KIMIA ANALISIS BAHAN MAKANAN

ANALISIS PROTEIN
indro-maret 13 HO 4 KABM PROTEIN 1

PENGERTIAN PROTEIN
Molekul protein merupakan suatu rantai panjang yang tersusun oleh matarantai asam-asam amino. Asam amino adalah senyawa yang memiliki satu atau lebih gugus karboksil (-COOH) dan satu atau lebih gugus amino (-NH2), yang salah satunya terletak pada atom C disebelah gugus karboksil (atom C alfa). Dalam protein alamiah ada sekitar 24 macam asam amino. Asam-asam amino yang berbeda-beda bersambung melalui ikatan peptida, yaitu ikatan antara gugus karboksil satu asam amino dengan gugus amino dari asam amino disampingnya.
indro-maret 13 HO 4 KABM PROTEIN 2

FUNGSI PROTEIN
Protein lebih berperanan penting dalam pembentukan biomolekul dari pada sumber energi. Tetapi jika organisme sedang kekurangan energi maka protein dapat digunakan sebagai sumber energi. Kandungan energi protein setara dengan karbohidrat, yaitu 4 kkal/gram. Protein alamiah mula mula dibentuk dari dari unit asam asam amino yang dirakit sama sekali baru (de novo) oleh organisme autotroph (tumbuhan atau mikroorganisme tertentu) dari unsur-unsur C, H, O, N dan S yang ada dalam tanah atau udara. Organisme heterotroph hanya dapat menggunakan protein jadi yang sudah dirakit oleh organisme autotroph tadi. Protein2 tersebut berguna untuk penyusunan senyawa2 biomolekul yang berperanan penting dalam proses biokimiawi dan menganti sel sel jaringan yang rusak.
indro-maret 13 HO 4 KABM PROTEIN 3

PENGGOLONGAN PROTEIN
Protein terdapat dalam produk hewan maupun tumbuhan. Protein tumbuhan kadang-kadang tidak mengandung asam amino esensial. Protein merupakan molekul rumit dan penggolongannya kebanyakan didasarkan sifat ultrasentrifugasi dan elektroforesis. PROTEIN SEDERHANA Jika dihidrolisis hanya menghasilkan asam amino saja. 1. Albumim Larut dalam air yang tidak mengandung garam. Contoh : albumim telur, laktalbumim, leukosin serelia, legumelin. 2. Globulin Tidak larut dalam air, tetapi larut dalam garam netral. Contoh : globulin serum, -laktoblobulin dalam susu, myosin dan aktin dalam daging, glisin dalam kedele.
indro-maret 13 HO 4 KABM PROTEIN 4

PENGGOLONGAN PROTEIN
3. Glutelin Tidak larut dalam air, larut dalam asam atau basa encer. Contoh glutenin dalam gandum dan orizenin dalam beras. Prolamin Tidak larut air, larut dalam alkohol 50-90%, mengandung prolina dan asam glutamat. Contoh : zein dalam jagung, gliadin dalam gandum. Skleroprotein Tidak larut air, tahan terhadap hiodrolisis oleh enzim. Merupakan protein serat yang berperan pada struktur dan pengikatan. Contoh gelatin dari kolagen, elastin dari tendon, keratin, komponen kuku.

4.

5.

indro-maret 13

HO 4 KABM PROTEIN

PENGGOLONGAN PROTEIN
6. Histon Larut dalam air dan diendapkan oleh amonia. Sifatnya basa karena kandungan lisina dan arginina nya tinggi. 7. Protamin Bersifat basa kuat, BM 4000 sampai 8000, kaya akan arginina. Contohnya skombrin dari ikan makarel (Scomber scombrus) PROTEIN KONJUGASI Mengandung bagian asam amino yang terikat pada bahan nonprotein, seperti lipid, asam nukleat atau karbohidrat, diantaranya : 1. Fosfoprotein Gugus fosfat terikat pada gugus hidroksil dari serina dan treonin Contoh kasein susu dan fosfoprotein kuning telur.
indro-maret 13 HO 4 KABM PROTEIN 6

PENGGOLONGAN PROTEIN
2. Lipoprotein Gabungan lipid dengan protein, mempunyai daya pengemulsi yang sangat baik. Terdapat dalam susu dan kuning telur. Nukleoprotein Gabungan asam nukleat dengan protein, terdapat dalam inti sel. Glikoprotein Gabungan karbohidrat dengan protein. Biasanya jumlah karbo hidrat kecil, kecuali beberapa glikoprotein. Contoh : ovomusin putih telur. Kromoprotein Protein yang gugus prostetiknya berwarna, contohnya hemoglobin dan myoglobulin, klorofil dan flavoprotein.
indro-maret 13 HO 4 KABM PROTEIN 7

3.
4.

5.

PENGGOLONGAN PROTEIN
PROTEIN TURUNAN Merupakan senyawa yang diperoleh dengan metode kimia atau enzimatik. Berdasarkan ukuran dan kelarutannya, dibedakan : turunan primer, hanya sedikit dimodifikasi dan tidak larut dalam air (contoh kasein yang dikoagulasi dengan rennet, isi lambung sapi). Turunan sekunder mengalami perubahan yang lebih besar, mencakup protease, pepton dan peptida. Peptida mengandung 2 atau lebih sisa asam amino yang terbentuk selam pemrosesan makanan (misalnya ketika pematangan keju). Jumlah asam amino esensial yang terdapat dalam protein dan ketersediaannya menentukan kualitas gizi protein.
indro-maret 13 HO 4 KABM PROTEIN 8

KANDUNGAN PROTEIN BEBERAPA MAKANAN

Produksi Daging sapi Daging babi Ayam (daging putih) Ikan cod Susu Telur Gandum Kedelai mentah Kedelai dimasak Beras mentah Beras dimasak
indro-maret 13

Protein (g/100 g) 16,5 10,2 23,4 17,6 3,6 12,9 13,3 34,1 11,0 6,7 2,0
HO 4 KABM PROTEIN 9

STRUKTUR DAN SIFAT PROTEIN

Apabila protein murni dianalisa unsur unsur penyusunnya, akan dijumpai gambaran sbb: C : 50 55% O : 20 25% N : 15 18% H : 5 7% S : 0,4 2,5% P : sedikit Fe : sedikit Cu : sedikit BM rata rata asam amino adalah 120, karena itu jika protein murni diketahui memiliki BM tertentu (mis. 120.000), dapat diperkirakan jumlah molekul asam amino penyusunnya 1000 unit.
indro-maret 13 HO 4 KABM PROTEIN 10

STRUKTUR DAN SIFAT PROTEIN

Karena molekulnya yang besar (BM dari beberapa puluh sampai angka jutaan), maka protein mudah sekali mengalami perubahan bentuk fisis atau aktivitas biologisnya. Kerusakan protein dapat disebabkan oleh pemanasan, penambahan asam atau basa, penambahan alkohol atau pelarut organik lain, logam berat, radiasi UV atau sinar radioaktif. Kerusakan protein tersebut umumnya bersifat permanen, dan secara fisik dapat diamati dengan terjadinya proses pemadatan sehingga protein tidak larut. Protein dapat terhidrolisa menadi asam-asam amino penyusunnya. Hidrolisa dapat terjadi dengan penambahan HCl atau H2SO4 encer, alkali encer, atau enzim tertentu. Yang terakhir berlangsung lambat, namun hasilnya tetap memiliki sifat optis aktif.
indro-maret 13 HO 4 KABM PROTEIN 11

DENATURASI PROTEIN
Denaturasi adalah proses yang mengubah struktur molekul tanda memutuskan ikatan kovalen. Proses ini bersifat khusus untuk protein, biasanya diikuti oleh hilangnya aktivitas biologi dan perubahan yang berarti pada sifat fisika terutama kelarutan. Denaturasi dapat terjadi oleh berbagai penyebab : panas, pH, garam dan tekanan permukaan (dikocok). Protein putih telur mudah didenaturasi dengan panas dan jika dikocok menjadi busa. Rentang suhu pada saat terjadi denaturasi dan koagulasi sebagaian besar protein sekitar 55 sampai 75oC. Ada beberapa kekecualian, misalnya kasein dan gelatin dapat dididihkan tanpa perubahan kestabilan yang nyata.
indro-maret 13 HO 4 KABM PROTEIN 12

PENCOKLATAN NONENZIM (REAKSI MAILLARD)

Rekasi Maillard sangat penting dalam industri makanan, hasilnya kadang dikehendaki (misalnya pembentukan kulit luar coklat pada roti), tetapi kadang tidak dikehendaki (pelunturan coklat susu yang diuapkan atau disterilkan). Reaksi pencoklatan dimulai dengan reaksi gugus amino pada asam amino, peptida, atau protein dengan gugus hidroksil glikosidik pada gula, diakhiri dengan pembentukan polimer nitrogen berwarna coklat atau melanoidin. Lisin merupakan asam amino yang paling reaktif. Makanan yang kaya gula mereduksi paling reaktif. Faktor lain yang mempengaruhi reaksi pencoklatan ialah suhu, pH, kandungan air, oksigen, logam, fosfat, SO2.
indro-maret 13 HO 4 KABM PROTEIN 13

indro-maret 13

HO 4 KABM PROTEIN

14

ASAM AMINO
Struktur asam amino di alam adalah sbb: COOH Asam amino mempunyai konfigurasi dan L, () HC NH2 kecuali glisina yang tidak mempunyai atom C R asimetrik. Asam amino diantaranya terdapat dalam antibiotika yan dihasilkan oleh bakteri tanah. Asam amino mempunyai sifat amfoter, larut dalam air, tidak berwarna, tidak larut dalam alkohol atau eter, dengan logam berat dapat mem bentuk garam kompleks (misalnya dengan Cu2+). Sampai sekarang dikenal 24 macam asam amino, yang dapat dikelompokkan menjadi asam amino esensial (tidak dapat disintesa oleh tubuh) dan asam amino non esensial (dapat disintesa).
indro-maret 13 HO 4 KABM PROTEIN 15

ASAM AMINO
Pada umumnya kualitas protein hewan lebih tinggi dari pada kualitas protein tumbuhan. Protein telur merupakan salah satu dari protein berkualitas, dan dipakai secara luas sebagai standar. Bilangan Nisbah Efisiensi Protein (NEP) kadng-kadang menggunakan putih telur sebagai standar. Protein serialia kadang-kadang tidak mengadung lisina dan treonina. Kedelai merupakan sumber lisina yang baik, tetapi tidak mengandung metioinina. Protein kentang berkualitas sangat baik (setara telur) tetapi jumlahnya kecil.

indro-maret 13

HO 4 KABM PROTEIN

16

PENGELOMPOKKAN ASAM AMINO

ESENSIAL Arginin *) Histidin Isoleusin Leusin Lisin Metionin*) Fenilalanin*) Treonin Triptofan Valin
indro-maret 13

NON ESENSIAL Alanin Asam Aspartat Sitrulin Sistin*) Asam glutamat Hidroksiprolin Prolin Serin Tirosin*) Glisin
HO 4 KABM PROTEIN 17

ANALISIS PROTEIN
Tujuan analisa protein dalam bahan makanan adalah : Menera jumlah kandungan protein dalam bahan makanan. Menentukan tingkat kualitas protein (dari sudut gizi) Menelaah protein sebagai salah satu bahan kimia, misalnya secara biokimia, fisiologis, rheologis, enzimatis. Secara rutin, yang biasa dilakukan adalah (a). PENERAAN JUMLAH PROTEIN TOTAL Keistimewaan protein, selain molekulnya mengandung C, H, O, S dan kadang-kadang P, Fe dan Cu, yaitu selalu N. Dengan demikian salah satu cara untuk menentukan kadar protein adalah dengan penentuan kandungan N yang ada dalam bahan makanan (atau bahan lain).
. indro-maret 13
HO 4 KABM PROTEIN 18

REAKSI BIURET Ikatan peptida dari protein bila idreaksikan dengan Cu2+ dalam suasana basa akan membventuk senyawa kokpleks tembaga yang berwarna ungu. Reaksi ini berlaku untuk protein yang mepunyai dua atau lebih ikatan peptida. H2N COOH O H O H2N C N C NH2 + CuSO4 --- ungu H2N COOH Biuret REAKSI NINHIDRIN Asam alfa amino dengan ninhidrin akan membentuk warna biru. Pertama asam alfa amino akan mengoksidasi ninhidrin, menghasilkan ninhidrin tereduksi, aldehid, amonia dan CO2. Kondensasi antara amonia, ninhidrin tereduksi dan Ninhidrin akan membentuk senyawa kompleks yang berwarna biru.
indro-maret 13 HO 4 KABM PROTEIN 19

ANALISIS KUALITATIF ASAM AMINO

ANALISIS KUALITATIF ASAM AMINO

REAKSI MILLON Protein + Hg(NO3)2 kemudian + HNO3 pk akan timbul warna merah. Reaksi ini akan positifuntuk protein yang mengandung gugus fenol spesifik.

REAKSI XANTHOPROTEIN REAKSI SANGER REAKSI EDMAND PENGENDAPAN PROTEIN DENGAN LOGAM BERAT PENGENDAPAN PROTEIN DENGAN ASAM KOMPLEKS

indro-maret 13

HO 4 KABM PROTEIN

20

PENERAAN JUMLAH PROTEIN

Penentuan protein secara absolut (langsung), misalnya dengan cara pemisahan, pemurnian dan penetapan kadar protein sangat sukar dan membutuhkan waktu lama dan biaya yang mahal, sehingga hanya dilakukan untuk penelitian. Misalnya untuk mengetahui susunan asam amino, aktivitas enzimatik, nilai gizi protein tertentu dll. Peneraan jumlah protein dalam bahan makanan umumnya dilakukan berdasarkan cara tidak langsung (empiris), yaitu melalui penentuan kandungan N yang ada dalam bahan. Penetuan dengan cara menghitung kadar C pernah dilakukan, tetapi hasilnya tidak tepat, karena sukar untuk memisahkan unsur C yang berasal dari protein dengan yang dari senyawa lain.
indro-maret 13 HO 4 KABM PROTEIN 21

ANALISIS KUANTITATIF PROTEIN

Apabila bahan yang dianalisa di destruksi, unsur N dari asam amino akan dilepaskan dan dapat ditetapkan jumlahnya secara kuantitatif. Jumlah protein dapat diperhitungkan atas dasar kandungan rata-rata unsur N yang ada dalam protein. Kelemahan cara ini : Setiap jenis protein mempunyai jumlah N yang berbeda, Ada senyawa lain yang bukan protein yang mengandung N (misalnya amonia, asam amino bebas, asam nukleat) Penentuan kadar protein jumlah dengan cara peneraan jumlah N total hasilnya disebut kadar protein kasar atau crude protein .
indro-maret 13 HO 4 KABM PROTEIN 22

PENETAPAN PROTEIN
1. METODE KJELDAHL PRINSIP : Nitrogen dari protein didestruksi dengan asam sulfat pekat akan menghasilkan senyawa amonium sulfat. Dengan penambahan basa NaOH akan terbentuk amonia, Amonia didestilasi, NH3 ditangkap dengan HCl berlebih, kelebihan HCl dititrasi dengan larutan baku NaOH. Banyaknya NH3 ekivalen dengan banyaknya N dari protein. Dengan mengalikan kadar N dengan faktor konversi, dapat dihitung kadar protein di dalam bahan yang diperiksa Kadar N = ( mL NaOH blanko mL NaOH spl) x NNaOH x 14 x 100% Berat sampel (mg)
indro-maret 13 HO 4 KABM PROTEIN 23

PENETAPAN PROTEIN
Dasar perhitungan yang dikembangkan oleh Kjeldahl ini (seorang ahli kimia dari Denmark tahun 1883), adalah hasil penelitian dan pengamatan yang menyatakan bahwa umumnya protein alamiah mengandung unsur N rata rata 16% (dalam protein murni). Apabila jumlah unsur N dalam bahan makanan telah dikethui, maka jumlah protein dapat diperhitungkan, yaitu : jumlah N x 100/16 atau jumlah N x 6,25 Tergantung dari asam amino yang paling banyak membentuk protein dan telah diketahui komposisinya, maka digunakan faktor perkalian yang lebih tepat

indro-maret 13

HO 4 KABM PROTEIN

24

PENETAPAN PROTEIN
Faktor perkalian protein 5,70 untuk tepung gandum 6,38 untuk susu 5,55 untuk gelatin (kolagen yang terlarut) 5,46 untuk kacang tanah 5,71 untuk kacang kedelai 5,95 untuk beras 5,30 untuk kelapa 6,25 untuk makanan lain (umum) Pada perkembangannya cara Kjeldahl telah dimodifiksi, misalnya oleh Gunning. Pengukuran unsur N yang terbentuk dapat pula dilakukan dengan metode kolorimetri.
indro-maret 13 HO 4 KABM PROTEIN 25

PENETAPAN PROTEIN
REAKSI PENETAPAN CARA KJELDAHL 1. TAHAP DESTRUKSI Sampel dipanaskan dengan H2SO4pk sehingga terdestruksi menjadi unsur2nya. C dan H berubah menjadi CO, CO2 dan H2O (terbang), sedangkan N berubah menjadi (NH4)2SO4. Untuk mempercepat proses destruksi sering ditambahkan katalisator campuran Na2SO4 dan HgO (20:1). Gunning menganjur kan untuk menggunakan K2SO4 dan CuSO4. Titik didih asam sulfat akan dipertinggi dan destruksi berjalan lebih cepat. Suhu destruksi berkisar 370o-410oC. SO4= dari H2SO2 akan berubah menjadi SO2 (asap beracun), karena itu sebaiknya ditampung dalam larutan NaHCO3.
indro-maret 13 HO 4 KABM PROTEIN 26

PENETAPAN PROTEIN
Asam amino histidin dan triptophan sukar dan memerlukan waktu lama untuk proses destruksinya. Kadang-kadang digunakan juga Selenium sebagai katalisator karena lebih reaktif (tidak diajurkan). Bila digunakan HgO, reaksinya adalah sebagai berikut : HgO + H2SO4 HgSO4 + H2O 2 HgSO4 Hg2SO4 + SO2 + 2On Hg2SO4 + 2 H2SO4 2 HgSO4 + 2 H2O + SO2 (CHON) + On + H2SO4 CO2 + H2O + (NH4)2SO4 (NH4)2SO4 daspat membentuk kompleks dengan Hg, karena itu sebelum destilasi Hg diendapkan dulu dengan K2S. Proses destruksi selesai jika larutan sudah jernih tidak berwarna atau berwarna biru (bila menggunakan katalisator CuSO4.
indro-maret 13 HO 4 KABM PROTEIN 27

PENETAPAN PROTEIN

DESTRUKSI PROTEIN
indro-maret 13 HO 4 KABM PROTEIN 28

PENETAPAN PROTEIN
2. TAHAP DESTILASI Dalam labu destilasi, (NH4)2SO4 direaksikan dengan larutan NaOH pekat (50%) sampai alkalis dan dipanaskan, sehingga pecah menjadi ammonia (NH3). Ammonia yang dibebaskan ditangkap dengan larutan HCl 0,1 N atau larutan asam borat 2% dalam jumlah berlebih. Ujung tabung destilasi (alonga) harus tercelup dalam larutan asam penampung. Untuk mengetahui asam dalam keadaan berlebih maka ditambahkan indikator methyl orange (jika penampung HCl) atau indikator campuran BCG+ MR (jika penampung asam borat). Dilakukan penetapan blanko. Destilasi berakhir apabila semua ammonmia terdestilasi sempurna dan destilat tidak bereaksi basis.
indro-maret 13 HO 4 KABM PROTEIN 29

PENETAPAN KADAR PROTEIN CARA KJELDAHL

indro-maret 13

HO 4 KABM PROTEIN

30

PENETAPAN PROTEIN
3. TAHAP TITRASI Jika sebagai penampung HCl (penambahan dengan pipet volume) selanjutnya sisa HCl dititrasi dengan larutan NaOH 0,1N standar sampai terjadi perubahan warna indikator. Selisih jumlah titrasi blanko dan sampel merupakan jumlah ekivalen nitrogen. Bila penampung asam borat 2% (tidak perlu dengan pipet volume) maka ammonium borat (NH4)3BO3 yang terbentuk dititrasi dengan HCl 0,1N standar (indikator BCG+MR) sehingga memben tuk asam borat kembali (H3BO3). Akhir titrasi ditandai dengan perubahan warna indikator dari biru menjadi merah muda. Selisih jumlah titrasi sampel dan blnko merupakan jumlah ekivalen nitrogen. Setelah diperoleh %N selanjutnya dihitung kadar protein.
indro-maret 13 HO 4 KABM PROTEIN 31

PENETAPAN KADAR PROTEIN CARA KJELDAHL

indro-maret 13

HO 4 KABM PROTEIN

32

PENETAPAN PROTEIN
2. METODE BIURET PRINSIP : Dalam larutan basa, Cu2+ membentuk kompleks dengan ikatan peptida (-CO-NH-) suatu protein, yang akan menghasilkan warna ungu, dengan absorbans maksimum pada panjang gelombang 540 nm. Absorbans ini berbanding lurus dengan konsenetrasi protein dan tidak tergantung pada jenis protein, karena seluruh protein pada dasarnya mempunyai jumlah ikatan peptida yang sama per satuan berat. Metode ini baik digunakan untuk menentukan kadar protein dalam suatu larutan. Digunakan untuk kadar 1 10 mg protein per mL, Hanya sedikit senyawa yang mengganggu, misalnya urea dan gula pereduksi yang akan bereaksi dengan ion Cu2+.
indro-maret 13 HO 4 KABM PROTEIN 33

PENETAPAN PROTEIN
METODE BIURET

End.

indro-maret 13

HO 4 KABM PROTEIN

34

PENETAPAN PROTEIN
3. METODE LOWRY PRINSIP : Reaksi antara Cu2+ dengan ikatan peptida dan reduksi asam fosfomolibdat dan asam fosfotungstat oleh tirosin dan triptofan (merupakan residu protein) akan menghasilkan warna biru. Warna yang terbentuk terutama dari hasil reduksi fosfomolibdat dan fosfotungstat, karena itu warna yang terbentuk tergantung pada kadar tirosin dan triptofan dalam protein. Metode Lowry 100 x lebih sensitif dibanding metode Biuret. Senyawa fenolik mengganggu hasil penetapan, karena juga membentuk warna biru. Gangguan dapat dihilangkan dengan cara mengendapkan protein dengan TCA, supernatan dibuang, endapan protein dilarutkan kembali untuk dianalisa.
indro-maret 13 HO 4 KABM PROTEIN 35

PENETAPAN PROTEIN
3. METODE LOWRY

indro-maret 13

HO 4 KABM PROTEIN

36

PENETAPAN PROTEIN
4. METODE TITRASI FORMOL Larutan protein dinetralkan dengan NaOH, kemudian ditambahkan formali akan memebentuk dimethilol. Selanjutnya dititrasi dengan larutan NaOH standar, dengan indikator pp.

indro-maret 13

HO 4 KABM PROTEIN

37

PENETAPAN PROTEIN
METODE LAINNYA:

indro-maret 13

HO 4 KABM PROTEIN

38