You are on page 1of 22

Abstract Mannheimia haemolytica (Mh) is the most pathogenic bacteria associated with bovine pneumonic pasteurellosis (mannheimiosis); furthermore,

it is the most important economic loss disease in beef cattle, and the second one after gastrointestinal diseases mainly in less than a year old dairy heifers. It is a common and important opportunistic agent in bovine nasopharynx. Stress immunosuppression or the infection caused by respiratory viruses or Mycoplasma spp, lead to its establishment and multiplication in lung tissue. A1 and A6 are the most frequent serotypes in pneumonic injuries, and A1 and A2 in the nasopharynx of healthy bovine. Among the Mh virulence factors, leukotoxin is the most important one; its primarily toxic effect is primarily against leukocytes in ruminants. A better understanding of the epidemiology and the importance of Mh species requires new identification criteria that include molecular techniques, as well as more sensitive procedures regarding biochemical and immunological isolation and identification. Antimicrobial efficacy, as prophylactic or therapeutical agents, has been very variable due to diagnosis inaccuracies and to the increase of multiresistant strains. There is a varied range of bacterins that have been used over the last decades; the efficacy of many of them has been questioned as they only protect partially and some of them might even increase the morbility. Vaccines with a supernatant culture containing leukotoxin and other soluble antigens, or isolated bacterial extracts or combined with bacterins, have been recently developed showing satisfactory results. Efficient prevention and control of bovine mannheimiosis should be supported by a reliable diagnosis, use of vaccines and efficient therapeutic measurements, together with good management practices. Key words: Bovine Mannheimiosis, Etiology, Prevention and Control, Bovines.

Resumen Mannheimia haemolytica (Mh) es la bacteria ms patgena y ms comnmente asociada con la pasteurelosis neumnica (mannheimiosis) bovina, la enfermedad econmicamente ms importante en bovinos productores de carne, y la segunda, despus de las enfermedades grastrointestinales, en becerras lecheras, principalmente menores de un ao. Es un habitante normal y un importante agente oportunista de la nasofaringe de bovinos; la inmunosupresin por estrs o la infeccin por virus respiratorios o por Mycoplasma spp, propician su establecimiento y multiplicacin en el tejido pulmonar. El A1 y el A6 son los serotipos ms frecuentes en lesiones neumnicas, y el A1 y A2 en nasofaringe de bovinos sanos. Entre los factores de virulencia de Mh, la leucotoxina es el ms importante, cuyo efecto txico primario es en contra de los leucocitos, particularmente de rumiantes. Para comprender mejor la epidemiologa y la importancia de las especies de Mh, se requieren nuevos criterios para su identificacin, que incluyan tcnicas moleculares y procedimientos ms sensibles de aislamiento e identificacin bioqumica e inmunolgica. La eficacia de los antimicrobianos, como profilcticos o teraputicos, ha sido muy variable debido a inconsistencias en el diagnstico y al incremento en la frecuencia de cepas multirresitentes. Existe una amplia gama de bacterinas empleadas durante dcadas; sin embargo, la eficacia de muchas de ellas ha sido cuestionada, pues slo protegen parcialmente, incluso algunas pueden incrementar la morbilidad. Recientemente se han desarrollado vacunas con sobrenadante de cultivo que contienen leucotoxina y otros antgenos solubles, o extractos bacterianos solos o combinados con bacterinas, con resultados muy satisfactorios. La prevencin y el control eficaz de la mannheimiosis bovina deben sustentarse en un diagnstico confiable, vacunas y medidas teraputicas eficaces, y buenas prcticas de manejo. Palabras clave: Mannheimiosis Bovina, Etiologa, Prevencin y Control, Bovinos.

Introduccin Entre las enfermedades infecciosas que afectan al ganado bovino, las de origen respiratorio constituyen la principal causa de prdidas en el mbito mundial, especialmente en animales 1 jvenes. Se calcula que aproximadamente 25% de los becerros experimentan al menos un episodio de enfermedad respiratoria durante el primer ao de vida, con tasas que van de 14 a 38%; estas incidencias son mayores en los becerros machos que en las hembras, tanto en la etapa previa al destete como en los periodos de engorda; adems, se estima que las neumonas causan aproximadamente 75% de los casos clnicos, y provocan de 45% a 55% de la mortalidad; su 2 tratamiento llega a representar 8% del total de los costos de produccin. Los microorganismos del gnero Pasteurella constituyen las bacterias ms frecuentemente aisladas de los procesos neumnicos de los animales domsticos; entre los cuales el problema de mayor significacin es la pasteurelosis neumnica bovina (PNB), tambin llamada neumona por fiebre de embarque; enfermedad respiratoria generalmente fatal que se caracteriza por una pleuroneumona fibrinosa grave, y que afecta principalmente a animales menores de un ao recientemente transportados, con una mayor incidencia en becerros de 1 a 5 meses de edad 36 nacidos durante otoo e invierno. La PNB es una de las enfermedades ms costosas que afecta al ganado bovino productor de leche o productor de carne, especialmente en aquellos animales de reciente ingreso en el hato; se considera la enfermedad econmicamente ms importante en bovinos productores de carne y la 7 segunda, despus de las enfermedades grastrointestinales, en becerras lecheras, por lo que es una de las principales causas de prdidas en la industria ganadera bovina del mundo; se calcula que representa 30% de la mortalidad total en bovinos, y al menos 1% en las ganaderas de engorda, y est relacionada con prdidas econmicas por ms de mil millones de pesos anuales 3,6,810 tan slo en Norteamrica. Adems, es responsable de la morbilidad y prdidas por ganancia de peso en al menos 10% adicional de estas ganaderas; consecuentemente, los costos por la enfermedad en la industria ganadera de Estados Unidos de Amrica son de, al menos, 640 9 millones de dlares anuales. Esta enfermedad es una de las principales causas de morbilidad y mortalidad en becerras lecheras en ese pas y Canad, con brotes que llegan a afectar entre 80% 5 y 90% de los animales, con tasas de letalidad menores a 5%. Considerando que Mannheimia haemolytica es el principal patgeno bacteriano de la PNB, para los propsitos de este artculo se nombrar a esta ltima como mannheimiosis bovina a lo largo de todo el texto.

Etiologa La etiologa de la mannheimiosis bovina (MnB) es multifactorial y se ven involucrados diversos factores de riesgo que determinan la presentacin y severidad de las lesiones neumnicas; entre ellos destacan los relacionados con el manejo que generan estrs, como cambios bruscos de temperatura, hacinamiento, transporte, confinamiento de animales de diferentes edades, condiciones del destete, nivel de inmunoglobulinas en el calostro, entre otros; asimismo, intervienen otros agentes infecciosos de origen bacteriano y particularmente agentes primarios de 3 tipo viral, tales como el virus sincitial, parainfluenza, rinotraquetis infecciosa bovina (herpes virus 4,5,10,11 1) y, ocasionalmente, adenovirus. Estos virus causan efecto citoptico directo en el aparato respiratorio; adems, reducen la remocin bacteriana y la capacidad fagoctica del macrfago 11 alveolar, lo cual facilita la colonizacin pulmonar por Pasteurella spp. Las especies del gnero Pasteurella son comensales habituales del tracto respiratorio superior de los rumiantes domsticos y silvestres, y no obstante que Mannheimia (Pasteurella)

haemolytica y P. multocida con mucha frecuencia se encuentran asociadas con enfermedades respiratorias, hay variaciones entre las diferentes cepas en su capacidad para producir enfermedad 9,12 en los diferentes huspedes animales. P. multocida se ha identificado como un importante patgeno de los animales durante muchos aos; sin embargo, la frecuencia y la significancia de Mannheimia (Pasteurella) haemolytica como un patgeno potencial ha sido reconocida ampliamente en los ltimos aos, y numerosas investigaciones sobre enfermedades virales han demostrado que P. multocida y Mannheimia (Pasteurella) haemolytica, actan ms frecuentemente como invasores 13 secundarios que como causa primaria de enfermedad. Mannheimia (Pasteurella) haemolytica es la bacteria ms patgena y ms comnmente asociada con el complejo de las enfermedades respiratorias de los bovinos, particularmente con la 6,8,10,14 MnB. La bacteria es un habitante normal de las criptas de las tonsilas del bovino sano y, adems, un importante agente oportunista del tracto respiratorio debido a que usual mente coloniza la parte alta de ste y, bajo ciertas condiciones de inmunosupresin del husped, afecta sus mecanismos de defensa, lo cual permite que la bacteria se establezca y se multiplique rpidamente, penetre a los pulmones durante la inhalacin e inicie una infeccin activa del epitelio 10 alveolar. Esta bacteria ha sido sometida a una extensa reclasificacin; originalmente fue llamada Bacterium 2,9 bipolare multocidum por Theodore Kitt, en 1885; posteriormente, en 1896, Flugge la 9 renombra Bacillus boviseptica y, en 1932, Newson y Cross proponen el nombre de Pasteurella 2,9,15 haemolytica. Entre 1959 y 1961, Smith describe dos biotipos de P. haemolytica sobre la base de caractersticas fenotpicas y de diferencias epidemiolgicas y patolgicas, clasificndolos como 2,9,1518 A y T, segn su habilidad para fermentar la Larabinosa o la trealosa, respectivamente. Biberstein et al. desarrollaron en 1960, un sistema de serotipificacin basado en la hemoaglutinacin indirecta (HAI) de antgenos capsulares solubles, y, en 1962, Biberstein y 20 Gills informaron sobre una asociacin consistente entre los serotipos y los biotipos que establece 15,16 una serotipificacin capsular. En investigaciones subsecuentes, el nmero de serotipos 15,21 reconocidos aument a 17 los serotipos 3, 4, 10 y 15 asociados con el biotipo T y el resto con el biotipo A; las cepas no tipificables por HAI fueron clasificadas posteriormente por contra 15 inmunoelectroforesis, demostrndose nueve serogrupos adicionales. En 1990, a partir de los resultados obtenidos en estudios sobre hibridacin ADN ADN, propiedades bioqumicas y anlisis genticos, los serotipos T3, T4, TIO y T15, del biotipo T, fueron 22 reclasificados como una especie separada que se denomin Pasteurella trehalosi. En 1995, 23 Younan y Fodor informaron sobre el aislamiento deP. haemolytica serotipo 17 (A17). 24 Recientemente, P. trehalosi ha sido reclasificada como Bibersteinia trehalosi.
15,19

Mannheimia haemolytica El gnero Pasteurella est conformado por un amplio grupo de especies de bacterias que se entrecruzan en sus caractersticas fenotpicas y genotpicas, por lo que desde hace varios aos se han realizado investigaciones con el propsito de clasificarlas adecuadamente. Los primeros estudios sobre hibridacin del ADNARN demostraron una homologa de 8% a 24% entre aislamientos de P. haemolytica y P. trehalosi; posteriores investigaciones validaron dichos resultados con estudios de hibridacin de ADNADN, los cuales mostraron una homologa de 0% 12 35% entre P. haemolytica y P. trehalosi.

En 1999, mediante estudios de ribotipificacin, electroforesis de enzimas multilocus, secuenciacin del gene 16S del ARNr e hibridacin ADNADN, los serotipos de P. haemolytica A fueron reclasificados en el nuevo gnero Mannheimia. En consecuencia, los anteriores serotipos A de P. haemolytica (A1, A2, A5, A6, A7, A8, A9, A12, A13, A14, A16 y A17) fueron renombrados como Mannheimia haemolytica. El serotipo 11 restante, que no est relacionado con Mannheimia 2,6,9,15 haemolytica, se renombr como Mg. Segn la clasificacin propuesta por Angen et al., el gnero Mannheimia comprende cinco especies: M. haemolytica (Mh) (originalmente biogrupo 1) que incluye los serotipos A (1, 2, 5 9, 1214, 16 y 17), todos aislados solamente de rumiantes. M. granulomatis, que incluye a cepas previamente clasificadas como P. granulomatis, Bisgaard taxn 20 y P. haemolytica biogrupo 3J. Incluye tambin todas las cepas clasificadas genticamente como P. haemolyticalike (parecidas a P. haemolytica), aisladas de conejos, liebres y bovinos, asociadas con neumonas y conjuntivitis purulenta en lepridos y con granulomas en piel y otras enfermedades en bovinos. M. glucosida incluye cepas originalmente clasificadas como P. haemolytica biogrupos 3 AH y 9, as como al serotipo 11 y todas sus cepas, la mayora aisladas de cavidad nasal de borregos, en algunos casos con neumonas u otras enfermedades. M. ruminalis, que incluye cepas no hemolticas de P. haemolytica previamente descritas como Actinobacillus lignieresii y P. haemolytica biogrupo 3J, aisladas del rumen de bovinos y ovinos, no asociadas con estados patolgicos. Por ltimo, M. varigena, que comprende un grupo de cepas originalmente clasificadas como P. haemolytica biogrupo 6 y Bisgaard taxn 15 y 36, han sido aisladas de bovinos y porcinos, 2,9,15,25 y asociadas con sepsis, neumona y otros estados patolgicos. Mh es una bacteria gramnegativa, encapsulada, no mvil, de forma cocobacilar o de bacilo pequeo pleomrfico (1 a 3 um de dimetro), mesoflica, aerobia y anaerobia facultativa, oxidasa positiva e indolnegativa; fermenta glucosa y otros carbohidratos, produciendo cido pero no gas. Es negativa a las pruebas de rojo de metilo, gelatinasa, Voges Proskauer. Crece en agar MacConkey, en medios enriquecidos como agar chocolate o agar sangre, formando colonias lisas de color blanco grisceo, con tamaos de 1 a 2 mm de dimetro despus de 24 h de incubacin. La mayora de las cepas producen una hemlisis cuando crecen en agar con sangre de bovino. Es capaz de fermentar Dsorbitol, Dxilosa, maltosa y dextrina; no fermentan arabinosa o glucsidos, y son negativas a la ornitina descarboxilasa y NPG (glucosidasa), pero positivas a ONPF (fucosidasa). La presencia de cpsula con propiedades de superficie antifagocticas la 15,18 hacen parcialmente resistente a fagocitosis. Mh se asla normalmente de procesos neumnicos en bovinos y ovinos, y tambin de procesos septicmicos en borregos y de mastitis en ovejas. Algunos de los serotipos probablemente forman parte de la microflora residente del tracto respiratorio superior de los rumiantes, aunque con 4,15,18 frecuencia es difcil su aislamiento. En bovinos que desarrollan pasteurelosis neumnica, probablemente haya portadores sanos de la cepa de Mh que causa la neumona, o es posible que 4 sean cepas adquiridas de otros animales. Mh es el principal agente etiolgico en el complejo de las enfermedades respiratorias de los 5,11,25 bovinos, particularmente de la MnB. Constituye un nuevo miembro de la familia Pasteurellaceae que originalmente inclua los gneros Haemophilus, Actinobacillus y Pasteurella (HAP). La mayora de los miembros de la familia HAP son comensales de la mucosa de mamferos, incluyendo humanos, pjaros y reptiles, no obstante, muchos son 6,18 patgenos oportunistas y pueden producir enfermedad bajo condiciones apropiadas. De los 12 serotipos reconocidos de Mh, A1 y A2 son los ms prevalentes en el mundo. Estos dos 26 serotipos son los que con mayor frecuencia se aslan de becerros; el A1 es el que se asla ms frecuentemente de lesiones neumnicas en los casos de MnB, aun cuando en bovinos sanos son 27 ms frecuentes los serotipos A1 y A2 en la nasofaringe, en ocasiones tambin se aslan los 2,5,6,810,28,29 serotipos A2, A5, A6, A7 y A9. En estudios recientes en Alemania y Estados Unidos de Amrica, adems del A1, el A6 ha sido registrado como el ms frecuentemente aislado en
15

pulmones neumnicos de bovinos. Tambin se han registrado los serotipos A11 (Mg) y 2,32,33 A12. No obstante que en los bovinos, por lo general, slo se encuentran los serotipos A1 y A2, este ltimo se asocia con la pasteurelosis neumnica ms frecuentemente en ovinos que en 8,28,34 bovinos. Estos dos serotipos son capaces de colonizar el tracto respiratorio superior de bovinos y ovinos y con frecuencia son especieespecficos en su capacidad de afectar el tracto 2,9 respiratorio inferior y producir enfermedad. En los bovinos sanos es comn que el serotipo A2 est presente en el tracto respiratorio superior, pero despus de un estado de estrs o de una infeccin viral, el serotipo A1 rpidamente reemplaza al A2 como el serotipo principal; esto probablemente se deba a una transmisin 2,9 horizontal a partir de animales enfermos que tengan el A1 activo en secreciones nasales. Se ha podido comprobar que el serotipo A2 predominaba en exudado de becerros en granja, y cuando estos animales fueron trasladados a corrales de subasta y luego a corrales de engorda se encontr 16,28 que predominaba el A1. En los ovinos es posible aislar cualquiera de los serotipos. Diversos estudios serolgicos sugieren que es posible que ocurra la transmisin interespecie de Mh desde 35 animales domsticos hacia animales silvestres o de vida libre, o viceversa. Cepas de Mh no tipificables (NT) tambin se aslan con frecuencias variables, a veces altas, que varan dependiendo de la fuente de aislamiento. En Gran Bretaa se ha registrado 9.3% en 26 exudado nasal y 12.8% en pulmones neumnicos de becerros, y en vacas, 20.1% en exudado nasal, 16.2% en pulmones neumnicos, 29.4% en sangre, 25% en hgado y bazo, 72.2% en tracto 36 genital, 89.5% en ubre y leche, 66.7% en tracto intestinal y 16.6% en cerebro. En exudado nasal 37 38 de ovinos se ha registrado 9.3% en Mxico, 15.8% en Estados Unidos de Amrica y 25% en 39 40 21 41 Dinamarca, y en pulmones neumnicos, 3.6% en Etiopa, 7% en Hungra y 8.3% en Turqua. En estudios recientes realizados en Mxico se encontraron frecuencias superiores a las registradas hasta ahora en otros pases. En exudado nasal de bovinos se encontraron frecuencias de 69% en 32,33 42 animales sanos y 67% en animales enfermos, y en pulmones neumnicos de bovinos, 71%. Esta cepas NT normalmente corresponden al biotipo A y se han descrito como mutantes de Mh, 44 algunas de las cuales presentan deficiencias en la produccin de antgenos solubles. En este 43 sentido, algunos estudios citados por Frank mencionan la posibilidad de que cepas clasificadas como NT por la tcnica de hemoaglutinacin indirecta (HAI), quiz sean cepas serotipificables mediante dicha tcnica, pero que la imposibilidad de reaccionar a la HAI puede ser consecuencia de la prdida de antgenos serotipoespecficos en la superficie celular, lo que corrobora las dificultades que se presentan para la serotipificacin de Mh mediante la HAI.
43 17

30,31

Mecanismos de patogenicidad Los mecanismos de patogenicidad de algunos de los miembros de la familia Pasteurellaceae no estn an muy claramente definidos, particularmente la patognesis de la PNB, ya que algunos de los mecanismos que le permiten a Mh establecerse y diseminarse durante la infeccin, no estn esclarecidos satisfactoriamente, incluso existe la posibilidad de que haya diferencias en dichos mecanismos entre las cepas aisladas de diversos cuadros neumnicos, as como de cepas 6,9,45 procedentes de animales sanos. En las cepas de Mh que afectan a los rumiantes se han identificado diversos mecanismos de expresin de su patogenicidad a travs de potentes antgenos, los cuales incluyen: una leucotoxina (Lkt) con actividad especfica contra leucocitos; lipopolisacridos (LPS), protenas de membrana externa (PME), protenas reguladas por hierro (PRH), fimbrias, enzimas (neuraminidasa, proteasas, metaloglicoproteasas), antgenos aglutinantes serotipo especfico y adhesinas; adems de la 6,8,14,4648 cpsula y plsmidos de resistencia a antibiticos. Todos estos mecanismos juegan un

papel fundamental en la patognesis de la enfermedad; sin embargo, slo la Lkt es considerada 10,14,45,46 como el factor de patogenicidad primario ms importante. Todos los genes relacionados con los factores de virulencia identificados han sido localizados en el genoma de Mh A1, el cual ha sido secuenciado recientemente. Leucotoxinas (Lkt) Las Lkt son un grupo de exotoxinas que producen su efecto txico primario en contra de los leucocitos, en particular los leucocitos de rumiantes, especialmente las clulas polimorfonucleares 10,48,50,51 (PMN). La toxina origina una amplia variedad de efectos biolgicos sobre los leucocitos 10 50 bovinos, cuyo resultado final es una pleuroneumona fibrinosa aguda. ' En estudios realizados en 1980 se pudo comprobar que el sobrenadante libre de clulas de cultivos de Mh A1 poda producir fagocitosis a bajas concentraciones y era citotxico a altas concentraciones; posteriormente se pudo descubrir que el sobrenadante contena una leucotoxina 9,18 (Lkt) termolbil secretada por Mh durante su crecimiento exponencial. La Lkt A de Mh forma parte de la familia de exotoxinas producidas por bacterias gramnegativas, llamadas toxinas RTX, en razn de que contienen un nmero variable de dominios de aminocidos repetidos ricos en glicina, de los cuales la familia de toxinas RTX (repeatsintoxin) deriva su nombre y causan una amplia variedad de efectos caractersticos sobre las clulas en que 9,45,47,52,53 18 actan. Las toxinas RTX se han encontrado en los 12 serotipos del gnero Mannheimia. La Lkt de Mh es una protena termolbil, calciodependiente, estable al oxgeno y al pH, y soluble en agua, y las ms altas concentraciones en su produccin se dan en la fase logartmica del 54,55 crecimiento de la bacteria. Se ha podido comprobar que el hierro es un factor requerido para el 56 ptimo crecimiento de la bacteria y para la produccin de la Lkt. Los genes de la Lkt de Mh han sido secuenciados y la toxina se ha expresado en E. coli. La organizacin gentica del opern de la Lkt de Mh (lktCABD) es similar a la del opern de la hemolisina de E. coli (hlyCABD), y contiene cuatro genes. El primer gen es el lktC el cual codifica una protena (LktC) que es la responsable de la activacin de la leucotoxina (Lkt) por acilacin. El segundo gen es el MA, el cual codifica la estructura protenica de la leucotoxina (LktA). Finalmente, los genes lktB y lktD codifican para las protenas LktB y LktD, que en conjunto son responsables de 10 14,45,52 la transportacin y la secrecin de la leucotoxina (LktA). , La Lkt de Mh tiene una estrecha 18 especificidad contra clulas blanco y es citotxica contra los leucocitos de rumiantes, y se ha identificado a la molcula CD18 como el receptor que interviene en la adherencia de la Lkt con los 10,18,52,57 leucocitos de rumiantes. La actividad de la LktA contra las clulas blanco es dosis dependiente y se puede clasificar en tres categoras. A muy bajas concentraciones la leucotoxina activa las clulas blanco para experimentar una interrupcin de la respiracin y la degranulacin. A medida que la concentracin de leucotoxina se incrementa, las clulas blanco son estimuladas para que experimenten apoptosis (muerte celular programada); cuando la concentracin de la leucotoxina es alta se presenta una necrosis de las clulas blanco como consecuencia del dao a la membrana debido a la formacin de poros. De esta manera, aumenta la posibilidad de colonizacin de la mucosa respiratoria por 9,10 parte de la bacteria. El efecto mejor conocido de las toxinas RTX sobre los neutrfilos es la formacin de poros (0.9 a 3 18 nm de dimetro) que atraviesan la membrana. En altas concentraciones, la Lkt causa una rpida (515 min) prdida del potasio intracelular y el hinchamiento de la clula. La formacin de numerosos desperfectos de la membrana plasmtica depende del calcio; entre ellos se incluyen poros hasta de 10 nm de dimetro sobre la superficie de la clula, estos poros hacen que la
18

membrana celular sea permeable a los iones y a la salida de agua, lo que origina la lisis 9,45,47 celular. Por lo tanto, en la MnB los macrfagos alveolares desempean un papel central en todos los 10 procesos celulares y en la cascada inflamatoria que conduce al dao pulmonar. Entre los leucocitos, los macrfagos son ms resistentes que los neutrfilos contra el efecto ltico de las Lkt, y entre los macrfagos alveolares son ms resistentes los de los bovinos adultos que los de 2 becerros menores de 16 semanas de edad. La induccin de la secrecin y la liberacin de pptidos quimiotcticos vasoactivos por clulas maestras, aumenta el nmero de leucocitos disponibles en el lugar de la inflamacin, en donde se producen depsitos fibrinosos, este proceso culmina en una neumona fibrinopurulenta aguda. Cualquier oportunidad de respuesta inmune secundaria es interrumpida por la actividad de la Lkt, 10 que previene la blastognesis de los linfocitos. La interaccin de la Lkt con el sistema inmune del husped es compleja e inteligente; induce 47,58,59 efectos biolgicos en los leucocitos bovinos de una manera especie especfica, pone al sistema del husped a trabajar en beneficio de la bacteria y deja a los tejidos de dicho portador desvalido en contra de la infeccin.

Protenas de membrana externa (PME) Se han realizado estudios enfocados a la identificacin de protenas de la superficie celular y PME producidas por diversos serotipos de Mh como potenciales inmungenos para prevenir la 29,60 pasteurelosis neumnica en el ganado. Los resultados de diversos estudios resaltan que las PME de Mh constituyen algunos de los ms 29,61 importantes antgenos para la estimulacin de respuesta inmune en contra de la MnB, y se ha podido comprobar una correlacin estadsticamente significativa entre la resistencia a la enfermedad y la presencia de anticuerpos sricos dirigidos contra una gran cantidad de protenas 6163 presentes en extractos salinos de la clula bacteriana ntegra. Se sabe entonces, que las PME tienen un gran potencial para desarrollar inmungenos, 9,63,64 especialmente aquellas que estn expuestas en la superficie. Las protenas expuestas en la cpsula de la clula bacteriana son un objetivo de gran inters para la respuesta inmune del husped. Dos mecanismos muy importantes en la inmunidad de los bovinos en contra de Mh: la muerte mediada por el complemento y la fagocitosis mediada por los neutrfilos, son mejorados 61 por la opzonizacin de la bacteria y por la eliminacin de la cpsula. Se considera que los anticuerpos para las PME de las bacterias gramnegativas tambin suministran proteccin contra la infeccin por Mh. Es probable que estos anticuerpos promuevan la 60 fagocitosis y quiz tambin la muerte, al disminuir la funcin de estas protenas. Si bien el papel de las PME como factor de virulencia no est del todo dilucidado, diversos estudios han confirmado su importancia en la patognesis de las infecciones y resaltan su participacin potencial en la respuesta de anticuerpos en la proteccin antibacteriana, adems de que participan como transportadoras de materiales a travs de la membrana (porinas) y en la adhesin a la clula 60,65 husped. De igual manera, se ha podido comprobar que las PME aisladas de Mh son poderosas moduladoras de la actividad de los leucocitos polimorfonucleados de bovinos e inducen alteraciones en su actividad biolgica, de tal manera que es posible observar in vitro, una

reduccin dosisdependiente en la capacidad de adherencia a la pared de nailon. Se cree que es posible que pequeas cantidades de PME estimulen la quimiotaxis y la adherencia de los 65 neutrfilos, favoreciendo de esta manera su acumulacin en el foco inflamatorio inicial. En ratones inmunizados con PME de Mh A1 y desafiados con Mh A1 viva, o con PME, se desarroll neumona broncointersticial muy similar a la MnB, adems, se present una alta concentracin de ttulos de anticuerpos contra las PME, lo cual sugiere que el complejo inmune 66 juega un papel muy importante en la patognesis de la MnB. El metaanlisis de 27 estudios realizados a lo largo de 12 aos con vacunas experimentales y comerciales, revel que aquellas que aportaron PME y otros antgenos de superficie, suministraron los mejores niveles de proteccin contra desafos con Mh, equivalente al proporcionado por 67 vacunas vivas. La capacidad inmunognica vara entre los diferentes serotipos de Mh, esto se ha podido comprobar con desafos intratraqueales de ovejas con Mh A2, A7 y A9, inmunizadas con extractos de PME de los mismos serotipos. Aunque se encontraron altos niveles de anticuerpos, slo la vacuna con PME de S7 produjo proteccin efectiva contra infeccin homloga y heterloga por Mh 68 A2, A7 y A9. Se ha comprobado que la presencia de anticuerpos contra PME de Mh tiene una correlacin estadstica con la resistencia a desafos experimentales con dicho microorganismo en vacas. Se pudo clonar y secuenciar el gene que codifica una de dichas protenas (PlpE), la cual es una 69 lipoprotena similar a una lipoprotena de Actinobacillus pleuropneumoniae. Estudios posteriores han podido demostrar que esta protena recombinante (rPlpE) es altamente imnunognica cuando se inyecta por va subcutnea en bovinos y la inmunidad adquirida aumenta considerablemente en 70,71 desafos experimentales.

Sialoglicoproteasa (Gcp) Entre los antgenos presentes en el sobrenadante de cultivos de Mh A1 destaca una O sialoglicoprotena (Gcp) que es una metaloproteasa neutra, con actividad de endopeptidasa y neuroaminidasa, que tiene la capacidad de fraccionar glicoprotena A tipo mucina en diferentes 7277 sitios. La presencia de anticuerpos (IgG1 e IgG2) contra la Gcp se pudo comprobar mediante el uso de sobrenadante de un cultivo de Mh A1 en fase de crecimiento logartmico, que contena una enzima proteoltica especfica para Gcp y con el cual se vacunaron y se desafiaron grupos de becerros; en muchos de estos sueros se pudo comprobar que contenan IgG1 e IgG2; adems, aquellos animales que tuvieron anticuerpos antiGcp, presentaron una neumona ms leve a la necropsia; estos resultados demostraron que la Gcp es inmunognica y que la bacteria produce la enzima in 75 vivo. El suero de bovinos convalecientes presenta actividad de Gcp, lo cual sugiere que esta Gcp 18 es inmunognica en los animales. Las clulas blanco de la Gcp an no han sido bien definidas, pero probablemente son sialoglicoprotenas presentes en la superficie de las clulas de la superficie de la mucosa, 18 macrfagos alveolares, neutrfilos alveolares u otros leucocitos. No obstante que el papel de la Gcp en la patognesis no ha sido demostrado convenientemente, se ha sugerido que su actividad interfiere con la adhesin de los neutrfilos por una escisin de la O sialoglicloprotena de las molculas de adhesin celular; alternativamente, la Gcp puede interferir con la respuesta inmune del husped por una escisin de las molculas de la IgG sricas o quiz contribuya en la 18,78 colonizacin bacteriana. El gen de Gcp ya fue clonado en E. coli y secuenciado,

desafortunadamente la Gcp se encontr agregada e inactiva en el periplasma de E. coli. En becerros que haban sido desafiados con Mh A1 se logr inducir una proteccin significativa con la 79 administracin solamente de la Gcp como vacuna.

72

Neuraminidasa La neuraminidasa es producida por Mh in vivo, ya que anticuerpos antineuraminidasa se pueden 80 encontrar en el suero de cabras despus de una infeccin transtorxica con bacterias. No obstante que el papel de la neuraminidasa en la neumona bovina es desconocido, esta enzima ha 18 sido implicada como factor de virulencia en diversos patgenos de mucosas. La produccin de neuraminidasa por especies de Pasteurella se registr por primera vez en 1970, demostrando que 102 de 104 cepas de P. multocida y tres de cinco cepas de P. haemolytica haban producido la 80,81 81 enzima. Straus et al. pudieron demostrar que todos los serotipos de Mh, excepto el serotipo A11 (Mg), son capaces de producir neuraminidasa. Se ha demostrado que la actividad protectora de la secrecin salivar se reduce cuando se remueven los residuos de cido silico de las glicoprotenas salivares; es posible que la neuraminidasa ejerza un efecto patognico mediante la remocin de los residuos de cido silico de las glicoprotenas del husped, y de esta manera reduce el efecto protector del moco, incrementando la adherencia de Mh al epitelio de la mucosa, particularmente en el tracto 9,82,83 respiratorio superior. Tambin se ha podido demostrar que aislamientos de Mh A1 pudieron producir niveles ms altos de neuraminidasa que cepas del serotipo A2, lo cual puede evidenciar 84,85 que la neuraminidasa est involucrada en la invasin de Mh en los procesos neumnicos.

Lipopolisacridos (LPS) El LPS de Mh es estructuralmente similar al de una bacteria tpica gramnegativa. Este LPS tiene las actividades propias de las endotoxinas gramnegativas: pirognicas, activacin de macrfagos, induccin del factor de tumoracin, activacin de la coagulacin en cascada, agregacin de 2,86 plaquetas e induccin del choque endotxico. La administracin intrabronquial de LPS purificado de Mh origin la exudacin de fibrina y neu trfilos, edema pulmonar y agregacin de plaquetas en los capilares, implicando al LPS como la 18,86,87 principal causa de necrosis microvascular y trombosis. El LPS de Mh A1 fue capaz de causar dao directo sobre las clulas del endotelio de las arterias pulmonares in vitro; demostrando la 86 funcin potencial de las endotoxinas en la patognesis de la lesin vascular en la MnB. La participacin del LPS podra ser el resultado de las funciones moduladas por los leucocitos bovinos y la simulacin de la respuesta inflamatoria del husped, de este modo se exacerba el dao a sus tejidos; de igual manera, el LPS participa como mediador en el incremento de las citocinas proinflamatorias, lpidos mediadores, procoagulantes, radicales de oxgeno y proteasas, 2 18 generados por los monocitos y los macrfagos bovinos. , Se ha podido demostrar que el LPS incrementa la actividad citoltica de la Lkt y que aumenta la expresin Lktdependiente de la IL8 y 88 89 el factor de necrosis tumoral alfa (TNFcc). ' Es probable que in vivo, el LPS y la Lkt acten de 9 manera sinrgica causando dao a los tejidos e inflamacin.

Adhesinas

Se sabe de manera general que las bacterias se pueden adherir a las superficies epiteliales a travs de receptores especficos, de tal manera que los factores bacterianos involucrados en la interaccin bacteriaclula son muy diversos; entre algunas de las estructuras bacterianas que pudieran participar en la adherencia se reconocen las fimbrias, adhesinas no fimbriales, adhesinas 83 proteinceas, el glicoclix, el LPS, protenas de membrana externa y la cpsula. Poco se sabe acerca de las molculas que participan en la habilidad de Mh para colonizar la faringe y las criptas tonsilares; es probable que codifique una adhesina que permita a la bacteria atacar el epitelio 9 83 respiratorio, tambin se ha mencionado la participacin del LPS, las fimbrias y el glicoclix; se ha 87 podido demostrar la capacidad del LPS de Mh para producir adherencia in vitro, tambin se conoce que el componente del polisacrido capsular facilita que Mh pueda unirse 83 especficamente a los fagocitos e impedir el desarrollo de sus funciones. Se sabe que existen dos tipos de fimbrias en Mh, unas largas y rgidas de 12 nm, y otras cortas y flexibles de 5 nm, las cuales pudieron ser evidenciadas especialmente cuando las bacterias fueron recuperadas de 51 lavados traqueales de becerros infectados experimental o naturalmente. El papel funcional de las adhesinas de Mh en la patognesis debe ser estudiado con ms detalle, no obstante es muy posible que esta adhesina participe en un proceso secuencial de reconocimiento de la clula husped, que precede a la liberacin de exo protenas con actividad cataltica, como la endopeptidasa o neuraminidasa, o ambas. Se considera que las adhesinas de Mh constituyen una alternativa como un inmungeno potencial para el desarrollo de vacunas en 77 contra de la MnB. En estudios recientes en Mxico, Jaramillo et al. lograron la purificacin por afinidad de una adhesina de 68 kDa que fue capaz de aglutinar especficamente eritrocitos de conejo, concluyendo que las adhesinas de Mh juegan un importantsimo papel en la infeccin. La adhesina de Mh es similar a una adhesina de alto peso molecular caraterizada en cepas no tipificables de H. 18 influenzae.
77

Plsmidos En Mh se ha podido demostrar la existencia de plsmidos de resistencia a antibiticos; aun cuando la presencia de plsmidos no es un fenmeno caracterstico entre todas las especies, algunas cepas poseen slo un plsmido pequeo (aproximadamente 4.2 kb), el cual es responsable de la 9,18,51 resistencia contra estreptomicina y sulfonamidas. En estudios con cepas de Mh A1, en la mayora de ellas se pudo aislar un plsmido que codificaba una (3 lactamasa, slo unas pocas 4 presentaron dos o ningn plsmido. No todos los plsmidos encontrados estn asociados con resistencia a antibiticos, paradjicamente fue posible encontrar resistencia en ausencia de plsmidos y algunos de ellos fueron correlacionados con la leucotoxina u otros factores de 9,51 virulencia. Los plsmidos juegan un papel muy importante en la estructura gentica de resistencia antimicrobiana de Mh. Entre los genes de resistencia a antimicrobianos uno de los ms frecuentes en Mh es el de resistencia a sulfonamidas (sulII). La mayora de estos genes se han encontrado en plsmidos de 4.2 a 16.7 kb, algunos de los cuales tambin generan resistencia contra estreptomicina, kanamicina y tetraciclinas; asimismo, la resistencia a lactmicos est asociada con pequeos plsmidos de 4.2 a 5.2 kb; tambin se ha identificado un pequeo plsmido de menos de 10 kb, asociado con resistencia a aminoglicsidos, as como uno de aproximadamente 113 kb de resistencia con estreptomicina, kanamicina, tetraciclinas y sulfonamidas; de igual manera, el gen de resistencia a estreptomicina (strA) se ha encontrado tanto en plsmidos como en el cromosoma de Mh; la resistencia a cloranfenicol est mediada principalmente por las cloramfenicolacetiltransferasas, muchas de las cuales estn localizadas en plsmidos que han 90 sido identificados en Mh.

Diagnstico Para la deteccin e identificacin de Mh se cuenta con diversas tcnicas de laboratorio que incluyen: aislamiento y fenotipificacin, serotipificacin y genotipificacin. Para el aislamiento y fenotipificacin se utiliza el cultivo in vitro en medios a base de agar sangre, adems de pruebas bioqumicas, todo lo cual permite determinar la morfologa de las colonias, la produccin de hemlisis, as como su comportamiento bioqumico para efectos de su identificacin 15,16 y biotipificacin. Adems de los mtodos convencionales disponibles para la identificacin bioqumica de Mh, se dispone de otros mtodos alternativos, que se basan en sistemas miniaturizados disponibles comercialmente y que facilitan y agilizan la fenotipificacin; entre ellos se encuentra el sistema API 20E y 20NE,* tabletas diagnsticas** y el sistema OxiFerm,*** que se han usado ampliamente como una herramienta en la identificacin de enterobacterias y no 7,35,39,9194 enterobacterias en medicina veterinaria, con resultados muy satisfactorios. Para la serotipificacin se emplean tcnicas de hemoaglutinacin mediante la utilizacin de antisueros de referencia especficos para los 12 serotipos reconocidos. Otra prueba serolgica que se puede utilizar es la tcnica de ensayo visual simple a partir de la obtencin de LktA de aislamientos de Mh, para determinar la presencia de anticuerpos antiLktA en el suero de los animales problema; de igual manera, mediante la tcnica de inmunoelectrotransferencia, a partir de protenas obtenidas de la membrana externa de Mh, que se emplean como antgenos para 16 determinar el patrn de reconocimiento por anticuerpos contra dichos antgenos. La variabilidad y complejidad de las caractersticas fenotpicas y genotpicas del gnero Mannheimia dificultan en gran medida la clasificacin de los aislamientos a travs de las tcnicas de laboratorio rutinarias, basadas en criterios descriptivos convencionales, que hacen imposible la clasificacin taxonmica precisa. Las tcnicas clsicas para la identificacin de bacterias, tales como la biotipificacin, serotipificacin, determinacin de patrones de susceptibilidad a antibiticos y fagotipificacion, se basan en diferencias fenotpicas, no obstante estas tcnicas se ven limitadas por la capacidad de las bacterias de alterar, de manera impredecible, la expresin de algunas de sus caractersticas, de tal manera que aislamientos de una misma cepa pueden variar fenotpicamente; adicionalmente, algunos de estos mtodos se ven limitados por la relativa gran cantidad de cepas que son fenotpicamente nulas, es decir, no 95,96 tipificables. Los mtodos fenotpicos para la caracterizacin de las especies de Mannheimia se han utilizado durante mucho tiempo y aunque se acepta que su reproducibilidad es alta, sus limitaciones ya han 39,97 sido reconocidas ampliamente. En estudios realizados para evaluar la especificidad de la serotipificacin como una herramienta diagnstica, se ha demostrado que no es un mtodo confiable para la correcta identificacin de Mh, y se hace nfasis sobre la necesidad de una amplia caracterizacin fenotpica y genotpica para la adecuada tipificacin de este microorganismo, considerando las dificultades que han presentado otros estudios para su clasificacin, basada 25,39,98 solamente en la fenotipificacin y la serotipificacin, teniendo en cuenta que el 39 gneroMannheimia abarca taxones de una gran heterogeneidad fenotpica y genotpica. Es evidente que los estudios sobre caracterizacin epidemiolgica requieren del uso tanto de los mtodos fenotpicos como genotpicos. Diversas tcnicas de biologa molecular han demostrado su utilidad en el estudio de la taxonoma, patognesis y epidemiologa de Mh. Entre las tcnicas empleadas en diversas investigaciones sobre la epidemiologa molecular de aislamientos de Mh se pueden destacar las siguientes: anlisis de restriccin para la deteccin de los genes del ARNr o ribotipificacin, polimorfismo de la longitud de los fragmentos de restriccin (RFLP), anlisis de endonucleasas de restriccin (REA) del ADN cromosomal, hibridacin de ADN ADN, electroforesis de enzimas multilocus (EEML), amplificacin al azar del polimorfismo del ADN (RAPD),

secuenciacin del ADN, electroforesis en gel de campos pulsados (PFGE) y anlisis del 15 39 97 99 polimorfismo de la longitud de fragmentos amplificados (AFLP). ' ' " Todos estos mtodos tienen como base el estudio del polimorfismo del ADN bacteriano y se ha demostrado su alto poder de discriminacin para la diferenciacin de cepas, superior a los mtodos convencionales de 15,95,96,100 tipificacin fenotpica.

Prevencin y control Dada la complejidad que involucra la multicausalidad de esta enfermedad, las medidas de prevencin y control siguen siendo motivo de anlisis y polmica respecto de su eficacia y la eficiencia de la inmunizacin, el empleo de quimioteraputicos y el control de factores medioambientales que propician el estrs en los animales y favorecen la accin invasora de Mh a travs de sus complejos mecanismos de virulencia. Tradicionalmente, el tratamiento contra la MnB se ha basado en el uso intensivo de antibiticos, incluyendo, adems, el tratamiento masivo de hatos, lo cual ha determinado un incremento en la incidencia de cepas multirresistentes de Mh. De ah que sea preferible una prevencin y control de 9 la enfermedad, basada ms en la vacunacin que en la quimioterapia. La seleccin de los antimicrobianos a emplear, raramente se basa en estudios previos de sensibilidad in vitro de cepas aisladas a partir de exudado nasal o traqueal, considerando, adems, que estos aislamientos no 101 reflejan necesariamente los microorganismos presentes en el tejido pulmonar. Para el tratamiento de la MnB se ha empleado una gran variedad de antimicrobianos que incluyen principalmente penicilinas, oxitetraciclina, trimetoprim/ sulfadoxina, ampicilina, tilmicosn, florfenicol y tulatromicina, y aunque todos ellos han demostrado eficacia, tambin se ha podido comprobar la resistencia contra peniclina, ampicilina, tetraciclina, sulfonamidas y tilmicosn en muchos 102 aislamientos de Mh. Una revisin ms amplia sobre dosificacin y eficacia de diversos antimicrobianos en el tratamiento de la MnB, as como sobre resistencia a antimicrobianos de Mh, 102 9 se encuentra en Rice et al. y Highlander. Existe en el mercado una amplia gama de vacunas, desafortunadamente no hay mucha informacin publicada en revistas arbitradas que sustenten su eficacia en estudios con desafos 9,103 controlados o en condiciones de campo. Aparentemente, estas vacunas slo aportan una proteccin parcial, incluso algunas, como las preparadas a base de clulas ntegras, pueden llegar a incrementar la morbilidad en el 104 hato. Otra estrategia de prevencin en lotes de engorda ha sido el empleo de vacunas 103 nicamente contra agentes virales, la cual tambin ha resultado poco efectiva. El desarrollo de vacunas efectivas contra la MnB depende primordialmente del conocimiento detallado de los antgenos y factores de virulencia de Mh, necesarios para estimular una proteccin inmune. Estos antgenos incluyen componentes de la superficie bacteriana (LPS, OMP) adems de 9 molculas secretadas (Lkt). Se ha podido demostrar correlacin entre los ttulos de anticuerpos antileucotoxina neutralizantes y la resistencia a la enfermedad; sin embargo, el empleo de la Lkt sola, purificada o recombinante, 62 78 no ha sido suficiente para originar proteccin. ' De manera similar, el empleo de polisacridos capsulares combinados con Lkt tampoco ha generado proteccin; sin embargo, el sobrenadante de cultivos mezclados con Lkt recombinante ha sido efectivo en ensayos con animales desafiados, lo que sugiere que la mejor opcin como vacuna para la MnB sea la mezcla de Lkt asociada con 9 antgenos de sobrenadante.

Tambin se ha informado sobre algunos resultados exitosos mediante el uso de vacunas vivas; sin 105,106 embargo, existe la preocupacin respecto a la posible virulencia de estas cepas. Estudios recientes se han enfocado a lograr la induccin de inmunidad local contra Mh, mediante la liberacin de antgenos a travs de la mucosa, reduciendo as la colonizacin de la nasofaringe por 102 parte del microorganismo, ya sea mediante la expresin de antgenos de Mh en vectores virales, que facilitaran la replicacin en el tracto respiratorio superior, o la administracin oral de dichos 102,107 antgenos encapsulados en microesferas de alginato, as como el desarrollo mediante ingeniera gentica, de plantas para la expresin de antgenos de Mh, a fin de producir vacunas 108 transgnicas comestibles. Estos antgenos derivados de plantas fueron inmunognicos cuando se inyectaron en conejos y tambin mediante vacunas orales estimularon una respuesta inmune en 109 la mucosa de becerros.

Conclusiones El impacto de la MnB en la industria bovina, tanto en ganado productor de carne como de leche, ha sido ampliamente comprobado en diversos estudios, tanto en Norteamrica como en 1,2 Europa; desafortunadamente poco se sabe al respecto en los pases de Amrica Latina y en Mxico en particular. Esta enfermedad se considera como la ms importante en bovinos 7 productores de carne y la segunda, despus de las gastrointestinales, en becerras lecheras. La MnB se desencadena como consecuencia de un desbalance en la interaccin en la trada constituida por uno o ms agentes infecciosos, las defensas del husped y factores estresantes medioambientales; no obstante esta complejidad etiolgica, la mayora de los estudios coinciden 2,6,810 en que el microorganismo involucrado como el principal agente etiolgico es la Mh A1. Los mecanismos de patogenicidad de esta bacteria no estn del todo esclarecidos, y es posible que existan diferencias entre cepas aisladas de diferentes cuadros neumnicos o de animales 6,9,45 sanos. Son varios los mecanismos de patogenicidad identificados en Mh, los cuales han sido 6,8,14,46,47 motivo de anlisis y discusin en diversos estudios. Entre ellos destaca particularmente la Lkt como el factor ms importante y ms ampliamente estudiado, y no obstante la capacidad inmunognica comprobada en algunos de dichos mecanismos, se considera que la Lkt juega el 9,18 papel ms preponderante en la induccin de una respuesta protectora. Siguen existiendo enigmas respecto de Mh, particularmente relacionados con aspectos de patogenicidad, virulencia y taxonoma, debido a la variabilidad y la complejidad de las caractersticas fenotpicas y genotpicas del gnero Mannheimia, as como por las dificultades en 9 su manipulacin gentica. Para una comprensin ms amplia de la epidemiologa y la importancia de todas las especies de Mh, es necesario adoptar nuevos criterios para su identificacin, que incluyan la utilizacin de tcnicas moleculares, as como procedimientos ms sensibles de aislamiento e identificacin bioqumica e inmunolgica. Los mtodos fenotpicos para su clasificacin, no obstante su alta reproducibilidad, presentan limitaciones. La serotipificacin en particular, no es confiable por s sola, si no es apoyada por una slida caracterizacin bioqumica. Por esta razn, la adecuada tipificacin de este microorganismo 25,44,97,98 requiere de una amplia caracterizacin fenotpica y genotpica. Las investigaciones basadas en ensayos experimentales de desafo o en el estudio acerca de la epidemiologa, taxonoma y virulencia, aportarn informacin primordial sobre el comportamiento de Mannheimia haemolytica en bovinos y otras especies animales.

Las medidas de prevencin y control ms eficaces contra la MnB se deben sustentar en la combinacin de un conjunto de actividades que incluyan un diagnstico confiable, vacunas y medidas teraputicas eficaces, y buenas prcticas de manejo. Referencias 1. Lekeu P. Bovine respiratory disease complex. Ann Med Vet 1996; 140: 101 105. [ Links ] 2. Zeccchinon L, Fett T, Desmecht D. How Mannheimia haemolytica defeats host defense through a kiss of death mechanism. Vet Res 2005; 36:133156. [ Links ] 3. Trigo T. El complejo respiratorio infeccioso de los bovinos y ovinos. Cien Vet 1987; 4:136. [ Links ] 4. Murphy GL, Robinson LC, Burrows GE. Restriction endonuclease analysis and ribotyping differentiate Pasteurella haemolytica serotype A1 isolates from cattle within a feedlot. J Clin Microbiol 1993; 31:23032308. [ Links ] 5. Pijoan P, Aguilar R, Morales A. Caracterizacin de los procesos neumnicos en becerros lecheros de la regin de Tijuana, Baja California. Vet Mx 1999;30:149 155. [ Links ] 6. Lo RY. Genetic analysis of virulence factors of Mannheimia (Pasteurella) haemolytica A1. Vet Microbiol 2001; 83:2335. [ Links ] 7. Katsuda K, Kamiyama M, Kohmoto M, Kawashima K, Tsunemitsu H, Eguchi M. Serotyping of Mannheimia haemolytica isolates from bovine pneumonia: 19872006. Vet J 2007; 178:146148. [ Links ] 8. Burrows LL, OlahWinfield E, Lo RY. Molecular analysis of the leukotoxin determinants from Pasteurella haemolytica serotypes 1 to 16. Infect Immun 1993; 61:50015007. [ Links ] 9. Highlander SK. Molecular genetic analysis of virulence in Mannheimia (Pasteurella) haemolytica. Front Biosci 2001; 6:11281150. [ Links ] 10. Narayanan S, Nagaraja T, Chengappa M, Stewart G. Leukotoxins of gram negative bacteria. Vet Microbiol 2002; 84:337356. [ Links ] 11. Trigo F. Patognesis y aspectos inmunolgicos de la pasteurelosis pulmonar bovina. Vet Mx 1991; 22:131134. [ Links ] 12. Jaworski MD, Hunter DL, Ward AC. Biovariants of isolates of Pasteurella from domestic and wild ruminants. J Vet Diagn Invest 1998; 10:4955. [ Links ] 13. Carter GR. Pasteurellosis: Pasteurella multocida and Pasteurella haemolytica. Adv Vet Sci 1967; 11:321379. [ Links ]

14. Fedorova ND, Highlander SK. Generation of targeted nonpolar gene insertions and operon fusions in Pasteurella haemolytica and creation of a strain that produces and secretes inactive leukotoxin. Infect Immun 1997; 65:25932598. [ Links ] 15. Angen O, Mutters R, Caugant DA, Olsen JE, Bisgaard M. Taxonomic relationships of the (Pasteurella) haemolytica complex as evaluated by DNADNA hybridizations and 16S rRNA sequencing with proposal ofMannheimia haemolytica gen. nov., comb. nov., Mannheimia granulomatis comb. nov., Mannheimia glucosida sp,nov., Mannheimia ruminalis sp, nov. and Mannheimia varigena sp, nov. Int J Syst Bacteriol 1999; 49 :6786. [ Links ] 16. Biberstein E. Biotyping and serotyping of Pasteurella haemolytica In: Ban JR, editor. Methods in Microbiology. NewYork: Academic Press Inc, 1978; 253 269. [ Links ] 17. Fraser J, Laird S, Gilmour N. A new serotype (biotype T) of Pasteurella haemolytica. Res Vet Sci 1982; 32:127128. [ Links ] 18. Boyce J, Lo R, Wilkie I, Adler B. Pasteurella and Mannheimia. In: Giles CL, Prescott JF, Songer JG, Thoen CO, editors. Pathogenesis of Bacterial Infectious in Animals. Carlton, Australia: Blackwell Publishing, 2004; 273294. [ Links ] 19. Biberstein EL, Gills M, Knight H. Serological types of Pasteurella hemolytica. Cornell Vet 1960; 50:283300. [ Links ] 20. Biberstein EL, Gills MG. The relation of the antigenic types to the A and T types of Pasteurella haemolytica. J Comp Pathol 1962; 72:316320. [ Links ] 21. Fodor L, Varga J. Characterization of a new serotype of P. haemolytica isolated in Hungary. Res Vet Sci 1988; 44:399. [ Links ] 22. Sneath PH, Stevens M. Actinobacillus rossii sp, nov., Actinobacillus seminis sp. nov., nom. rev., Pasteurella bettii sp. nov., Pasteurella lymphangitidis sp. nov., Pasteurella mairi sp. nov., and Pasteurella trehalosi sp. nov. Int J Syst Bacteriol 1990; 40:148153. [ Links ] 23. Younan M, Fodor L. Characterization of a new Pasteurella haemolytica serotype (A17). Res Vet Sci 1995; 58:98. [ Links ] 24. Blackall P, Bojesen A, Christensen H, Bisgaard M. Reclassification of (Pasteurella) trehalosi as Bibersteinia trehalosi gen. nov., comb. nov. Int J Syst Evol Microbiol 2007; 57:666674. [ Links ] 25. Angen O, Quirie M, Donachie W, Bisgaard M. Investigations on the species specificity of Mannheimia (Pasteurella) haemolytica serotyping. Vet Microbiol 1999;65:283290. [ Links ] 26. Wray B, Thompson D. Serotypes of Pasteurella haemolytica isolated from calves. Br Vet J 1971; 127:lxvilxvii. [ Links ]

27. Frank G, Smith P. Prevalence of Pasteurella haemolytica in transported calves. Am J Vet Res 1983; 44:981985. [ Links ] 28. Coln F, Jaramillo L, Aguilar F, Trigo F, Merino M. Serotipos de Pasteurella haemolytica en pulmones neumnicos de ovinos en Mxico. Rev LatiAm Microbiol 1987; 29:231234. [ Links ] 29. Pandher K, Murphy GL, Confer AW. Identification of immunogenic, surface exposed outer membrane proteins of Pasteurella haemolytica serotype 1. Vet Microbiol 1999; 65:215226. [ Links ] 30. AlGhamdi GM, Ames TR, Baker JC, Walker R, Chase CC, Frank GH et al. Serotyping of Mannheimia (Pasteurella) haemolytica isolates from the upper Midwest United States. J Vet Diagn Invest 2000; 12:576578. [ Links ] 31. Ewers C, LubkeBecker A, Wieler LH. Mannheimia haemolytica and the pathogenesis of enzootic bronchopneumonia. Berl Mnch Tierrztl Wochenschr 2004; 117:97115. [ Links ] 32. JaramilloArango C, HernandezCastro R, SuarezGuemes F, MartinezMaya J, AguilarRomero F, JaramilloMeza L et al. Prevalence of Mannheimia haemolytica isolated from bovine nasal exudates and associated factors, in dairy farms in the NorthCentral of Mexico. J Anim Vet Adv 2007; 6:404409. [ Links ] 33. JaramilloArando C, HernandezCastro R, SuarezGuemes F, MartinezMaya J, AguilarRomero F, JaramilloMeza L et al. Characterization of Mannheimia spp. strains isolated from bovine nasal exudates and factors associated to isolates, in dairy farms in the Central Valley of Mexico. Res Vet Sci 2008; 84:713. [ Links ] 34. BlancoViera F, Trigo F, JaramilloMeza L, AguilarRomero F. Serotypes of Pasteurella multocida andPasteurella haemolytica isolated from pneumonic lesions in cattle and sheep from Mexico. Rev LatAm Microbiol 1995; 37:121126. [ Links ] 35. Villard L, Gauthier D, Lacheretz A, Abadie G, Game Y, Maurin F et al. Serological and molecular comparison ofMannheimia haemolytica and Pasteurella trehalosi strains isolated from wild and domestic ruminants in the French Alps. Vet J 2006; 171:545 550. [ Links ] 36. Quirie M, Donachie W, Gilmour N. Serotypes of Pasteurella haemolytica from cattle. Vet Rec 1986; 119:9394. [ Links ] 37. Argueta G, Mercado P, Trigo T. Frecuencia de Pasteurella haemolytica en la cavidad nasal de corderos y ovinos adultos. Vet Mx 1988; 19:9397. [ Links ] 38. Frank G. Serotypes of Pasteurella haemolytica in sheep in the Midwestern United States. American J Vet Res 1982; 43:20352037. [ Links ] 39. Angen O, Ahrens P, Bisgaard M. Phenotypic and genotypic characterization of Mannheimia (Pasteurella) haemolyticalike strains isolated from diseased animals in Denmark. Vet Microbiol 2002; 84:103114. [ Links ]

40. Sisay T, Zerihun A. Diversity of Mannheimia haemolytica and Pasteurella trehalosi serotypes from apparently healthy sheep and abattoir specimens in the highlands of Wollo, North East Ethiopia. Vet Res Commun 2003; 27:3 14. [ Links ] 41. Kirkan S, Kaya O. Serotyping of Mannheimia haemolytica strains in pneumonic lungs of sheep in the Aydin Region of Turkey. Turk Vet Anim Sci 2005: 29:491 494. [ Links ] 42. JaramilloArango C, HernandezCastro R, CampuzanoOcampo V, SuarezGuemes F, DelgadoGonzalez R, Trigo F. Characterization of Mannheimia sp. and P. multocida strains isolated from bovine pneumonic lungs in two slauhgterhouses in Mexico. J Anim Vet Adv 2007; 6:13981404. [ Links ] 43. Frank G. Serological groups among untypable bovine isolates of Pasteurella haemolytica. J Clin Microbiol 1980; 12:579582. [ Links ] 44. Gentry M, Confer A, Holland S. Comparison of the toxic and antigenic properties of single bovine isolates of Pasteurella haemolyticarepreaenting five sero types and an untypable strain. Vet Microbiol 1988; 16:351367. [ Links ] 45. Highlander SK, Fedorova ND, Dusek DM, Panciera R, Alvarez LE, Rinehart C. Inactivation of Pasteurella (Mannheimia) haemolytica leukotoxin causes partial attenuation of virulence in a calf challenge model. Infect Immun 2000; 68:3916 3922. [ Links ] 46. Marciel AM, Highlander SK. Use of operon fusions in Mannheimia haemolytica to identify environmental and cisacting regulators of leukotoxin transcription. Infect Immun 2001; 69:62316239. [ Links ] 47. Jeyaseelan S, Sreevatsan S, Maheswaran SK. Role of Mannheimia haemolytica leukotoxin in the pathogenesis of bovine pneumonic pasteurellosis. Anim Health Res Rev 2002; 3:6982. [ Links ] 48. Leite F, O'Brien S, Sylte MJ, Page T, Atapattu D, Czuprynski CJ. Inflammatory cytokines enhance the interaction of Mannheimia haemolytica leukotoxin with bovine peripheral blood neutrophils in vitro. Infect Immun 2002; 70:43364343. [ Links ] 49. Gioia J, Qin X, Jiang H, Clinkenbeard K, Lo R, Liu Y et al. The genome sequence of Mannheimia haemolyticaA1: insights into virulence, natural competence, and Pasteurellaceae phylogeny. J Bacteriol 2006; 188:72577266. [ Links ] 50. Deshpande MS, Ambagala TC, Ambagala AP, Kehrli ME Jr., Srikumaran S. Bovine CD18 is necessary and sufficient to mediate Mannheimia (Pasteurella) haemolytica leukotoxininduced cytolysis. Infect Immun 2002; 70:5058 5064. [ Links ] 51. Sleim R. Review: Major pathogenic components of Pasteurella multocida and Mannheimia (Pasteurella) haemolytica isolated from animal origin. El Cairo, Egypt: Bacteriology Department, Animal Health Research Institute, 2005. [ Links ]

52. Hsuan SL, Kannan MS, Jeyaseelan S, Prakash YS, Sieck GC, Maheswaran SK. Pasteurella haemolytica A1derived leukotoxin and endotoxin induce intracellular calcium elevation in bovine alveolar macrophages by different signaling pathways. Infect Immun 1998; 66:28362844. [ Links ] 53. Wang Z, Clarke C, Clinkenbeard K. Pasteurella haemolytica leukotoxininduced increase in phospholipase A2 activity in bovine neutrophils. Infect Immun 1998; 66:18851890. [ Links ] 54. Berggren K, Baluyut C, Simonson R, Bemrick W, Maheswaran S. Cytotoxic effects of Pasteurrella haemolyticaon bovine neutrophils. Am J Vet Res 1981; 42:1383 1388. [ Links ] 55. Shewen PE, Wilkie BN. Evidence for the Pasteurella haemolytica cytotoxin as a product of actively growing bacteria. Am J Vet Res 1985; 46:12121214. [ Links ] 56. Gentry MJ, Confer AW, Weinberg ED, Homer JT. Cytotoxin (leukotoxin) production by Pasteurella haemolytica:requirement for an ironcontaining compound. Am J Vet Res 1986; 47:19191923. [ Links ] 57. Li J, Clinkenbeard KD, Ritchey JW. Bovine CD18 identified as a species specific receptor for Pasteurella haemolytica leukotoxin. Vet Microbiol 1999; 67:91 97. [ Links ] 58. Jeyaseelan S, Kannan MS, Briggs RE, Thumbikat P, Maheswaran SK. Mannheimia haemolytica leukotoxin activates a nonreceptor tyrosine kinase signaling cascade in bovine leukocytes, which induces biological effects. Infect Immun 2001; 69:6131 6139. [ Links ] 59. Jeyaseelan S, Kannan MS, Hsuan SL, Singh AK, Walseth TF, Maheswaran SK. Pasteurella (Mannheimia) haemolytica leukotoxininduced cytolysis of bovine leukocytes: role of arachidonic acid and its regulation. Microb Pathog 2001;30:59 69. [ Links ] 60. Squire P, Smiley D, Croskell R. Identification and extraction of Pasteurella haemolytica membrane proteins. Infect Immun 1984; 45:667673. [ Links ] 61. Pandher K, Murphy GL. Genetic and immunological analyses of a 38 kDa surface exposed lipoprotein of Pasteurella haemolytica A1. Vet Microbiol 1996; 51:331 341. [ Links ] 62. Purdy CW, Straus DC, Struck D, Foster GS. Efficacy of Pasteurella haemolytica subunit antigens in a goat model of pasteurellosis. Am J Vet Res 1993; 54:16371647. [ Links ] 63. Morton RJ, Panciera RJ, Fulton RW, Frank GH, Ewing SA, Homer JT et al. Vaccination of cattle with outer membrane proteinenriched fractions of Pasteurella haemolytica and resistance against experimental challenge exposure. Am J Vet Res 1995; 56:875879. [ Links ]

64. Kimura A, Gulig PA, McCracken GH Jr., Loftus TA, Hansen EJ. A minor high molecularweight outer membrane protein of Haemophilus influenzae type b is a protective antigen. Infect Immun 1985; 47:253259. [ Links ] 65. Iovane G, Galdiero M, Vitiello M, De Martino L. Effect of Pasteurella haemolytica outer membrane proteins on bovine neutrophils. FEMS Immun Med Microbiol 1998; 20:2936. [ Links ] 66. McBride JW, Wozniak EJ, Brewer AW, Naydan DK, Osburn BI. Evidence of Pasteurella haemolytica linked immune complex disease in natural and experimental models. Microb Pathog 1999; 26:183193. [ Links ] 67. Srinand S, Ames T, Maheswaran S, King V. Efficacy of various vaccines against pneumonic pasteurellosis in cattle: a metaanalysis. Prev Vet Med 1995; 25:7 17. [ Links ] 68. Sabri MY, ZamriSaad M, Mutalib AR, Israf DA, Muniandy N. Efficacy of an outer membrane protein of Pasteurella haemolytica A2, A7 or A9enriched vaccine against intratracheal challenge exposure in sheep. Vet Microbiol 2000; 73:1323. [ Links ] 69. Pandher K, Confer AW, Murphy GL. Genetic and immunologic analyses of PlpE, a lipoprotein important in complementmediated killing of Pasteurella haemolytica serotype 1. Infect Immun 1998; 66:56135619. [ Links ] 70. Confer A, Ayalew S, Panciera R, MonteLongo M, Whitworth L, Hammer J. Immunogenicity of recombinantMannheimia haemolytica serotype 1 outer membrane protein PlpE and augmentation of a commercial vaccine. Vaccine 2003; 21:2821 2829. [ Links ] 71. Ayalew S, Confer A, Blackwood E. Characterization of immunodominant and potentially protective epitopes ofMannheimia haemolytica serotype 1 outer membrane lipoprotein PlpE. Infect Immun 2004; 72:72657274. [ Links ] 72. Abdullah KM, Udoh EA, Shewen PE, Mellors A. A neutral glycoprotease of Pasteurella haemolytica A1 specifically cleaves Osialoglycoproteins. Infect Immun 1992; 60:5662. [ Links ] 73. Lee CW, Lo RY, Shewen PE, Mellors A. The detection of the sialoglycoprotease gene and assay for sialoglycoprotease activity among isolates of Pasteurella haemolytica A1 strains, serotypes A13, A14, T15 and A16. FEMS Microbiol Lett 1994; 121:199 205. [ Links ] 74. Lee CW, Shewen PE. Evidence of bovine immunoglobulin G1 (IgG1) protease activity in partially purified culture supernate of Pasteurella haemolytica A1. Can J Vet Res 1996; 60:127132. [ Links ] 75. Lee CW, Shewen PE, Cladman WM, Conlon JA, Mellors A, Lo RY. Sialoglycoprotease of Pasteurella haemolytica A1: detection of antisialoglycoprotease antibodies in sera of calves. Can J Vet Res 1994; 58:9398. [ Links ]

76. Nyarko KA, Coomber BL, Mellors A, Gentry PA. Bovine platelet adhesion is enhanced by leukotoxin and sialoglycoprotease isolated from Pasteurella haemolytica A1 cultures. Vet Microbiol 1998; 61:8191. [ Links ] 77. Jaramillo L, Diaz F, Hernandez P, Debray H, Trigo F, Mendoza G et al. Purification and characterization of an adhesin from Pasteurella haemolytica. Glycobiology 2000; 10:3137. [ Links ] 78. Conlon J, Shewen P, Lo RY. Efficacy of recombinant leukotoxin in protection against pneumonic challenge with live Pasteurella haemolytica A1. Infect Immun 1991; 59:587591. [ Links ] 79. Shewen PE, Lee CW, Perets A, Hodgins DC, Baldwin K, Lo RY. Efficacy of recombinant sialoglycoprotease in protection of cattle against pneumonic challenge with Mannheimia (Pasteurella ) haemolytica A1. Vaccine 2003; 21:1901 1906. [ Links ] 80. Straus DC, Purdy CW. In vivo production of neuraminidase by Pasteurella haemolytica A1 in goats after transthoracic challenge. Infect Immun 1994; 62:4675 4678. [ Links ] 81. Straus DC, Jolley WL, Purdy CW. Characterization of neuraminidases produced by various serotypes ofPasteurella haemolytica. Infect Immun 1993; 61:4669 4674. [ Links ] 82. Confer AW, Panciera RJ, Gentry MJ, Fulton RW. Immunologic response and resistance to experimentally induced pneumonic pasteurellosis in cattle vaccinated with various dosages of lyophilized Pasteurella haemolytica.Am J Vet Res 1986; 47:1853 1857. [ Links ] 83. Jaramillo ML, Zenteno E, Trigo FJ. Mechanisms of pathogenicity and adhesion in Pasteurella haemolytica. Rev LatAm Microbiol 1999; 41:105116. [ Links ] 84. Frank GH, Tabatabai LB. Neuraminidase activity of Pasteurella haemolytica isolates. Infect Immun 1981; 32:11191122. [ Links ] 85. Straus DC, Unbehagen PJ, Purdy CW. Neuraminidase production by a Pasteurella haemolytica A1 strain associated with bovine pneumonia. Infect Immun 1993; 61:253259. [ Links ] 86. Poulsen D, Mosier D, Clinkenbeard K, Confer A. Direct effects of Pasteurella haemolytica lipopolysaccharide of bovine pulmonary endothelial cells in vitro. Am J Vet Res 1989; 50:16331637. [ Links ] 87. Poulsen D, Confer A, Clinkenbeard K, Mosier D. Pasteurella haemolytica lipopolysaccharideinduced arachidonic acid release from a neutrophil adherence to bovine pulmonary artery endothelial cells. Am J Vet Res 1990; 51:1635 1639. [ Links ] 88. Lafleur RL, Abrahamsen MS, Maheswaran SK. The biphasic mRNA expression pattern of bovine interleukin8 inPasteurella haemolytica lipopolysaccharide

stimulated alveolar macrophages is primarily due to tumor necrosis factor alpha. Infect Immun 1998; 66:40874092. [ Links ] 89. Lafleur RL, Malazdrewich C, Jeyaseelan S, Bleifield E, Abrahamsen MS, Maheswaran SK. Lipopolysaccharide enhances cytolysis and inflammatory cytokine induction in bovine alveolar macrophages exposed to Pasteurella (Mannheimia) haemolytica leukotoxin. Microb Pathog 2001; 30:347357. [ Links ] 90. Kehrenberg C, SchulzeTanzil G, Martel JL, ChaslusDancla E, Schwarz S. Antimicrobial resistance inPasteurella and Mannheimia: epidemiology and genetic basis. Vet Res 2001; 32:323339. [ Links ] 91. Oberhofer T. Comparison of the API 20E and Oxi/ Ferm Systems in identification of nonfermentative and oxidasepositive fermentative bacteria. J Clin Microbiol 1979; 9:220226. [ Links ] 92. Swanson E, Collins M. Use of the API 20E system to identify veterinary Enterobacteriaceae. J Clin Microbiol 1980; 12:1014. [ Links ] 93. Collins M, Swanson E. Use of the API 20E system to identify non enterobacteriaceae from veterinary medical sources. Am J Vet Res 1981; 42:1269 1273. [ Links ] 94. Erasmus J. The usefulness of the API 20E classification system in the identification of Actinobacillus actinomycetem comitans, Actinobacillus seminis and Pasteurella haemolytica. Onderst J Vet Res 1983; 50: 9799. [ Links ] 95. Maslow J, Mulligan M. Molecular Epidemiology: Application of contemporary techniques to the typing of microorganisms. Clin Infect Dis 1993:153 164. [ Links ] 96. Versalovic J, Lupski J. Molecular detection and genotyping of pathogens: more accurate and rapid answers. Trends Microbiol 2002; 10:1521. [ Links ] 97. ChasludDancla E, LesageDecauses MC, LeroySetrin S, Martel JL, Coudert P, Lafont JP. Validation of random amplified polymorphic DNA assays by ribotyping as tools for epidemiological surveys of Pasteurella from animals. Vet Microbiol 1996; 52:91102. [ Links ] 98. Poulsen LL, Reinert TM, Sand RL, Bisgaard M, Christensen H, Olsen JE et al. Occurrence of haemolyticMannheimia spp. in apparently healthy sheep in Norway. Acta Vet Scand 2006; 47:70. [ Links ] 99. Derosa DC, Mechor GD, Staats JJ, Chengappa MM, Shryock TR. Comparison of Pasteurella spp. simultaneously isolated from nasal and transtracheal swabs from cattle with clinical signs of bovine respiratory disease. J Clin Microbiol 2000; 38:327 332. [ Links ] 100. Liu SL, Schryvers A, Sanderson K, Johnston R. Bacterial phylogenetic closters revealed by genome structure. J Bacteriol 1999; 181:67476755. [ Links ]

101. Allen JW, Viel L, Bateman KG, Rosedal S, Shewen PE, PhysickSheard P. The microbial flora of the respiratory tract in feedlot calves: associations between nasopharyngeal and bronchoalveolar lavage cultures. Can J Vet Res 1991; 55:341 346. [ Links ] 102. Rice J, CarrascoMedina L, Hodgins D, Shewen P. Mannheimia haemolytica and bovine respiratory disease. Anim Health Res Rev 2008; 8 117 128. [ Links ] 103. Bowland SL, Shewen PE. Bovine respiratory disease: commercial vaccines currently available in Canada. Can Vet J 2000; 41:3348. [ Links ] 104. Wilkie BN, Markham RJ, Shewen PE. Response of calves to lung challenge exposure with Pasteurella haemolytica after parenteral or pulmonary immunization. Am J Vet Res 1980; 41:17731778. [ Links ] 105. Confer AW, Panciera RJ, Fulton RW, Gentry MJ, Rummage JA. Effect of vaccination with live or killedPasteurella haemolytica on resistance to experimental bovine pneumonic pasteurellosis. Am J Vet Res 1985; 46:342347. [ Links ] 106. Panciera RJ, Corstvet RE, Confer AW, Gresham CN. Bovine pneumonic pasteurellosis: effect of vaccination with live Pasteurella species. Am J Vet Res 1984; 45:25382542. [ Links ] 107. Bowersock TL, Hogenesch H, Suckow M, Guimond P, Martin S, Borie D et al. Oral vaccination of animals with antigens encapsulated in alginate microspheres. Vaccine 1999; 17:18041811. [ Links ] 108. Lee RW, Strommer J, Hodgings D, Shewen PE, Niu Y, Lo RY. Towards development of an edible vaccine against bovine pneumonic pasteurellosis using transgenic white clover expressing a Mannheimia haemolytica A1 leukotoxin 50 fusion protein. Infect Immun 2001; 69:57865793. [ Links ] 109. Lo RY. Development of transgenic alfalfa expressing antigens of Mannheimia hemolytica as an oral vaccine against bovine pneumonic pasteurellosis. Proceedings of the International Pasteurellaceae Society Conference 2008; 2008 Oct 12 15; Sorrento, Italia. Sorrento, Italia: International Pasteurellaceae Society, 2008: S:11. [ Links ]