MEDIOS DE CULTIVO EMBRIONARIO: IGUALES O DIFERENTES?

Jorge Ten, Ph.D. www.institutobernabeu.com, jten@institutobernabeu.com

NDICE

1.- Recorrido histrico e introduccin. 2.- Estrategias de cultivo. Requisitos nutricionales. 3.- Resultados clnicos. 4.- Controles y posibles efectos del cultivo embrionario. 5.- Aportaciones experimentales. 6.- Conclusiones y futuro.

 INTRODUCCIN: RECORRIDO HISTRICO

Recorrido histrico
1947 (Fischer) 1912 (Lewis)

1907 (Harrison) 1946 (White) Medios definidos qumicamente

2014

Recorrido histrico
1958 (McLaren y Biggers) 1912 (Lewis) Ratones nacidos tras cultivo

1907 (Harrison)

1956 (Whitten)

2014

Embriones de ratn desde 8 clulas hasta blastocisto .

Medio simple: 9 componentes includo el agua.

Recorrido histrico
1967 (Biggers et al.) 1947 (Fischer) 1912 (Lewis)

1907 (Harrison)

1956 (Whitten) 1946 (White) Desarrollo embrionario dependiente de piruvato. Sustitucin de cloruro clcico por lactato clcico.

2014

Recorrido histrico
1967 (Biggers et al.) 1947 (Fischer) 1912 (Lewis)

1907 (Harrison)

1956 (Whitten) 1946 (White) Menezo, (1984): Medio B2

2014

Recorrido histrico
1967 (Biggers et al.) 1947 (Fischer) 1912 (Lewis)

1907 (Harrison)

1956 (Whitten) 1946 (White)

2014

1997 (Gardner y Lane)

Cultivo secuencial (piruvato/glucosa)

Diseo de los medios de cultivo

1.- Seleccin del nmero de compuestos:

Principalmente son componentes comunes a todos los fluidos del cuerpo. Algunos son especficos del fluido del oviducto y otros son compuestos qumicos no encontrados de forma natural.

2.- Determinacin de la concentracin de cada componente.

Diseo de los medios de cultivo

Definidos arbitrariamente como medios simples (12 componentes) o medios complejos (ms de 12). Tres soluciones salinas son la base de los medios de cultivo actuales:
Tyrodes solution: base del medio M16 (whittinghan, 1971). Krebs-Ringer Bicarbonate (1932). Earles Balanced Salt Solution (1943).

NDICE

1.- Introduccin. Recorrido histrico. 2.- Estrategias de cultivo. Requisitos nutricionales.

Las dos aproximaciones

1.- Let the Embryo Choose

El diseo de medios que minimicen los efectos inherentes de estrs que son impuestos inevitablemente a los embriones preimplantatorios cuando son cultivados en un ambiente qumicamente definido .
(Summers and Biggers, Hum Reprod Update 9: 557-82, 2003)

Let the embryo choose

- Determina la concentracin ptima de cada componente para que el embrin elija lo que necesita. - Basado en el desarrollo in vitro de embriones y posterior desarrollo in vivo. e.g. Bavister (HECM, hamster), Biggers (KSOM, mouse), Wiemer et al. (Global, human).

Las dos aproximaciones

2.- Back to Nature

para optimizar el desarrollo de embriones de mamfero en cultivo, se requieren medios secuenciales, diseados especficamente para encontrar los requisitos cambiantes que presenta el embrin en desarrollo.
(Gardner and Lane, In Principles of Cloning, 187-213, 2002)

Back to nature

-Basado en las concentraciones de los compuestos encontrados en fluidos de oviducto y utero, as como en los patrones del metabolismo embrionario. e.g. Tervit (SOF, sheep), Mnzo (B2, cow), Quinn (HTF, human), Gardner (G1/G2, human). -La concentracin de una sustancia en el medio, debe ser aproximadamente la concentracin a la cul debe estar expuesta in vivo.

Metabolism of pronucleate oocyte and cleavage stage embryo

Metabolism of pronucleate oocyte and cleavage stage embryo

-High pyruvate and lactate concentration -Low concentration of glucose -High ATP:ADP level in early embryos -Lactate dehydrogenase (LDH) isoforms. Pass from I to V during embryo growth to blastocyst stage -Changes in patterns of energy metabolism as the embryo develops -Glycine: pHi -Glutamine and aspartate: energy source

Metabolism of the blastocyst

Metabolism of the blastocyst

-Low pyruvate and lactate concentration -High concentration of glucose -Reduction in ATP:ADP level, facilitating a high flux of glucose. -NAD+ increases in order to proceed high levels of glycolysis -Changes in patterns of energy metabolism as the embryo develops -Citrate as precursor in lipid synthesis. - Increase in number of receptors for specific growth factors.

Controversia cientfica (Biggers, Summers, Rieger vs Gardner, Lane, Leese)

1. Las medidas de los fludos del oviducto y tero pueden ser altamente variables y sujetos a cambios fisiolgicos. 2. In vivo, hay un flujo de nutrientes, metabolitos e iones, as como una interaccin entre el embrin y los tejidos maternos. Relativa importancia de las concentraciones.

Controversia cientfica (Biggers, Summers, Rieger vs Gardner, Lane, Leese)

3. Las medidas tomadas de los fludos del oviducto y tero podran diferir debido al estrs impuesto en un ambiento fsico in vitro.
4. Las medidas del metabolismo embrionario son dependientes de las condiciones de cultivo que se dan antes y durante la toma de medidas.

Estrategias

1985

1997

2014

Desde cigoto hasta 4-8 clulas

extended culture

Tres estrategias para cultivar embriones humanos.

Protocolo nico medio sin renovacin

Protocolo nico medio con renovacin

Protocolo empleo medios secuenciales

CASAS COMERCIALES (modificado de Biggers et. al., 2008)

COMPANY Cook IVF SEQUENTIAL MEDIA Sidney IVF Cleavage Medium/Sidney IVF blastocyst medium SINGLE MEDIUM -

CooperSurgical

Sage Media: Quinns Advantage cleavage/Quinns Advantage Blastocyst medium. Medicult Media: ORIGIO Sequential Fert/ORIGIO Sequential Cleav.
Ferticult/Ferticult G3 IVC-ONE/IVC-TWO ECM/MultiBlast Medium G-1 v5 PLUS/G-2 v5PLUS -

FertiPro N.V. InVitro Care Inc. Irvine Scientific Vitrolife IVFonline

Continuos single culture Global

Algunas consideraciones generales sobre la composicin

Piruvato como fuente de energa durante la ovognesis. La glucosa no inhibe los estados iniciales del desarrollo embrionario.

Algunas consideraciones generales sobre la composicin

Aminocidos (aas) esenciales y no esenciales (Eagle, 1959):

Esenciales: 13 aas que deben ser includos en el medio de cultivo: arginina, cistena, glutamina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, treonina, triptfano, tirosina, valina. No esenciales: 7 aas que no son requeridos: alanina, asparragina, cido asprtico, cido glutmico, glicina, prolina, serina-

Algunas consideraciones generales sobre la composicin

Aminocidos (Gardner, 2000):

Precursores biosntesis. Fuentes de energa. Osmolitos. Tampones de Ph intracelular. Quelantes de metales pesados.

Algunas consideraciones generales sobre la composicin

Glutamina: rotura en solucin acuosa derivando a amonio (acumulacin y efecto txico). Cambio a alanil-glutamina: reduccin acumulacin amonio (Lane, 2001). La sustitucin de la glutamina por un dipptido estable, como la alanil-glutamina o la glicil-glutamina (Biggers y Summers, 2008).

Algunas consideraciones generales sobre la composicin

Empleo de vitaminas:
Funcin antioxidante: evitar o reducir la produccin de especies reactivas de oxgeno. Vitamina C, E,B2 (riboflavina), B5, B6 (balance sodio-potasio).

Empleo de antibiticos. Evitar el crecimiento de contaminantes.

Gentamicina, penicilina G, estreptomicina.

NDICE

1.- Recorrido histrico e introduccin. 2.- Estrategias de cultivo. Requisitos nutricionales. 3.- Resultados clnicos.

Algunas consideraciones

La formulacin de un medio de cultivo como responsable para incrementar significativamente los resultados en TRA es extremadamente difcil (Pool et al., 2012). Existen 233 factores que pueden afectar el resultado. (Pool et al., 2012. Methods in Molecular Biology, vol. 912).

60 factores: fuera del laboratorio de FIV

88 factores: en el laboratorio de FIV

85 factores: tcnicas especficas en el laboratorio

 Hay un medio de cultivo mejor que otro?

-Slo 4 estudios informaron sobre tasas de nio nacido. -Slo 9 trabajos estudiaron el efecto del medio de cultivo sobre embarazo evolutivo/clnico.

Heterogeneidad de los estudios

Conclusiones sobre los estudios publicados

Los datos referidos a embarazo evolutivo y nacimientos son insuficientes para seleccionar el mejor medio de cultivo.

Son necesarios ms estudios rigurosos controlados y randomizados.

-Criterios de inclusin estrictos. -Randomizacin a nivel de ovocitos. -Efecto inter e intra-observador (ndice Kappa). -Clculo correcto del tamao muestral y poder estadstico.
Pool et al., 2012

NDICE

1.- Recorrido histrico e introduccin. 2.- Estrategias de cultivo. Requisitos nutricionales. 3.- Resultados clnicos. 4.- Controles y posibles efectos del cultivo embrionario.

Controles en el laboratorio

Recomendaciones de las casas comerciales. Medida del pH y osmolaridad de los medios de cultivo.

Controles en el laboratorio

- La mayora de casas comerciales recomiendan rangos comprendidos entre 7.2-7.4. -Determinar un Ph extracelular (Phe) ptimo es complejo, ya que habra que aislarlo de otras variables como el CO2 y el bicarbonato.

La concentracin de los componentes del medio de cultivo pueden afectar al Ph intracelular (Phi) a pesar de mantenerse en el mismo Phe.

Modelo de investigacin para ajustar y aislar el Phe: empleo de zwitteriones en los tampones.

Efectos del cultivo embrionario

Especies reactivas del oxgeno (ROS):

Estrategia de cultivo a bajas presiones de oxgeno para mimetizar las condiciones in vivo. Discrepancias en los resultados clnicos.

Expresin gnica

Hay expresin de gran nmero de genes durante el periodo preimplantatorio (Latham et al., 2000):
Una fraccin significativa del genoma se dedica a la expresin de genes en el desarrollo temprano. Los genes que se co-expresan en el mismo estadio tienen a agruparse en el genoma. Los genes expresados incluyen cohortes actuando de una manera especfica.

Expresin gnica

La expresin de genes de embriones preimplantacionales cultivados en un mismo medio de cultivo se altera cambiando la concentracin de un nico constituyente (Ho et al., 1994)

Expresin gnica

Las condiciones de cultivo afectan a la expresin gnica en ovejas (Young et al., 2001) y vacas (Niemann y Wrenzycki, 2000; Wrenzycki et al., 2001, Rizos et al., 2002).

Expresin gnica

Protenas de estrs: Hsp70, Hsp90, CHOP10, Ceramida (revisin: Biggers y Summers, 2003). Expresin de variantes genticas anormales por estrs (Biggers y Summers, 2003).

Efectos a largo plazo

LOS (large offspring syndrome, en rumiantes): relacionado con el empleo de medios complejos, suero o co-cultivos (Koshla et al., 2001). Patrones alterados/defectos en la impronta genmica (Gardner y Lane, 2005; Allen y Reardon, 2005).

Efectos perinatales

-Estudio retrospectivo de 2833 nios nacidos (no mltiples) en da 3 vs 96 en da 5-6 -No diferencias en el peso al nacer al comparar tres medios diferentes para dia 5-6. -Mayor peso al nacer en da 5-6, respecto a da 3 (332053.4 vs 3465503).

NDICE

1.- Recorrido histrico e introduccin. 2.- Estrategias de cultivo. Requisitos nutricionales. 3.- Resultados clnicos. 4.- Controles y posibles efectos del cultivo embrionario. 5.- Aportaciones experimentales.

Aportaciones desde la metabolmica

-El cido octanoico (AO) se emplea como estabilizador proteico en medios de cultivo. -Variacin de la concentracin de AO por lotes en las preparaciones de HSA. -Embriotoxicidad por disrupcin mitocondrial , disminucin intracelular del pH y dao oxidativo.

Aportaciones desde la metabolmica

ESPECTRO DE MASAS COMPLETO DE UN MEDIO DE CULTIVO DE DA 3 A DA 5

ANLISIS QUIMIOMTRICO DE UNA REGIN DE LOS DATOS DE MASAS DE UN MEDIO DE CULTIVO DE 5 DAS

El modelado de los datos nos proporciona la contribucin de cada uno de los picos a los datos experimentales, es decir, que podemos cuantificar la concentracin de los metabolitos. La intensidad del pico es cuantificada y esta intensidad tiene una relacin directa con la concentracin de la molcula que genera el pico. Por tanto, podemos determinar si la concentracin de los diferentes metabolitos cambia en los medios de cultivo en funcin de las fechas de posible fabricacin.

El anlisis quimiomtrico de los datos nos permite obtener la siguiente distribucin, donde los diferentes signos identifican a las muestras utilizadas . Como conclusin, podemos considerar que hay diferencias en las concentraciones de ciertos metabolitos presentes en los medios de cultivo comerciales de da 3 a da 5. Con un medio, de otra casa comercial, para cultivo hasta da 3, se observan resultados similares.

Conclusiones

Estrategias de cultivo embrionario con tasas de xito contrastadas y similares. Complejidad en el diseo de estudios para comprobar la superioridad de un medio sobre otro. Condiciones de cultivo controladas en cada laboratorio para garantizar el desarrollo embrionario ptimo (controles de calidad). Nuevos sistemas de cultivo dinmicos a tener en cuenta.

Conclusiones

Posibles efectos deletreos del cultivo embrionario: concentracin de oxgeno, expresin gnica, efectos perinatales y a largo plazo. Necesidad de una GARANTA por parte de las casas comerciales: posibles diferencias en la concentracin de metabolitos presentes entre diferentes lotes. Incertidumbre.

 MEDIOS DE CULTIVO EMBRIONARIO: IGUALES O DIFERENTES?

Diferentes entre casas comerciales. Podran ser hasta diferentes en un mismo medio. Bien usados, con protocolos y controles de calidad ptimos: Iguales en resultados clnicos.

 MEDIOS DE CULTIVO EMBRIONARIO: IGUALES O DIFERENTES?

MUCHAS GRACIAS!

Jorge Ten, Ph.D. www.institutobernabeu.com, jten@institutobernabeu.com