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NDICE
1.- Recorrido histrico e introduccin. 2.- Estrategias de cultivo. Requisitos nutricionales. 3.- Resultados clnicos. 4.- Controles y posibles efectos del cultivo embrionario. 5.- Aportaciones experimentales. 6.- Conclusiones y futuro.
Recorrido histrico
1947 (Fischer) 1912 (Lewis)
2014
Recorrido histrico
1958 (McLaren y Biggers) 1912 (Lewis) Ratones nacidos tras cultivo
1907 (Harrison)
1956 (Whitten)
2014
Recorrido histrico
1967 (Biggers et al.) 1947 (Fischer) 1912 (Lewis)
1907 (Harrison)
1956 (Whitten) 1946 (White) Desarrollo embrionario dependiente de piruvato. Sustitucin de cloruro clcico por lactato clcico.
2014
Recorrido histrico
1967 (Biggers et al.) 1947 (Fischer) 1912 (Lewis)
1907 (Harrison)
2014
Recorrido histrico
1967 (Biggers et al.) 1947 (Fischer) 1912 (Lewis)
1907 (Harrison)
2014
Definidos arbitrariamente como medios simples (12 componentes) o medios complejos (ms de 12). Tres soluciones salinas son la base de los medios de cultivo actuales:
Tyrodes solution: base del medio M16 (whittinghan, 1971). Krebs-Ringer Bicarbonate (1932). Earles Balanced Salt Solution (1943).
NDICE
- Determina la concentracin ptima de cada componente para que el embrin elija lo que necesita. - Basado en el desarrollo in vitro de embriones y posterior desarrollo in vivo. e.g. Bavister (HECM, hamster), Biggers (KSOM, mouse), Wiemer et al. (Global, human).
Back to nature
-Basado en las concentraciones de los compuestos encontrados en fluidos de oviducto y utero, as como en los patrones del metabolismo embrionario. e.g. Tervit (SOF, sheep), Mnzo (B2, cow), Quinn (HTF, human), Gardner (G1/G2, human). -La concentracin de una sustancia en el medio, debe ser aproximadamente la concentracin a la cul debe estar expuesta in vivo.
1. Las medidas de los fludos del oviducto y tero pueden ser altamente variables y sujetos a cambios fisiolgicos. 2. In vivo, hay un flujo de nutrientes, metabolitos e iones, as como una interaccin entre el embrin y los tejidos maternos. Relativa importancia de las concentraciones.
3. Las medidas tomadas de los fludos del oviducto y tero podran diferir debido al estrs impuesto en un ambiento fsico in vitro.
4. Las medidas del metabolismo embrionario son dependientes de las condiciones de cultivo que se dan antes y durante la toma de medidas.
Estrategias
1985
1997
2014
extended culture
CooperSurgical
Sage Media: Quinns Advantage cleavage/Quinns Advantage Blastocyst medium. Medicult Media: ORIGIO Sequential Fert/ORIGIO Sequential Cleav.
Ferticult/Ferticult G3 IVC-ONE/IVC-TWO ECM/MultiBlast Medium G-1 v5 PLUS/G-2 v5PLUS -
Piruvato como fuente de energa durante la ovognesis. La glucosa no inhibe los estados iniciales del desarrollo embrionario.
Glutamina: rotura en solucin acuosa derivando a amonio (acumulacin y efecto txico). Cambio a alanil-glutamina: reduccin acumulacin amonio (Lane, 2001). La sustitucin de la glutamina por un dipptido estable, como la alanil-glutamina o la glicil-glutamina (Biggers y Summers, 2008).
Empleo de vitaminas:
Funcin antioxidante: evitar o reducir la produccin de especies reactivas de oxgeno. Vitamina C, E,B2 (riboflavina), B5, B6 (balance sodio-potasio).
NDICE
1.- Recorrido histrico e introduccin. 2.- Estrategias de cultivo. Requisitos nutricionales. 3.- Resultados clnicos.
Algunas consideraciones
La formulacin de un medio de cultivo como responsable para incrementar significativamente los resultados en TRA es extremadamente difcil (Pool et al., 2012). Existen 233 factores que pueden afectar el resultado. (Pool et al., 2012. Methods in Molecular Biology, vol. 912).
-Slo 4 estudios informaron sobre tasas de nio nacido. -Slo 9 trabajos estudiaron el efecto del medio de cultivo sobre embarazo evolutivo/clnico.
Los datos referidos a embarazo evolutivo y nacimientos son insuficientes para seleccionar el mejor medio de cultivo.
-Criterios de inclusin estrictos. -Randomizacin a nivel de ovocitos. -Efecto inter e intra-observador (ndice Kappa). -Clculo correcto del tamao muestral y poder estadstico.
Pool et al., 2012
NDICE
1.- Recorrido histrico e introduccin. 2.- Estrategias de cultivo. Requisitos nutricionales. 3.- Resultados clnicos. 4.- Controles y posibles efectos del cultivo embrionario.
Controles en el laboratorio
Recomendaciones de las casas comerciales. Medida del pH y osmolaridad de los medios de cultivo.
Controles en el laboratorio
- La mayora de casas comerciales recomiendan rangos comprendidos entre 7.2-7.4. -Determinar un Ph extracelular (Phe) ptimo es complejo, ya que habra que aislarlo de otras variables como el CO2 y el bicarbonato.
La concentracin de los componentes del medio de cultivo pueden afectar al Ph intracelular (Phi) a pesar de mantenerse en el mismo Phe.
Modelo de investigacin para ajustar y aislar el Phe: empleo de zwitteriones en los tampones.
Expresin gnica
Hay expresin de gran nmero de genes durante el periodo preimplantatorio (Latham et al., 2000):
Una fraccin significativa del genoma se dedica a la expresin de genes en el desarrollo temprano. Los genes que se co-expresan en el mismo estadio tienen a agruparse en el genoma. Los genes expresados incluyen cohortes actuando de una manera especfica.
Expresin gnica
La expresin de genes de embriones preimplantacionales cultivados en un mismo medio de cultivo se altera cambiando la concentracin de un nico constituyente (Ho et al., 1994)
Expresin gnica
Las condiciones de cultivo afectan a la expresin gnica en ovejas (Young et al., 2001) y vacas (Niemann y Wrenzycki, 2000; Wrenzycki et al., 2001, Rizos et al., 2002).
Expresin gnica
Protenas de estrs: Hsp70, Hsp90, CHOP10, Ceramida (revisin: Biggers y Summers, 2003). Expresin de variantes genticas anormales por estrs (Biggers y Summers, 2003).
LOS (large offspring syndrome, en rumiantes): relacionado con el empleo de medios complejos, suero o co-cultivos (Koshla et al., 2001). Patrones alterados/defectos en la impronta genmica (Gardner y Lane, 2005; Allen y Reardon, 2005).
Efectos perinatales
-Estudio retrospectivo de 2833 nios nacidos (no mltiples) en da 3 vs 96 en da 5-6 -No diferencias en el peso al nacer al comparar tres medios diferentes para dia 5-6. -Mayor peso al nacer en da 5-6, respecto a da 3 (332053.4 vs 3465503).
NDICE
1.- Recorrido histrico e introduccin. 2.- Estrategias de cultivo. Requisitos nutricionales. 3.- Resultados clnicos. 4.- Controles y posibles efectos del cultivo embrionario. 5.- Aportaciones experimentales.
-El cido octanoico (AO) se emplea como estabilizador proteico en medios de cultivo. -Variacin de la concentracin de AO por lotes en las preparaciones de HSA. -Embriotoxicidad por disrupcin mitocondrial , disminucin intracelular del pH y dao oxidativo.
ANLISIS QUIMIOMTRICO DE UNA REGIN DE LOS DATOS DE MASAS DE UN MEDIO DE CULTIVO DE 5 DAS
El modelado de los datos nos proporciona la contribucin de cada uno de los picos a los datos experimentales, es decir, que podemos cuantificar la concentracin de los metabolitos. La intensidad del pico es cuantificada y esta intensidad tiene una relacin directa con la concentracin de la molcula que genera el pico. Por tanto, podemos determinar si la concentracin de los diferentes metabolitos cambia en los medios de cultivo en funcin de las fechas de posible fabricacin.
El anlisis quimiomtrico de los datos nos permite obtener la siguiente distribucin, donde los diferentes signos identifican a las muestras utilizadas . Como conclusin, podemos considerar que hay diferencias en las concentraciones de ciertos metabolitos presentes en los medios de cultivo comerciales de da 3 a da 5. Con un medio, de otra casa comercial, para cultivo hasta da 3, se observan resultados similares.
Conclusiones
Estrategias de cultivo embrionario con tasas de xito contrastadas y similares. Complejidad en el diseo de estudios para comprobar la superioridad de un medio sobre otro. Condiciones de cultivo controladas en cada laboratorio para garantizar el desarrollo embrionario ptimo (controles de calidad). Nuevos sistemas de cultivo dinmicos a tener en cuenta.
Conclusiones
Posibles efectos deletreos del cultivo embrionario: concentracin de oxgeno, expresin gnica, efectos perinatales y a largo plazo. Necesidad de una GARANTA por parte de las casas comerciales: posibles diferencias en la concentracin de metabolitos presentes entre diferentes lotes. Incertidumbre.
MUCHAS GRACIAS!