glucsidos y/o b) la ausencia de monosacridos en disacridos, trisacridos y polisacridos ms complejos, las cuales demuestran que la glucosa fue metabolizada. Las bacterias que fermentan un hidrato de carbono por lo comn son anaerobias facultativas. En el proceso de fermentacin, un hidrato de carbono se degrada y fracciona en dos triosas, (molculas de carbono), que con posterioridad se degradan a una cantidad de compuestos de 1, 2, 3 y 4 carbonos. Los productos finales varan con cada especie bacteriana, lo que depende del sistema enzimtico presente en la especie y de las condiciones ambientales. El criterio importante es que antes de su degradacin, la glucosa es fosforilada a un compuesto glucosa 6fosfato. La fermentacin requiere un compuesto orgnico como aceptor final de electrones. La va principal fermentativa de degradacin de la glucosa es la va de Embden-Meyerhof-Parnas (EMP), aunque la degradacin puede ocurrir por va o en combinacin con la desviacin (shunt) de la pentosa (va Warburg-Dickins, desviacin de la hexosa monofosfato (HMP) o va de Entner-Doudoroff (ED). Sin embargo, las tres vas requieren la fosforilacin inicial de la glucosa antes de que pueda ocurrir la degradacin (Fig. 4). El cido pirvico (CH3COCOOH) es el intermediario principal en la degradacin de la glucosa y el catabolismo del cido pirvico involucra muchos mecanismos diferentes que forman una variedad de productos finales caractersticos de las fermentaciones bacterianas. Los monosacridos son catabolizados como resultado de la oxidacin a cido pirvico a travs de una secuencia de pasos metablicos mediados por enzimas especficas. Las bacterias pueden utilizar vas diferentes para formar cido pirvico y ms de una va puede ocurrir de manera simultnea en el mismo microorganismo.

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Los productos finales caractersticos de la fermentacin bacteriana son: cido lctico cidos s actico y frmico cido lctico y alcohol etlico (etanol) etanol acetilmetilcarbinol (acetona) y CO2 cido succnico a cido propinico y CO2 CO2 y acetona a alcohol isoproplico (isopropanol) cido butrico a alcohol butlico (butanol).

Fig. 4 Tres vas de fermentacin fosforilada

Las bacterias producen clases diversas de patrones fermentacin de acuerdo con los productos finales formados caractersticos. Segn la
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mayora de los autores, los grupos ms importantes de bacterias exhiben uno de los cinco tipos principales de patrones de fermentacin. Fermentacin alcohlica Glucosa pirvico acetaldehdo 2 etanol+ CO2

Las bacterias alcohlicas degradan la glucosa a cido pirvico por la va metablica de Embden-Meyerhof-Parnas. Fermentacin del cido lctico Las bacterias que producen cido lctico pueden ser divididas en dos subgrupos: fermentadoras homolcticas y heterolcticas. En el caso del cido homolctico o cido lctico simple, las bacterias degradan la glucosa por la va de EMP casi exclusivamente a cido lctico, slo con rastros de otros productos finales. Las fermentadoras heterolcticas a veces se denominan fermentadoras mixtas del cido lctico. Estos microorganismos pueden catabolizar la glucosa por una de las tres vas de degradacin (EMP, desviacin de la pentosa o proceso de EntnerDuodoroft) para dar los productos finales caractersticos: cido lctico ms cido actico y cidos frmicos, etanol y CO2 y a veces glicerol. Una nica especie bacteriana puede exhibir tanto la fermentacin homolctica como la heterolctica. Los factores de control son el pH y el sustrato presente para la actividad bacteriana.

acetaldehdo cido pirvico cido succnico

cido actico cido propinico + CO2

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Fermentacin del cido propinico Los productos finales principales del cido pirvico son el cido propinico (propionato) y CO2 por la va del cido succnico, aunque puede producirse cido actico. Los microorganismos anaerobios llevan a cabo la fermentacin propinica. Fermentaciones del grupo coliforme Los integrantes del grupo coliforme a menudo se denominan fermentadores mixtos de cidos fermentadores del cido frmico o bacterias colnicas-disentricas-tifoideas (grupo CDT). La fermentacin mixta de cidos es caracterstica de los miembros de la familia Enterobacteriaceae y estos microorganismos degradan la glucosa en una diversidad de productos finales. El grupo coliforme puede subdividirse en dos categoras: a) Los microorganismos que rinden diversos productos mixtos de cidos. b) Los que elaboran butilenglicol como principal producto final. El tipo o las combinaciones y cantidades del producto final producidas dependen del gnero o de las especies que se prueban. Los productos de los microorganismos que elaboran varios cidos incluyen los siguientes: cidos frmico, actico, lctico y succnico, etanol y CO2 e H2, pero no butilenglicol (butanodiol). El alcohol se forma por la fermentacin alcohlica; el cido lctico, el cido actico y el CO2 se forman por la fermentacin lctica a travs de la dismutacin del cido pirvico. En la dismutacin, una molcula de cido pirvico es reducida para dar cido lctico y la otra molcula es oxidada y se forma cido actico y CO2. Entre los miembros de la familia Enterobacteriaceae, Escherichia coli exhibe este tipo de fermentacin. 2 molculas de cido pirvico cido actico + cido lctico + CO2

El segundo grupo est compuesto por microorganismos cuyo principal producto final es el butilenglicol. Entre los miembros de la familia Enterobacteriaceae, los grupos Klebsiella-Enterobacter muestran este tipo de fermentacin.

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Fermentacin del alcohol butlico (butanol) La fermentacin del butanol es llevada a cabo por las bacterias anaerobias como Clostridium sp. Los diversos productos finales formados son cido actico, cido frmico, etanol, cido butrico, butanol, acetona, isopropanol y una gran cantidad de CO2 y H2. La combinacin y las cantidades de los productos finales formados dependen del gnero y de las especies bacterianas. Algunos microorganismos producen sobre todo cidos butrico y actico, CO2 e H2, otros producen butilenglicol, acetona, butanol e isopropanol. Sin embargo, no se forma cido lctico. Las pruebas de fermentacin de hidratos de carbono pueden utilizarse para determinar qu productos finales se han formado pero no las vas metablicas utilizadas. Asimismo, el medio contiene otros constituyentes para el crecimiento que pueden degradarse para dar diversos productos finales similares a los producidos por la degradacin de los hidratos de carbono mientras que el microorganismo est utilizando alguno de los carbonos producidos por la degradacin del hidrato de carbono para producir nuevas clulas. El indicador de pH utilizado con ms frecuencia para demostrar la fermentacin del hidrato de carbono es el rojo fenol, ya que la mayora de los productos finales del metabolismo de los hidratos de carbono son cidos orgnicos. Con el rojo fenol, el cambio de color ocurre cerca del pH original del medio (pH cido 6.8, neutro pH 7.4). La peptona en el medio tambin es degradada por las especies bacterianas y produce sustancias alcalinas. El cido producido por la fermentacin de un hidrato de carbono se observa por un cambio de pH slo cuando se produce ms cido por la degradacin del hidrato de carbono que sustancias alcalinas provenientes de la degradacin de la peptona. La observacin de un cambio de color que denota acidez est influenciada por dos factores a) el indicador del pH utilizado y b) las propiedades buffer del medio. Productos por una mol Glucosa Ruta de las Pentosas Entner-Doudoroff 12 NADPH + 12H+ + ATP 2 NADPH + ATP

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Anexo 2 Normas Oficiales Mexicanas


Norma Oficial Mexicana NOM-065-SSA1-1993, Que establece las Especificaciones Sanitarias de los Medios de Cultivo.
Al margen un sello con el Escudo Nacional, que dice: Estados Unidos Mexicanos.- Secretara de Salud. LUIS MOUREY VALDES, Director General de Control de Insumos para la Salud, por acuerdo del Comit Consultivo Nacional de Normalizacin de Regulacin y Fomento Sanitario, con fundamento en los artculos 39 de la Ley Orgnica de la Administracin Pblica Federal; 38 fraccin II, 45, 46 fraccin II, 47 de la Ley Federal sobre Metrologa y Normalizacin; 8o. fraccin IV y 12 fraccin II del Reglamento Interior de la Secretara de Salud. INDICE PREFACIO 1. OBJETIVO Y CAMPO DE APLICACION 2. REFERENCIAS 3. DEFINICIONES, SIMBOLOS Y ABREVIATURAS 4. CLASIFICACION 5. ESP.ECIFICACIONES 6. MUESTREO 7. METODOS DE PRUEBA 8. ETIQUETADO 9. CONCORDANCIA CON NORMAS INTERNACIONALES 10. OBSERVANCIA DE ESTA NORMA 11. VIGENCIA PREFACIO

Participaron en la elaboracin de esta Norma Oficial Mexicana: Direccin General de Control de Insumos para la Salud de la Secretara de Salud, Instituto Mexicano del Seguro Social, Cmara Nacional de la Industria Farmacutica (CANIFARMA): Seccin de Productos Auxiliares para la Salud, y las siguientes empresas: Merck Mxico, S.A., Becton Dickinson, S.A. de C.V., Anachem, S.A. de C.V., Alfonso Marx, S.A. de C.V., Dibico, S.A. de C.V.
1. Objetivo y campo de aplicacin 1.1 Objetivo. Esta Norma tiene por objeto determinar las especificaciones mnimas que deben tener los medios de cultivo para microorganismos en general. 1.2 Campo de aplicacin.

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Esta Norma es de observancia obligatoria en todas las industrias, laboratorios y establecimientos dedicados al proceso de estos productos en el territorio nacional. 2. Referencias La presente Norma se complementa con las siguientes normas oficiales mexicanas: NOM Z-13 "Gua para la redaccin, estructuracin y presentacin de las Normas Oficiales Mexicanas". NOM-008-SCFI-93 "Sistema General de Unidades de Medida". 3. Definiciones, smbolos y abreviaturas 3.1 Definiciones. 3.1.1 Medio de cultivo es el material nutritivo en el que se pueden recuperar, multiplicar y aislar los microorganismos, as como efectuar pruebas de susceptibilidad. 3.1.1.1 Generalmente se presenta desecado en forma de polvo fino o granular. 3.1.1.2 Puede presentarse tambin hidratado y preparado. 3.1.2 Se entiende por proceso el conjunto de actividades relativas a la obtencin, elaboracin, fabricacin, preparacin, conservacin, mezclado, acondicionamiento, envasado, manipulacin, transporte, distribucin, importacin, exportacin, almacenamiento y expendio o suministro al pblico de los dispositivos mdicos. 3.2 Smbolos y abreviaturas. ATCC Coleccin Americana de Cultivos Tipo NOM Norma Oficial Mexicana SI Sistema Internacional de Unidades SSA Secretara de Salud ENCB Escuela Nacional de Ciencias Biolgicas IMSS Instituto Mexicano del Seguro Social 4. Clasificacin 4.1 Por su aspecto fsico, los medios de cultivo preparados pueden ser: Lquidos, Semislidos, Slidos. 4.1.1 Medios lquidos. Se emplean fundamentalmente para: - Cultivar los microorganismos y obtener grandes cantidades de los mismos o bien la produccin de metabolitos especficos. - Estimular y promover la seleccin de algn o algunos microorganismos e impedir que otros se multipliquen. - Identificar al microorganismo estudiado mediante pruebas bioqumicas. 4.1.2 Medios semislidos. - Se utilizan para identificaciones bioqumicas y averiguar si el germen estudiado es mvil. Los medios semislidos tienen una consistencia blanda. 4.1.3 Medios slidos. - Se utilizan para obtener colonias aisladas de microorganismos. Los medios slidos constituyen la mayor parte de los medios de cultivo que se emplean en Microbiologa. 4.2 Por su uso, se clasifican en: 4.2.1 Medios selectivos. Son medios que contienen sustancias que impiden el desarrollo de algunos microorganismos, pero en una flora mixta permiten el aislamiento y recuperacin del germen o grupo de grmenes de inters. 4.2.2 Medios selectivos de enriquecimiento. Son medios lquidos que estimulan la multiplicacin de algn germen determinado e impiden o inhiben la reproduccin de otros. 4.2.3 Medios diferenciales.

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Son aquellos que contienen indicadores de cido base, redox o sustancias que detectan cambios en el medio o en las caractersticas tpicas de las colonias. 4.2.4 Medios para cultivar grmenes anaerbicos. Son medios de cultivo para aquellos grmenes que requieran condiciones de anaerobiosis o de microaerofilia. 4.2.5 Medios de cultivo para medir la potencia de los antibiticos. 4.2.6 Medios de transporte. Sirven para transportar los especmenes que contienen a los microorganismos, del sitio de la toma del producto hasta el laboratorio donde va a efectuarse el estudio. Estos medios impiden que se altere la proporcin original de la flora microbiana en los especmenes. 4.2.7 Medios para filtracin a travs de membrana. Pueden ser lquidos o slidos. En el primer caso, se preparan a la concentracin usual y permiten el crecimiento de microorganismos presentes en la membrana. Los medios slidos tienen un contenido mnimo de agar para favorecer la difusin de nutrientes del medio de la membrana. 4.2.8 Medios especiales para cultivo de hongos y levaduras. 4.2.9 Medios especiales para cultivo de protozoarios. 5. Especificaciones El fabricante debe especificar en cada medio: 5.1 Contenido de humedad (medio deshidratado). 5.2 Composicin del medio. 5.3 Mtodo de preparacin. 5.4 Condiciones de presin y temperatura para la esterilizacin del medio preparado (en autoclave). 5.5 Advertencia de no esterilizar el medio, si es el caso. 5.6 Caractersticas de desarrollo de los microorganismos en el medio. 5.7 Advertencia sobre la conservacin de los medios preparados. 5.8 Resultados de las pruebas de estabilidad del medio. 5.9 Resultado de las pruebas de viabilidad del medio. 5.10 pH del medio preparado. 5.11 Fuerza de gel (si procede). 6. Muestreo 6.1 El muestreo del producto debe estar de acuerdo a la Norma Oficial Mexicana NOM-Z-12 "Muestreo para la Inspeccin por Atributos", partes 1 y 2. 7. Mtodos de prueba 7.1 La viabilidad de los medios debe probarse con cultivos tipo de microorganismos de la ATCC (Coleccin Americana de Cultivos Tipo) u otras cepas certificadas. Centros de Referencia de Cultivos Tipo de la SSA, ENCB o IMSS. 8. Etiquetado 8.1 El etiquetado sobre el envase del medio de cultivo debe ser en idioma espaol, con caracteres claros y legibles, de conformidad con lo establecido en la Ley General de Salud, su Reglamento en Materia de Control Sanitario de Actividades, Establecimientos, Productos y Servicios y las normas oficiales mexicanas que se emitan al efecto, debiendo incluir adems: - Nombre comercial del producto. - Uso. - La leyenda "Agente de Diagnstico". - Presentacin. - Datos de conservacin y almacenaje. - Fecha de caducidad. - Nmero de lote.

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- Nmero de Registro SSA. - Nombre y domicilio del fabricante. - Nombre y domicilio del distribuidor. - Mtodo de preparacin y pH final. - Frmula. 9. Concordancia con normas internacionales Esta Norma no concuerda con ninguna norma internacional. 10. Observancia de esta Norma La vigilancia del cumplimiento de la presente Norma corresponde a la Secretara de Salud, cuyo personal realizar la verificacin y la vigilancia que sean necesarias. 11. Vigencia Esta Norma entrar en vigor al da siguiente de su publicacin en el Diario Oficial de la Federacin. Sufragio Efectivo. No Reeleccin. Mxico, D.F., a 5 de septiembre de 1994.- El Director General de Control de Insumos para la Salud, Luis Mourey Valds.- Rbrica. Fecha de publicacin: 27 de febrero de 1995

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NORMA Oficial Mexicana NOM-087-ECOL-SSA1-2002, Proteccin ambiental - Salud ambiental - Residuos peligrosos biolgico-infecciosos - Clasificacin y especificaciones de manejo.
Al margen un sello con el Escudo Nacional, que dice: Estados Unidos Mexicanos.-Secretara de Medio Ambiente y Recursos Naturales. CASSIO LUISELLI FERNANDEZ, Presidente del Comit Consultivo Nacional de Normalizacin de Medio Ambiente y Recursos Naturales, y ERNESTO ENRIQUEZ RUBIO, Presidente del Comit Consultivo Nacional de Normalizacin, de Regulacin y Fomento Sanitario, con fundamento en lo dispuesto en los artculos 32 bis fracciones I, II, IV, V y 39 fracciones I, VIII y XXI de la Ley Orgnica de la Administracin Pblica Federal; 4 de la Ley Federal de Procedimiento Administrativo; 5 fracciones V, VI y XIX, 15, 36, 37, 37 Bis, 150, 151, 151 Bis, 160 y 171 de la Ley General del Equilibrio Ecolgico y la Proteccin al Ambiente; 3 fracciones XIII y XIV, 13, apartado A) fraccin I, 45, 116, 117, 118, 128, 129 y 393 de la Ley General de Salud; 38 fraccin II, 40, fracciones I, III, V, IV, X y XI, 41, 43, 44 y 47 de la Ley Federal sobre Metrologa y Normalizacin; 1o., 2o. y 4o. fracciones II, III y IV, 5o., 6o. y 58 del Reglamento de la Ley General del Equilibrio Ecolgico y la Proteccin al Ambiente en materia de Residuos Peligrosos; 2 fraccin I incisos a) y c), y 7o. y 66 del Reglamento de la Ley General de Salud en materia de Control Sanitario de Actividades, Establecimientos, Productos y Servicios; 10 del Reglamento de la Ley General de Salud en materia de Prestacin de Servicios de Atencin Mdica; 28, 31 fraccin II, 33 y 34 del Reglamento de la Ley Federal sobre Metrologa y Normalizacin; 8 fraccin V del Reglamento Interior de la Secretara de Medio Ambiente y Recursos Naturales; 2 literal C fraccin II del Reglamento Interior de la Secretara de Salud y 2, fracciones I, II, III, VII, VIII y IX, 7 fraccin XVI, y 12 fraccin VI del Decreto por el que se crea la Comisin Federal para la Proteccin contra Riesgos Sanitarios, ordenan la publicacin en el Diario Oficial de la Federacin de la Norma Oficial Mexicana NOM-087-ECOL-SSA1-2002, Proteccin ambiental-Salud ambiental-Residuos peligrosos biolgico-infecciosos-Clasificacin y esp.ecificaciones de manejo, y CONSIDERANDO Que en cumplimiento a lo establecido en la fraccin I del artculo 47 de la Ley Federal sobre Metrologa y Normalizacin, con fecha 1 de noviembre de 2001 se public en el Diario Oficial de la Federacin, con carcter de proyecto la Norma Oficial Mexicana PROY-NOM087-ECOL-SSA1-2000, Proteccin ambiental- Salud ambiental-Residuos peligrosos biolgico-Infecciosos-Clasificacin y especificaciones de manejo, mismo que fue elaborado de manera conjunta con la Secretara de Salud, con el fin de que dentro de los 60 das naturales siguientes a su publicacin, los interesados presenten sus comentarios ante el Comit Consultivo Nacional de Normalizacin para la Proteccin Ambiental, sito en bulevar Adolfo Ruiz Cortines nmero 4209, piso 5o., colonia Jardines en la Montaa, cdigo postal 14210, Delegacin Tlalpan, Distrito Federal o se enviaron al correo electrnico o al fax que se sealaron. Durante el citado plazo, la Manifestacin de Impacto Regulatorio correspondiente estuvo a disposicin del pblico en general para su consulta en el citado domicilio, de conformidad con el artculo 45 del citado ordenamiento. Que en el plazo de los 60 das antes sealado, los interesados presentaron sus comentarios al proyecto en cuestin, los cuales fueron analizados por el citado Comit,

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realizndose las modificaciones procedentes al mismo. La Secretara de Medio Ambiente y Recursos Naturales public las respuestas a los comentarios recibidos en el Diario Oficial de la Federacin el da 20 de enero de 2003. Que habindose cumplido con el procedimiento establecido en la Ley Federal sobre Metrologa y Normalizacin, el Comit Consultivo Nacional de Normalizacin para la Proteccin Ambiental aprob la Norma Oficial Mexicana NOM-087-ECOL-SSA1-2002, Proteccin ambiental-Salud ambiental-Residuos peligrosos biolgico-infecciososClasificacin y especificaciones de manejo, misma que abroga a su similar NOM-087-ECOL1995 y su aclaracin publicada en el citado rgano informativo el 12 de junio de 1996, Que establece los requisitos para la separacin, envasado, almacenamiento, recoleccin, transporte, tratamiento y disposicin final de los residuos peligrosos biolgico-infecciosos que se generan en establecimientos que presten atencin mdica, actualizando el ao de su expedicin. Por lo expuesto y fundado se expide la siguiente: INDICE 0. Introduccin 1. Objetivo y campo de aplicacin 2. Referencias 3. Definiciones y terminologa 4. Clasificacin de los residuos peligrosos biolgico-infecciosos 5. Clasificacin de los establecimientos generadores de residuos peligrosos biolgicoinfecciosos 6. Manejo de residuos peligrosos biolgico-infecciosos 7. Grado de concordancia con normas y lineamientos internacionales y con las normas mexicanas tomadas como base para su elaboracin 8. Bibliografa 9. Observancia de esta Norma Apndice normativo 0. Introduccin La Ley General del Equilibrio Ecolgico y la Proteccin al Ambiente, define como residuos peligrosos a todos aquellos residuos que por sus caractersticas corrosivas, reactivas, explosivas, txicas, inflamables y biolgico-infecciosas, que representan un peligro para el equilibrio ecolgico o el ambiente; mismos que sern manejados en trminos de la propia ley, su Reglamento y normas oficiales mexicanas que expida la Secretara de Medio Ambiente y Recursos Naturales previa opinin de diversas dependencias que tengan alguna injerencia en la materia, correspondindole a la citada SEMARNAT su regulacin y control. Con fecha de 7 de noviembre de 1995, se public en el Diario Oficial de la Federacin la Norma Oficial Mexicana NOM-087-ECOL-1995, Que establece los requisitos para la separacin, envasado, almacenamiento, recoleccin, transporte, tratamiento y disposicin final de los residuos peligrosos biolgico-infecciosos que se generan en establecimientos que presten servicios de atencin mdica. Los establecimientos de atencin mdica son regulados por la Secretara de Salud por lo que en la revisin de la norma mencionada, se incluye a los representantes del sector. Esta revisin consider las caractersticas de los diferentes tipos de unidades mdicas que prestan atencin a poblaciones rurales. Los residuos peligrosos biolgico-infecciosos se han venido manejando en trminos de las regulaciones ambientales antes sealadas, sin embargo fue necesario actualizar la NOM-

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087-ECOL-1995, tomndose en consideracin las experiencias y competencias de los sectores involucrados en su cumplimiento, con el fin de que sus disposiciones sean operativas y adecuadas para proteger el medio ambiente y la salud de la poblacin en general. 1. Objetivo y campo de aplicacin La presente Norma Oficial Mexicana establece la clasificacin de los residuos peligrosos biolgico-infecciosos as como las especificaciones para su manejo. Esta Norma Oficial Mexicana es de observancia obligatoria para los establecimientos que generen residuos peligrosos biolgico-infecciosos y los prestadores de servicios a terceros que tengan relacin directa con los mismos. 2. Referencias Norma Oficial Mexicana NOM-052-ECOL-1993, Que establece las caractersticas de los residuos peligrosos, el listado de los mismos y los lmites que hacen a un residuo peligroso por su toxicidad al ambiente, publicada en el Diario Oficial de la Federacin el 22 de octubre de 1993. Esta Norma contiene la nomenclatura en trminos del Acuerdo Secretarial publicado el 29 de noviembre de 1994, por el cual se actualiza la nomenclatura de 58 normas oficiales mexicanas. 3. Definiciones y terminologa Para efectos de esta Norma Oficial Mexicana, se consideran las definiciones contenidas en la Ley General del Equilibrio Ecolgico y la Proteccin al Ambiente, su Reglamento en materia de Residuos Peligrosos, la Ley General de Salud, sus Reglamentos, y las siguientes: 3.1 Agente biolgico-infeccioso Cualquier microorganismo capaz de producir enfermedades cuando est presente en concentraciones suficientes (inculo), en un ambiente propicio (supervivencia), en un hospedero susceptible y en presencia de una va de entrada. 3.2 Agente enteropatgeno Microorganismo que bajo ciertas circunstancias puede producir enfermedad en el ser humano a nivel del sistema digestivo, se transmite va oral-fecal. 3.3 Bioterio Es un rea o departamento especializado en la reproduccin, mantenimiento y control de diversas especies de animales de laboratorio en ptimas condiciones, los cuales son utilizados para la experimentacin, investigacin cientfica y desarrollo tecnolgico. 3.4 Carga til Es el resultado de la sustraccin del peso vehicular al peso bruto vehicular. 3.5 Centro de acopio Instalacin de servicio que tiene por objeto resguardar temporalmente y bajo ciertas condiciones a los residuos peligrosos biolgico-infecciosos para su envo a instalaciones autorizadas para su tratamiento o disposicin final. 3.6 Cepa Cultivo de microorganismos procedente de un aislamiento. 3.7 Establecimientos generadores Son los lugares pblicos, sociales o privados, fijos o mviles cualquiera que sea su denominacin, que estn relacionados con servicios de salud y que presten servicios de atencin mdica ya sea ambulatoria o para internamiento de seres humanos y utilizacin de animales de bioterio, de acuerdo con la tabla 1 del presente instrumento. 3.8 Irreconocible Prdida de las caractersticas fsicas y biolgico-infecciosas del objeto para no ser reutilizado. 3.9 Manejo Conjunto de operaciones que incluyen la identificacin, separacin, envasado, almacenamiento, acopio, recoleccin, transporte, tratamiento y disposicin final de los residuos peligrosos biolgico-infecciosos.

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3.10 Muestra biolgica Parte anatmica o fraccin de rganos o tejido, excreciones o secreciones obtenidas de un ser humano o animal vivo o muerto para su anlisis. 3.11 rgano Entidad morfolgica compuesta por la agrupacin de tejidos diferentes que concurren al desempeo de un trabajo fisiolgico. 3.12 Prestador de servicios Empresa autorizada para realizar una o varias de las siguientes actividades: recoleccin, transporte, acopio, tratamiento y disposicin final de residuos peligrosos biolgicoinfecciosos. 3.13 Residuos Peligrosos Biolgico-Infecciosos (RPBI) Son aquellos materiales generados durante los servicios de atencin mdica que contengan agentes biolgico-infecciosos segn son definidos en esta Norma, y que puedan causar efectos nocivos a la salud y al ambiente. 3.14 Sangre El tejido hemtico con todos sus elementos. 3.15 SEMARNAT Secretara de Medio Ambiente y Recursos Naturales. 3.16 SSA Secretara de Salud. 3.17 Separacin Segregacin de las sustancias, materiales y residuos peligrosos de iguales caractersticas cuando presentan un riesgo. 3.18 Tejido Entidad morfolgica compuesta por la agrupacin de clulas de la misma naturaleza, ordenadas con regularidad y que desempean una misma funcin. 3.19 Tratamiento El mtodo fsico o qumico que elimina las caractersticas infecciosas y hace irreconocibles a los residuos peligrosos biolgico-infecciosos. 4. Clasificacin de los residuos peligrosos biolgico-infecciosos Para efectos de esta Norma Oficial Mexicana se consideran residuos peligrosos biolgicoinfecciosos los siguientes: 4.1 La sangre 4.1.1 La sangre y los componentes de sta, slo en su forma lquida, as como los derivados no comerciales, incluyendo las clulas progenitoras, hematopoyticas y las fracciones celulares o acelulares de la sangre resultante (hemoderivados). 4.2 Los cultivos y cepas de agentes biolgico-infecciosos 4.2.1 Los cultivos generados en los procedimientos de diagnstico e investigacin, as como los generados en la produccin y control de agentes biolgico-infecciosos. 4.2.2 Utensilios desechables usados para contener, transferir, inocular y mezclar cultivos de agentes biolgico-infecciosos. 4.3 Los patolgicos 4.3.1 Los tejidos, rganos y partes que se extirpan o remueven durante las necropsias, la ciruga o algn otro tipo de intervencin quirrgica, que no se encuentren en formol. 4.3.2 Las muestras biolgicas para anlisis qumico, microbiolgico, citolgico e histolgico, excluyendo orina y excremento. 4.3.3 Los cadveres y partes de animales que fueron inoculados con agentes enteropatgenos en centros de investigacin y bioterios. 4.4 Los residuos no anatmicos Son residuos no anatmicos los siguientes: 4.4.1 Los recipientes desechables que contengan sangre lquida.

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4.4.2 Los materiales de curacin, empapados, saturados, o goteando sangre o cualquiera de los siguientes fluidos corporales: lquido sinovial, lquido pericrdico, lquido pleural, lquido Cfalo-Raqudeo o lquido peritoneal. 4.4.3 Los materiales desechables que contengan esp.uto, secreciones pulmonares y cualquier material usado para contener stos, de pacientes con sospecha o diagnstico de tuberculosis o de otra enfermedad infecciosa segn sea determinado por la SSA mediante memorndum interno o el Boletn Epidemiolgico. 4.4.4 Los materiales desechables que estn empapados, saturados o goteando sangre, o secreciones de pacientes con sospecha o diagnstico de fiebres hemorrgicas, as como otras enfermedades infecciosas emergentes segn sea determinado por la SSA mediante memorndum interno o el Boletn Epidemiolgico. 4.4.5 Materiales absorbentes utilizados en las jaulas de animales que hayan sido expuestos a agentes enteropatgenos. 4.5 Los objetos punzocortantes 4.5.1 Los que han estado en contacto con humanos o animales o sus muestras biolgicas durante el diagnstico y tratamiento, nicamente: tubos capilares, navajas, lancetas, agujas de jeringas desechables, agujas hipodrmicas, de sutura, de acupuntura y para tatuaje, bisturs y estiletes de catter, excepto todo material de vidrio roto utilizado en el laboratorio, el cual deber desinfectar o esterilizar antes de ser dispuesto como residuo municipal. 5. Clasificacin de los establecimientos generadores de residuos peligrosos biolgico-infecciosos 5.1 Para efectos de esta Norma Oficial Mexicana, los establecimientos generadores se clasifican como se establece en la tabla 1. TABLA 1 NIVEL I
Unidades hospitalarias de 1 a 5 camas e instituciones de investigacin con excepcin de los sealados en el Nivel III. Laboratorios clnicos y bancos de sangre que realicen anlisis de 1 a 50 muestras al da. Unidades hospitalarias psiquitricas. Centros de toma de muestras para anlisis clnicos.

NIVEL II
Unidades hospitalarias de 6 hasta 60 camas; Laboratorios clnicos y bancos de sangre que realicen anlisis de 51 a 200 muestras al da; Bioterios que se dediquen a la investigacin con agentes biolgicoinfecciosos, o Establecimientos que generen de 25 a 100 kilogramos al mes de RPBI.

NIVEL III
Unidades hospitalarias de ms de 60 camas; Centros de produccin e investigacin experimental en enfermedades infecciosas; Laboratorios clnicos y bancos de sangre que realicen anlisis a ms de 200 muestras al da, o Establecimientos que generen ms de 100 kilogramos al mes de RPBI.

5.2 Los establecimientos generadores independientes del Nivel I que se encuentren ubicados en un mismo inmueble, podrn contratar los servicios de un prestador de servicios comn, quien ser el responsable del manejo de los residuos peligrosos biolgicoinfecciosos.

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6. Manejo de residuos peligrosos biolgico-infecciosos 6.1 Los generadores y prestadores de servicios, adems de cumplir con las disposiciones legales aplicables, deben: 6.1.1 Cumplir con las disposiciones correspondientes a las siguientes fases de manejo, segn el caso: a) Identificacin de los residuos. b) Envasado de los residuos generados. c) Almacenamiento temporal. d) Recoleccin y transporte externo. e) Tratamiento. f) Disposicin final. 6.2 Identificacin y envasado 6.2.1 En las reas de generacin de los establecimientos generadores, se debern separar y envasar todos los residuos peligrosos biolgico-infecciosos, de acuerdo con sus caractersticas fsicas y biolgicas infecciosas, conforme a la tabla 2 de esta Norma Oficial Mexicana. Durante el envasado, los residuos peligrosos biolgico-infecciosos no debern mezclarse con ningn otro tipo de residuos municipales o peligrosos.

TABLA 2 TIPO DE RESIDUOS 4.1 Sangre 4.2 Cultivos y cepas de agentes infecciosos 4.3 Patolgicos ESTADO FISICO Lquidos Slidos Slidos Lquidos 4.4 Residuos no anatmicos Slidos Lquidos 4.5 Objetos punzocortantes Slidos ENVASADO Recipientes hermticos Bolsas de polietileno Bolsas de polietileno Recipientes hermticos Bolsas de polietileno Recipientes hermticos Recipientes rgidos polipropileno COLOR Rojo Rojo Amarillo Amarillo Rojo Rojo Rojo

a) Las bolsas debern ser de polietileno de color rojo traslcido de calibre mnimo 200 y de color amarillo traslcido de calibre mnimo 300, impermeables y con un contenido de metales pesados de no ms de una parte por milln y libres de cloro, adems debern estar marcadas con el smbolo universal de riesgo biolgico y la leyenda Residuos Peligrosos Biolgico-Infecciosos (Apndice Normativo), debern cumplir los valores mnimos de los parmetros indicados en la tabla 3 de esta Norma Oficial Mexicana.

Las bolsas se llenarn al 80 por ciento (80%) de su capacidad, cerrndose antes de ser transportadas al sitio de almacenamiento temporal y no podrn ser abiertas o vaciadas.

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TABLA 3 PARAMETRO Resistencia a la tensin Kg/cm2 UNIDADES ESP.ECIFICACIONES SL: 140 ST: 120 Elongacin % SL: 150 ST: 400 Resistencia al rasgado G SL: 90 ST: 150 SL: Sistema longitudinal. ST: Sistema transversal. 6.2.2 Los recipientes de los residuos peligrosos punzocortantes debern ser rgidos, de polipropileno color rojo, con un contenido de metales pesados de no ms de una parte por milln y libres de cloro, que permitan verificar el volumen ocupado en el mismo, resistentes a fracturas y prdidas de contenido al caerse, destructibles por mtodos fsicos, tener separador de agujas y abertura para depsito, con tapa(s) de ensamble seguro y cierre permanente, debern contar con la leyenda que indique "RESIDUOS PELIGROSOS PUNZOCORTANTES BIOLOGICO-INFECCIOSOS" y marcados con el smbolo universal de riesgo biolgico (Apndice Normativo). a) La resistencia mnima de penetracin para los recipientes tanto para punzocortantes como para lquidos, debe ser de 12.5 N (doce punto cinco Newtons) en todas sus partes y ser determinada por la medicin de la fuerza requerida para penetrar los lados y la base con una aguja hipodrmica calibre 21 x 32 mm mediante calibrador de fuerza o tensimetro. b) Los recipientes para los residuos peligrosos punzocortantes y lquidos se llenarn hasta el 80% (ochenta por ciento) de su capacidad, asegurndose los dispositivos de cierre y no debern ser abiertos o vaciados. c) Las unidades mdicas que presten atencin a poblaciones rurales, con menos de 2,500 habitantes y ubicadas en zonas geogrficas de difcil acceso, podrn utilizar latas con tapa removible o botes de plstico con tapa de rosca, con capacidad mnima de uno hasta dos litros, que debern marcar previamente con la leyenda de "RESIDUOS PELIGROSOS PUNZOCORTANTES BIOLOGICO-INFECCIOSOS". 6.2.3 Los recipientes de los residuos peligrosos lquidos deben ser rgidos, con tapa hermtica de polipropileno color rojo o amarillo, con un contenido de metales pesados de no ms de una parte por milln y libres de cloro, resistente a fracturas y prdidas de contenido al caerse, destructible por mtodos fsicos, deber contar con la leyenda que indique RESIDUOS PELIGROSOS LIQUIDOS BIOLOGICO-INFECCIOSOS y marcados con el smbolo universal de riesgo biolgico (Apndice Normativo)

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En caso de que los residuos lquidos no sean tratados dentro de las instalaciones del establecimiento generador, debern ser envasados como se indica en la tabla 2 de esta Norma Oficial Mexicana. 6.3 Almacenamiento 6.3.1 Se deber destinar un rea para el almacenamiento temporal de los residuos peligrosos biolgico-infecciosos. Los establecimientos generadores incluidos en el Nivel I de la tabla 1 de esta Norma Oficial Mexicana, quedan exentos del cumplimiento del punto 6.3.5 y podrn ubicar los contenedores a que se refiere el punto 6.3.2 en el lugar ms apropiado dentro de sus instalaciones, de manera tal que no obstruyan las vas de acceso. 6.3.2 Los residuos peligrosos biolgico-infecciosos envasados debern almacenarse en contenedores metlicos o de plstico con tapa y ser rotulados con el smbolo universal de riesgo biolgico, con la leyenda "RESIDUOS PELIGROSOS BIOLOGICO-INFECCIOSOS". 6.3.3 El periodo de almacenamiento temporal estar sujeto al tipo de establecimiento generador, como sigue: (a) Nivel I: Mximo 30 das. (b) Nivel II: Mximo 15 das. (c) Nivel III: Mximo 7 das. 6.3.4 Los residuos patolgicos, humanos o de animales (que no estn en formol) debern conservarse a una temperatura no mayor de 4C (cuatro grados Celsius), en las reas de patologa, o en almacenes temporales con sistemas de refrigeracin o en refrigeradores en reas que designe el responsable del establecimiento generador dentro del mismo. 6.3.5 El rea de almacenamiento temporal de residuos peligrosos biolgico-infecciosos debe: a) Estar separada de las reas de pacientes, almacn de medicamentos y materiales para la atencin de los mismos, cocinas, comedores, instalaciones sanitarias, sitios de reunin, reas de esparcimiento, oficinas, talleres y lavanderas. b) Estar techada, ser de fcil acceso, para la recoleccin y transporte, sin riesgos de inundacin e ingreso de animales. c) Contar con sealamientos y letreros alusivos a la peligrosidad de los mismos, en lugares y formas visibles, el acceso a esta rea slo se permitir al personal responsable de estas actividades. d) El diseo, construccin y ubicacin de las reas de almacenamiento temporal destinadas al manejo de residuos peligrosos biolgico-infecciosos en las empresas prestadoras de servicios, debern ajustarse a las disposiciones sealadas y contar con la autorizacin correspondiente por parte de la SEMARNAT. e) Los establecimientos generadores de residuos peligrosos biolgicoinfecciosos que no cuenten con espacios disponibles para construir un almacenamiento temporal, podrn utilizar contenedores plsticos o metlicos

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para tal fin, siempre y cuando cumplan con los requisitos mencionados en los incisos a), b) y c) de este numeral. 6.3.6 Los residuos peligrosos biolgico-infecciosos podrn ser almacenados en centros de acopio, previamente autorizados por la SEMARNAT. Dichos centros de acopio debern operar sistemas de refrigeracin para mantener los residuos peligrosos biolgico-infecciosos a una temperatura mxima de 4C (cuatro grados Celsius) y llevar una bitcora de conformidad con el artculo 21 del Reglamento en materia de Residuos Peligrosos de la Ley General del Equilibrio Ecolgico y la Proteccin al Ambiente. El tiempo de estancia de los residuos en un centro de acopio podr ser de hasta treinta das. 6.4 Recoleccin y transporte externo 6.4.1 La recoleccin y el transporte de los residuos peligrosos biolgico-infecciosos referidos en esta Norma Oficial Mexicana, deber realizarse conforme a lo dispuesto en los ordenamientos jurdicos aplicables y cumplir lo siguiente: a) Slo podrn recolectarse los residuos que cumplan con el envasado, embalado y etiquetado o rotulado como se establece en el punto 6.2 de esta Norma Oficial Mexicana. b) Los residuos peligrosos biolgico-infecciosos no deben ser compactados durante su recoleccin y transporte. c) Los contenedores referidos en el punto 6.3.2 deben ser desinfectados y lavados Despus de cada ciclo de recoleccin. d) Los vehculos recolectores deben ser de caja cerrada y hermtica, contar con sistemas de captacin de escurrimientos, y operar con sistemas de enfriamiento para mantener los residuos a una temperatura mxima de 4C (cuatro grados Celsius). Adems, los vehculos con capacidad de carga til de 1,000 kg o ms deben operar con sistemas mecanizados de carga y descarga. e) Durante su transporte, los residuos peligrosos biolgico-infecciosos sin tratamiento no debern mezclarse con ningn otro tipo de residuos municipales o de origen industrial. 6.4.2 Para la recoleccin y transporte de residuos peligrosos biolgico-infecciosos se requiere la autorizacin por parte de la SEMARNAT. Dicho transporte deber dar cumplimiento con los incisos a), b), d) y e) del numeral 6.4.1 de esta Norma Oficial Mexicana. 6.5 Tratamiento 6.5.1 Los residuos peligrosos biolgico-infecciosos deben ser tratados por mtodos fsicos o qumicos que garanticen la eliminacin de microorganismos patgenos y deben hacerse irreconocibles para su disposicin final en los sitios autorizados. 6.5.2 La operacin de sistemas de tratamiento que apliquen tanto a establecimientos generadores como prestadores de servicios dentro o fuera de la instalacin del generador, requieren autorizacin previa de la SEMARNAT, sin perjuicio de los procedimientos que competan a la SSA de conformidad con las disposiciones aplicables en la materia. 6.5.3 Los residuos patolgicos deben ser incinerados o inhumados, excepto aquellos que estn destinados a fines teraputicos, de investigacin y los que se mencionan en el inciso

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4.3.2 de esta Norma Oficial Mexicana. En caso de ser inhumados debe realizarse en sitios autorizados por la SSA. 6.6. Disposicin final Los residuos peligrosos biolgico-infecciosos tratados e irreconocibles, podrn disponerse como residuos no peligrosos en sitios autorizados por las autoridades competentes. 6.7 Programa de contingencias Los establecimientos generadores de residuos peligrosos biolgico-infecciosos y los prestadores de servicios debern contar con un programa de contingencias en caso de derrames, fugas o accidentes relacionados con el manejo de estos residuos. 7. Grado de concordancia con normas y lineamientos internacionales y con las normas mexicanas tomadas como base para su elaboracin 7.1 Esta Norma Oficial Mexicana no concuerda con ninguna Norma Internacional por no existir referencia en el momento de su elaboracin, ni existen normas mexicanas que hayan servido de base para su elaboracin. 8. Bibliografa 8.1 Althaus H, Sauerwald M, Schrammeck E. Hygienic aspects of waste disposal Zbl Bakt Mikr Hyg, I Abt Orig B. 1983; 178:1-29. 8.2 Anglin AM Collmer JE. Loving TJ. Beltran KA. Coyner BJ. Adal K. Jagger J. Sojka NJ, Farr BM. An outbreak of needlestick injuries in hospital employees due to needles piercing infectious waste containers. Infect Control Hosp. Epidemiology 1995; 16:570-6. 8.3 Belkin NL. Medical Waste a minimal Hazard. Infect Control Hosp. Epidemiol 1993; 13:75-76. 8.4 Brenniman GR. Allen RJ. Impact of repackaging hazardous (infectious) hosp.ital waste on the indoor air quality of a hosp.ital. Science of the Total Environment. 1993; 128:141-9. 8.5 Birnaum D. Medical Waste Applied Epidemiology. Letters to the Editor. Infect Control Hosp. Epidemiol 1993; 14:7-8. 8.6 Cimino JA. Health and safety in the solid waste industry. Am J Public Health 1975; 65:38-46. 8.7 Collins CH. Treatment and disp.osal of clinical and laboratory waste. Med Lab Sci 1991; 48:324-31. 8.8 Crow S. Infectious waste. Infect Control Hosp. Epidemiology 1984; 5:149-50. 8.9 Crow S. Dissolving the problem of infectious medical waste. Infect Control Hosp. Epidemiology. 1996; 17:434-7. 8.10 Daschner FD. Chemical Disinfection of medical waste. Infect Control Hosp. Epidemiology 1993; 14:306. 8.11 Daschner FD. Disinfection of Medical Waste. Letters to the Editor authors reply Infect Control Hosp. Epidemiology 1993; 14:306. 8.12 Daschner FD. The Hosp.ital and Pollution: Role of the Hosp.ital Epidemiologist in Protecting the Environment. In Wenzel R. Prevention and Control of Nosocomial Infection. Third edition William & Wilkins USA 1997; pag. 595-605. 8.13 Decker MD and Schaffer W. The relationship between the Hosp.ital and the Community in Hospital Infection Bennnett JV and Brachman editors. Philadelphia 1998. Fourth edition Lypincott-Raven Press. pag 181-188. 8.14 Gardner JS, Favero MS. CDC Guideline for handwashing and hosp.ital environmental control, 1985. Infect Control Hosp. Epidemiology 1986; 7:231-33. 8.15 Gerberding JL. Limiting the risks of health care workers. In Sande MA and Volberding PA. The Medical Management of AIDS. W.B. Saunders Company. United States. Fifth edition 1997; pag. 75-85. 8.16 Gerberding JL. Management of occupational exposures to blood-borne viruses, N Engl J Med 1995; 332:444-51.

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RESIDUOS PELIGROSOS BIOLOGICOINFECCIOSOS

Fecha de publicacin: 17 de febrero de 2003

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Anexo 3 Escala de MacFarland


La escala de MacFarland es una serie de patrones de turbidez previamente calibrados. Consiste en 10 tubos de vidrio cerrados hermticamente que contienen suspensiones de partculas de sulfato de bario o ltex que permiten la comparacin visual de la turbidez del precipitado con la densidad bacteriana (ver tabla 15). Para cada cepa bacteriana hay que establecer la equivalencia entre la turbidez de cada tubo y la masa o la concentracin de bacterias (en clulas/mL) que genera una turbidez similar. Comercialmente se pueden encontrar disponibles y generalmente incluyen una tarjeta de Wickerham, la cual contiene lneas paralelas en negro como se observa en la Fig.5 El estndar de sulfato de MacFarland (22), se prepara mezclando: 0.54 mL de cloruro de bario 0.048 M (1.175 p/v de cloruro de bario dihidratado) con 99.5 mL de H2SO4 al 1% v/v se debe mantener agitacin constante para mantener la suspensin. Un estndar de 0,5 McFarland es equivalente a una suspensin de bacterias que contienen entre 1 x 108 y 2 x 108 UFC / ml de E. coli. Verificar la densidad correcta del estndar midiendo la absorbancia de la turbidez, en un espectrofotmetro a 625 nm, el rango de absorbancia debe ser de 0,08 a 0,13 para el estndar de 0.5 de MacFarland. Se debe tapar bien el tubo y guardarlo en un lugar oscuro a temperatura ambiente.
El uso del estndar de McFarland en el procedimiento de Kirby-Bauer

Para la prueba de susceptibilidad siguiendo el procedimiento de Kirby-Bauer (23), la suspensin bacteriana del organismo de prueba deber ser similar al estndar de 0,5 McFarland. La preparacin del inculo en un tubo se debe realizar suspendiendo las colonias bacterianas en solucin salina y comparando la suspensin resultante con el estndar de 0.5 MacFarland. Esta comparacin se realiza con la tarjeta de Wickerham (en una rea bien iluminada) a no ms de 1 pulgada de la superficie de esta, observando a travs de las lneas ambas suspensiones. Si la suspensin de bacterias parece ms diluida que el estndar de 0.5 MacFarland, se deben

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adicionar ms colonias bacterianas, si la suspensin tiene un aspecto ms denso se agrega solucin salina con el fin de diluir la suspensin a la densidad adecuada.

Fig. 5
Estndares de MacFarland (de izquierda a derecha) 0.5, 1.0, 2.0, 3.0, situados frente a una tarjeta de Wickerham. Se utilizan para preparar las suspensiones bacterianas a una turbidez especfica.

Preparacin de los estndares de MacFarland

Tabla. 15

Tubo Nm. BaCl2

1 0.1

2 0.2

3 0.3 9.7

Estndar de Sulfato de Bario 4 5 6 7 8 0.4 9.6 0.5 9.5 0.6 9.4 0.7 9.3 0.8 9.2

9 0.9 9.1

10 1.0 9.0

1% (mL)

H2SO4
1% (mL)

9.9. 9.8

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Anexo4 Esterilizacin por autoclave


La esterilizacin comprende todos los procedimientos fsicos, mecnicos y qumicos, que se emplean para destruir, inactivar o retener grmenes en general y patgenos en particular. Dentro de los mtodos fsicos ms empleados est la esterilizacin por calor hmedo, la tcnica utilizada para la preparacin de los medios de cultivo (24). Calor hmedo: El calor hmedo produce desnaturalizacin y coagulacin de protenas. Estos efectos se deben principalmente a dos razones:

El agua es una especie qumica muy reactiva y muchas estructuras biolgicas (DNA, RNA, protenas, etc.) son producidas por reacciones que eliminan agua. Por lo tanto, reacciones inversas podran daar a la clula a causa de la produccin de productos txicos. Adems, las estructuras secundarias y terciarias de las protenas se estabilizan mediante uniones de puentes de hidrgeno intramoleculares que pueden ser reemplazadas y rotas por el agua a altas temperaturas. El vapor de agua posee un coeficiente de transferencia de calor mucho ms elevado que el aire. Por lo que, los materiales hmedos conducen el calor mucho ms rpidamente que los materiales secos debido a la energa liberada durante la condensacin.

Antecedentes: El primer antecedente fue la marmita de Papin en 1681, semejante a una olla a presin que permita mantener el agua por encima de los 100 C. En 1830 William Henry, mdico de Manchester; trataba ropa y otros utensilios provenientes de personas infectadas exponindolos en una vasija a vapor recalentado y aire caliente obteniendo el material libre de infeccin. Pasteur en 1876, Koch y Wolffhugel en 1881 dan los fundamentos de la esterilizacin por calor seco y calor hmedo: 30 minutos a 110

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120 C de exposicin al vapor eran equivalentes a una hora de calor seco a 130 150 C. En 1884 aparece en Pars con el nombre de Chamberland (25) un equipo para usar en laboratorio, el que luego se empleara en todos los laboratorios biolgicos. El autoclave es el aparato comnmente utilizado en los laboratorios para esterilizar cultivos y soluciones que no formen emulsiones con el agua y que no se desnaturalicen a temperaturas mayores a 100 C. El modelo ms usado es el de Chamberland. Una temperatura de 121 C (una atmsfera de sobrepresin) con un tiempo de exposicin mayor a 15 minutos sirve para destruir organismos formadores de esporas.
Fig. A 4.1

Equipo de Autoclave

Fig. 6
Equipo de Autoclave

Equipo: Consta de una caldera de cobre, sostenida por una camisa externa metlica, que en la parte inferior recibe calor por combustin de gas o por una resistencia elctrica.

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La caldera se cierra en la parte superior por una tapa de bronce sujetada por bulones, mariposas o charnelas. Esta tapa posee tres orificios, uno para el manmetro, otro para el escape de vapor en forma de robinete (tambin llamado espita) y el tercero, para una vlvula de seguridad que funciona por contrapeso o a resorte. Funcionamiento y mtodo: 1. Se coloca agua en la caldera, procurando que su nivel no alcance a los objetos que se disponen sobre una rejilla o canasta de metal. 2. Se cierra asegurando la tapa, ajustando las mariposas de seguridad y se enciendo el termostato, dejando abierta la vlvula de escape hasta que todo el aire se desaloje y comience la salida de vapor en forma de chorro continuo y abundante. 3. Se cierra la vlvula de escape y se espera hasta que llegue a la temperatura adecuada. A partir de all se cuenta el tiempo de esterilizacin, luego del cual se debe esperar al descenso de la temperatura para abrir la vlvula de escape y la tapa del autoclave nuevamente. Este proceso de esterilizacin es el que mejor resultados da en Microbiologa. El vapor de agua a fuerte presin acta a mayores temperaturas. La tabla 16 muestra la temperatura que alcanza el equipo a determinadas atmsferas de presin.
Tabla 16
Influencia de la descarga incompleta de aire en la temperatura del autoclave (26)

Presin [atm] Descarga completa del aire 109 115 121 126 130 133 Descarga de aire 100 109 115 121 126 130

1/3 2/3 1 4/3 5/3 2

Temperatura [C] 2/3 del Descarga de 1/2 del aire 90 100 109 115 121 126

Sin descarga del aire 72 90 100 109 115 121

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Tiempo de esterilizacin en autoclave: Del tiempo, temperatura y presin usados en la esterilizacin depende el xito alcanzado. Generalmente los datos presin y temperatura estn establecidos, y el nico factor que se vara es el tiempo. Los materiales necesitan diferentes tiempos de esterilizacin dependiendo de su textura, porosidad, y otras caractersticas propias de cada material. Algunos materiales como el hule, necesitan poco tiempo, mientras otros como el metal quirrgico necesitan ms. Cuando se esteriliza se deben hacer paquetes bien cerrados y bien ordenados, para que haya buena penetracin de vapor en el material. No incluir dentro del mismo paquete material con diferentes tiempos de esterilizacin. El mtodo utilizado para envolver los paquetes deber garantizar el mantenimiento de las condiciones de esterilidad de los materiales durante su almacenamiento. Se deben acomodar los bultos o paquetes de tal forma que haya una libre circulacin de vapor entre ellos (no tratar de llenar el autoclave hasta sobrecargarlo). Colocar de lado las botellas, frascos y cualquier clase de recipiente no poroso de material seco. Esto permite un pronto desplazamiento del aire y un rpido contacto del vapor con las superficies de las vasijas y su contenido. Tambin facilita el secado. Esterilizar los lquidos separndolos de otros materiales. La cristalera deber esterilizarse colocando los recipientes boca abajo u horizontales.

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CONCLUSIONES

La informacin recopilada en este manual sobre una tcnica de aislamiento de bacterias en placas de agar, cuenta con los fundamentos tericos, una gua para su preparacin la cual involucr no solo recomendaciones de fabricantes, sino tambin las recomendaciones de personal profesional en esta rea e informacin sobre el control de calidad necesario en este procedimiento. Es necesario sealar que solo se mencionaron algunos de los cientos de medios de cultivo en agar slido empleados en el rea microbiolgica, pero con informacin detallada de cada uno de ellos, as como su interpretacin, esto con la finalidad de que el alumno tenga herramientas necesarias y al docente le permita tener una gua en la cual apoyarse, en el proceso de enseanza y aprendizaje prctico en el laboratorio de Microbiologa General I.

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