You are on page 1of 109

Toraktan zole Edilen Actinomycetlerin Antimikrobiyal Aktivitesinin Saptanmas Yksek Lisans Tezi Neslihan BALKAR

Yrd.Do.Dr. S.Elif KORCAN


BYOLOJ ANABLM DALI Temmuz 2007

AFYON KOCATEPE NVERSTES FEN BLMLER ENSTTS

Yksek Lisans Tezi

Topraktan zole Edilen Actinomycetlerin Antimikrobiyal Aktivitesinin Saptanmas

Neslihan BALKAR

Yrd.Do.Dr. S.Elif KORCAN

BYOLOJ ANABLM DALI

Temmuz 2007

ONAY SAYFASI
Yrd.Do.Dr. S.Elif KORCAN danmanlnda, Neslihan BALKAR tarafndan hazrlanan Topraktan zole Edilen Actinomycetlerin Antimikrobiyal Aktivitesinin Saptanmas balkl bu alma, lisansst eitim ve retim ynetmeliinin ilgili maddeleri uyarnca 16/08/2007 tarihinde aadaki jri tarafndan Biyoloji Anabilim Dalnda Yksek Lisans Tezi olarak oybirlii ile kabul edilmitir. nvan, Ad, SOYADI Bakan ye ye Prof. Dr. Merih KIVAN Prof. Dr. Muhsin KONUK Yrd. Do. Dr. S. Elif KORCAN (Danman) mza

Afyon Kocatepe niversitesi Fen Bilimleri Enstits Ynetin Kurulunun 01./08/2007 tarih ve 2007/17-04 sayl kararyla onaylanmtr.

Do.Dr. Zehra AKINCI BOZKURT Enstit Mdr

NDEKLER ZET ABSTRACT TEEKKR SMGELER VE KISALTMALAR DZN EKLLER DZN ZELGELER DZN 1.GR 2. GENEL BLGLER 2.1 Actinomycetlerin Morfolojik zellikleri 2.1.1 Makroskobik Morfolojisi 2.1.1.1. Havasal misel (Aerial misel ) 2.1.1.2. Substrat misel (Vejetatif veya batk misel) 2.1.2 Mikroskobik Morfolojisi 2.2 Actinomycetlerin Snflandrlmas 2.3 Streptomyceslerin Genel zellikleri 2.3.1 Streptomyces Ekolojisi 2.3.2 Streptomycesin Taksonomisi 2.3.3 Streptomycesin Metabolizmas 2.3.4 Streptomycesler Tarafndan retilen Sekonder Metabolitler 2.3.5 Streptomyceslerden Elde Edilen Antimikrobiyal Maddeler 2.4 Antimikrobiyal Maddeler 2.4.1 Antibiyotiklerin Tarihesi 2.4.2 Antibiyotiklerin Snflandrlmas 2.4.3 Antibiyotiklerin Biyosentezi 2.4.4 Antimikrobiyal Maddelerin Etki Mekanizmas 2.4.5 Antimikrobiyal Maddelerin Kullanm Alanlar 2.4.5.1 Enfeksiyon Hastalklarnda Kullanm 2.4.5.2 Ziraat Alannda Kullanm 2.4.5.3 Hayvanclkta kullanm iv v vi vii viii ix 1 4 4 4 4 5 5 6 7 10 11 12 12 13 16 20 22 23 23 24 24 25 25

2.4.5.4 Aratrma materyali olarak kullanm 2.5 Antimikrobik ve Kemoteraptik Maddelere Kar Oluan Bakteriyal Diren 3. MATERYAL VE METOT 3.1.Materyal 3.1.1 Aratrma in Seilen stasyonlar 3.1.2 Aratrmada Kullanlan Test Mikroorganizmalar 3.1.3 Kimyasal Maddeler 3.1.4 Kullanlan Solsyon ve zcler 3.1.5 Deneyde Kullanlan Ortamlarn erikleri ve Hazrlanmas 3.2 Metot 3.2.1 Topraktan Actinomycet zolasyonu 3.2.2 zole Edilen Actinomycetlerin Antimikrobiyal Etkinliklerinin Belirlenmesi 3.2.3 Seilen zolatlarn Biyokimyasal zelliklerinin Belirlenmesi 3.2.3.1 Niasta Hidrolizi 3.2.3.2 Lipit Hidrolizi 3.2.3.3 Jelatin Hidrolizi 3.2.3.4 Hidrokarbonlarn Paralanmas 3.2.3.5 Melanin retimi 3.2.3.6 Tirozinin Paralanmas 3.2.3.7 Katalaz Testi 3.2.4 Seilen zolatlarn Fizyolojik zelliklerinin Belirlenmesi 3.2.4.1 Karbon Kaynaklarnn Kullanm 3.2.4.2 Azot Kaynaklarnn Kullanm 3.2.4.3 nhibitr Ortamlar 3.2.5 Seilen zolatlarn Kltrel ve Morfolojik zelliklerinin Belirlenmesi 3.2.6 Fermantasyonla Antimikrobiyal Etkili Molekln retimi 3.2.6.1 Sporulasyon 3.2.6.2 nokulum Hazrlanmas 3.2.6.3 Fermantasyon 3.2.7 Fermantasyon Svsnda Antimikrobiyal Etkinin Saptanmas 3.2.8 Antibakteriyal Etkili Molekln zolasyonu

27 27 29 29 29 29 30 31 32 43 44 45 45 45 46 46 46 46 47 47 47 47 47 48 48 48 49 49 49 49 50

ii

3.2.8.1 Solvent Ekstraksiyonu 3.2.8.2. nce Tabaka Kromatografisi (TLC) ile Uygun Solvent Sisteminin Belirlenmesi 3.2.8.3. Biyootogram 3.2.8.4 Kolon Kromatografisi ve UV Spektrofotometre 4. BULGULAR 4.1 zolatlarn Antimikrobiyal Aktivitesi 4.2 Kltrel ve Morfolojik zelliklerin ncelenmesi 4.3 Biyokimyasal ve Fizyolojik zelliklerin ncelenmesi 4.4 Fermantasyonla Antimikrobiyal Etkili Molekllerin retimi 4.5 Antimikrobiyal Etkili Aktikf Molekllerin zolasyonlar 5. TARTIMA VE SONU KAYNAKLAR ZGEM

50 50 51 52 53 53 56 59 66 70 76 86 98

iii

ZET Yksek Lisans Tezi Topraktan zole Edilen Actinomycetlerin Antimikrobiyal Aktivitesinin Saptanmas Neslihan BALKAR Afyon Kocatepe niversitesi Fen Bilimleri Enstits Biyoloji Anabilim Dal Danman: Yrd. Do. Dr. S. Elif KORCAN Afyonkarahisar ili topraklarndan 52 Streptomyces izole edilmitir. Kltr ortamlarnda en iyi gelien, Gr (+), Gr (-) bakteriler ve mayalara kar en yksek aktiviteyi gsteren 3 izolat seilmitir. zolatlar en fazla antimikrobiyal aktiviteyi S. aureus ATCC 25923e kar gstermi olup, zon ap 23 mm olarak llmtr. zolatlarn morfolojik ve fizyolojik zellikleri incelenmitir. Antimikrobiyal etkili maddenin eldesi iin izolatlar farkl besiyeri ortamlarnda retilmilerdir. AA32 izolatndan elde edilen ekstre UV spektrofotometrede 211-284 nm arasnda pik vermitir. TLCde yrtldkten sonra antimikrobiyal etkiye sahip olan blge kaznm ve Rf deeri 0.527 olarak tespit edilmitir. Bu blge UV spektrada 216, 254 ve 284nm de pikler vermitir. AA33 ise 262-282 nm de pik vermi olup antimikrobiyal etkiye sahip 2 blge tespit edilmitir (Rf 0.487 ve 0.527). Bu blgelerin UV deerleri 1.blgenin; 254, 282 ve 2. blgenin; 208, 256 ve 282 olarak llmtr. 2007, 97 sayfa Anahtar kelimeler; Streptomyces, izolat antimikrobiyal aktivite, Afyonkarahisar

iv

ABSTRACT MSc Thesis Investigation of the Antimicrobial Activity of Actinomycet Isolated from Soil Neslihan BALKAR Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Biology Supervisor: Asist. Prof. S. Elif KORCAN Fifty-two Streptomyces isolates were gained from the soils of Afyonkarahisar. 3 Streptomycese isolates which have the widest antimicrobial spectrum have been chosen as the best cultures isolates they showed very strong anti-microbial activity against Gram-positive, Gram-negative bacteria and yeasts. The results indicated that obtained isolates were highly active against S.aureus ATCC 25923. The morphological and the physiological characteristics of those Streptomycess have been determined. Isolates fermented in different nutritive substances and antimicrobial metabolites have been extracted. The UV spectra of the culture AA32 extracts for the active isolates showed absorbance peaks ranging between 211 and 284 nm. Bioactive region was detected on the TLC plate (Rf 0.527). The UV spectra of the active compounds in aqua showed maximum peaks at 216, 254 and 284. The UV spectra of the other culture of AA33 extracts for the active isolates showed absorbance peaks ranging between 262 and 282 nm (Rf 0.487 and 0.527). Two bioactive regions were detected on the TLC plate (Rf 0.487 and 0.527). Isolates showed absorbance peaks in first region 254, 282; second region; 208, 256 and 282. 2007, 97 pages Key words: Streptomyes, isolates antimicrobial activity Afyonkarahisar

TEEKKR Tez almam esnasnda beni ynlendiren, bilgisini, yardmlarn ve manevi desteini hibir zaman esirgemeyen deerli danman hocam Yrd. Do. Dr. S. Elif KORCANa, almalarmn her aamasnda deneyimlerinden faydalandm Prof. Dr. Muhsin KONUKa, Yrd. Do. Dr. brahim Hakk CERCye ve Yrd. Do. Dr. Meltem DLEKe, maddi ve manevi desteklerini hibir zaman esirgemeyen, her zaman yanmda olan aileme teekkr bir bor bilirim. Neslihan BALKAR

vi

SMGELER VE KISALTMALAR DZN 1. Simgeler cm C dk gr h lt ml mm g l m Derece Santimetre Santigrad derece Dakika Gram Saat Litre Mililitre Milimetre Mikrogram Mikrolitre Mikromolar

2. Ksaltmalar CoNS DNA DMSO DAP ISP Gr(-) Gr(+) Rf RNA TLC UV VRE WHO Koaglaz (-) Staphlococcus Deoksiribonkleik Asit Dimetil Slfoksit Diamino Pimelik Asit International Streptomyces Project Gram negatif Gram pozitif Tutucu Faktr (Retention factor) Ribonkleik Asit nce Tabak Kromatografi (Thin Layer Chromatography) Ultra Viole Vankomisin Direnli Enterekok Dnya Salk rgt

vii

EKLLER DZN

Sayfa No

ekil 2.1 a) Farkl Renklerde Streptomyces Kolonileri b) Sentezlenen Bir Antibiyotik ekil 3.1 Biyootogram Sonucu Oluan Zon Alanlar ekil 4.1 zolatlarn Gliserol Yeast Agar Ortamnda 7 Gnde Geliimi ekil 4.2 zolatlarn ISP 4 Ortamnda 7 Gnde Geliimi ekil 4.3 zolatlarn ISP 5 Ortamnda 7 Gnde Geliimi ekil 4.4 zolatlarn Sakaroz Nitrat AgarOrtamnda 7 Gnde Geliimi ekil 4.5 zolatlarn ISP 7 Ortamnda 7 Gnde Geliimi ekil 4.6 zolatlarn Glukoz Asparajin Agar Ortamnda 7 Gnde Geliimi ekil 4.7 zolatlarn Gliserol Nitrat AgarOrtamnda 7 Gnde Geliimi ekil 4.8 zolatlarn Glukoz Nitrat Agar Ortamnda 7 Gnde Geliimi ekil 4.9 zolatlarn Nutrien Agar Ortamnda 7 Gnde Geliimi ekil 4.10 zolatlarn Malt Agar Ortamnda 7 Gnde Geliimi ekil 4.11 zolatlarn Melanin Formasyon Ortamnda 7 Gnde Geliimi ekil 4.12 zolatlarn Spor Zincir Morfolojisi ekil 4.13 zolatlarn TLC de Oluan Grntleri ekil 4.14 Biyootogram Sonucu Oluan Zon Alanlar ekil 4.15. 4-10 Aras Fraksiyonlarn Oluturduu Antimikrobiyal Etki (Stphylococcus aureus ) ekil 4.16 Ham Madde, Kaznt Bant ve Kolon Kromatorafisi Sonucu Elde Edilen Maddelerin Pik Deerleri

8 51 63 63 63 64 64 64 64 65 65 65 65 66 72 72 73 74

viii

ZELGELER DZN Sayfa No izelge 2.1 Actinomycetales Takmnn Taksonomik Snflandrlmas izelge 2.2 eitli Actinomycetler Tarafnda retilen Biyoaktif Mikrobiyal Metabolitler izelge 2.3 Streptomycesler Tarafndan retilen Antibiyotikler izelge 2.4 eitli Trlerin Biyoaktif Mikrobiyal Metabolit retimi izelge 2.5 eitli Canllar Tarafndan retilen Biyoaktif Mikrobiyal Metabolitler izelge 2.6 Hayvanclkta Kullanlan Baz Antibiyotikler izelge 3.1 alma basamaklar izelge 4.1 zolasyon Blgelerine Gre Antimikrobiyal Aktivite Oranlar izelge 4.2 Afyonkarahisar linden zole Edilen Aktinomisetlerin Antimikrobiyal Aktiviteleri (mm) izelge 4.3 zolatlarn Kltrel ve Morfolojik zellikleri izelge 4.4 AA32 Nolu zolatn Biyokimyasal ve Fizyolojik zellikler izelge 4.5 AA33 Nolu zolatn Biyokimyasal ve Fizyolojik zellikleri izelge 4.6 KA11 Nolu zolatn Biyokimyasal ve Fizyolojik zellikleri izelge 4.7 AA32 ve AA33 Numaral zolatlarn Farkl Besiyeri Ortamlarnda Antibiyotik retimi izelge 4.8 AA32 ve AA33 Numaral zolatlarn Farkl Besiyeri Ortamlarnda Antibiyotik retimi izelge 4.9 Farkl Besiyeri Ortamlarnda 32 Numaral zolatn Ya Arlk lmleri izelge 4.10 Farkl Besiyeri Ortamlarnda 32 Numaral zolatn Byme Erisi izelge 4.11 Farkl Besiyeri Ortamlarnda 33 Numaral zolatn Ya Arlk lmleri izelge 4.12 Farkl Besiyeri Ortamlarnda 33 Numaral zolatn Byme Erisi izelge 4.13 AA32 ve AA33 Numaral zolatlarn Farkl zgenlerle Ekstraksiyonu izelge 4.14 zolatlarn UV spektrum ve Rf deerleri 71 74 70 69 69 68 67 67 54 56 59 60 61 19 26 43 53 14 18 6 9

ix

1. GR Geen 40 yl esnasnda doal rnlerin kimyas srekli bir geliim gstermektedir. Doal rnlerin kolay elde edilebilirlii ve maliyetinin dk olmas zellikle fakir lkelerde nemlidir. Dnya salk rgt (WHO), dnya zerindeki insanlarn % 80inin tedavi amac ile doal rnlerden yararlandn bildirmitir (Farnsworth et al.1985). Son yllarda antibiyotiklerin bilinsiz kullanm ile kemoteraptikler ve antimikrobiyal ajanlara kar patojen organizmalarn diren kazanmas nedeniyle antibiyotiklerin aktivitelerinin bu mikroorganizmalara kar aratrlmas ile yeni, etkili antimikrobiyal maddelerin elde edilmesi zorunlu hale gelmitir. zellikle 1988ler den bu yana vankomisin direnli Enterokoklarn (VRE) ortaya k, buna ek olarak baklk sisteminin kmesine neden olan virs (HIV) gibi yeni patojenlerin ortaya kmas doal rnlerin nemini tm dnyada artrmaktadr. Bu nedenle yeni biyoaktif doal rnlerin aratrlmas kimyaclar, mikrobiyologlar ve farmakologlarn ilgilendii temel konularn banda gelmektedir. evremizde bulunan mikroorganizmalarn birou halen bilinmemektedir nk birok mikroorganizma laboratuvar koullarnda kltre edilememektedir. Eer kltre edilemeyen bu bakterilerin sekonder metabolitleri aratrlabilirse phesiz ki birok aktif doal rnlerin kefi mmkn olacaktr (Rondon et al. 2000, MacNeil et al. 2001, Martinez et al. 2004). Saprofitik yaayan Actinomycetler birok ekolojik alanda bulunmasna ramen, toprak populasyonunun bakteri ve funguslarla beraber en byk populasyonunu oluturur (sizawa and Araragi, 1986). Actinomycetler iinde, toprakta en yaygn olan ve en ok tre sahip olan genusun Streptomyces olduu birok aratrmac tarafndan bildirilmitir (Waksman 1967, Kster 1976). Streptomyces genusu yelerinin, peptidoglukanda diaminoasit olarak diaminopimelik asitin LL izomerinin (LL DAP) bulunmas ile hzl bir ekilde genus seviyesinde identifikasyonlar yaplr. Alkali, organik maddece zengin topraklarn Streptomyces trleri iin iyi bir habitat olduu ve bu durumun birok

antogonist trler iinde geerli olduu eitli aratrmalar ile saptanmtr. Bugne kadar yaplan almalarda Actinomycetler den elde edilen antibiyotiklerin byk ounluunun Streptomyces genusuna ait olduu bildirilmitir (Waksman1967, Lancini et al. 1995). Vuillemin 1889 ylnda ilk defa, antibiosis szcn bir organizmann kendi hayatn devam ettirebilmek iin dier bir organizmay paralamas durumunu ifade etmek iin kullanmtr. Daha sonra Papacostas ve Gate bu kelimenin manasn u ekilde tanmlamtr Eer bir organizmann dier bir organizma zerinde zararl etkisi invivoda ise buna antogonizm, invitroda ise antibiosis olarak adlandrlr. Waksman 1942de antibiyotii; mikroorganizmalarn bymelerini inhibe edici zellie sahip mikrobiyal orjinli kimyasal madde olarak tanmlamtr (Waksman 1967). Antibiyotikler, dk konsantrasyonlarda mikroorganizmalar zerine etkili olan, dk molekler arlkta mikrobiyal molekllerdir (ner 1989). Antibakteriyal etkili lizozim gibi enzimler yada kolisin gibi kompleks protein moleklleri, glisin, lsin gibi aminoasitler, etanol butanol gibi anaerobik fermantasyon rnleri antibiyotik olarak kabul edilmezler. Kemoteraptikler ise antibiyotiklerle ayn zellie sahip olduklar halde kimyasal ve sentetik olarak elde edilen maddelerdir (ner 1989). Antibiyotikler heterojen bir gruptur molekl arl 150-5000 dalton arasnda deiir. Moleklleri sadece karbon veya hidrojen veya ok yaygn olarak karbon, hidrojen, oksijen ve azot, hatta bir ksm kkrt, fosfor veya halojen atomlar ierir. Hemen hemen tm organik kimyasal fonksiyonel guruplar (hidroksil, karbonil, nitrojen fonksiyonel gruplar vb.) ve btn organik yaplar (alifatik zincirler, alisiklik zincirler, aromatik halkalar, heterosiklikler, karbonhidratlar, polipeptitler vb.) bulunur. Genellikle antibiyotikler, bakteri bymesini inhibe eden polar gruplara sahiptirler (Lancini et al. 1995). Dier sekonder rnler gibi antibiyotiklerde, enzimatik olarak katalize edilmi uzun bir reaksiyonlar serisinin son rndr. Sentez iin yapsal ve dzenleyici genler i grr. Bir antibiyotik 15-20 genin ortak rndr. Antibiyotiklerin sentezindeki reaksiyonlar birka biyosentetik yol izinde gruplanmtr. Bu yol izlerinin, normal hcresel

metabolizmann basit biyosentetik yol izi varyasyonlar olduunu ve buradaki kk deiimlerin artc dzeyde farkl maddeler verebileceinin bilinmesi nemlidir. lkemizde Actinomycetler den antibiyotik retimi ile ilgili almalar olduka snrldr. lkemizin corafik konumu dnldnde farkl Actinomycet sularnn izole edilebilecei ve hatta izole edilen bu sularda farkl antibiyotik trevlerinin sentezlenebilecei sylenebilir. Bol hammadde kaynana sahip olan lkemizde halen antibiyotik aktif maddeleri dardan satn alnmaktadr. Bunun nedeni konu ile ilgili yeterli aratrmann yaplamamas ve teknolojinin tam olarak bilinememesidir. Yapacamz bu alma ile Afyonkarahisar ilinden izole ettiimiz Actinomycet sularnn antimikrobiyal madde retim kapasitelerinin belirlenmesi amalanmtr. Bu alma lkemizde yaplacak yeni almalara katk salayacaktr.

2. GENEL BLGLER 2.1 Actinomycetlerin Morfolojik zellikleri 2.1.1 Makroskobik Morfolojisi Actinomycetler tipik koloni zellii gstermektedirler. Bir Actinomycet kolonisi bakteriler gibi tek tek hcre kolonisi olmayp dallanan flamentler eklindedir. Kat ortam zerinde byyen bir koloni vejetatif ve havasal misellerden olumaktadr. zerinde havasal misel gelimemise, pudrams ve pamuksu bir durum gsterir. Ayrca koloninin yaps, ekli, bykl ve renginin kltrel koullara gre deitii gzlenmitir (Waksman et al. 1957). Actinomycetin karakterizasyonu ve tanmlanabilmesi iin, agar zerinde byyen Actinomycet kolonisinin yapsnn nemli kriterler arasnda olduu dnlm, koloninin bykl ve ekli en nemli tehis kriterlerinden biri olarak kabul edilmitir (Krainsky 1914). 2.1.1.1 Havasal misel (Aerial misel ) Actinomycetlerin eitli trleri batk misel zerinde havasal bir misel oluturmalaryla karakterize edilmektedirler. Havasal miselin oluumunda organizmann yaps, ortamn yaps ve byme artlar rol oynamaktadr. Streptomyces ambofaciensde ortamdaki Ca+2 miktarnn 0.1-0.5 g arasnda olmas havasal misel geliimini arttrd saptanmtr. Agar ortamlar zerinde gelien kolonilerde havasal misel zerinde konsantrik halkalar halinde sporlu ve sporsuz halkalar olutuu grlmtr (Natsome et al. 1989). Havasal misel, substrat miselinden oluur ve tm koloniyi rtebilir, bylece pamuksu, pudrams bir grnm kazanr (Kutzner 1956).

Havasal hifler yap ve uzunluk bakmndan olduka farkllk gstermektedirler. Bu hiflerin aplar 1-1.4 mye ulaabilir. Havasal hifler yaps ok farkl olan sporoforlar oluturabilirler. Sporoforlar dz, uzun veya ksa olabilir. Standart koullarda her bir Streptomyces trnde havasal miselin yaps sabit ve karakteristiktir, bu durum taksonomik almalar iin iyi bir kriter olarak kullanlabilir (Korcan 1995). 2.1.1.2 Substrat misel (Vejetatif veya batk misel) Vejetatif miselde baz hiflerin uzunluu 600 mden fazla olabilir; bazlar ok ksa, dallanm ve eridirler. Dallanma tipik olarak monopodialdir. Actinomycetaceae ve Dermatophillaceaeda olduu gibi vejatatif hifler ubuksu, kokoid elementlere paralanabilir. Fakat bu durum Streptomycetaceaeda grlmez. Miselyum serttir, yal kltrlerde bile septasz ve yapk kalr. Son zamanlarda yal kltrlerde en azndan ara sra septa oluumu gzlendii iddia edilmitir (Waksman 1957). Hif hcrelerinin sitoplazmas nceleri homojen olup, hcre yalandka koful oluur, kofullarda ya ve volutin granlleri bulunabilir. Ultrasonik muamele ile hiflerin sv kltrlerde gelitirilmesinde Ca+2 ve Mg+2 seviyelerinin nem tad bildirilmitir (Elisa 1993). 2.1.2 Mikroskobik Morfolojisi Lam lamel arasnda 300-400 bytme ile incelendiklerinde ekilsiz ve ipliklerin karmasndan meydana gelmi yumak eklinde, evreye nsal biimde uzanan, ularnda oval yada yuvarlak biimli iliklerin bulunduu iplikler eklinde grlrler. Gram boyal preparatlarnda filamanlar gram pozitif, orta ksm granll bir grnm verir. Hematoksilen eozin ile boyamada topuz ksmlar eozinofil boya ile boyanr doku kesitlerinden hazrlanan histolojk perparatlarn boyanmas ile Actinomycet granlleri etraflarn lenfositlerin evreledii bir rozet biiminde grnrler. Asidorezistan, boyanmazlar hareketsiz ve kapslszdrler (Bilgehan 1995).

Streptomyceslerin

mikroskobik

incelemelerinde

mikroskobu

ve

elektron

mikroskobu kullanlr. Ik mikroskobu ile yaplacak incelemelerde selofaj teknii immersiyon preparasyonu ve slayt kltrlerden yararlanlr (Kieser 2000). 2.2 Actinomycetlerin Snflandrlmas Actinomycetlerin snflandrlmas izelge 2.1de verilmitir. izelge 2.1 Actinomycetales Takmnn Taksonomik Snflandrlmas

Altakm Micromonosporineae

Aile Micromonosporaceae

Frankineae

Frankiaceae Sporichthyaceae Geodermatophilaceae Microsphaeraceae Acidothermaceae Pseudonocardiaceae

Cins Micromonospora, Actinoplanes, Catellatospora, Couchioplanes, Catenuloplanes, Pilimelia Dactylosporangium Frankia Sporichthya Geothermatophills, Blastococcus Microsphera Acidohermus Pseudonocardia, Actinopolyspora, Actinosynnema, Amycolatopsis, Kibdelosporium, Kutzneria, Lentzea, Saccharomonospora, Saccharopolyspora, Saccarothrix, Streptoalloteichus, Thermocrispum. Streptomyces Nocardia, Rhodococcus. Gordonia Mycobacterium Dietzia Tsukamurella Corynebacterium, Turicella Micrococcus, Arthrobacter, Kocuria, Nesterenkonia, Rorhia, Renibacterium, Stomatococcus Brevibacterium Cellulomonas, Oeskovia, Rarobacter Dermatobacter, Brachybacterium Intrasporangium, Sanguibacter, Terrabacter Jonesia Microbacterium, Agrococcus, Agromyces, Aureobacterium, Clavibacter, Curtobacterium, Rathaybacter Promicromonospora Actinomyces, Mobiluncus, Arcanobacterium

Pseudonocardineae

Streptomisineae Corynebacteriuam

Micrococcineae

Streptomycetaceae Nocardiaceae Gordoniaceae Mycobacteriaceae Dietziaceae Tsukamurellaceae Corynebacteriaceae Micrococcaceae Brevibacteriaceae Cellulomondaceae Dermabacteraceae Intrasporangiaceae Jonesiaceae Microbacteriaceae Promicromonosporaceae

Actinomyineae

Actinomycetaceae

Propionibacterianeae

Propionibacteraceae

Propionibacterium, Luteococcus, Microlunatus, Propioniferax Streptosporangium, Herbidospora, Microbispora, Microtetraspora, Planobispora, Planomonospora Thermomonospora, Actinomadura, Spirillospora Nocardiopsis Glycomyces

Streptosporangineae

Streptosporangiaceae Thermomonosporaceae Nocardiopsaceae

Glycomycineae
1

Glycomycetaceae

http://www.ncbi.nlm.nih./

2.3 Streptomyceslerin Genel zellikleri Streptomyces cinsi, Actinomycet genusuna dahil olan, miselyal, ok hcreli, prokaryot toprak bakterileridir. Toprakta saylar ok fazla olduu iin toprak mikrobiyal populasyonunun nemli bir ksmn oluturur. Topran zelliine, pH, organik ve anorganik madde miktarna gre farkl Streptomyces populasyonlar oluur. Actinomycetler toprak, gl, deniz, kanalizasyon amuru, 60Cde iyi byyen formlar dahil bol miktarda Actinomycet ierirler (Umreit and McCoy 1941; Waksman 1967). Ayrca baz bceklerin i organlarnda da bulunurlar (Redavut bcei Rhodrius proliksus ) (Erikson 1935). ounlukla optimum scaklk istekleri 25C -30C ve pH 6.5-8 arasnda olup bunun dnda termofilik, psikrofilik, asidofilik ve alkolofilik olanlarda mevcuttur (Denizci 1996). Toprak slatld zaman oluan toprak kokusunu Actinomycetlerin salglad uucu madde verir (Korcan 1995). Streptomyces yeleri aerob ve kemoorganotroftur. Oksidatif tipte metabolizmaya sahiptirler. Actinomycetler katalaz pozitiftirler ve genellikle nitrat nitrite indirgerler. Adenini, eskulini, kazeini, jelatini, hipoksantini, niastay ve L-tirozini degrade ederler (Korcan 1995). Koloniler bakterilerden farkl olarak tek tek hcre ya da hcre gruplarndan olumazlar. Havasal ve vejetatif hiften oluan rmcek a benzeri bir grnts vardr. Koloniler

ilk bata przsz grntedir. nk havasal hifler dallanma yapmamtr. Havasal miselin dallanmas ile granll, pamuksu, pudrams ve kadifemsi ekilde koloniler oluur (Korcan 1995). ekil 2.1de fakl renkte koloniler gsterilmitir (Chater 1998).

ekil 2.1 a ) Farkl Renklerde Streptomyces kolonileri b) Sentezlenen Bir Antibiyotik (Chater 1998). Koloniler genellikle havasal hifin tepe ksm tylenince oluur (Thompson et al. 98-99). Ve tre zg renk meydana getirirler (ekil 2.1), (Redenbach et al. 1996 ). Bu kolonilerde gri, beyaz, sar, sar-yeil, lila, krmz, turuncu, pembe ve kahverengi gibi birok renk gzlenir (Chater 1998). Koloninin renk vermesi sekonder metabolit sentezinin grsel kaynadr (Thompson et al.2000). Streptomycesler olumsuz evre koullarndan kurtulmak iin morfolojik ve fizyolojik olarak farkllarlar ve ok eitli yararl madde, sekonder metabolit, anti-bakteriyal, anti-viral, anti-fungal, anti-algal ve anti-tmoral, bileimleri sentezlerler (Thompson et al.98-99). Ortamdaki bakteri ve funguslar elemine etmek iin onlarn hcre duvarlarndaki murain tabakasn paralayan hidrolazlar ve hcre duvar oluum mekanizmasn bloke eden bir takm maddeleri sentezlerler. Bu sekonder metabolitler; eczaclkta, immn cevap modlatrleri, farkl enzim inhibitrleri, herbisitler, insektisitler ve anti parazitik bileimlerin yapmnda

kullanlrlar.

Ekonomik ve ticari adan ok nemlidirler (Thompson et al.2000).

Doadaki antibiyotiklerin yaklak %80ini Actinomycetler ve bunun yaklak %70ini de Streptomycesler retir. Dier antibiyotiklerin 4 funguslardan penisilin, fumagilin, variotin ve griseofulin; 3 tanesini bakterilerden basitrasin, polimiksin ve tirotrisin elde edilir ve tedavi amal kullanlr (Korcan 1995). eitli Actinomycetler tarafndan retilen biyoaktif mikrobiyal metabolitler izelge 2.2de verilmitir (Berdy 2004). izelge 2.2 eitli Actinomycetler Tarafnda retilen Biyoaktif Mikrobiyal Metabolitler (Berdy 2004) Streptomycetaceae Streptomyces Streptoverticillium Kitasatospora Chainia Microellobosporia Nocardioides Micromonosporaceae Micromonospora Actinoplanes Dactylosporangium Anpullariella Glycomyces 740 248 58 9 2 MKTAR ~ 8000 258 37 30 11 9 Thermomonosporaceae MKTAR Actinomadura Saccharothrix Microbiospora Actinosynnema Nocardiopsis Microtetraspora Thermomonospora Micropolyspora/Faenia Thermoactinomyces Thermopolyspora Thermoactinopolyspora 345 68 54 51 41 26 19 13/3 14 1 1

Catenuloplanes Catellatospora Pseudonocardiaceae Saccharopolyspora

3 1 131

Mycobacteriaceae Nocardia Mycobacterium Arthrobacter Brevibacterium 357 57 25 17

Amycalotopsis/Nocardia Kibdellosporangium Pseudonocardia Amycolata Saccharomonospora Actinopolyspora Streptosporangiaceae Streptosporangium Streptoalloteichus Spirillospora Planobispora Kutzneria Planomonospora

120/357 34 27 12 2 1 79 48 11 10 4 2 Proactinomyces Rhodococcus Dier trler Actinosporangium Microellobosporia Frankia Westerdykella Kitasatoa Synnenomyces Sebekia Elaktomyces Excelsospora Alkalomyces Catellatospora Erythrosporangium Streptoplanospora Microechinospora Salinospora 30 11 7 6 5 4 3 3 3 1 1 1 1 1 1 14 13

2.3.1 Streptomyces Ekolojisi Sreptomycesler doada ekolojik adan bakldnda olduka ilgin organizmalardr. Actinomycet cinslerinin %90dan fazlasnn temsilcileri topraktan izole edilmitir. Streptomyces, cinsinin yeleri arasnda en yaygnlarndan ve ayn zamanda en fazla allanlarndandr. Toprak kompleks bir habitat olup yksek organik maddeli asit toprak zonunun, Streptomyces populasyonu ile, ntral ve mineralce zengin ayn topraktaki Streptomyces populasyonun tamamen farkl olabilecei grlmtr (Williams et al. 1982).

10

Toprakta koloniler halinde vejetatif hifleri ile geliirler ve sporlaryla evreye yaylrlar, sporlar semi-dormant olduklar iin toprakta canl kalabilirler. Hatta 70 yllk toprak rneklerinden Streptomyces kltrleri elde edilmitir. Sporlar dk besin ve suya kar direnlidirler fakat miseller kurakla kar olduka hassastrlar. Laboratuvar koullarnda sporlarn gelimesinde sporlar n germinasyona urarlar daha sonra tekrar spor oluumu grlr. Germinasyon spor younluunu etkilerken, trler arasndaki apraz reaksiyonlarn etkili olmad saptanmtr. Spor germinasyonu iin besinsel (eksogenus) maddelere, kalsiyum ve suya ihtiya vardr. Topraktaki Actinomycetler birok ekstraseller madde retirler ve bu sayede polimerlerin l bitki, hayvan ve fungus materyalinin paralanmasn salarlar bu nedenle rekalsitrant polimerleri ile birlikte besinsel siklus ile topraktaki biyodegradasyonda nem tarlar. Asitofilik Streptomycesler kitinolitik aktiviteye de sahiptirler. Ayn zamanda sellaz, amilaz, maltaz, ksilenaz aktiviteleri de mevcuttur. Topran yan sra Actinomycetler rizosferdede bulunurlar (Kieser et al. 2000) . Havadan izole edilen ilk Actinomycet trne Streptothrix alba ad verilmitir (RossiDoria 1891) daha sonra bu tr Streptomyces albus olarak adlandrlmtr. Ayn zamanda Streptomyces ve micromonospora trlerinin ev ii ve d atmosferde 28C ile 37C arasnda izole edildii bildirilmitir (Devries 1960). Tatl su glleri nehirler ve kanalizasyon amuru 60Cde iyi byyen termofilik formlar dahil bol miktarda Actinomycet ierirler. Gl taban amurunun tm mikrobiyal populasyonun %1020sini mikromonosporann tekil ettii saptanmtr (Ubmerit and McCoy 1941; Waksman 1967). Kompostlar ve kfl yemler; nem, aerobik ntral ve alkali pH artlarnda remesi tevik edilen birok farkl Actinomycet populasyonu ierir. Mikrobiyal aktivite genelde yksek organik besleyici madde ile uyarlr (Kieser et al. 2000). 2.3.2 Streptomycesin Taksonomisi Streptomycetes cinsi Actinomycet ailesine ait olan 4 cinsten Streptomyces, Aktinomyces, Nocordia ve Mycobacteriumdan biridir. lk bata bu canllarn

11

sistematiini oluturmakta glk ekildi. nk bu canllar bakteri ve fungus gruplarna benzer zellikler gsteriyorlard. Actinomycetlere bakteri ve funguslar aras bir gei grubu olarak baklm ise de ileri dzeyde yaplan testler ile ortaya karlan zellikler Actinomycetlerin bakteri olarak kabul edilmesine yol amtr (Korcan 1995). 2.3.3 Streptomycesin Metabolizmas Birok Streptomyces glukoz katabolizmasnda Emden-Meyerhof- Parnas yolunu kullanr fakat S. antibioticus grnte hekzoz monofosfat dngsn kullanr. S. clavuligerus glukozu karbon ve enerji kayna olarak metabolize edemez fakat niastay kullanr. Baz Streptomyceslerin sekonder metabolizma srasnda glikolizisin hekzoz monofosfata dnt bilinmektedir. Ksacas Streptomyceslerin Pseudomonaslarda olduu gibi genel olarak Embden- Meyerhof dngsn kullandklarn syleyemeyiz. ekerler spesifik kinazlar ile fosforilasyona uratldklarnda hcre iin nemli gibi grnmektedirler fakat furuktozun fosforilasyonu ve transportu iin fruktoz fosfotransferaz sistem (PTS)nin varl S.coelicolor, S. lividans ve S. griseofuscus da daha yeni bulunmutur. Glukoz ve galaktoz katabolizmalar zerine yaplan almalar dier bakterilerle olduka ilgin benzerlikler ve farkllklar gstermektedir (Kieser et al. 2000). 2.3.4 Streptomycesler Tarafndan retilen Sekonder Metabolitler Baz Actinomycetler metabolit salglama zelliine sahiptir. Bu metabolitler bata insan ve hayvan olmak zere ok eitli canllarn bymeleri zerine olumlu etki yaparlar. Actinomycetlerin vitamin B12yi retme yetenekleri kefedildikten sonra (Rickes et al. 1948) bu organizma vitamin kayna olarak incelenmeye balanmtr. Streptomyces cinsine dahil sularn antibiyotik retimi esnasnda, atlan misel artkalarnn bol miktarda B12 vitamini ierdii bilinmektedir (Goodwin 1963). Bu vitamine ek olarak B kompleks vitaminlerinden niasin, peptatonik asit, biotin, pridoksin, tiamin, riboflavinde retilmektedir (Hall et al.1979).

12

Gerek organik gerekse sentetik ortamlarda bytldklerinde ok sayda Actinomycet, eitli pigment oluturma zelliine sahiptir. zellikle antibiyotik retebilen kltrlerin rodomisine ve sinerubine benzer pigmentler oluturduu bildirilmitir (Corbaz et al. 1957). Pigmentin yaps tr tanmlanmasnda nemli bir kriter olarak deerlendirilmektedir. Sentetik ortamlarn kullanlmasyla birlikte farkl organizmalarn krmzdan maviye, turuncuya, sardan kahverengiye ve siyaha kadar deien ok eitli pigmentler oluturduklar bildirilmitir (Lndenben 1952). Actinomycetler ayn zamanda ok eitli enzim retme kapasitesine sahiptir. Bu enzimlerden bazlar izole edilmi, konsantre hale getirilmi ve saflatrlmtr. Bu enzimlerden biri de kitinazdr. Kitinaz reten organizmalar zellikle tropik topraklarda yaygn olup baz Streptomyces trleri tarafndan retildii tespit edilmitir (Sykes 1973). Streptomyces lividansn kitini karbon ve enerji kayna olarak kulland saptanmtr (Neugebaver 1991). Kitinaz retme yetenei olmayan baz trlerin funguslarn hcre eperini eritme yeteneinden yoksun olduu bildirilmitir (Boucher 1992). 2.3.5 Streptomyceslerden Elde Edilen Antimikrobiyal Maddeler Streptomyceslerden yaklak 8000 kadar doal biyoaktif sekonder metabolit elde edilmitir. Doada retilen antibiyotiklerin %70ini Streptomyces genusu retmektedir (Berdy 2004). Streptomycesler tarafndan retilen antibiyotikler izelge 2.3.de verilmitir. Bu antibiyotiklerin antibakteriyal, antiviral, antifungal, antitmoral, insektisit ve herbisitik vb. gibi etki mekanizmalarna sahip olduklar grlmektedir.

13

izelge 2.3 Streptomycesler Tarafndan retilen Antibiyotikler (Kieser et al. 2000)


Antibiyotik Actinomycin D Actinomycin A Avermektin Bambermycin Bialophos Bleomycin Candicidin Cephamycin reten Organizma S.ssp. S.ssp. S.avermitilis S.bambergiensis Kimyasal snf Peptid Makrolit Makrolit Substiuted glukozit S.hygroscopicus S. verticillus Peptit Glikopeptit Polien Makrolit -Laktam Glutamin sentezi DNA strandbreaage S.griseus Nocardia lactamdurans (ve dierleri) Choloramphenico l Chloratetracyclin e S.orchidaceus Cycloserine Daptomycin Daunomycin Desferrioxamin Doxorubicin (Adriamycin) Eritromisin FK506 (Tacrolimus) Fortimicin Fosfomycin Gentamicin Hygromycin B Kanamycin Micromonospora olivoasterospora S.spp. Micromonospora spp. S.hygroscopicus Substitued aminoglukozit S.kanamyceticus Aminglukozit R
Antibakteriyal

Hedef Transkripsiyon Sitokrom sistem Klorit iyon yolu

Uygulama alan Antitmr Telosidal Antiparazitik Growth promotant Herbisidal Antitmr

amino

Peptidoglikan

Membran Peptidoglikan
Antibakteriyal

S.venezuelae

N-dichloroacyl phenylpropanoid Tetrasiklin (PK) Substitued peptit Lipopeptit Anthrasiklin Peptit Anthrasiklin (PK) Makrolit (PK) Makrolit (PK) Aminoglukozit Fosforik asit Aminoglukozit siklik

R R Peptidoglikan Lipoteikoik asit DNA intercalation Demir DNA intercalation R FK R Peptidoglikan R R proteinlerini balayarak

Antibakteriyal

S.aureofaciens

Antibakteriyal

Antibakteriyal

S.roseosporus S.peucetius S.pilosus S.peucetius var. caesius Sac. erythraea S.hygroscopicus

Antibakteriyal Antitmr Antitmr

Antibakteriyal mmunosuppressant Antibakteriyal

Antibakteriyal Antibakteriyal

Antihelmintik

14

Lasalocid

S.lasaliensis

Polieter (PK)

Membran

Anticoccidial growth promotant

Lincomycin Milbemycin Mithramycin Mitomycin C Monensin

S.lincolensis S.hygroscopicus

eker-amide Makrolit Aureolik asit (PK) Benzokuinon Polieter (PK)

R Klorit cannels demir

Antibakteriyal Antiparazitik

S.argillaceus S.caespitosus S.verticillatus S.cinnamonensis

DNA alkylation DNA Membran

Antitmr Antitmr

Anticoccidial Byme durdurucu

Natamycin Neomycin Nikkomycin Nocardin Nosiheptide Novobiocin Nystasin Oleandomycin Oxytetracyclin Phleomycin Paromomycin Polyoxins Pristinamycin Puromycin Rapamycin Rifamycin Ristocetin Salinomycin

S.nataensis S.fradiae S.tendale Nocardia uniformis S.actuosus S.niveus

Tetraene polien Aminoglukozit Nkleosit -Laktam Tiopeptit Coumerin glukozit Polien Makrolit(PK) Makrolit (PK) Tetrasiklin(PK) Gliikopeptit Aminoglukozit var. Nklozit peptit

Membran R Kitin biyosentezi Peptidoglikan R DNA giraz ( altnitesi) Membran R R DNA R Kitin biyosentezi R

Antifungal Antibakteriyal Antifungal insektisidal Antibakteriyal Byme durdurucu Antibakteriyal

S.noursei S.antibioticus S.rimosus S.verticillus S.rimosus S.cacaoi asoensis S.pristinaespiralis S.alboniger S.hygroscopicus Amycolatopsis mediterranei Nocardia lurida S.albus

Antifungal Antibakteriyal Antibakteriyal Antitmr Antiamibal Antifungal (Bitki koruma) Antibakteriyal Aratrma mmn basklayc Antibakteriyal Tberkiloz

Prin nkleosit Makrolit (PK) Anamycin (PK) Glikopeptit Polieter (PK)

R Protein balar RNA polimeraz Peptidoglikan Membran

Antibakteriyal AntikoksidalB yme durdurucu

Spectinomycin

S.spectabilis

Aminocyclitol

Antibakteriyal

15

Spinosyns Spiramycin Streptogramins Streptomisin Streptothricin Teichoplanin Tetracycline Thienamycin Thiostrepton Tobramycin Tylosin Validamycin Vancomycin Virginamycin

Sac.spinosa

Tetrasiklik makroloit (PK) Makrolid Makrosiklik laktonlar Aminoglukozit N-glukozit Glikopeptit Tetrasiklin(PK) -Laktam Tiopeptit Aminoglukozit Makrolit(PK) Aminoglukozit Glikopeptit Makrosiklik lakton(PK)

Bilinmiyor R R R R Peptidoglikan R Peptidoglikan R R R R Peptidoglikan R

nsektisidal

S.ambofaciens S.graminofaciens

Antibakteriyal Antibakteriyal

S.griseus S.lavendulae Actinoplanes teichomyceticus S.aureofaciens S.cattleya S.azureus S.tenebrarius S.fradiae S.hygroscopicus Amycolatopsis orientalis S.virginiae

Antibakteriyal Byme durdurucu Antibakteriyal

Antibakteriyal Antibakteriyal Byme durdurucu Antibakteriyal Byme durdurucu Bitki koruyucusu Antibakteriyal

Byme durdurucu

PK= Poliketit R= Ribozomlara balanarak ve protein sentezini inhibe ederek

2.4 Antimikrobiyal Maddeler Antibiyotiklerin hikayesi yarm yzyl ncesine dayanr. Flemingin aratrmalarndan bu yana gnmzde antibiyotik almalar olduka ilgin srekli deien, gelien bir sre gstermektedir. Gnmzde on bin mikrobiyal doal rn bilinmektedir. Baz zamanlar bu konuya olan ilgi azalsa da yinede gitgide artmaktadr. Antibakteriyal antibiyotiklerin nemli gruplar olan tetrasiklinler, sefalosporinler, makrolitler ve aminoglukozitler kefedilmitir. Antibiyotik keiflerinde temel izolat Streptomyces trleri olmutur. Tm izole edilen bileiklerin %70-80i Streptomyces trlerindendir. Bu bileikler bakteri ve funguslara etkendirler. Bu periyot ierisinde antitmr, antiviral,

16

antibiyotik olmayan enzimler ve inhibitr-metabolitler kefedilmitir. Antitmr olarak faydalanlan ilalarn banda doksorubisin bunun yan sra tarmda antiparazitik avermektin, besinlere katlan monensin, herbisitik etkisi olan glufosinat ve farmakolojik olarak kullanlan sitatinler, siklosporinler yeni bulunan nemli rnlerdir. Yeni patojenlerin ortaya kmasyla nadir olarak rastlanlan Actinomycet ve bunlarn rnleri de nem kazanmtr. 1940l yllarda yaklak 10-20 arasnda antibiyotik kefedilmi 1950lerde 300-400, 1960da 800-1000, 1970lerde 2500 antibiyotik biliniyordu. 1980lerde 5000, 1990da 10000 ve 2000ler de ise 20000 antibiyotik bileii biliniyordu. 2002 ylna geldiimizde ise 22000 biyoaktif sekonder metabolit (antibiyotikleri iine alan) ile ilgili bilimsel yaynlar yaplmtr. Sekonder metabolitler; dk molekll (~3000in altnda), taksonomik olarak farkllklar gsteren, organizmaya zg doal rnlerdir. Bu doal rnlerin biyolojik aktiviteleri vardr bunlara biyoaktif mikrobiyal sekonder metabolitler denir. Sekonder metabolitlerin atas bitkilerdir daha sonra Penicillium glaucomadan kristalize fungal rn olarak 1986da mikofenolik asit kefedilmitir. Sekonder metabolitler antimikrobiyal, antifungal, antibakteriyal, antiprotozoal, antitmral ve antiviral etkiye sahip olabilirler. Bunlarn tm antibiyotik olarak adlandrlrlar. Antimikrobiyal etkiye sahip olmayan sekonder metabolitler biyoreglatrler ya da biyokimyasal modlatrler olarak adlandrlabilir. Antibiyotikler ve benzer doal rnler sekonder matabolitler olup prokaryotik (Prokaryotae, Monera) ve karyotik organizmalar tarafndan retilir. Prokaryotlar arasnda son yllarda Bacillus ve Pseudomonasn yan sra Mycobacteria ve Cyanobacteriada bu gruba katlmtr. Yaklak 3800 aktif bileik Mycobacterilerden elde edilmitir. Buda tm antimikrobiyal bileiklerin %17si dir. pliksi Actinomycet trlerinde on binin zerinde biyoaktif bileikler retilir. Bunlarn 7600 Streptomycesden kken alr 2500 de nadir olarak rastlanlan Actinomyceteler dir ve biyoaktif mikrobiyal rnlerin en geni grubudur (%45). Basidomycetes grubuna ait funguslardan yaklak 8600 metabolit retilir ve buda mikrobiyal rnlerin %35i olur.

17

Bilinen bu 22500 antibiyotikten ancak 150 tanesi veterinerlik, tp ve tarm alanlarnda kullanm bulmutur. 20000-25000 inaktif metabolit bulunmaktadr. Bugn gnmzde 50000 mikrobiyal metabolit bilinmektedir. Yksek bitkilerden (Spermatophyta) gymnospermler ve angiospermler antmikrobiyal metabolit retirler. phesiz ki yksek bitkilerde alkoloidler, flavonoidler, terpenoidler vardr. Bunlar toksik ve farmakolojik etkiye sahip olup bazlarda antiviral ve antitmral etkiye sahiptir. Hayvanlar aleminde Polifera, Mollusca, Cnidaria, Anthozoa, Echinodermata ve Bryozoa (Sngerler, mollusklar) antimikrobiyal metabolit retirler. 1972de sadece 25, 1982de yaklak 30, 1992de 1500 ve gnmzde 6000 kadar deniz kkenli biyoaktif bileik bulunmaktadr. Streptomycetlerden streptomisin, kloramfenikol, tetrasiklin ve makroloid

antibiyotiklerinin eldesi ile almalar bu trde younlamtr. Bu trden yaklak %70 ve nadir elde edilen Actinomyceteler den %25-30 arasnda antibiyotik elde edilmitir. eitli canl gruplarnn retmi olduu biyoaktif mikrobiyal rnler izelge 2.4. ve 2.5.de gsterilmitir (Berdy 2004). izelge 2.4 eitli Trlerin Biyoaktif Mikrobiyal Metabolit retimi (Berdy 2004) Antibiyotikler Kaynak Total Dier Bakteriler Eubacteriales Bacillus sp. Pseudomonas Myxobacter Cyanobacter 2900 2170 795 610 400 300 (780) (570) (235) (185) (130) (80) Biyoaktiktif Metabolitler Aktivite Dier 900 580 65 185 10 340 (1680) 3800 (1150) 2750 (300) (370) (140) (420) 860 795 410 640 Aktivitelerle yok Toplam Biyoaktif Metabolitler

18

Aktinomisetler Streptomyces sp. Rare actinos Fungi Mikroskobik fungi Basidiomycetes Mayalar Yumuak kfler Toplam Mikrobiyal Protozoa

8700 6550 2250 4900 3770 1050 105 30 16500 35

(2400) (1920) (580) (2300) (2070) (450) (200) (35) (5) (5500 ) 10

1400 1080 220 3700 2680 950 950 35 20 6000 5

(3800) 10100 (3000) (800) (6000) (4750) (1400) (1150) (70) (25) 11500 (45) 7630 2470 8600 6450 1950 2000 140 60 22500 50

Penicillium/Aspergillus 1000

izelge 2.5 eitli Canllar Tarafndan retilen Biyoaktif Mikrobiyal Metabolitler (Berdy 2004) Kaynak Antibiyotikler Likenler 160 Algler 620 Alak Yapl Bitkiler 200 Yksek Yapl Bitkiler 11500 Omurgaszlar* 480 Bcekler* 320 Solucanlar,Dierleri* 160 (Kabuklular) Deniz Hayvanlar 3400 (Tamam) Sngerler 1850 Slenterler 630 Tunikatlar 420 Mollusklar 300 Ekinodermler 220 Bryozoa 70 Balklar* 50 Amfibiler,Srngenler* 240 Terresterial,vertebrata* 410 Memeliler* 340 Dier(Kular,v.s*) 50 Dier Biyoaktif ? 730 ? ? ? Toplam 160 1350 200 11500 480 320 160 6100 3350 1100 650 650 280 120 50 240 410 340 50

2700 1500 570 230 350 60 50 ? ? ?

19

2.4.1 Antibiyotiklerin Tarihesi Antibiyotik kelimesi Yunanca anti (kar) ve bios (yaam) szcklerinden tretilmitir. Szlklerdeki tanmlamasyla Bitkilerde, zellikle kf mantarlarnda bulunan ya da yapay olarak retilen, bakteri ve dier mikroorganizmalarn geliimini durduran ya da onlar yok eden maddelerin ortak addr. Antibiyosis szc ise, Mikroorganizmalar arasndaki kartlk olarak adlandrlr. Penisilinin bulunmasndan sonra geriye dnk olarak yaplan aratrmalar, gnmzden 2500 yl kadar nce inlilerin, kfl soya fasulyesinden yaplan ilalar tedavi amacyla kullandklarn gstermitir. Benzer ilalara, her toplumun gemiinde rastlamak olasdr. Bugn bile toplumda koca kar ilac, ev ilac, halk ilac adyla bilinen ve ou bitkisel kaynakl olan bu ilalarn bir blmnn, antibiyotik oluturan mikroorganizmalar veya bunlarn etkili maddelerini ierdii dnlebilir. Mikrobiyolojinin en byk atlmn yapt 19. yzyln ikinci yarsnda, mikroorganizmalardan tedavi amacyla yararlanlabileceini ilk dnen 1877 ylnda Pasteur ve Joubert olmutur. 1880lerde zararsz bakterileri, hastalk yapan bakterilere kar kullanma abalarna giriilmitir. Replacement tedavisi denen bu yntemin temelini, bir hastalk etkeninin remesini in vitro koullarda inhibe edebilen, ancak kendisi patojen olmayan bir bakteriyi, tedavi amacyla hastalara inokle etmek oluturmaktayd. Bu yntem tberkloz, difteri, veba, kolera, flarbon gibi hastalklarda snrl bir baar ile kullanlmtr. 1920-1930 yllar arasnda, baz barsak enfeksiyonlarnn tedavisinde Lactobacillus acidophilusun, streptokok tayclna karda Staphylococcus aureusun sk olarak kullanld grlmektedir. Londrada St Marys Hospitalda stafilokok varyantlar zerinde almalar yapan Alexander Fleming, bir rastlant sonucu kltr ortamna bulam bir kf mantarnn evresinde stafilokoklarn reyemediklerini, tersine lp eridiklerini grmtr. Bu mantarn kltr filtratlar, deneysel enfeksiyonlarda birok bakteriye kar gl biimde etkin bulunmu ve Fleming, reyen kf mantarlarnn Penicillinum trnden oluundan esinlenerek, etkili maddeye penisilin adn vermitir. 1928 ylndaki ilk gzlem ve almalardan sonra bu konu ile bir sre ilgilenen olmamtr. 1940 ylnda Oxford niversitesi Tp Fakltesinden Florey, Chain ve Abraham penisilin konusu ile yeniden ilgilenmeye balam; bu antibiyotiin farelerde oluturulan streptokok

20

enfeksiyonlardaki yksek etkinliini deneysel olarak kantlam ve sonularn Mays 1940da yaynlamlardr. Penisilinin insanlardaki ilk ve byk baars 1941 ylnda gereklemi, 1939 ylndan balayarak 1943 ylna kadar Actinomycetes trleri zerinde almalar yapan Waksman ve arkadalar sonunda, Streptomyces griseus kltrlerinden streptomisin adn verdikleri bir madde elde etmilerdir. 1944 ylnda tedavi alanna giren bu antibiyotik, birok gram pozitif ve gram negatif mikroorganizma yannda Mycobacteriumlara kar da ok etkili olmutur. Uzun ve ypratc 2. Dnya Savann geni insan kitlelerine yayd tberkloz hastalnn denetim altna alnmasnda byk katks olan streptomisin, zellikle gram negatif mikroorganizmalarda ve Mycobacteriumlarda giderek artan diren gelimelerine yol at. Sonuta, etkinliini giderek yitirdi ve daha dar alanlarda daha bilinli olarak kullanlmaya baland. Streptomisinin temsil ettii aminoglukozid grubu antibiyotikler, birbirini izleyerek tedavi alanna girmeye devam ettiler. Waksman ve Lechevalier Streptomyces fradiaeden neomisini elde ettiler. Gnmzde sindirim sisteminden hemen hemen hi emilmedii iin yalnzca barsak florasn inhibe etmek iin snrl olarak kullanlmaktadr. Topraktan izole edilen Actinomycetelerin antibiyotik oluturma zelliklerinin bilimsel yntemlerle aratrlmas srasnda McGuire ve ark. 1952 ylnda Filipinlerde, Streptomyces erythreus kltrlerinden eritromisin ad verilen ve makrolit grubu antibiyotiklerin ilk bireyini oluturan yeni bir antibiyotik elde ettiler. Azdan ve parenteral kullanlabilen bu antibiyotik birok gram negatif ve gram pozitif bakteri yannda, Actinomyces, Mycobacterium, Treponema, Mycoplasma, Chlamydia ve Rickettsialara karda yksek dzeyde aktivite gstermekteydi. Eritromisin ve trevleri geni spektrumlu antibiyotikler olmakla birlikte genel olarak penisilinlerin ilk alternatifleri olarak kullanlmaktadrlar. 1970li yllarda spanyada izole edilen Streptomyces cattlea kltrlerinden yeni bir -laktam antibiyotii elde edildi. Tienamisin ad verilen bu madde karbapenemlerin ilk rneini oluturmaktayd. Grld gibi insanlk mikroorganizmalarla sava halindedir. Yzyllar boyunca mikroorganizmalarn dedii olmu; 19. yzyl sonu ve 20. yzyln banda

21

mikrobiyolojide ulalan noktalar, a ve serumlarn saaltm alanna girmesi, bu savata dengeyi salam; kemoteraptik ve antibiyotiklerin kefiyle stnlk insanlara gemitir. Ancak doada bir canlnn dierini tmyle yok edemedii de ortadadr (Aktulu 1997). 2.4.2 Antibiyotiklerin Snflandrlmas Antibiyotikler kimyasal yaplarna gre10 gruba ayrlr (Berdy 1974). 1- Karbonhidrat antibiyotikler (saf sakkaritler, aminoglukozitler, dier C ve N glukozitler, Dier eker derivatlar) 2- Makrosiklik lakton (Laktam) antibiyotikler (Makrolit antibiyotikler, Polyen antibiyotikler, antibiyotikler) 3- Qinonlar ve benzer antibiyotikler (linear kondanse polisiklik bileikler, naftokinon trevleri, benzokuinon trevler, eitli kinon benzeri bileikler) 4- Aminoasit, peptit antibiyotikler (aminoasit trevleri, homopeptitler, heteromer peptitler, peptolitler, yksek molekl arlkl peptitler) 5- Nitrojen ieren heterosiklik kondanse antibiyotikler (kondense olmam (tek) etkili heterosiklikler, alkoloidler) 6- Oksijen ieren heterosiklik antibiyotikler (Furan trevleri, piran trevleri, benzopiran trevleri, kk laktonlar, polieter antibiyotikler) 7- Alisiklik antibiyotikler (sikolakton trevleri, kk terpenler, oligaterpen antibiyotikler) 8- Aromatik antibiyotikler (benzen bileikleri,kondanse aromatik bileikler, nanbenzoid aromatik bileikler, aromatik bileiklerin farkl trevleri) 9- Alifatik antibiyotikler (alkan trevleri, alifatik karboksilik asit trevleri, S veya P ieren alifatik bileikler) 10- Misellaneous antibyotikler heterosiklikler, antibiyotik (antitmr) dier makrosiklik lakton antibiyotikler, makrolaktam

22

2.4.3 Antibiyotiklerin Biyosentezi Kimyasal yaplar ve retici organizmalar asndan ok byk farkllklar gstermesine kar, antibiyotiklerin sentezindeki reaksiyonlar birka biyosentetik yol izinde gruplanmtr. Bu yol izlerinin, normal hcresel metabolizmann basit biyosentetik yol izi varyasyonlar olduunu ve buradaki kk deiimlerin artc dzeyde farkl maddeler verebileceinin bilinmesinin nemli olduu belirtilmektedir (Denizci 1996). Biyosentetik yol izlerine gre antibiyotikler iki ana grup altnda toplanmlardr. 1- Primer metabolitlere analog olanlar (Aminoasitler, koenzimler, nkleosidazlarn analoglar). 2- Polimerizasyon yolu ile trevlenenler. Bunlar drt grup altnda toplanrlar; a- Klasik protein sentez mekanizmasnda grev almayan aminoasitlerin kondensasyonu sonucunda oluan, sonraki reaksiyonlar ile modifiye edilmi olan peptit antibiyotikleri ve trevleri. b- Asetat ve propionat birimlerinden meydana gelenler. Ya asitlerinin biyosentetik yol izinden trevlenirler (poliketit sentezi). c- Terpenoid olanlar. sopiren sentezinden trevlenirler. Sadece Funguslar ve baz Actinomysetler tarafndan retilirler. d- Aminoglikosid olanlar. Birka eker moleklnn kondensasyonu ile (genellikle amino eker ve siklik aminoalkol) meydana gelenler (Lancini ve ark 1995). 2.4.4 Antimikrobiyal Maddelerin Etki Mekanizmas Antibiyotikler etkili olduklar mikroplarn metabolik ilemlerine mdahale ederek alrlar. Antibiyotikler mdahale ettikleri metabolik ilemlere gre spesifiktir. Bu metabolik ilemlere rnek olarak; protein sentezi, hcre eperi sentezi, nkleik asit sentezi veya hcre zar fonksiyonlarn verebiliriz. Penisilin, vankomisin ve sefalosporin gibi antibiyotikler bugn en ok kullanlan antibiyotiklerdendir. Bu antibiyotiklerin hepsi bakterilerin hcre eperini zayflatrlar.

23

Bakterilerin hcre eperleri uzun peptidoglikan zincirlerinden oluur. Antibiyotikler bu moleklleri bir arada tutan peptit balantlarnn sentezini nlerler. Bylece hcre eperleri zayflar ve bakteri liziz olur. Streptomisin, eritromisin, tetrasiklin ve kloramfenikol gibi antibiyotikler ise ya protein sentezini nlerler ya da anormal proteinlerin sentezlenmesine yol aarlar. Antibiyotikler bunlar bakterilerin ribozomlarna balanarak yaparlar. Bakteri ribozomlar karyotik ribozomlardan daha kk olduklar iin, bu tr antibiyotikler sadece bakterileri etkiler. Bylece bakterilerin, saldrd canllara zarar vermezler. Rifampisin ve antrasiklin gibi antibiyotikler ise nkleik asit sentezine mdahale ederler. Antrasiklinler bunu DNA replikasyonunu nleyerek yaparken, rifampisin transkripsiyonu nler. Baz antibiyotikler ise patojenleri hcre zarlarna mdahale ederek yok ederler. Hcre zarna yaplan mdahaleler, hcre zarnn yapsn deitirerek onun birok zelliini de kaybetmesine yol aar. Bu, hcre sitoplazmasnn hcre dna akmas gibi hcrenin ykmyla sonulanacak olaylara yol aabilir (Int kayna 2). 2.4.5 Antimikrobiyal Maddelerin Kullanm Alanlar Genellikle antibiyotikler, kimyasal tedavide kullanlmak zere, antimikrobiyal etkili madde olarak retilirler (Crueger & Crueger 1984). Ayrca antibiyotikler iftlik hayvanlar, tavukuluk ve bitkilerdeki hastalklarn

tedavisinde, besinlerin muhafazasnda, biyokimyasal ve kltr ortamlarnda seici ajan olarak kullanlmaktadr (Waksman 1963,1967, Porter 1976, Berdy 1986, Lancini et al. 1995). 2.4.5.1 Enfeksiyon Hastalklarnda Kullanm Gnmzde antibiyotikler, klinik tedavide en nemli olan ve en ok kullanlan ilalar arasndadr. Enfeksiyon hastalklarnn tedavisi, antibiyotik veya dier antimikrobiyal

24

maddelerin dzenli bir ekilde, ila olarak verilmesi ile mikrobiyal kaynakl hastalklarn iyiletirilmesi olarak ifade edilir (Lancini et al. 1995). 2.4.5.2 Ziraat Alannda Kullanm Bugn ok sayda antibiyotik, tehlikeli etkileri olan bakteriyal, fungal, viral enfeksiyonlara, bceklerin ve dier parazitlerin neden olduu hastalklara kar hatta, rekabeti otlara kar kltr bitkilerini korumak iin tarmda kullanlmaktadr (Waksman 1967, Arai et al. 1976, Drautz et al. 1985, Berdy 1986, Lancini et al. 1995 ). Antibiyotiklerin tarmdaki uygulamalar u ekilde sralanabilinir (Lancini et al. 1995). 1- Bakteriyal enfeksiyonlarn kontrolnde. Bu amala genellikle insanlar iin gelitirilmi ve kullanlan streptomisin, zellikle, Erwina sp. ve Xhantomonas sp. enfeksiyonlarna kar kullanlmaktadr. 2- Fungal enfeksiyonlarn kontrolnde. Bunlarn birou Piricularia oryzae trne kar etkili olan blastisidin S gibi nkleosid ve polioksinlere aittirler. Dier nemli antifungal antibiyotikler karyotlarda protein sentezi inhibitr olarak bilinen siklohegzimid ve kasugamisindir. 3- Yabanc ot kontrolnde. Antibiyotik zellik gsteren ok sayda sentetik bileiklerin bazlar bitki zararllarnn kontrolnde herbisit olarak kullanlmaktadrlar. 2.4.5.3 Hayvanclkta kullanm Gnmzde antibiyotikler, hayvanlarn eitli enfeksiyonlara kar korunmas amac ile kullanlmaktadr (Waksma 1967, Berdy 1986, ner 1989, Lancini et al. 1995). lk defa 1948de dk dozda antibiyotiklerin diyetlerde kullanm ile tavuklarda arlk artnn gzlendii rapor edilmi ve daha sonraki yllarda farkl antibiyotikler ile farkl hayvanlarda yaplan almalarda intestinal bakteriyal florann etkilenmesi neticesinde arlk art olduu saptanmtr.

25

Byme zerine antibiyotiklerin etkisi, aada verilen nedenlere dayandrlmtr; (Lancini et al. 1995). 1- Toksin reten intestinal bakterilerin inhibisyonuna, 2- Asemptomik hastalklara neden olan bakterilerin inhibisyonuna, 3- Diyetlerde sequiester proteinler veya esansiyel besinleri paralayan bakterilerin inhibisyonuna, 4- Florann bir blmnn inhibisyonu sonucunda konukunun bymesi iin gerekli besin faktrlerini sentezleyen bakterilerin stimlasyonuna dayandrlmtr. Antibiyotiklerin hayvanclkta kullanlmaya balamasnn ilk yllarnda medikal amal olarak penicilin, tetrasiklin, eritromisin, streptomisin gibi antibiyotikler birok lkede kullanlmtr. Hayvanclkta kullanlan antibiyotikler izelge 2.6da verilmitir. izelge 2.6 Hayvanclkta Kullanlan Baz Antibiyotikler (Berdy 1986) Antibiyotik Monensin Ticari smi Rumensin Ruminsin Coban Elancoban Salinomisin Coxistae Bio-cox eustin Lasalocid Moenomisin Bovatec Avatec Flavomisin Streptomyces bambergiensis Streptomyces ghanaensis Streptomyces ederensis Streptomyces geysirensis Streptomyces lasaliensis Streptomyces albus Streptomyces cinnamonensis reten Organizma

26

2.4.5.4 Aratrma materyali olarak kullanm Tedavi edici hibir deeri olmayan ve pratikte hi kullanlmayan, fakat biyokimyasal aralar olarak kullanlan, birok antibiyotik bulunmaktadr. Bunlarn bazlar enzim inhibitr olarak kullanlp hcresel metabolizma da grev alan bir molekln ilevinin saptanmasnda kullanlrlar. rnein, protein sentezinde birok ayrntl bilgiler, kloramfenikol ve siklohegzimidin inhibitr olarak kullanlmas ile otaya karlmlardr (Waksman 1967, Umezawa et al.1972, Lancini et al. 1995). Ayrca prokaryot ve karyotlarda RNA polimeraz arasndaki farkllk rifamisin kullanm sayesinde saptanmtr. Bunlarn yannda antibiyotikler, birka genetik ilemde markrlar olarak veya konjugasyon denemelerinde verilen karakterlerdeki mikroorganizmalar semek amac ile ve hedef enzim inhibisyonu sonucunda, hedef enzimin genetik haritada gen pozisyonunun belirlenmesinde, bir veya daha ok antibiyotik diren genleri tayan vektrlerin gen transferi iin kullanld genetik mhendisliinin btn ilemlerinde, rekombinanat klonlarn seiminde kullanlmaktadr (Lancini et al. 1995). Leben ve Kett tarafndan, 1948 ylnda bulunan ve Streptomyces kistazawaensis, St. griseus, St. blastomycetius, St. flavochromogenes tarafndan retilen antimisin, solunumun elektron transport almalarnda, oksidatif inhibitr olarak biyokimya laboratuvarlarnda kullanlmaktadr (Berdy 1986). 2.5 Antimikrobik ve Kemoteraptik Maddelere Kar Oluan Bakteriyal Diren Antimikrobik kemoteraptik maddelere kar bakterilerde iki tip diren oluur. Bunlardan ilki doal (ntirinsic) diren dieri ise edinsel (Non- ntirinsic) direntir. Doal diren, mikroorganizmann temel zelliidir. Bakterilerin birounda,

antimikobik kemoteraptik maddeler kullanlmadan nce de var olan direntir. Serratia, Proteus, Providencia Morgenella, Edvardsiella, Cedeecea cinslerinin polimiksinlere (polimiksin B ve kolitsin ) kar olan direnleri doal dirence rnektir.

27

Edinsel diren de ise normal olarak, bakteri nce antimikrobik kemoteraptik madde ile karlamamsa meydana gelmez. Duyarl bir bakteri toplumunda edinsel direncin olumas iki trl olur. A- Spontan kromozomal mutasyonla kazanlan diren; Kromozomal mutasyonlar spontan olarak her 105-106 hcre blnmesi sonucu normal olarak meydana gelmektedir. Bu trl mutasyonlar antimikrobik tedavi srasnda meydana gelebildii gibi, ila alnmad zamanlarda da meydana gelebilir. Antimikrobik kemoteraptik maddeye mikroorganizmann maruz kalmas, direnlilerin hzla oalmasn ve duyarl hcrelerin azalmasn, dolayl olarak da yeni ve direnli bir hcre topluluunun ortaya kmas sonucunu dourur. B- Plazmid ve transpozomlar gibi kromozom d elementler yoluyla kazanlan diren; a- Plazmitlere bal diren; Plazmitler, kromozomdan bamsz olarak replike olan, kromozom d DNA paracklardr. R- plazmidi as verilen diren plazmitleri, saylar ona varan farkl antimikrobik kemoteraptik maddeler kar diren genleri tamaktadrlar. Vcutta normal florann plazmit transferine kar bir koruma salad anlalmtr. zellikle barsak florasnn byk bir ksmn oluturan anaerob basillerin meydana getirdii anaerob artlar plazmit transferini engellemektedir. b- Transpozonlara bal diren; Transpozonlar ise, bir DNA moleklnden dierine geebilen DNA dizileridir. Bunlar bamsz olarak replike olmamaktadrlar. Bu nedenle, kromozom ve plazmit iinde bulunurlar. Kromozomlar ile plazmitler arasnda gidip gelebilirler. Son yllarda oklu diren genlerini tayan bakterilerde transpozonlarn rolleri olduu dnlmtr (Klturgay 1992).

28

3. MATERYAL ve METOT 3.1 Materyal 3.1.1 Aratrma in Seilen stasyonlar Aratrmada kullanlan toprak rnekleri Afyonkarahisar ilinin 7 farkl blgesinden (Ahmet Necdet Sezer Kamps (ANS), Ataky, Devlet park, Hdrlk, Akaray, Gmkent ve zdilek) alnmtr. rnekler alnrken, izole edilecek mikroorganizma grubunun evresel istekleri dikkate alnarak arazide bitki rtsnn bol olarak bulunduu yerler olmasna zen gsterilmitir. Toprak rnekleri steril petrilere konularak laboratuvara getirilip incelenmeye balanmtr. 3.1.2 Aratrmada Kullanlan Test Mikroorganizmalar Topraktan izole edilen Actinomycetlerin antimikrobiyal aktivitelerini saptamak iin Afyon Kocatepe niversitesi Tp Fakltesi Mikrobiyoloji ABDda Phonix BD (Phonix, BD,USA) otomatik identifikasyon sistemi ile identifikasyonlar yaplan hasta izolatlar ve standart test organizmalar kullanlmtr. 1Staphylococcus aureus ATCC 25923 2.Klebsiella pneumoniae 3. Esherichia coli ATCC 25922 4.Pseudomonas aeuroginosa ATCC 27853 5.Proteus vulgaris 6. Salmonella enteriditis 7. Candida albicans

29

3.1.3 Kimyasal Maddeler Gliserol (Redel-de Han 15524 ) Yeast Ekstarkt (Fluka 09182) K2HPO4 (Merck 1.05101.1000) Pepton (Fluka 19942) Agar (Fluka 05039) Malt Ekstrakt (Fluka 70167) znr niasta (NH4)2SO4 NaCl (Redel-de Han 13423) CaCO3 FeSO4. 7H2O (Redel-de Han 12354) MnCl2. 4 H2O (Merck 1.05927.1000 ) ZnSO4. 7 H2O (Redel-de Han 14455 ) CuSO4.5 H2O (Redel-de Han 12849 ) MgSO4. 7H2O (Fluka 63140) L-Asparagin (Merck 1.01565.0100) L- Tirozin (Merck 1.08371) DL-Alanin (Merck 751 K144563 ) L-Histidin (Sigma H-8000 ) Potasyum nitrat (GPR 29638) L-Glutamin (Duchefa Biocheme G0708.0050) Glisin (Duchefa Biocheme G0709.1000) Sodium azide (Riedel-de Han 13412) Kristal viole (Merck 1.014) Sodyum klorit (Riedel-de Han 13423) Fenol (Riedel-de Han 16017) Sakkaroz (Merck 1.07651) Laktoz (Merck 1.07657 ) D-mannitol (Redel-de Han15719 ) Glukoz (Merck 1.08342)

30

D-galaktoz (Duchefa biocheme 002381.05) D-fruktoz (Duchefa biocheme 000757.04) Myo-nozitol (Duchefa biocheme 10609.0100) NaNO3 (Fluka 71757) KCl (Redel-de Han 12636 ) Jelatin (Merck 1.04078.0500 ) Beef Ekstrakt (acumedia 7228A) Meat Ekstrakt (Merck 1.03979 ) Tributirin (Aldrich 113026) NH4Cl (Redel-de Han 11209) NaH2PO4.2H2O (Redel-de Han 04270) KMnO4 (Merck 1.05080.1000) K2CO3 (Aldrch S24452-015) NaOH (Redel-de Han 06203) MTT (3-[4,5-dimetiltiaksol 2-yl]-2,5-difenil. tetrazolyum bromit) (MTT) Ninhidrin (Merck 1,06762.0010) Siklohegzimit (Sigma C-7698 ) 3.1.4 Kullanlan Solsyon ve zcler %3 lk H2O2 zeltisi Gramn iyot zeltisi Aseton (CARLO ALBO 400974) Etilasetat (Merck 1.00864.2500) Asetik asit (Redel-de Han 27225) Metanol (Sgma-Aldrch 34885) Kloroform (Redel-de Han 24216) n- Butanol (Merck 1.00988) Hegzan (TEKKM TK.080210.01000) Metilen klorit (Merck 1.06050.2500) Ninhidrin solsyonu MTT solsyonu

31

3.1.5 Deneyde Kullanlan Ortamlarn erikleri ve Hazrlanmas Gliserol Yeast Agar Gliserol (Redel-de Han 15524 ) Yeast Ekstarkt (Fluka 09182) K2HPO4 (Merck 1.05101.1000) Pepton (Fluka 19942) Agar (Fluka 05039) Distile su 1gr 0.4 gr 0.2gr 5 gr 3 gr 200 ml

Besiyeri ierikleri distile suda zldkten sonra 1.1 atmosfer basn altnda 121Cde 15 dk. sre ile sterilize edilmitir. Sterilizasyon ileminden sonra 50g/ml siklohegzimit (Huck et al. 1991, Waksman,, 1967, Williams & Davies, 1965, Mc Carthy & Williams 1990) ilave edilmitir. Gliserol Yeast Agar ortam Actinomycetlerin topraktan izolasyonunda, byme ortam olarak ayrca agar ilave edilmeden hazrlanan broth hali ise fermantasyon iin fermantasyon ortam 1 olarak kullanlmtr (Tamer vd. 1989). ISP 2 Yeast Ekstrakt Malt Ekstrakt Agar Yeast Ekstrakt (Fluka 09182) Malt Ekstrakt (Fluka 70167) Glukoz (Merck 1.08342) Agar (Fluka 05039 ) Distile su 4gr 10 gr 4 gr 15 gr 1 lt

Besiyeri ierikleri distile suda zldkten sonra 1.1 atmosfer basn altnda 121Cde 15 dk. sre ile sterilize edilmitir. Hazrlanan ortam izolatlarn kltrel zelliklerinin incelenmesinde kullanlmtr (Shirling & Gottlieb, 1966, Williams&Cross 1971). Ayrca Actinomycetlerin topraktan izolasyonunda byme ortam olarak, agar ilave edilmeden hazrlanan broth hali ise fermantasyon iin fermantasyon ortam 2 olarak kullanlmtr (Huck et al.1991).

32

ISP 4 norganik Tuz Niasta Agar znr niasta (NH4)2SO4 KH2PO4 (Merck 1.04871.1000) MgSO4. 7H2O (Fluka 63140) NaCl (Redel-de Han 13423) CaCO3 *Shirling ve Gottlieb iz tuzlar solsyonu Agar (Fluka 05039 ) Distile su *Shirling ve Gottlieb iz tuzlar solsyonu FeSO4. 7H2O (Redel-de Han 12354) MnCl2. 4 H2O (Merck 1.05927.1000 ) ZnSO4. 7 H2O (Redel-de Han 14455 ) Distile su 0.1 gr 0.1 gr 0.1 gr 100 ml 10 gr 2gr 1 gr 1gr 1gr 2 gr 1 ml 15 gr 1 lt

Az miktarda souk su ile kartrlp zlen niasta distile su ile 1 ltye tamamlandktan sonra zerine dier maddeler ilave edilmitir. z tuzlar solsyonu kullanlarak hazrlanan ortam, otoklavda 1.1 atmosfer basn altnda 121Cde 15dk. sre ile sterilize edilmitir. Hazrlanan ortam izolatlarn kltrel zelliklerinin incelenmesinde kullanlmtr (Shirling & Gottlieb 1966, Wendisch & Kutzner 1991). ISP 5 Gliserol Asparagin Agar L-Asparagin (Merck 1.01565.0100) Gliserol (Redel-de Han 15524 ) K2HPO4 (Merck 1.05101.1000 ) *Shirling ve Gottlieb iz tuzlar solsyonu Agar (Fluka 05039 ) Distile su 1gr 10gr 1 gr 1 ml 15 gr 1lt

33

Besiyeri ierikleri distile suda zldkten sonra 1.1 atmosfer basn altnda 121Cde 15 dk. sre ile sterilize edilmitir. Hazrlanan ortam izolatlarn kltrel zelliklerinin incelenmesinde kullanlmtr (Pridham & Lyons, 1961, Shirling & Gottlieb 1966, Williams & Cross 1971,Wendisch & Kutzner 1991). ISP 7 Tirozin Agar Gliserol (Redel-de Han 15524 ) L- Tirozin (Merck 1.08371) L- Asparagin (Merck 1.01565.0100 ) K2HPO4 (Merck 1.05101.1000 ) MgSO4. 7H2O (Fluka 63140 ) NaCl (Redel-de Han 13423 ) FeSO4. 7H2O (Redel-de Han 12354 ) Distile su *Pridham ve Gottlieb iz tuzlar solsyonu Agar (Fluka 05039 ) 15 gr *Pridham ve Gottlieb iz tuzlar solsyonu CuSO4.5 H2O (Redel-de Han 12849 ) FeSO4. 7H2O (Redel-de Han 12354 ) MnCl2. 4 H2O (Merck 1.05927.1000 ) ZnSO4. 7 H2O (Redel-de Han 14455 ) Distile su 0.64 gr 0.11 gr 0.79 gr 0.15 gr 100 ml 15 gr 0.5 gr 1 gr 0.5gr 0.5 gr 0.5 gr 0.01 gr 1 lt 1 ml

Besiyeri ierikleri distile suda zldkten sonra 1.1 atmosfer basn altnda 121Cde 15 dk. sre ile sterilize edilmitir. Hazrlanan ortam izolatlarn kltrel zelliklerinin incelenmesinde kullanlmtr (Shirling & Gottlieb 1966 ).

34

Sakkaroz Nitrat Agar Sakkaroz (Merck 1.07651) NaNO3 (Fluka 71757) K2HPO4 (Merck 1.05101.1000 ) MgSO4. 7H2O (Fluka 63140 ) KCl (Redel-de Han 12636 ) FeSO4. 7H2O (Redel-de Han 12354 ) Agar (Fluka 05039 ) Distile su 30 gr 2 gr 1 gr 0.5 gr 0.5 gr 0.01 gr 15 gr 1 lt olarak bilinir.

Bu ortam sklkla Czapeks agar veya Czapeks solsyon agar

Besiyeri ierikleri distile suda zldkten sonra 1.1 atmosfer basn altnda 121Cde 15 dk sre ile sterilize edilmitir. Hazrlanan ortam izolatlarn kltrel zelliklerinin incelenmesinde kullanlmtr (Waksman 1967, Ohkuma et al. 1992). Glukoz Asparagin Agar Glukoz (Merck 1.08342 ) Asparagin (Merck 1.01565.0100 ) K2HPO4 (Merck 1.05101.1000 ) Agar (Fluka 05039 ) Distile su 10 gr 0.5 gr 0.5 gr 15 gr 1 lt

Otoklavda 1.1 atmosfer basn altnda 121Cde 15 dk. sre ile sterilize edilmitir. Hazrlanan ortam izolatlarn kltrel zelliklerinin incelenmesinde kullanlmtr (Waksman 1967, Ohkuma et al. 1992). Melanin Formasyon Ortam Yeast Ekstrakt (Fluka 09182 ) L- Tirozin (Merck 1.08371) 1 gr 1 gr

35

NaCl (Redel-de Han 13423 ) Agar (Fluka 05039 ) Distile su

8.5 gr 15gr 1 lt

Otoklavda 1.1 atmosfer basn altnda 121Cde 15 dk sre ile sterilize edilmitir. Hazrlanan ortam izolatlarn fizyolojik zelliklerinin incelenmesinde kullanlmtr (Waksman 1967 ). ISP 12 Karbon Nutrient Ortam *Karbon kayna (NH4)2SO4 KH2PO4 (Merck 1.04871.1000 ) MgSO4. 7H2O (Fluka 63140 ) CuSO4.5 H2O (Redel-de Han 12849 ) FeSO4. 7H2O (Redel-de Han 12354 ) MnCl2. 4 H2O (Merck 1.05927.1000 ZnSO4. 7 H2O (Redel-de Han 14455 ) Agar (Fluka 05039 ) Distile su 10 gr 2.64 gr 2.38 gr 1 gr 0.0064 gr 0.001 gr 0.007 gr 0.0015 gr 15 gr 1 lt

Karbon kaynaklar membran filtre ile steril edilerek ortama %1 orannda ilave edilmitir. Glukoz pozitif kontrol ortam olarak, karbon kayna bulunmayan ortam ise negatif kontrol ortam olarak kullanlmtr. (Shirling & Gottlieb 1966, Waksman 1967). Azot Kullanm Ortam D-Glukoz (Merck 1.08342 ) MgSO4. 7H2O (Fluka 63140 ) NaCl (Redel-de Han 13423 ) FeSO4. 7H2O (Redel-de Han 12354 ) K2HPO4 (Merck 1.05101.1000 ) 1 gr 0.05 gr 0.01 gr 0.001 gr 0.1 gr

36

Agar (Fluka 05039 ) Distile su

1.5 gr 100 ml

Test edilecek azot kaynaklar, ortama % 0.1 (wv) orannda ilave edilmitir. Hazrlanan ortamlar izolatlarn kullanabildii azot kaynaklarnn belirlenmesi amac ile kullanlmtr. L-Asparagin ieren ortamlar pozitif kontrol ortam olarak kullanlmtr (Williams et al. 1983, Locci 1989). Bennets Ortam Gliserol (Redel-de Han 15524 ) L-Alanin (Merck 751 K144563 ) NaCl (Redel-de Han 13423 ) CaCO3 FeSO4. 7H2O (Redel-de Han 12354 ) MgSO4. 7H2O (Fluka 63140 ) Agar (Fluka 05039 ) Distile su 20 gr 2.5 gr 1 gr 0.1 gr 0.1 gr 0.1 gr 15 gr 1 lt

Otklavda 1.1 atmosfer basn altnda 121Cde 15 dk. sre ile sterilize edilmitir. Hazrlanan ortam izolatlarn fizyolojik zelliklerinin incelenmesinde kullanlmtr (Jones 1949, Locci 1989). Jelatin besiyeri Jelatin (Merck 1.04078.0500 ) Nutrient Broth 12 gr 100 ml

Otoklavda 1.1 atmosfer basn altnda 121Cde 15 dk sre ile sterilize edilmitir. Hazrlanan ortam izolatlarn biyokimyasal zelliklerinin belirlenmesinde kullanlmtr (otuk 2003).

37

Gliserol Nitrat Agar Besiyeri 9daki sakarozun yerine 30 gram gliserol ilave edilerek hazrlanan bu ortam izolatlarn kltrel zelliklerinin incelenmesinde kullanlmtr (Waksman 1967). Glukoz- Nitrat Agar Besiyeri 9daki sakarozun yerine 30 gram glukoz ilave edilerek hazrlanan bu ortam izolatlarn kltrel zelliklerinin incelenmesinde kullanlmtr (Waksman 1967). Nutrient Agar Pepton (Fluka 19942 ) Beef Ekstrakt (acumedia 7228A) Agar (Fluka 05039 ) Distile su 5 gr 3 gr 15 gr 1 lt

Otoklavda 1.1 atmosfer basn altnda 121Cde 15 dk. sre ile sterilize edilmitir. Hazrlanan ortam izolatlarn kltrel zelliklerinin incelenmesinde ve izolatlarn antimikrobiyal etkilerinin belirlenmesinde kullanlmtr (ner 1989). Nutrient Broth Pepton (Fluka 19942 ) Beef Ekstrakt (acumedia 7228A ) Distile su 5 gr 3 gr 1 lt

Otklavda 1.1 atmosfer basn altnda 121Cde 15 dk. sre ile sterilize edilmitir. Hazrlanan ortam almalarda test organizmalarnn aktive edilmesi ve fermantasyon ortam kullanlmtr (ner 1989).

38

Malt Ekstrakt Malt Ekstrakt (Fluka 70167 ) Pepton (Fluka 19942 ) Agar (Fluka 05039 ) Distile su 30 gr 5 gr 15 gr 1 lt

Besiyeri ierikleri distile suda zldkten sonra 1.1 atmosfer basn altnda 121Cde 15 dk. sre ile sterilize edilmitir. Hazrlanan ortam izolatlarn kltrel zelliklerinin incelenmesinde ve izolatlarn stoklanmasnda kullanlmtr (ner 1989). Malt Broth Malt Ekstrakt (Fluka 70167 ) Pepton (Fluka 19942 ) Distile su 30 gr 5 gr 1 lt

Besiyeri ierikleri distile suda zldkten sonra 1.1 atmosfer basn altnda 121Cde 15 dk. sre ile sterilize edilmitir. Hazrlanan ortam izolatlarn kltrel zelliklerinin incelenmesinde ve fermantasyon ortam olarak kullanlmtr (ner 1989). Niasta Agar Pepton (Fluka 19942 ) Meat Ekstrakt (Merck 1.03979) Niasta Agar (Fluka 05039 ) Distile su *Gramn yot zeltisi yot KI Distile su 1 gr 2 gr 300 ml 5 gr 3 gr 2 gr 15 gr 1 lt

39

Besiyeri ierikleri distile suda zldkten sonra 1.1 atmosfer basn altnda 121Cde 15 dk. sre ile sterilize edilmitir. Hazrlanan ortam izolatlarn biyokimyasal zelliklerinin belirlenmesi amac ile kullanlmtr. zolatlarn niasta agara ekimleri yapldktan sonra inkbasyona braklmlardr. nkbasyon sresi sonunda petrilere gramn iyot zeltisi dklm ve renk oluumuna gre deerlendirme yaplmtr. (otuk 2003). Tributirin Agar Pepton (Fluka 19942) Meat Ekstrakt (Merck 1.03979) Tributirin (Aldrich 113026) Agar (Fluka 05039 ) Distile su 5 gr 3 gr 10gr 15gr 1 lt

Besiyeri ierikleri distile suda zldkten sonra 1.1 atmosfer basn altnda 121Cde 15 dk. sre ile sterilize edilmitir. Hazrlanan ortam izolatlarmzn biyokimyasal zelliklerinin belirlenmesinde kullanlmtr. Pepton, agar ve meat ekstrakt stlarak eritildi, 90Cye kadar soutulduktan sonra tributirin ilave edilmitir ve kartrcda emlsiyon haline getirilmitir (otuk 2003). Temel Mineral Ortam NH4Cl (Redel-de Han 11209) NaH2PO4.2H2O (Redel-de Han 04270 ) KH2PO4 (Merck 1.04871.1000 ) MgSO4.7H2O (Fluka 63140 ) NaCl (Redel-de Han 13423 ) Agar (Fluka 05039 ) Distile su 0.05gr 0.05gr 0.05gr 0.05gr 0.4gr 1.5 gr 100 ml

40

Besiyeri ierikleri distile suda zldkten sonra 1.1 atmosfer basn altnda 121Cde 15 dk. sre ile sterilize edilmitir. Hazrlanan ortam izolatlarn biyokimyasal zelliklerinin belirlenmesi amac ile kullanlmtr. Bu ortam steril tplere 10ar ml konulduktan sonra zerine %1 orannda hidrokarbon ilave edilmitir. almamzda hidrokarbon kayna olarak mazot kullanlmtr (ner 1989). Fermantasyon Ortam A Glukoz (Merck 1.08342 ) Pepton (Fluka 19942 ) Meat Ekstrakt (Merck 1.03979) NaCl (Redel-de Han 13423 ) Distile su 10gr 5gr 5gr 5gr 1 lt

Besiyeri ierikleri distile suda zldkten sonra 1.1 atmosfer basn altnda 121Cde 15 dk. sre ile sterilize edilmitir. Hazrlanan ortam izolatlardan antibakteriyal molekln retimi iin fermantasyon ortam olarak kullanlmtr (Schatz & Waksman 1944e gre Hepgvendik1989dan). Ninhidrin Solsyonu Ninhidrin Aseton 0.2gr 100ml

TLC plaklarna sklarak aktif molekln peptit yaps saptanmtr. Solsyon aminoasitler iin kullanlmaktadr (Toennies 1951). MTT (3-[4,5-dimetiltiaksol 2-yl]-2,5-difenil tetrazolyum bromit) Solsyonu MTT Distile su 0.025gr 10ml

41

Bu Solsyon biyootogram sonras bakterilerin canl kald blgeyi pembe renge boyamaktadr (Lund et al. 1975).

42

3.2. Metot izelge 3.1 alma basamaklar


1- Bakteri izolasyonu 2- zolatlarn antimikrobiyal spekturumunun belirlenmesi 3-zolatlarn karakterizasyonu

3A-Morfolojik zelliklerinin saptanmas Koloni ve mikroskobik yaps

3B- Biyokimyasal zelliklerinin saptanmas Lipid hidrolizi, Tirozin retimi, Jelatin hidrolizi, Melanin retimi, Niasta hidrolizi, Katalaz hidrolizi, Tirozinin paralanmas, Hidrokarbonlarn paralanmas Karbon kaynaklar kullanm Azot kaynaklar kullanm

4- Fermantasyonla antimikrobiyal maddenin belirlenmesi 4A-Sporulasyon 4B- nokulum hazrlanmas 4C- Fermantasyon 5- Fermantasyon svsnda ham madde ekstraksiyonu (solvent ekstraksiyonu) 6- TLC 7- Biyootogram 8- Kolon kromatografisi ile etken maddenin saflatrlmas 9-UV spektrofotometrik lm

43

3.2.1 Topraktan Actinomycet zolasyonu (Waksman 1922) Toprak rnekleri, alkol ile temizlenmi bir apa ile 5-10 cm derinlikte alan toprak profilinden, alkolle temizlenmi bir kakla steril petrilere alnmtr (Brown 1958). Alnan her bir kompozit topraktan, steril koullarda 10 gr tartlp 500 mllik steril erlenlere konulduktan sonra zerine %0.1 orannda CaCO3 ilave edilerek kartrlm ve bir gn sreyle oda scaklnda bekletilmitir (El-Nakeeb&Lechevalier 1963, Williams&Cross 1971). Erlenlerde bulunan her bir toprak rnei zerine 90 ml steril distile su ilave edilerek alkalanmtr. Bylece toprak rnekleri yaklak 10-1 orannda sulandrlmtr. Bu ekilde hazrlanm her bir toprak rnei sspansiyonundan steril bir pipet yardm ile 1 ml alnarak, iinde 9 ml steril distile su bulunan tplere aktarlm ve bylece yaklak 10-2lik toprak sspansiyonu elde edilmitir. Ayn ilem 10-3 ve 10-5lik sulandrmalar elde etmek iin tekrarlanmtr. Hazrlanan 10-3, 10-4 ve 10-5lik sulandrmalardan steril bir pipetle 0.5 ml alnarak steril petrilere konulmu ve zerine soutulmu besiyeri Malt Agar, Nutrient Agar ve Gliserol Yeast Agar ilave edilerek paralel allmtr. Besiyeri ile toprak sspansiyonun homojen karmasn salamak iin petrilere rotasyon hareketi yaptrlmtr. Hazrlanan petriler 27C ve 40Cde 5-7 gn inkbasyona braklmtr. Tm petriler inkbasyon sresi boyunca Actinomycet kolonilerinin var olup olmadn saptamak iin gzlenmitir. Kat ortam zerinde pudrams, derimsi veya pamuksu bir grnme sahip olan kolonilerin mikroskobik incelemeleri yaplm ve gram boyama zelliklerine baklarak Actinomycet izolatlar belirlenmitir. Her bir toprak rneinden elde edilen izolatlar, mikroskobik ve makroskobik zelliklerine gre gruplandrlarak, grubu temsil eden rasgele bir izolat alma iin seilmitir.

44

3.2.2 zole Edilen Actinomycetlerin Antimikrobiyal Etkinliklerinin Belirlenmesi zole edilen Actinomycet kltrlerinde antimikrobiyal etkinin varl Spektrum-Plak Metodu (Raper et al. 1949, Nakayama 1981) kullanlarak saptanmtr. Nutrient Agarl petriler zerine, antimikrobiyal aktivitesi belirlenecek izolatn ekimi, izolatlar 27Cde 5 -7 gn inkbasyona braklmtr. Test organizmas olarak kullanlacak mikroorganizmalarn (Staphylococcus aureus ATCC 25923, Klebsiella pneumoniae, Esherichia coli ATCC 25922, Pseudomonas aureoginosa ATCC 27853, Proteus vulgaris, Candida albicans, Salmonella enteriditis) 24 saatlik taze Nutrient Broth kltrleri hazrlanm ve bu mikroorganizmalar Actinomycet kolonisi ile 90 a yapacak ekilde Actinomycet kolonisinden balayarak petri kenarna doru tek izgi halinde ekilmitir. Test mikroorganizmalarnn geliimi iin petriler 24 saat 37Cde inkbasyona tabi tutulmu ve inkbasyon sonunda Actinomycet izolatnn test organizmasna inhibisyon etkisi milimetre olarak llmtr (Raper et al. 1949). 3.2.3 Seilen zolatlarn Biyokimyasal zelliklerinin Belirlenmesi petriyi ortalayacak ekilde, bir utan dier uca doru yaplmtr. Bu ekilde ekimleri yaplan

3.2.3.1 Niasta Hidrolizi Seilen izolatlar Niasta Agar zerine ekilmi ve 27Cde 5-7 gn inkbasyona braklmlardr. Bekleme sresi sonunda petriyi rtecek ekilde Gramn iyodin zeltisi agar zerine dklm ve dklen solsyonun fazlas aktlmtr. yodinin varlnda niasta, besiyerinde mavi-siyah bir renk verir, bu sonu ortamda niasta paralayan enzimin bulunmadnn bir gstergesi olup, negatif bir sonutur. Eer niasta hidroliz edilmise, organizmann redii blge etrafnda ak bir hidroliz zonu oluacaktr (otuk 2003 ).

45

3.2.3.2 Lipit Hidrolizi Tributirin Agar bulunan petrilere izolatlar ekilmi ve 27Cde 5-7 gn inkbasyona braklmlardr. Bu sre sonunda petrilerde ak zon oluup olumad incelenmitir. Ak zon oluumu lipit hidrolizi iin pozitif bir sonu olarak deerlendirilmitir (otuk 2003). 3.2.3.3 Jelatin Hidrolizi Jelatin besiyerine izolatlarn taze kltrlerinden ayr ayr ekim yaplm olup tpler 27Cde 5 gn inkbasyona braklm ve bu sre sonunda 4Cde 30 dk. buzdolabnda bekletilmitir. Yzeyinde svlama saptanan kltrler jelatinaz oluturan ve jelatini hzla hidrolize eden sular olarak deerlendirilmitir. Kat kalan kltrler ek olarak 5 gn daha inkbe edilerek, jelatinin hidrolize olup olmadna tekrar baklmtr. Svlama grlen sular jelatini yava hidrolize eden sular olarak saptanmtr (otuk 2003 ). 3.2.3.4 Hidrokarbonlarn Paralanmas Mikroorganizmalarn hidrokarbonlar paralamalarn belirlemede izolatlarn Malt Agardaki taze kltrleri kullanlmtr. Hidrokarbonun paralanmas iin gerekli olan temel mineral ortamndan, steril deney tplerine 10ar ml konulmutur. Mineral ortama %1 orannda hidrokarbon rnei katlarak ortam hazrlanm ve izolatlar tplere ekilmitir. almada hidrokarbon olarak mazot kullanlmtr. Tpler 27Cde 5-7 gn inkbasyona braklmtr. Bu sre sonunda ak zon oluumu pozitif olarak deerlendirilmitir (ner 1989). 3.2.3.5 Melanin retimi Melanin retimi iin Melanin Formasyon Ortam kullanlmtr. Besiyeri petrilere dkldkten sonra izolatlarn ekimleri yaplm ve 27Cde 5-7 gn inkbasyona

46

braklmlardr. Bu sre sonunda petrilerde kahverengi renk oluumu melanin retimi asndan pozitif olarak deerlendirilmitir (Denizci 1996). 3.2.3.6 Tirozinin Paralanmas zolatlarn ekimleri Bennets ortamna L-Tirozin ilave edilerek hazrlanm besiyerinde yaplm ve 27Cde 5-7 gn inkbasyona braklmlardr. nkbasyon sonunda bulanklk oluan tplerdeki sular tirozini paralayan sular olarak saptanmtr (Denizci 1996). 3.2.3.7 Katalaz Testi Petrilerde bulunan taze kltrlerin zerine % 3lk hidrojen peroksit zeltisinden ilave edilerek sularn katalaz aktiviteleri incelenmitir. Oksijen kabarcklarnn kmas ve yzeyde kpk birikimi grlen sular katalazn mevcut olduu sular olarak belirlenmitir (otuk 2003). 3.2.4 Seilen zolatlarn Fizyolojik zelliklerinin Belirlenmesi 3.2.4.1 Karbon Kaynaklarnn Kullanm zolatlarn karbon kaynaklarnn belirlenmesinde Karbon Nutrient Ortam kullanlmtr. Farkl karbon kaynaklar ieren ortamlar 27Cde 5-7 gn inkbasyona braklmlardr. Karbon kayna olarak D-glukoz, laktoz, sakkaroz, gliserol, D-mannitol, D-galaktoz, Dfruktoz, inozitol kullanlmtr (Denizci 1996). 3.2.4.2 Azot Kaynaklarnn Kullanm zolatlarn azot kaynaklarnn belirlenmesinde Azot Kullanm Ortam kullanlmtr. Farkl azot kaynaklar ieren ortamlar 27Cde 5-7 gn inkbasyona braklmlardr. Azot kaynaklar olarak L-asparajin, DL-alanin, L-histidin, potasyum nitrat, L-tirozin, Lglutamin, KNO3 ve glisin kullanlmtr (Denizci 1996).

47

3.2.4.3 nhibitr Ortamlar Malt Agara inhibitr olarak, sodyum klorit (%4, %7, %10 ve %13 oranlarnda), kristal viole (0.0001gr ), sodyum azid (0.01,0.02gr), ve fenol (0.1gr) katlarak 27oCde 5-7 gn inkbe edilmitir. Kontrol olarak iinde inhibitr bulunmayan Malt Agar kullanlmtr. Besiyeri zerindeki organizmann geliimi, kontrol grubu ile karlatrlarak inhibitrlerin etkisi saptanmtr. Ayrca 3 farkl scakln (10C, 37C ve 45C) sular zerine etkisi izolatlarn 27Cdeki geliimleri ile karlatrlarak incelenmitir (Denizci 1996). 3.2.5 Seilen zolatlarn Kltrel ve Morfolojik zelliklerinin Belirlenmesi Seilen izolatlarn Gliserol Yeast Agar, Yeast Ekstrakt- Malt Ekstrakt Agar (ISP 2), norganik Tuz- Niasta Agar (ISP 4), Gliserol-Asparagin Agar (ISP 5), Tirozin Agar (ISP 7), Sakaroz Nitrat Agar, Gliserol Nitrat Agar, Glukoz Nitrat Agar, Glukoz Asparajin Agar, Nutrient Agar ve Malt Agar ortamlarnda morfolojik ve kltrel zelliklerinin incelenmesi amacyla 27Cde 7 gn boyunca inkbasyona braklmlardr. Bu ortamlarda inkbe edilen izolatlar, aerial misel rengi, batk misel rengi ve difze pigment rengi asndan makroskobik olarak incelenmitir. zolatlarn melanin pigment retimi Melanin Formasyon Ortam kullanlarak incelenmitir (Denizci 1996). 3.2.6 Fermantasyonla Antimikrobiyal Etkili Molekln retimi Antimikrobiyal aktiviteleri olduu saptanan izolatlar arasndan seilen AA32 ve AA33n fermantasyonla antimikrobiyal etkili maddelerinin retiminin belirlenmesi iin farkl fermantasyon ortamlar (Gliserol Yeast Broth, ve Fermantasyon Ortam A) kullanlmtr. Fermantasyon denemeleri sporulasyon, inokulum ve fermantasyon olmak zere balca aamada gerekletirilmitir. Fermantasyon sresince izolatlarn antimikrobiyal madde retimi ve biomasn inkbasyon sresince deiimi ya arlk metodu kullanlarak belirlenmitir (Denizci 1996).

48

3.2.6.1 Sporulasyon Fermantasyonda kullanlan mikroorganizmalarn Malt Agarda taze kltrleri

hazrlanm, bu ortamda aktif hale gemesi ve sporulasyona girmesi iin 5-7 gn 28Cde inkbe edilmilerdir. Bu sre sonunda izolatlar inokulum ortamn alamak iin kullanlmtr (Denizci 1996). 3.2.6.2 nokulum Hazrlanmas inde 100er ml fermantasyon ortam bulunan 250 mllik erlenlere bir ze dolusu spor alandktan sonra alkalamal etvde (N-BOTEK.INC NB-205) 28Cde 200rpmde (devir/dakika) 3 gn boyunca inkbe edilerek fermantasyon ortamnn alanmasnda kullanlmlardr (Ohkuma et al. 1992). 3.2.6.3 Fermantasyon Fermantasyon, 250 ml olarak hazrlanm fermantasyon ortamlarna, inokulumdan %5 (v/v) orannda a ilave edilerek gerekletirilmitir. Erlenler alkalamal etvde 28Cde 200 devir/dakika alkalama hznda 168 saat sreyle alkalanarak inkbe edilmilerdir (Ohkuma et al. 1992). 3.2.7 Fermantasyon Svsnda Antimikrobiyal Etkinin Saptanmas Staphylococcus aureus ATCC 25923 ve E.coli ATCC 25922 test organizmalar, Nutrient Brothda 37Cde 24 saat sreyle inkbe edilmi ve 0.5 McFarland bulankllk antimikrobiyal etkinin saptanmasnda kullanlmtr. Ekim iin steril ekvyon ubuu kullanlarak sv kltrdeki test organizmalarndan Nutrient Agar zerine birbirini kesen zig zagl izgiler ekerek her tarafa homojen bir ekilde yaylmak suretiyle ekim yaplmtr. Ekimleri yapldktan sonra agar zerinde 6mm apnda ukurlar alm ve her bir ukura 400 l fermantasyon ortam olarak kullanlan besiyeri yklenmitir. Petriler 37Cde 24 saat sreyle inkbasyona braklm ve bu srenin sonunda oluan

49

inhibisyon zonlarnn aplar llerek antimikrobiyal aktivite incelenmitir (Augustne 2005). 3.2.8 Antimikrobiyal Etkili Molekln zolasyonu AA32 ve AA33ten ham madde ekstraksiyonu, solvent ekstraksiyonu ile, etken maddelerin tespiti ise ince tabaka kromatografisi, biyootogram, UV spektrofotometre ve kolon kromatografisi yntemleri kullanlarak gerekletirilmitir. 3.2.8.1 Solvent Ekstraksiyonu Fermantasyon ortamnda reyen izolatlar Whatman filtre kad kullanlarak uzaklatrldktan sonra 150 ml zc (metilen klorit, n-butanol ve hegzan) 250 ml fermantasyon svs ile birlikte bir gn sreyle alkalanmtr. Bu ilem sonunda erlenler bir sre bekletilmi ve younluklar farkl olan fermantasyon svs ile zcnn birbirinden ayrld grlmtr. Hegzan ve n- butanol fermantasyon svsnn stnde yer alrken metilen klorit altta kalmtr. Ayrma hunisi yardmyla iki sv birbirinden ayrlm ve zc ile fermantasyon svs ayr kaplarda toplanmtr. Hegzan, n- butanol ve metilen klorid fazlar ayr ayr evaporatrde (Heidolph 2) 40C scaklkta younlatrlmtr. Younlatrlm ekstratlar 37Cde 3-4 gn tutularak kat ekstrakt elde edilmitir. Bu ekstraktlar ince tabaka ve kolon kromatografilerinde kullanlmtr (Zitouni et al. 2005). 3.2.8.2 nce Tabaka Kromatografisi (TLC) ile Uygun Solvent Sisteminin Belirlenmesi Aktivite gsteren solvent fazlarnda znen molekllerin kromatografik ayrma ve inceleme ilemlerinde, ince tabaka kromatografisi iin silica jel (Merck 5554) ve solvent sistemi olarak da aada belirtilen sistemler kullanlmtr. nce tabaka kromatografisi ile maddeler solvent sistemlerinde yrtldkten sonra %0.2lik asetonik ninhidrin ile spreylenerek bantlar grnr hale getirilmi ve aktif molekln peptit yapda olup

50

olmad saptanmtr. Peptit yapsndaki bantlarn Rf deerleri hesaplanmtr. Ayrca her bir bant TLC zerinden kaznarak UV spektradaki maksimum absorbans deerleri belirlenmitir (Denizci 1996). Kloroform: Metanol Kloroform: Metanol: Su n-Butanol: Asetikasit: Su Etilasetat: Metanol: Su 3.2.8.3 Biyootogram erisinde Nutrient Agar bulunan petrilere, TLC plaklar, bantl yzeyi da bakacak ekilde yerletirildikten sonra 24 saatlik taze kltrleri hazrlanm olan S.aureus ATCC 25923 test organizmas yar kat Nutrient Agara eklenerek plak yzeyini kaplayacak ekilde dklmtr. 37Cde 24 saat inkbasyon sonunda petriler MTT solsyonu ile spreylenmitir. MTT solsyonu canl kalan bakterileri pembe renge boyarken antimikrobiyal aktivitenin bulunduu ve bakteri remesinin olmad blgede zon oluumu gzlenmitir (Lund et al. 1975). ekil 3.1de biyootogram sonucu oluan zon alan grlmektedir (Tianjin 2003) . 8:2 6.5:3:1 6:2:2 40:5.4:5

ekil 3.1 Biyootogram Sonucu Oluan Zon Alanlar (Tianjin 2003)

51

3.2.8.4 Kolon Kromatografisi ve UV Spektrofotometre Solvent ekstraksiyonu sonucu elde edilen ham ekstraktan 0.2 gr tartlp 1 ml suda zdkten sonra 3500 gde 2 dk boyunca santrifj edilmitir. Daha sonra bu ham ekstrakt sefakril (S 200) kolonda n-butanol:asetik asit:su (6:2:2) ieren solvent sistemi kullanlarak saatte 4.5ml (4.5ml h-1) ak hznda yrtlerek 1.5 mllik 52 fraksiyon toplanmtr. Toplanan fraksiyonlarn tamam UV spektrofotometrede (TU-1880 Double Beam) okunarak lmleri yaplm ve pik deerleri belirlenmitir. Aktivite gsteren fraksiyonlar TLCde yrtlerek Rf deeri belirlenen blge kaznarak aktif madde izolasyonu yaplmtr (Denizci 1996).

52

4. BULGULAR 4.1 zolatlarn Antimikrobiyal Aktivitesi Afyonkarahisar ilinin 7 farkl blgesinden alnan toprak rneklerinden, farkl koloni morfolojisine sahip 52 Actinomycet suu izole edilmitir. Sonular izelge 4.1de verilmitir. izelge 4.1 zolasyon Blgelerine Gre Antimikrobiyal Aktivite Oranlar rnek Alnan Blge Akaray Ataky Gmkent Devlet Park Hdrlk ANS zdilek Toplam zolat Says 4 (%7.60) 12 (%23.0) 5 (%9.60) 5 (%9.60) 6 (%11.50) 18 (%34.60) 2 (%3.80) 52 Antimikrobiyal Aktivite Gsteren zolat Says 1 (%25.00) 10 (%83.30) 3 (%60.00) 2 (%40.00) 2 (%33.30) 10 (%55.50) 1 (%50.00) 29 (%55.70)

En fazla izolasyon ANS kampsnden 18 izolatla (%34.6) elde edilmitir. Bunu Ataky 12 (%23) ve Hdrlk 6 (%11.5) izolatla takip etmitir. zolatlarn 29unun (%55.7) antimikrobiyal aktiviteye sahip olduu saptanmtr. En fazla izolasyon ANS kampsnden olmasna karn en fazla antimikrobiyal aktivite gsteren blge %83.3 ile Ataky olmutur. zole edilen 52 farkl suun Gram(+) ve Gram(-) bakteriler ile mayalara kar gstermi olduklar antimikrobiyal aktiviteleri belirlenmi olup sonular izelge 4.2de belirtilmitir.

53

izelge 4.2 Afyonkarahisar linden zole Edilen Actinomycetlerin Antimikrobiyal Aktiviteleri (mm)
TEST ORG.

Salmonella enteriditis

Klebsiella pneumoniae

Pseudomonas aeuroginosa

E.coli

Proteus vulgaris

Candida albicans

Stphylococcus aureus

ATCC 25922

ATCC 27853
ZOLAT

ATCC 25923

KA1 KA 2 KA 3 KA 4 KA 5 KA 6 KA 7 KA 8 KA 9 KA 10 KA 11 AA12 DA13 GA14 A15 AA16 AA18 AA19 AA20 DA22 DA23 DA24

1 6 3 -

1 -

2 2 3 4 -

2 5 14 -

2 2 -

4 3 4 12 12 3 4 4 3 4 7 4

AA17* 5

AA21* -

54

DA25 GA26 GA27 GA28 GA29 AA30 AA31 AA32 AA33 AA34 KA35 KA36 KA37 KA38 KA39 KA40 KA41 A42 A43 A44 A45 A46 HA47 HA48 HA49 HA50 HA51 HA52

4 3 2 20 2 2 3 5 -

5 7 3 -

5 4 5 5 12 8 2 6 -

2 7 5 2 6 4 -

4 5 -

2 2 4 -

7 6 4 2 23 22 2 6 20 9 1 -

AA: Ataky izolatlar, , A: Akaray izolatlar, DA: Devlet Park izolatlar, GA: Gmkent izolatlar HA: Hdrlk izolatlar, KA: ANS izolatlar, A: zdilek izolatlar * Termofilik Actinomycet trleri

55

Antimikrobiyal aktivite gsteren izolatlarn %46.1i Gr(-)lere, %44.2si Gr(+)lere, %9.6s mayalara kar etkin iken %9.6s hem antibakteriyal hem de antifungal aktivite gstermitir. zolatlar %44.2 ile en fazla Staphylococcus aureus ATCC 25923e etkili olup bunu Salmonella enteriditis (%23), Pseudomonas aeuroginosa ATCC 27853 (%23), E.coli (%19.2), C.albicans (% 9.6), Klebsiella pneumoniae (%7.6) ve Proteus vulgaris (%3.8) takip etmitir. En fazla antimikrobiyal etkiye sahip olan sular AA32, AA33 ve KA11 olarak saptanmtr. Termofilik izolatlardan AA17 Salmonella enteriditis ve Staphylococcus aureus ATCC 25923e, AA21 ise Klebsiella pneumoniae ve E.coli ATCC 25922ye kar etkili bulunmutur. nhibisyon zonuna bakldnda her izolatta Gr(+) bakterilere kar Gr(-)lere oranla daha fazla antimikrobiyal etki gstermitir. AA33 izolatnn AA32 ve KA11den farkl olarak C.albicansn remesini inhibe ettii grlmtr (izelge 4.2). 4.2 Kltrel ve Morfolojik zelliklerin ncelenmesi zolatlarn kltrel ve morfolojik zellikleri saptanm ve elde edilen sonular izelge 4.3de verilmitir. izelge 4.3 zolatlarn Kltrel ve Morfolojik zellikleri AA32 Ortam Gliserol Yeast Agar ISP 2 ISP 4 ISP 5 ISP 7 Sakkaroz Nitrat Agar Glukoz Asparajin Agar Gliserol Nitrat Agar Glukoz Nitrat Agar Nutrient Agar Malt Agar Melanin reme ++ + +++ ++ ++ ++ +++ ++ + +++ ++ +++ +++ Aerial misel rengi Krem Sar Sar-Krem Sar-Beyaz Sar- Beyaz Beyaz Sar- Beyaz Beyaz Krem Sar- Beyaz Beyaz-Krem Koyu Krem Batk misel Rengi Kahverengi Sar Sar Sar- Krem Sar Beyaz Sar- Krem Kahverengi Krem Sar Kahverengi Kahverengi znr pigment rengi Sar Kahverengi Kahverengi

56

Formasyon AA33 Gliserol Yeast ++ Agar ISP 2 +++ ISP 4 +++ ISP 5 +++ ISP 7 +++ Sakkaroz ++ Nitrat Agar Glukoz +++ Asparajin Agar Gliserol Nitrat + + + Agar Glukoz Nitrat + + + Agar Nutrient Agar ++ Malt Agar +++ Melanin +++ Formasyon KA11 Gliserol Yeast + Agar ISP 2 + ISP 4 ++ ISP 5 +++ ISP 7 +++ Sakkaroz ++ Nitrat Agar Glukoz ++ Asparajin Agar Gliserol Nitrat + + + Agar Glukoz Nitrat + + + Agar Nutrient Agar + Malt Agar +++ Melanin +++ Formasyon (-) reme yok (+) reme zayf (++) reme iyi (+++) reme ok iyi

Sar-Krem Sar Sar-Krem Sar Krem Beyaz Krem Krem Krem Beyaz Sar-Krem Koyu Krem Beyaz Beyaz Krem Pembe Beyaz Beyaz Beyaz Krem Beyaz Krem-Yeil Koyu Krem

Turuncu Sar Sar Sar Sar Beyaz Beyaz Krem-Kahve Krem-Kahve Ak sar Kahverengi Kahverengi Krem Krem Krem Beyaz Krem Kahverengi Kahverengi Krem Kahverengi Kahverengi

Sar Kahverengi Kahverengi Kahverengi

57

AA33 numaral izolatn 12 farkl besiyerindeki aerial misel, batk misel ve znr pigment rengi incelendiinde ISP 2 ve ISP 5de aerial misel ve batk misel renginin sar olduu, ISP 4de sar, Malt Agar ve Melanin Formasyon Ortamnda kahverengi znr pigment oluturduu saptanmtr. zolatn Gliserol Yeast Agarda batk misel renginin turuncu olduu grlmtr. zolatn 12 besiyerinde 10 farkl renk grubu oluturduu saptanmtr. zolat Gliserol Yeast Agar, Sakkaroz Nitrat Agar ve Nutrient Agar dndaki dier besiyerlerinde ok iyi (+++) reme gsterirken bu besiyerlerinde reme iyi (++) olarak tespit edilmitir. AA32 izolat Gliserol Yeast Agar ve Malt Agarda kahverengi batk misel olutururken ISP 2, ISP 4, ISP 7, ve Nutrient Agarda ise sar renkli batk misel oluturduu belirlenmitir. Ayrca ISP 4de sar, Malt Agarda ise kahverengi znr pigment gzlenmitir. Kullanlan besiyerlerinde 9 farkl renk grubu saptanmtr. zolatn en az reme gsterdii besiyeri ISP 2 olarak tespit edilmitir. KA11 numaral izolatn batk misel rengi ISP 4, ISP 5, ISP 7, Glukoz Asparajin Agar ve Nutrient Agarda krem, Gliserol Nitrat Agar, Glukoz Nitrat Agar ve Malt Agarda kahverengi olarak saptanmtr. ISP 7de aerial misel rengi pembe, Malt Agarda ise krem-yeil olarak tespit edilmitir. zolat hibir besiyerinde znr pigment oluturmamtr. KA11 numaral izolatn 12 besiyerinde 7 farkl renk grubu oluturduu saptanmtr. zolat, Gliserol Yeast Agar, ISP 2 ve Nutrient Agarda zayf reme gsterirken ISP 5, ISP 7, Gliserol Nitrat Agar, Glukoz Nitrat Agar ve Malt Agarda ok iyi reme gzlenmitir. AA32 ve AA33 izolatlarnn ISP 4 ve Malt Agarda oluturduklar znr pigment renklerinin ayn olduu gzlenmitir. Her izolatta Melanin Formasyon Ortamnda aerial misel, batk misel ve difze pigment rengi olarak ayn sonular vermitir (izelge 4.3)

58

4.3 Biyokimyasal ve Fizyolojik zelliklerin ncelenmesi zolatlarn biyokimyasal ve fizyolojik zellikleri saptanm ve elde edilen sonular izelge 4.4- 4.6da belirtilmitir. izelge 4.4 AA32 Nolu zolatn Biyokimyasal ve Fizyolojik zellikler Ortam nhibitrler Kristal viole (0.0001gr) Fenol (0.1gr) Sodyum azid(0.01gr) Sodyum azid (0.02gr) Sodyum klorit %4 Sodyum klorit %7 Sodyum klorit %10 Sodyum klorit %13 Penisilin G inhibisyonu Yetime Scaklklar 10C 27C 37C 45C Karbon kaynaklar kullanm Glukoz Laktoz Sukroz Gliserol nozitol Galaktoz Fruktoz Mannitol C Kaynaksz Azot kaynaklarnn kullanm KNO3 L-Asparagin DL-Alanin L-Tirozin Karakter Ortam Biyokimyasal zellikleri Niasta hidrolizi Lipit hidrolizi Jelatin hidrolizi Katalaz testi Hidrokarbonlarn paralanmas Melanin retimi(ISP 11) Tirozinin paralanmas Antimikrobiyal aktivite + Salmonella enteriditis Klebsiella pneumoniae + + Pseudomonas aeuroginosa ATCC
27853

Karakter + + + + +++ + + + + + + -

Proteus vulgaris
E.coli ATCC 25922

Staphylococcus aureus
ATCC25923

Candida albicans +++ ++ ++ +++ ++ +++ ++ +++ +++ +++ +++ +++

59

L-Histidin L-Glutamin Glisin N Kaynaksz (+) Var (-) Yok

+++ +++ +++ -

izelge 4.5 AA33 Nolu zolatn Biyokimyasal ve Fizyolojik zellikleri Ortam nhibitrler Kristal viole (0.0001gr) Fenol (0.1gr) Sodyum azid(0.01gr) Sodyum azid (0.02gr) Sodyum klorit %4 Sodyum klorit %7 Sodyum klorit %10 Sodyum klorit %13 Penisilin G inhibisyonu Yetime Scaklklar 10C 27C 37C 45C Karbon kaynaklar kullanm Glukoz Laktoz Sukroz Gliserol nozitol Galaktoz Fruktoz Mannitol C Kaynaksz Azot kaynaklarnn kullanm KNO3 L-Asparagin DL-Alanin L-Tirozin L-Histidin Karakter Ortam Biyokimyasal zellikleri Niasta hidrolizi Lipit hidrolizi Jelatin hidrolizi Katalaz testi ++ Hidrokarbonlarn paralanmas Melanin retimi Tirozinin paralanmas Antimikrobiyal aktivite Salmonella enteriditis Klebsiella pneumoniae Pseudomonas aeuroginosa
ATCC 27853

Karakter + + + + + +++ + + + + + + +

+ + -

Proteus vulgaris E.coli


ATCC 25922

Staphylococcus aureus
ATCC25923

Candida +++ ++ ++ +++ ++ +++ ++ +++ +++ +++ +++ + +++

60

L-Glutamin Glisin N-Kaynaksz (+) Var (-) Yok

+++ +++ -

izelge 4.6 KA11 Nolu zolatn Biyokimyasal ve Fizyolojik zellikleri Ortam nhibitrler Kristal viole (0.0001gr) Fenol (0.1gr) Sodyum azid(0.01gr) Sodyum azid (0.02gr) Sodyum klorit %4 Sodyum klorit %7 Sodyum klorit %10 Sodyum klorit %13 Penisilin G inhibisyonu Yetime Scaklklar 10C 27C 37C 45C Karbon kaynaklar kullanm Glukoz Laktoz Sukroz Gliserol nozitol Galaktoz Fruktoz Mannitol C kaynaksz Azot kaynaklarnn kullanm KNO3 L-Asparagin DL-Alanin L-Tirozin L-Histidin L-Glutamin Karakter Ortam Biyokimyasal zellikleri Niasta hidrolizi Lipit hidrolizi Jelatin hidrolizi Katalaz testi Hidrokarbonlarn paralanmas Melanin retimi Tirozinin paralanmas Antimikrobiyal aktivite Salmonella enteriditis Klebsiella pneumoniae Pseudomonas aeuroginosa
ATCC 27853

Karakter + + + + + + + + + + -

+ + -

Proteus vulgaris E.coli


ATCC 25922

Staphylococcus aureus
ATCC25923

Candida albicans +++ ++ ++ +++ +++ +++ + +++ +++ +++ +++ + +++ +++

61

Glisin N Kaynaksz (+) Var (-)

+++ Yok

AA32 numaral izolat penisilin dnda dier btn inhibitr ortamlarda inhibe olmutur. Maksimum reme 27Cde gzlenirken izolatn 37Cde de reyebildii belirlenmitir. Scaklk 10Cye drldnde ve 45Cye karldnda ise reme saptanmamtr. zolat karbon kayna olarak glukoz, galaktoz, mannitol ve gliserol bulunan ortamlarda daha iyi reme gstermitir. Ortama eklenen tm azot kaynaklarnda remenin iyi olduu saptanmtr. zolatn Melanin Formasyon Ortamnda kuvvetli melanin retimi yapt, jelatin hidrolizi dnda tm biyokimyasal aktivitelere sahip olduu ve hidrokarbonlar paralad tespit edilmitir (izelge 4.4). AA33 kristal viole, fenol ve sodyum azidin inhibe ettii saptanmtr. %7 ve zerindeki sodyum klorit konsantrasyonlarnn AA33 izolatnn remesini inhibe ettii ancak %4lk sodyum klorit konsantrasyonunda izolatn reyebildii belirlenmitir. Maksimum reme scakl 27C olarak tespit edilmitir. 37Cde reyebilen izolat scaklk 10Cye drldnde ve 45Cye karldnda reme saptanmamtr. zolatn karbon kayna olarak glukoz, gliserol, galaktoz ve mannitol bulunan ortamlarda, dier karbon kaynaklar bulunan ortamlara gre daha fazla redii tespit edilmitir. L-tirozin dndaki dier azot kaynaklarnda iyi reme gsterdii belirlenmitir. Yaplan testlerde btn biyokimyasal aktivitelere sahip olduu ve kuvvetli melanin rettii saptanmtr (izelge 4.5). KA11i btn inhibitr ortamlarn inhibe ettii belirlenmitir. AA32 ve AA33 izolatlarnda olduu gibi KA11de de 27C ve 37 Cde reme gzlenirken 10C ve 45Cde reme saptanmamtr. zolatn karbon kayna olarak glukoz, gliserol, galaktoz, mannitol ve inozitol bulunan ortamlarda dier karbon kaynaklarna gre daha iyi redii ve fruktozda remenin en az olduu tespit edilmitir. KA11 izolat azot kaynaklarndan sadece L-tirozinli ortamda en az geliim gsterirken azot kayna bulunmayan ortamda reme gzlenmemitir. zolatn, besiyerinde zayf melanin retmi yapt belirlenmitir (izelge 4.6).

62

Her izolatta karbon kayna olarak glukoz, galaktoz, mannitol ve gliserol bulunan ortamlarda iyi geliim gstermilerdir. Azot kaynaklarndan L-tirozini ise sadece AA32 izolat kuvvetli ekilde kullanmtr. Biyokimyasal testlerde melanin retimi kuvvetli olan izolatlar olarak AA32 ve AA33 belirlenirken KA11 izolat zayf melanin retimi gstermitir. Ayrca AA32nin jelatin hidrolizi yapmad saptanmtr. zolatlarn Farkl besiyerlerindeki geliimleri ve hif yaps ekil 4.1-4.12de gsterilmitir.

AA33

AA32

KA11

ekil 4.1 zolatlarn Gliserol Yeast Agar Ortamnda 7 Gnde Geliimi

AA33

AA32

KA11

ekil 4.2 zolatlarn ISP 4 Ortamnda 7 Gnde Geliimi

AA33

AA32

KA11

ekil 4.3 zolatlarn ISP 5 Ortamnda 7 Gnde Geliimi

63

AA33

AA32

KA11

ekil 4.4 zolatlarn Sakaroz Nitrat Agar Ortamnda 7 Gnde Geliimi

AA33

AA32

KA11

ekil 4.5 zolatlarn ISP 7 Ortamnda 7 Gnde Geliimi

AA33

AA32

KA11

ekil 4.6 zolatlarn Glukoz Asparajin Agar Ortamnda 7 Gnde Geliimi

AA33

AA32

KA11

ekil 4.7 zolatlarn Gliserol Nitrat Agar Ortamnda 7 Gnde Geliimi

64

AA33

AA32

KA11

ekil 4.8 zolatlarn Glukoz Nitrat Agar Ortamnda 7 Gnde Geliimi

AA33

AA32

KA11

ekil 4.9 zolatlarn Nutrien Agar Ortamnda 7 Gnde Geliimi

AA33

AA32

KA11

ekil 4.10 zolatlarn Malt Agar Ortamnda 7 Gnde Geliim

AA33

AA32

KA11

ekil 4.11 zolatlarn Melanin Formasyon Ortam Ortamnda 7 Gnde Geliimi

65

AA33

AA32 ekil 4.12 zolatlarn Spor Zincir Morfolojisi

KA11

zolatlarn hifa yaps dallanm, septasz olarak belirlenmi ayrca sporlarn oval olduu saptanmtr. 4.4 Fermantasyonla Antimikrobiyal Etkili Molekllerin retimi Fermantasyon sresince AA32 ve AA33n antimikrobiyal etkili molekllerinin belirlenmesinde test organizmalar olarak Staphylococcus aureus ATCC 25923 ve Esherichia coli ATCC 25922 kullanlmtr. Alt gn sresince llen zon aplar izelge 4.7 ve 4.8de verilmitir. zolatlarn ya arlklar ise besiyeri Gliserol Yeast Broth (Fermentasyon ortam 1), ISP 2 (Fermentasyon ortam 2) ve Fermantaston Ortam Ada (FOA) yedi gn boyunca gnde iki kez belirli aralklarla llm olup sonular izelge 4.9, 4.10da ve grafik 4.1 ve 4.2de verilmitir.

66

izelge 4.7 AA32 ve AA33 Numaral zolatlarn Farkl Besiyeri Ortamlarnda Antibiyotik retimi (Zon ap mm) (Staphylococcus aureus)
SAAT Ortam

20

24

43

48

67

72

91

96

115

120

139

144

ZOLAT AA32 GYB FOA GYB FOA 20 16 12 20 12 17 15 23 14 18 16 24 15 18 16 25 18 19 17 25 13 20 13 24 13 21 10 24 12 21 24 11 20 18 10 18 16 17 15 15

ZOLAT AA33

GYB; Gliseol Yeast Broth, FOA; Fermantasyon Ortam A

Staphylococcus aureus ile yaplan denemelerde AA32 ve AA33 numaral izolatlarda antimikrobiyal madde retimi Fermantasyon Ortam Ada 20.saatte balarken Gliserol Yeast Brothda ise 24. saatte balamtr. AA32 numaral izolatn en yksek inhibisyon zonu Fermantasyon Ortam Ada 67.ve 72.saatlerde 25 mm ve AA33 numaral izolatta ise Fermantasyon Ortam Ada 91. ve 96.saatlerde 21 mm olarak llmtr (izelge 4.7). izelge 4.8 AA32 ve AA33 Numaral zolatlarn Farkl Besiyeri Ortamlarnda Antibiyotik retimi (Zon ap mm) (Esherichia coli) SAAT Ortam ZOLAT AA32 GYA FOA GYA FOA 12 12 18 15 13 17 18 18 14 17 19 19 12 18 21 20 11 18 16 23 9 23 13 25 5 26 11 24 30 21 25 21 11 10 20 5 11 0 20 24 43 48 67 72 91 96 115 120 139 144

ZOLAT AA33

67

Test organizmas olarak Esherichia coli kullanlan deneylerde her iki izolattada antimikrobiyal madde retimi Fermantasyon Ortam Ada 20.saatte, Gliserol Yeast Brothda ise 24.saatte balamtr. En yksek inhibisyon zonu AA32 numaral izolatta Fermantasyon Ortam Ada 91.saatte 25mm olarak ve AA33 numaral izolatta ise Fermantasyon Ortam Ada 96. saatte 30mm olarak llmtr (izelge 4.8). izelge 4.9 Farkl Besiyeri Ortamlarnda 32 Numaral zolatn Ya Arlk lmleri (gr/100ml)

FO1(GYB) Zaman(Saat) 21 27 35 41 59 65 83 89 107 113 0.40 0.59 1.18 1.70 2.08 2.00 1.73 1.28 1.00 0.05

FO2 (ISP 2) 0.15 0.23 0.54 0.77 0.92 0.94 0.37 0.34 0.32 0.32

FOA 0.15 0.39 1.27 1.45 2.23 3.32 3.28 2.24 2.00 1.99

FOA; Fermantasyon Ortam A, FO1; Gliserol Yeast Broth FO2; ISP 2

68

Farkl besi ortamlarnda 32 nolu izolatn byme erisi 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 0 20 40 60 80 100 120 nkbasyon sresi izelge 4.10 Farkl Besiyeri Ortamlarnda 32 Numaral zolatn Byme Erisi izelge 4.11 Farkl Besiyeri Ortamlarnda 33 Numaral zolatn Ya Arlk lmleri (gr/100ml)

Zaman(Saat) 21 27 35 41 59 65 83 89 107 113

Ya arlk

FOA GYB ISP2

FO1 (GYB) 0.19 0.35 0.77 0.93 1.49 1.75 1.15 0.75 0.38 0.35

FO2 (ISP 2) 0.26 0.35 0.74 0.76 1.14 0.89 0.16 0.07 0.06 0.05

FOA 0.11 0.44 1.65 1.95 2.74 3.32 2.74 2.55 2.43 2.34

69

Farkl besi ortamlarnda 33 nolu izolatn byme erisi 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 0 20 40 60 80 100 120 nkbasyon sresi izelge 4.12 Farkl Besiyeri Ortamlarnda 33 Numaral zolatn Byme Erisi Ya arlk tayininde AA32 numaral izolat iin en yksek deer FOAda 3.32 g/100 ml ile 65.saatte, AA33 numaral izolat iin ise FOAda 3.32 g/100ml ile yine 65.saatte llmtr. Arlk art en ok FOAda tespit edilmitir. Her iki su iin en az arlk art FO2de grlmtr (izelge 4.9, 4.10). 4.5 Antimikrobiyal Etkili Aktif Molekllerin zolasyonlar Fermantasyon Ortam Ada hazrlanan fermantasyon ortam sonucunda izolatlarn rettii antimikrobiyal etkili aktif molekln ekstraksiyonu 3 farkl solvent ile yaplm ve antimikrobiyal aktivite Candida albicans, Esherichia coli ATCC 25922 ve Staphylococcus aureus ATCC 25923 test organizmalar kullanlarak zon aplar llmtr. Sonular izelge 4.11de verilmitir.

Ya arlk

FOA GYB ISP2

70

izelge 4.13 AA32 ve AA33 Numaral zolatlarn Farkl zgenlerle Ekstraksiyonu (mm inhibisyon zon ap)

Esherichia coli ATCC 25922

Staphylococcus aureus ATCC 25923

Candida albicans

Test organizmas

zc ZOLAT AA32 Metilen Klorid Butanol Hegzan Metilen Klorid Butanol Hegzan 10 12 11 6 9 ZOLAT AA33 9 9 -

Elde edilen ekstraktlar en iyi su ve DMSOda (Dimetil slfoksit) zlmtr. Ham ekstrakt n-Butanol: Asetik Asit: Su (6:2:2) solvent sistemi kullanlarak ince tabaka kromatografisinde muamele edilmitir. zolatlar TLC de yrtldkten sonra ninhidrin pskrtlmesi sonucunda AA32 numaral izolatta be bant belirlenirken AA33 numaral izolatta 4 bant tespit edilmitir. farkl zcden elde edilen ekstraktlardan oluan bantlar ekil 4.13.de gsterilmi ve bantlar sefotaksim ile karlatrlmtr (ekil 4.15)

71

AA32

AA33

Sefotaksim AA32

Y32

Y33

ekil 4.13 zolatlarn TLC de Oluan Grntleri


Yrtlp Ninhidrin Pskrtlmesiyle Gzlenen Bantlar ve Sefotaksimle karlatrlmas, ift Ynl Yrtme(Y) (M: Metilen klorid, H: Hegzan ve B: n-Butanol ).

TLCde bantlar grnr hale getirildikten sonra Rf deerleri hesaplanmtr. AA32 izolatnn 3.band ile AA33 numaral izolatn 2. band ve AA32nin 5. band ile AA33n 4. bandnn Rf deerleri ayn kmtr. zolatlarn antimikrobiyal etkili moleklnn tespiti iin biyootogramlar yaplmtr. Test organizmas olarak Staphylococcus aureus ATCC 25923 kullanlm olup AA32 numaral izolatta bir, AA33 numaral izolatta ise 2 blge tespit edilmitir. Bu blgelerin Rf deerleri hesaplanm zolat AA32de biyootogram sonucunda zon oluumu 5.bant (Rf= 0.527) etrafnda, zolat AA33de ise 3. (Rf gzlenmitir (ekil 4.14).
=

0.487) ve 4. bantlar (Rf= 0.527) etrafnda

AA33

AA32

ekil 4.14 Biyootogram Sonucu Oluan Zon Alanlar

72

ekilde grlen pembe alanlar, test organizmas zerine izolatlarn yrtlm olduu TLC plaklar yerletirildikten sonra 24 saatlik inkbasyon sonucunda MTT iz tuzlar solsyonu spreylenmesinden birka dakika sonra canl kalan test organizmasnn bulunduu alanlar gstermektedir. AA32 numaral izolatn, antimikrobiyal aktivitesi olduu dnlen 5. band kaznarak kolon kromatografisi sonucu toplanan fraksiyonlarla karlatrma yapmak iin +4Cde saklanmtr. Kaznan bant ile AA32 numaral izolatn ham ekstrakt tplere alnp 1er ml distile suda zlp santrifj edildikten sonra UV spektrofotometrede lmleri yaplmtr. AA32 numaral izolatn kolon kromatografisi yaplm ve 1.5 mllik tplerle 52 fraksiyon toplanmtr. Toplanan tm fraksiyonlarn UV spektrofotometrede lmleri yaplm, ham ekstrakt ve bantla lmler karlatrlmtr. kan sonular neticesinde 4-10 aras fraksiyonlarn disk difzyon yntemiyle antimikrobiyal aktivitelerine baklm ve hepsinde zon oluumu gzlenmitir (ekil 4.15).

ekil 4.15. 4-10 Aras Fraksiyonlarn Oluturduu Antimikrobiyal Etki (Staphylococcus aureus ATCC 25923)

73

izelge 4.14 zolatlarn UV Spektrum ve Rf Deerleri Ham Ekstrakt Rf UV Rf TLC UV Rf UV 6.Fraksiyon

0.179 284 0.230 254 AA32 0.307 245 0.408 211 0.527 0.527 284 254 216 0.256 282 0.307 262 . AA33 0.487 0.527 282 254 282 256 208 0.527 286 254

6.Fraksiyon

5.Bant

AA32 Ham madde

ekil 4.16 Ham Madde, Kaznt Bant ve Kolon kromatografisi Sonucu Elde Edilen Maddelerin Pik Deerleri

74

almamzda sefotaksimin UV deeri 254 olarak tespit edilmi olup etken maddemiz ile benzerlik gstermitir. Ancak sefotaksimin molekl arl 455.47 gr/mol iken izolat AA32den elde edilen etken maddenin ise 467.89 gr/mol olduu belirlenmitir

75

5. TARTIMA VE SONU Actinomycetler aminoglukozid, makrolit, -laktam, polien, polieter, tetrasiklin gibi eitli antibiyotik gruplarnn retiminde kullanlrlar (Gupte et al. 2002). Antibiyotiklerin bilinsiz kullanm sonucunda oul direnli izolatlarn ortaya kmas ve yeni patojen organizmalarn belirlenmesi, antibiyotik trevlerinin kefini zorunlu hale getirmektedir. Gnmzde yeni antibiyotikler iin yaplan aratrmalar bakteri, Actinomycet, Streptomyces, fungus ve alglerin sekonder metabolitlerinin antimikrobiyal etkisinin incelenmesi zerine younlamtr. zellikle toprak mikroorganizmas olarak bilinen Actinomycetler antimikrobiyal madde retiminde ilk sray almalar ile yeni antimikrobiyal maddelerin belirlenmesi almalarnda temel mikroorganizmalar olmulardr. Nakhimovskaia (1937) topraktan izole ettii 80 Actinomycet kltrnde yapt almada 47 tanesinin antogonistik, 27 tanesinin ise aktif madde rettiini ve bunlarn Gram pozitif bakteriler zerinde etkili olduunu saptamtr. Linder ve Wallhauser (1955) 2500 Streptomyces kltrnn %77sinin Gram pozitif bakterilere %40nn gram negatif bakterilere, %32sinin Mycobacterium ve %18nin de funguslara etkili olduunu bildirmilerdir. En iyi antifungal aktivite ise Saccharothrix sp.lerde grlmtr. Saccharothrix trlerinin Nocardiopsis genusundan gram pozitiflere kar daha fazla antimikrobiyal aktivite gsterdii birok aratrmac tarafndan bildirilmi olmasna karn (Horvath 1954, Isshiki et al.1989, Takeuchi 1992, Wank et al. 2001) gram negatif ve funguslara kar antimikrobiyal etki nadir olarak bildirilmitir (Lamari et al. 2002). Ouhdouch et al. (2002) Moroccandan 320 Actinomycet suu izole etmiler ve 32 izolatn yksek antimikrobiyal etki gsterdiini saptamlardr. ahin ve Uur (2003) 74 Streptomyces izolatnn %45.9unda antimikrobiyal aktivite olduunu saptamtr. zellikle 50 izolat koaglaz (-) Staphlococcus (CoNS) lara kar kuvvetli antimikrobiyal etki gstermitir. 5 izolat ise CoNS ve mayalara kar inhibisyon zonu 20mm zerinde olan ok kuvvetli antimikrobiyal etki gstermitir (ahin ve Uur 2003).

76

almamzda benzer olarak, topraktan izole edilen toplam 52 farkl Actinomycet izolatnn 29unda (%55.7) antimikrobiyal aktivite gzlenmitir. zolatlarn %44.2si Gram pozitif, %46.1i Gram negatif bakterilere, %9.62s C. albicansa ve %9.6snn ise her ne kar etkili olduu saptanmtr. Ayrca izolatlar %44.2 ile en fazla Staphylococcus aureus ATCC 25923e etkili olmu ve bunu Salmonella enteriditis (%23), Pseudomonas aeuroginosa ATCC 27853 (%23), E.coli (%19.2), C.albicans (% 9.6), Klebsiella pneumoniae (%7.6) ve Proteus vulgaris (%3.8) takip etmitir. Kuzey Kanada topraklarndan izole edilen 600 Actinomycetin antibiyotik aktivitesi zerine yaplan almada izole edilen kltrlerin %47sinin S.aureus, %8.2sinin E.coli, %19.5inin M.tuberculosis zerine etkili olduu saptanmtr (Waksman 1967). Baka bir almada Actinomycet izolatlarnn %44.5inde antimikrobiyal etki bulunmu ve bunlardan 9u Bortrytis cinerea, Herpes simplex, Candida albicans ve Staphylococcus epidermise kar ok yksek antimikrobiyal etki gstermitir (Slavica et al. 2005). Zitouni et al. (2005) Actinomycet izolatlar ile yapt almada Saccharothrix izolatlarnn Gram pozitif bakterilerden Mycobacterium luteusa, mayalardan S. cerevisiae ve funguslardan M. ramannianusa kar gl antimikrobiyal aktivite gsterdiini; gram negatif bakterilerden E. coli ve P. fluorescense kar ise zayf antimikrobiyal aktivite gsterdiini saptamtr. Ayn almada Nocardiopsis izolatlarnn ise M. luteusa kar kuvvetli antimikrobiyal aktivite gsterdii ve bu grupta yer alan sularn M. ramannianusa kar antifungal aktivitelerinin zayf ve kuvvetli etki gsterenler olmak zere balca iki gruba ayrldn saptamlardr. Bu almada, en fazla antimikrobiyal etki gsteren izolatlardan AA33, test mikroorganizmalarndan sadece Salmonella enteriditis ATCC 25923n, AA32 Salmonella enteriditis ve Candida albicansn remesini inhibe edememektedir. zolat KA11 ise sadece Pseudomonas aeurouginosa ATCC 27853, Salmonella enteriditis ATCC 25923 ve E.coli ATCC 25922 nin remesini inhibe etmitir. Birok Actinomycet trnn renk verici maddeler ve pigmentler rettii bilinmektedir. Bu nedenle kltrlerdeki kolonilerin ve aerial hifalarn renkleri birbirlerinden farkldr.

77

Koloni rengi mavi, meneke moru, portakal rengi, krmz, pembe, sar, yeil, gri, siyah vb. olabilir. Genellikle krmz pigment reten trler ipliksi miselyal yap ve kre eklindeki klamidosporlar ile karakteristiktir. Streptomisin reten izolatlarn fermantasyon kltrlerinde rengin yeilimsi, koyu yeil ve bazen de pembemsi ve pembemsi gri-kahverengi olduu gzlenmitir (Krasilnikov,1959). Zitouni et al. (2005) kemotaksonomik ve kltrel zelliklerine gre (znebilir pigment, aerial misel ve substrat misel rengi) 86 izolat 12 grupta toplamlardr. almamzda izole edilen 52 Actinomycet izolatnn, aerial misel renginin koyu gri, gri, yeil, sar, sar-krem, pembe, pembe-krem, krem, turuncu-gri, mor ve beyaz olduu grlmtr. Actinomycet izolatlarnn pigment oluturmas kltrel ve fizyolojik koullara gre deimektedir. Kraslnkov (1959) Actinomyces albus, A. vulgaris, A. levoris, A. griseusun protein ieren besiyerinde (Meat-pepton agar vb.) pigment oluturmadn, A. coelicolor, Actinomyces cyaneus, A. violaceus ve A. ruberde ise oksijensiz ortamda pigmentasyon gzlenmediini, dolaysyla besiyerindeki karbon ve azot kaynann pigment geliiminde dorudan etkili olduunu bildirmitir. Nitrojen kayna olarak asparajin kullanldnda A.cyaneus renksiz, pepton kullanldnda ise mavi-gri renktedir. A.violaceus ise asparajinli besiyerinde meneke moru, peptonlu besiyerinde ak krmz- meneke moru renk verir. Actinomyces viridochromogenes asparajinli ortamda ak yeil, peptonlu ortamda ise gri-kahverengi-yeildir. almamzda antimikrobiyal aktivitesi olduu saptanan KA11 izolatnn peptonlu ortamda krem-yeil, tirozin ieren ortamda ise pembe renk verdii gzlenmitir. Bhattacharyya et al. (1998) fermantasyon ile Streptomyceslerden antimikrobiyal madde retiminde nitrojen kayna olarak arjinin kullanldnda en iyi verimin alndn arjinini asparajin, amonyum nitrat, amonyum slfat ve sodyum nitratn takip ettiini bildirmilerdir. Baka bir almada ise S.fraiaeden sentetik ortamda neomisin retimi iin en iyi azot kaynaklarnn sodyum nitrat, - alanin, L-aspartik asit, L-histidin, L-

78

prolin ve DL-treonin oluunu amonyum tuzlar ve dier aminoasitlerin neomisin retimini desteklemediini gstermilerdir (Dulmage 1952). Antimikrobiyal aktivite gsteren izolatmzda KNO3, L-asparajin, DL-alanin, Lglutamin, ve glisin bulunan ortamlarda kuvvetli reme gsterirken, AA32 hari Ltirozin bulunan ortamda remenin dier azot kaynaklarna gre daha zayf olduu gzlenmitir. Azot kaynann yan sra ortamdaki karbon kayna da pigmentasyon ve antimikrobiyal madde retimini etkilemektedir. Karbon kayna olarak glukoz ieren ortamda A. cyaneus renksiz iken, sukroz bulunan ortamda koyu mavi, niastal ortamda grimsi mavi, sodyum asetatl ortamda ise kltr renksizdir. Hobbs et al.(1990) S.coelicolor tarafndan aktinorhodin retiminde fermantasyon ortamnda arjinin (0.75gr/l) ve gliserol (11.5gr/l) bulunmasnn antibiyotik retimini tevik ettiini, Legator ve Gottlieb (1953) ise S.venezuelladan kloramfenikol eldesinde ortama %1 gliserol katlmasnn etkili olduunu bildirilmilerdir. Bhattacharyya et al. (1998) nitrojen kayna olarak arjinin, karbon kayna olarak gliserol kullandklarnda Streptomyces hygroscopicusdan maksimum antibiyotik elde etmilerdir. Dulmage (1952) karbon kayna olarak gliseroln kullanld sentetik ortamlarda neomisin sentezinin arttn bildirmitir. almamzda karbon kayna olarak inozitoln kullanld ortamda KA11in dier izolatlara oranla daha iyi redii, fruktoz bulunan ortamda ise remenin dier izolatlardan daha zayf olduu tespit edilmitir. izolatta karbon kayna bulunmayan ortamda gelime gstermemitir. Karbon kayna olarak gliserol, azot kayna olarak pepton kullanlan besiyerinde AA33 izolatnn batk misel rengi turuncuya, AA32nin ise kahverengiye dnt gzlenmitir. Bunun yan sra karbon kayna olarak maltoz, azot kayna olarak da pepton ilave ettiimiz besi ortamnda izolatnda batk misel renginin kahverengi olduu ve karbon kayna olarak gliserol, azot kayna olarak amonyum slfat ilave ettiimizde ise AA32 ve AA33de batk misel rengi sar, KA11de ise beyaz olarak tespit edilmitir.

79

Dastager et al. (2006) melanin retiminin Streptomyceslerin snflandrlmasnda anahtar rol oynadn, farkl karbon ve nitrojen kaynaklarnn melanin pigmentinin oluumunu etkilediini ve niastann melanin retiminde en etkili karbon kayna olduunu bunu, gliserol ve fruktozun takip ettiini saptamlardr. Ayn zamanda aratrmaclar strain DAS139da miselyal geliimin az olmasna ramen melanin pigmenti retiminin iyi olduunu, substrat olarak L-tirozin veya L-dopa kullanlarak melanin retim testinin yaplmasnn Streptomyceslerin identifikasyonunda ve klasifikasyonunda yararl olacan bildirmilerdir. almamzda melanin pigmenti oluumu Melanin Formasyon Ortam kullanlarak belirlenmitir. Benzer olarak L-tirozin ieren bu ortamda izolattada melanin pigmenti olumu ancak KA11de pigmentasyon dier izolatlara gre daha zayf olmutur. Kraslnkov (1959), dk scakln (10-15oC) gelime ve pigmentasyonu olumsuz ynde etkiledii, pigment oluumunun 25-30oC civarnda artt fakat daha yksek scaklklarda (37-40oC) termofilik Actinomycetler haricindeki hibir trn pigmentasyon gstermediini bildirmitir (Kraslnkov 1959). almamzda en fazla antimikrobiyal etki gsteren 3 izolatn optimum scaklk isteklerinin 27C ile 37C arasnda olduu ve bu scaklk aralnda pigment oluturduu, 10C ve 45C scaklklarda remedikleri gzlenmitir. Kltrel zelliklerin yan sra biyokimyasal ve fizyolojik zelliklerde Streptomyceslerin identifikasyonunda kullanlan kriterler arasndadr. Bu almada AA33 numaral izolat, ierisinde % 4lk sodyum klorit bulunan ortamda olduka iyi geliim gstermesi, AA32 ise jelatini hidroliz etmemesi ile dier izolatlardan farkllk gstermitir. KA11 ve AA32 izolatlar inhibitr bulunan ortamda gelime gstermemitir. Ayrca; AA33 ve KA11in penisilin Gye duyarl, AA32 nin ise direnli olduu bulunmutur.

80

Ouhdoucha et al. (2001) mezofilik Streptomyces izolatlarnn antibiyotik retiminde baskn olduunu ve genellikle 27C civarnda antibiyotik rettiklerini bildirmilerdir. Benzer olarak bu almamzda antimikrobiyal etkinliklerinin en fazla olduunu saptadmz izolatlar mezofilik Actinomycet izolatlar olup, fermantasyon denemelerinde 28C inkbasyon scakl olarak kullanlmtr. Denizci (1996) drt farkl Streptomyces izolatnda yapt almada farkl besiyerleri kullanarak fermantasyon ortamnda antibiyotik retiminin 16. saatte baladn ve 7296. saatleri arasnda inhibisyon zonunun en yksek dzeye ulatn saptamtr. Zitouni (2005) ise fermantasyon ortamnda antibiyotik retiminin 2. gn baladn 4. gn maksimuma ulatn bildirmitir. almamzda AA32 ve AA33 izolatlarnn Fermantasyon Ortam Ada remeleri ve antimikrobiyal madde retimleri dier fermantasyon ortamlarna gre daha iyi olduu iin antimikrobiyal madde ekstraksiyonunda bu ortam kullanlmtr. Staphylococcus aureus ATCC 25923e kar AA32 ve AA33n antimikrobiyal madde retimi Fermantasyon Ortam A'da 20.saatte balad; Gliserol Yeast Brothda (Fermantaston Ortam 1) ise 24. saatte balad saptanmtr. AA32de en yksek inhibisyon zonu Fermantasyon Ortam Ada 67.ve 72. saatlerde 25 mm ve AA33de ise Fermantasyon Ortam Ada 91. ve 96.saatte 21 mm olarak llmtr. Test organizmas olarak Esherichia coli ATCC 25922ye kar antimikrobiyal madde retimi Fermantasyon Ortam Ada 20.saatte, Gliserol Yeast Brothda ise 24.saatte balamtr. En yksek inhibisyon zonu AA32 suunda Fermantasyon Ortam Ada 91.saatte 25 mm olarak ve AA33de ise Fermantasyon Ortam Ada 96. saatte 30 mm olarak llmtr. Denizci (1996) etken madde ekstraksiyonu iin en iyi solventin metilen klorit olduunu bunu n-butanoln izlediini bildirmitir. Zitouni (2005) Solvent ekstraksiyonunda butanol ve metilen klorit kullandnda, elde ettii ham madde antimikrobiyal etki gstermi, hegzan kullandnda ise etki gstermemitir. Dier bir almada antimikrobiyal etki gsteren ham madde iin en iyi solventin n butanol olduu ve bu bileiin renksiz olup, suda ve DMSOda (Dimetil slfoksit) zndn fakat metanol, n-butanol, etilasetat, 1-propanol, 2-propanol, etanol, asetonitril, diklora metan,

81

n-hegzan, aseton, kloroform ve toluende znmedii bildirilmitir. Genel olarak iyonik bileikler solvent ekstraksiyonu sonucunda suda iyonik olmayan bileiklerden daha iyi znmektedirler ( Calton et al.1986). almamzda hegzan nonpolar, metilenklorit zayf polar, n-butanol ise yksek polar yapda olup, bileiklerin ekstraksiyonu iin kullanlmtr. Metilen klorit ile n-butanol ekstratlarndan elde edilen ham maddelerin antimikrobiyal etki gsterdii saptanmtr. AA33 ve AA32den elde edilen ham maddeler iin en iyi solvent su olup bunu DMSO takip etmitir. Aseton, metanol, kloroform, hegzan, butanol de ise ham madde znmemitir. Suda znebilen maddeler polar bantlar ierirler. Polaritesi en fazla olan bantlar O-H tr bunu N-H ve C-H izler. Ekstraktmzn su gibi polar zcde ok iyi znmesi, ekstraktmzda O-H ve N-H gruplarnn varln gstermektedir. Bush et al.(1993) iki Streptomyces izolatndan elde ettii antimikrobiyal maddenin UV visible spektrada maksimum pik deerlerinin 263 ve 266 nm olduunu saptanmlardr. Bu deerlerden yola karak etken maddenin aromatik halka ierdiini bildirmilerdir. Aromatik halka (N-H ve C=N ) serbest amin ve karbonil (C=O) ieren heterosiklik bir yapdr. Nkleosit ve nkleotid antibiyotkleri asidik zincir ve fosfat gruplar ile bal yaplardr. Renksiz olup suda znrler. Maksimum UV- visible spektralar genelde 260-270 nm arasndadr. Bu antibiyotikler genellikle Streptomyces trleri tarafndan retilirler. Saccharothrix trleri tarafndan retilen tek nkleosit antibiyotik vardr. Fakat bu antibiyotiin antifungal aktivitesi yoktur ve herbisidal aktiviteye sahiptir. Taddei et al.(2006) Actinomycet izolatlarndaki sekonder metabolitlerin belirlenmesinde 2D TLC uygulamasnn basit ve gvenilir olduunu bildirmilerdir. Swaadoun ve ark. (1999) Sudan izole ettikleri Actinomycetlerden polyen tabiatnda, 215-270 nmde maksimum absorbsiyon gsteren antibiyotik elde etiklerini bildirmilerdir. Ouhdoucha et al.(2002) Actinomycetlerden elde ettii etken maddenin UV 410-250-380-290 nmde maksimum absorbans gsterdiini ve nonpolyenik antibiyotik olduunu saptamlardr. ahin ve Uur (2003) CoNS ve mayalara kar antimikrobiyal etki gsteren Actinomycet izolatlarndan elde ettii ham ekstraktn UV

82

spekturumunu 212 ve 260 nm, TLC plaklarnda aktif blgenin Rf deerlerini 0.60 ve 0.80 olarak belirlemitir. Augustine et al.(2005) ise Streptomyces albidoflavusdan antifungal aktiviteye sahip nonpolyen antibiyotik elde etmi ve bu etken maddenin 211, 216 ve 218 nmde UV spektrada maksimum absorbans gsterdiini ve bu maddenin karbon atomlar arasnda ift ba olduunu belirtmilerdir. Saf bileiin suda zndn fakat hamisin gibi standart antifungal antibiyotiklerin suda znmediini ayn zamanda nistatin, amfoterisin gibi standart polyen antifungal antibiyotiklerin UV spekturumunun, elde ettii nonpolar antimikrobiyal maddeden farkl olduunu bildirmitir Zitouni (2005) Actinomycetten elde ettii ham maddeyi, solvent sistem olarak nbutanol-asetik asit-su (3:1:1) kullanarak TLC plaklarnda yrtm ve ninhidrin ile spreyleyerek Rf deeri 0.07 olan tek bir bant elde etmitir. Ninhidrin serbest amin gruplar baka bir deyile aktif maddenin peptit yapsnda olup olmadn belirlemek iin kullanlmtr. Srbistandan izole edilen 20 farkl Streptomyces izolat ile yaplan bir almada izolatlarn invitro olarak gram pozitif, gram negatif ve mayalara kar etkileri aratrlm aktif izolatlarn kltr ekstraktlarnn UV spekturumu 221 ve 240 nmde maksimum absorbans gstermitir. TLC plaklarnda aktif blgeler Rf 0.70 ve 0.88 ve aktif bileiin metanolde UV spekturumu 217 ve 221nm olarak belirlenmitir (Slavica et al.2005). Bu almada elde edilen ham ekstre iin en iyi sistemin n-butanol:asetik asit:su (6:2:2) olduu belirlenmitir. TLC plaklarna ninhidrin pskrtlerek bant oluumu gzlenmitir. AA32 numaral izolatta be (0.179, 0.230, 0.307, 0.408 ve 0.527), AA33 numaral izolatta drt bant (0.256, 0.307, 0.487, 0.527) tespit edilmitir (ekil 4.15). Biyootogram sonucunda AA32 numaral izolattan elde edilen ham maddede bir, AA33 numaral izolattan elde edilen ham maddede ise 2 zon oluumu grlmtr. Bu blgelerin Rf deerleri AA32de 0.527, AA33de ise 0.527 ve 0.487 olarak belirlenmitir. Etken maddenin UV spekturumlarnn AA32de 284, 254 ve 216 olduu bu deerlerin AA33deki 4. bandn UV deerlerine benzedii ancak AA33 deki Rf

83

deeri 0.487 olan bandn UV deerlerinin (282, 254) farkl olduu tespit edilmitir. Antimikrobiyal etki gsteren maddelerin ninhidrin ile saptanmas etken maddelerin amin grubu ierdiini gstermitir. Sonu olarak AA32 numaral izolatta bir, AA33 numaral izolatta ise iki antimikrobiyal madde olduu ve antimikrobiyal etkisi olduu saptanan AA32 deki 5. bant ile AA33 deki 4. bantlarn benzer maddeler olabilecei dnlmtr. Daha nceki almalarla karlatrldnda, UV spektrumlarnn 260 nm civarnda olmas antimikrobiyal zellik gsteren maddelerin aromatik yapda ya da polyen tabiatnda olabileceini gstermektedir. Zitouni (2005) Actinomycetlerden elde ettii ham ekstreyi kolon kromatografsi ile ayrtrm (5ml her bir tp) 6 ile 11. fraksiyonlar arasnda antifungal aktiviteye sahip ham maddenin bulunduunu gstermitir. almamzda ham ekstrenin kolon kromatografisi sonucunda (1.5 ml her bir tp) 4-10. fraksiyonlar arasnda antimikrobiyal aktivite tespit edilmi ve UV deerleri, TLC zerinden kaznarak okunan deerlerle benzer bulunmutur. almamzda kontrol olarak kullanlan sefotaksimin TLC deki Rf deeri 0.513 olup, hem izolat AA32 hemde AA33de antimikrobiyal aktiviteye sahip olduu saptanan ve Rf deeri 0.527 olan madde ile benzerlik gstermektedir. Barbarin and Tilquinin (2001) yapt almada sefotaksimlerin 256 nm civarlarnda pik verdii bununda sephem halkasndan kaynakland bildirilmitir. almamzda sefotaksimin UV deeri 254 nm olarak tespit edilmi olup etken maddemiz ile benzerlik gstermitir. Ancak sefotaksimin molekl arl 455.47 gr/mol iken izolat AA32den elde edilen etken maddenin ise 467.89 gr/mol olduu belirlenmitir. Sonu olarak; antimikrobiyal etkisi olduunu belirlediimiz madde O-H bakmndan zengin, amin gruplar ieren, molekl arl 467.89 gr/mol, Rf deeri 0.527, Maksimum UV spektrumu 254 nm olan polar yapya sahip bir bileiktir. Sefalosporine olan benzerlii ve UV spektra deerleri etken maddenin aromatik yapda yada polyen

84

tabiatnda olabileceini gstermektedir. Ancak NMR, MS, nfrared UV vb. teknikler kullanlarak maddenin molekl yapsnn tanmlanmas gereklidir. Farkl habitatlardaki Actinomycet sular ve bunlarn metabolitlerinin aratrlmas yeni antimikrobiyal maddelerin kefi iin gereklidir (Ouhdouch et al.2001). in ve Avusturalyada farkl habitatlardan Actinomycet izole edilerek antimikrobiyal aktiviteleri aratrlmtr (Okazaki and Naito1986, Nolan et al.1988,). Ancak corafik konumu gz nne alndnda ok farkl habitatlara sahip olan lkemizde, Actinomycet sekonder metabolitleri ile ilgili almalar metabolitin kimyasal yapsnn tam olarak ortaya konulamamas ile snrl kalmaktadr. Bu nedenle bundan sonraki almalar aktif bileiin yapsnn belirlenmesi zerine younlamaldr.

85

KAYNAKLAR Aktulu, Y., 1997, stanbul niversitesi Cerahpaa Tp Fakltesi Srekli Tp Eitimi Etkinlikleri Pratikte Antibiyotik Kullanm Sempozyumu 2-3 Mays , stanbul, 11-25. Arai, T., Kuroda, S& Mikami, Y., 1976, Classification of Actinomycetes with Reference to Antibiotics Production In Actinomycetes. The Boundary Microorganisms. 543-651. Ed. by. T. Arai, Toppan Company Limited, TokyoSingapor. Augustine, S. K., Bhavsar, S.P., and Kapandis, B.P., 2005, A non-polyene antifungal antibiotic from Streptomyces albidoflavus. PU 23 J. Biosci Vol.30, pp. 201211. Barbarin N.,and Tilquin B., 2001, Study of nonvolatile degradation compounds produced by radiosterilization of cefotaxime. Radiation Physics and Chemistry Vol. 60, pp. 359367. Berdy J., 1974, Recent developments in antibiotic research and claaification of antibiotics according to chemical structure. Adv. Appl. Microbiol., Vol.18, pp.309-406. Berdy, J., 1986, Further antibiotics with practical application. In Biotechnology Vol, 4, pp. 487-505. Ed. by H. Pape & H.J. Rhem,VCH Verlag, Weinheim. Bilgehan, H., 1995, Klinik Mikrobiyolojik Tan. Faklteler Kitapevi Bar Yaynlar 465-474. Bhattacharyya, B.K., Sushil C.P., Sukanta K.S., 1998, Antibiotic production by Streptomyces hygroscopicus D1.5: Cultural Effect. Revista de Microbiologia Rev. Microbiol.Vol. 29, pp.1-6.

86

Boucher. I., Dupuy. A., Vidal P., 1992, Purification and characterization of a chitosanese from Streptomyces N174. Applied and microbiology Biotechnology springer-verlog Vol. 38, pp. 188-193. Brown, J.C., 1958, Soil fungi of Some British sand dunes in relation to soil type and succession. Ecology Vol. 46, pp. 641-664. Bush, B.D., G.V. Fitchett, D.A., Gates, D. Langely, 1993, Carbocyclic nucleosides from a species of Saccharothrix. Phytochemistry Vol. 32, pp. 737739. Carlton, J.G., Carrington, S.C., and Hamman, J. P., 1986, Product Recovery. In Manual Industrial Microbiology and Biotechnology. 436-447. American Society for Microbiology. Washington D.C. Chater K.F.,1998, Taking a genetic scalped to the Streptomyces colony. Microbiology Vol. 114, pp.1465-1478. Corbaz, R., Ettlnger, L., Kemler, Schrlein, W., and Zahner., H., 1957, Zur Systematik der Actinomyceten. 1.ber Streptomyceten mitrhodomycinartigen Pigmenten Arch. Microbial. Vol. 25, pp. 325-332. Cruger, W.&Cruger, A.,1984, Biotechnologie-Leehrbuch der angewandten

Microbiologie, 197-242. R. Oldenbourg Verlag Mnchen Wien. otuk, A., 2003. Genel Mikrobiyoloji Laboratvar Yntemleri. Nobel Tp Kitapevleri LTD.T. 79-92. Dastager S.G, Wen-Jun Li, Dayanand A, Shu-Kun Tang, Xin-Peng Tian Xiao-Yang Zhi, Li-Hua Xu and Cheng-Lin Jiang 2006, Seperation, identification and analysis of pigment (melanin) production in Streptomyces. African Journal of Biotechnology Vol. 5, pp. 1131-1134, 16 April.

87

Denizci, A., 1996, Ege ve Dou Kardeniz Blgesi Topraklarnda zole edilen Aktinomisetlerden Antibakteriyal Antibiyotiklerin Aranmas ve retimi zerine Bir Aratrma. Doktora Tezi, Ege niversitesi, Fen Bilimleri Enstits, zmir. Devries, G. A., 1960, Aspergillus fumigatus and actinomycetes in air. Acta Allegol Vol.15, pp. 99-106. Drautz, H., Reuschenbach, P. and Zahner, H., 1985. Metabolic Products of Microorganisms. 225 Elloramycin. A new anthracyclin-like antibiotic from Streptomyces olivaceus. Isolation Characterization Structure and Biological Properties. The Journal of Antibiotics. Vol. 38, pp. 1291-1301. Dulmage, T.H., 1952, The Production of Neomycin by Streptomyces fradiae in Synthetic Media. Appl. Microbiol Vol.1, pp. 103-106. El-Nakeeb, M.A and &Lechevalier, H.A., 1963, Selective isolation of aerobic Actinomycetes. Appl. Microbiol. Vol. 11, pp. 75-77. Elisa, M., Mguelez, Gruz Martn, Carlos Hardsson and Manuel, B., Manzanal, 1993, Hyphal Death during Colony Development in Streptomyces antibioticus: Existence of a Process of Cell Deletion in a Multicellular Prokaryote. The Journal of Cell Biology, Vol. 145, pp. 515-525. Erikson, D., 1935, The pathogenic aerobic organismus of the Actinomyces group Med. Recearch Council (Gt. Brit) Spec. Rep. Vol. 203, pp. 5-61. Farnsworth, N. R., Akerele, O. A. S. Bingel, D. D. Soejarto, Z. Guo, Bull.WHO.1985, Medicinal plants in therapy. Bull. World Health Organisation, Vol. 63, pp. 965. Goodwin, T.W., 1963, Vitamins Biochemistry of Industrial microorganisms. Roinbow, C-,Rose, A.H=Academic Pres, London, pp. 151-205.

88

Gupte, M., Kulkarni, P., and Ganguli, B.N., 2002, Antifungal Antibiotics. Appl Microbiol. Biotechnol. Vol. 58, pp. 4657. Hall, A.N., Thomas, G. A., Twar, K. S., and Walker, T. K.,1953, Nutrition of Acetobacter species. Arch. Biochem. and Biophys Vol. 46, pp. 485-487. Hepgvendik, N., 1989, Topraktan zole Edilen Bir Actinomycete Trnn Antibiyotik retim Faliyetleri zerine Bir Aratrma. Yksek Lisans Tezi, E., Fen. Fak. B.y.Bl, Temel ve End. Mikrobiy. Anabilim Dal. Bornova- ZMR. Horvath, J., 1954, Contributions to the biology of quantitive changes antibiotic production, based upon Investigations on a Streptomyces. Acto Microbial. Acod. Sci. Hung. Vol. 1, pp. 131-140. Huck, T.A., Porter. N and Bushell, M., 1991, Positive selection of antibiotic producing soil isolates. Journal of General Microbial., Vol. 137, pp. 2321-2329. Iszawa, S.&Araragi, M., 1976, Composition of Actinomycete Population in Soil. In Actinomycetes, The Boundary Microorganisms pp. 97-108. Ed. by. T. Arai, Toppan Company Limited, Tokyo-Singapore. Isshiki, K., Sawa, T., Nakagawa,H., Matsuda, N., Hattori, S., Hamada, M., Takeuchi. T., 1989, 3-O-Isobutyrylkinamycin C and 4-deacetyl-4-O-isobutyrylkinamycin antibiotics produced by a Saccharothrix species. J. Antibiot. Vol. 42, pp. 467 469. Jnos, B., 2004. Bioactive Microbial Metabolites. A Personal View Received 2004, Japan Antibiotics Research Association. J. Antibiot. Vol. 58, pp.126. Jones, K.L., 1949, Fresh isolates of actinomycetes in which the presence of Sporogenous aerial mycelium is fluctuating characteristic. Journal of Bacteriology Vol. 57, pp. 141-146.

89

Keser, T., Bbb, M.J., Buttner, M.J., Chater, K.F., Hopwood, D.A., 2000, Practical Streptomyces Genetics. John Innes Foundation Norwich. Printed by Crowes, Norwich 5-17. Klturgay, K., Gkrmak, F., Tre, O., Gral G., Helvac, S., 1992, Temel Mikrobiyoloji ve Parazitoloji. Onur Yaynclk 90-91. Korcan, E., 1995, Topraktan ve havadan izole edilen Actinomycete trlerinin aktivitesinin belirlenmesi. Yksek Lisans Tezi, Osman Gazi niversitesi Fen Bilimleri Enstits, Eskiehir. Krainsky, A., 1914, Die Actinomyceten undihre Bedevturg in der Natur, Zentr Bakteriol Parasienk. II Abt. Vol. 41, pp. 649-688 der. Krasilnikov, N.A.,1959,

Rules for the classfication of antibiotic-producing

Actinomycetes Diagnostik der Bakterien und Actinomyceten. Veb. G.Fischer Verlag, Jena . English transl. Of section on Actinomycetes, C.Pfizer & Co., Inc. Kutznet, H. J. 1956, Beitrag zur Systematik und Okologie der Gattung Streptomyces Waksman et Henrici. Dissertation, Hohenheim. Kster, E.,1976, Ecology and Predominance of Soil Streptomycetes. In Actinomycetes, The Boundary Microorganisms. pp. 109-122. Ed. by. T.Arai Toppan Company Limited, Tokyo-Singapor. Lamari, L., Zitouni, A., Boudjella, H., Badji, B., Sabaou, N., Lebrihi, A., Lefebvre, G., Seguin, E. & Tillequin, F. 2002, New dithiolopyrrolone antibiotics from Saccharothrix sp. SA 233. I. Taxonomy, fermentation, isolation, and biological activities. J Antibiot Vol. 55, pp. 696701. Lancini, G., Parenti, F&Gallo,G.G.,1995, Antibiotics: A Multidisiplinary Approach. Plenum Pres, New Tork and London.

90

Legator, M.,and Gottlieb, D.1953, The dynamics of chloramophe-nicol synthesis. Antibiot. Chemother. Vol. 3, pp. 809-817. Liang, L., 2003, Investigation of Secondary Metabolites of North Sea Bacteria Fermantation, Isolaton Structure Elucidation and Bioactivity. Ph. D.thesis. University of Gttingen, Gttingen, Germany. Lindenben, W., 1952, ber einige chemish interessante Actinomycetens tmme und ihre Klassifierung. Arch. Microbial., Vol.17, pp. 361-383. Linder, W. and Wallhausser, K.H., 1955, Die Arbeitsmethoden der Forschung zur Auffinfung neuer Antibiotica. Arch Microbial. Vol. 22, pp. 219-234. Locci, R., 1989, Streptomyces and Related Genera. Bergys Manual of Systematic Bacteriology, Vol. 4, pp. 2451-2508. Lund, B.M. and Lyon, G.D., 1975, Detection of inhibitors of Erwinia carotovora and Eherbicola on thin-layer chromatograms. J Chromatogr Vol.110, pp. 193-196. MacNeil, I. A., C. L. Tiong, C. Minor, P. R. August, T. H. Grossman, K. A. Loiacono, B. A. Lynch, T. Phillips, S. Narula, R. Sundaramoorthi, A. Tyler, T. Aldredge, H. Long, M. Gilman, D. Holt, and M. S. Osburne. 2001, Expression and isolation of antimicrobial small molecules from soil DNA libraries. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. Vol.3, pp. 301308. Martinez, A., S. J. Kolvek, C. L. Tiong Yip, J. Hopke, K. A. Brown, I. A. MacNeil, and M. S. Osburne. 2004, Genetically modified bacterial strains and novel bacterial Artificial chromosome shuttle vectors for constructing environmental libraries and detecting heterologous natural products in multiple bacterial hosts. Appl. Environ. Microbiol. Vol.70, pp. 24522463.

91

Nakayama, K., 1981, Sources of Industrial MicroorganismsIn Biotechnology. Vol. 1, pp. 355-410. Ed. by H.J. Rehm & G. Reed, VCH Verlag, Weinheim. Nakhmovskaa, M. I., 1937, The antagonism between actinomycetes and soil bacteria. Microbiology (U.S.S.R.), Vol. 6, pp.131-57. Natsume, M., Yosu, K., Maruma, S., 1989, Department of Agricultural Chemistry, Nagoya University, chikusa, JAPAN. J. Antibiotic. Tokyo; Vol. 42, pp. 440. Neugebaver, E., Gomache, B., Derry, V.C., and Brezezinski, R., 1991, Chitinolytic properties of Streptomyces lividans. Arch. Microbial. Vol. 156, pp. 192-197. Nolan R., Cross T., 1988, Isolation and screening of actinomycetes, in: Goodfellow M., Williams S.T., Mordarski M. (Eds.), Actinomycetes in Biotechnology. Academic Press, London, pp. 132. Ohkuma, H., Naruse, N., Nishiyama, Y., Tsuno, T., Hoshino, Y., Sawada, Y., Konishi, M. And Oki, T., 1992, Sultreiecin. New Antifungal and Antitumor Antibiotic from Sterptomyces roseiscleroticus Production, Isolation, Structure and Biology Activity. The Journal of Antibiotics, Vol. 45, pp.1239-1249. Okazaki T., Naito A., 1986, Studies on actinomycetes isolation from Australian soil. in: Szabo G., Biro S., Goodfellow M. (Eds.), Biological, Biochemical and Biomedical Aspects of Actinomycetes, Akademiai Kiado, Budapest, , pp. 739 741. Ouhdouch, Y., Barakate,M., Finance, C., 2001, Actinomycetes of Moroccan habitats, isolation and screening for antifungal activities. Eur. J. Biol. Vol. 37, pp. 6974. ner, M., 1989, leri Endstriyel Mikrobiyoloji Ders Notlar. Ege niv. Fen Fak. Temel ve Endstriyel Mikrobiyoloji Ana Bilim Dal, Bornova-zmir.

92

Porter, J.N., 1976, Antibiotics In Industrial Microbiology pp. 460-478. Ed.by B.M Miller & W. Litsky, Mc Graw- Hill BookCompany. Raper, K.B., Thom, C., Fennel. D.L., 1949, A manual of the Penicilia. Williams Wilkins Company, Baltimore. Redenbach M., Kieser H. M, Denapaite D., Eichner D., Cullum J., Kinashi H. and Hopwood D.A.1996, Aset of ordered cosmids and adetailed genetic and Physical map fort the 8 Mb Streptomyces coelicolor A3(2) chromozome Mol. Microbiol. Vol. 27, pp. 77-96. Rickes, E.L., Brink, N.G., Konuszy, F.r., Wood, T.R., and Folkers, K., 1948, Comporative data on vitamin B12 , from liver and from anev sorce, S.griseus Science Vol.108, pp. 634-635,148. Rondon, M. R., P. R. August, A. D. Bettermann, S. F. Brady, T. H. Grossman, M.R.J. Liles, K. A. Loiacono, B. A. Lynch, I. A. MacNeil, C. Minor, C. L. Tiong, M.Gilman, M. S. Osburne, Clardy, J. Handelsman, and R. M. Goodman. 2000, soil metagenome: a strategy for accessing the genetic and functional diversity of uncultured microorganisms. Appl. Environ. Microbiol. Vol. 66, pp. 25412547. Rossi-Dora, T. 1891, Su di alcune specie di Streptotrix trovate nellaria studiate in rapporto a quelle giA note e specialmente all Actinomyces. Ann. igiene, Vol.1, pp. 399- 439. Schatz, A. and Waksman, S.A., 1944, Sptertomycin A. Substance Exhibiting Antibiotic Activity Aganist Gram- negative and Gram- positive Bacteria. Proc. Soc. Exptl. Biol. Med. Vol. 55, pp. 66-69. Shirling, E.B. and Gttlieb, D.,1966, Methods for Charecterization of Streptomyces species. Int. J. Syst. Bacteriology, Vol.16, pp. 313-340.

93

Slavica, B.I.,, Sandra, S. K., Zoran, B.T., 2005 UV/VIS Analysis and Antimicrobial Activity of Streptomyces solates Medicine and Biology Vol. 12, pp. 44-46. Swaadoun, I., Hameed, K.M., Moussauui. A., 1999, Characterization and analysis of antibiotic activity of some aquatic actinomycetes. Microbios; Vol.99, pp. 173179. ahin, N., Uur, A., 2003, Investigation of the Antimicrobial Activity of Some Streptomyces Isolates. Turk J Biol. Vol.27 pp. 79-84 TBTAK 79. Taddei A., Margaret V., Juan G., Maikahl R., Cristina C., 2006, Chemical screening: A simple approach to visualizing Streptomyces diversity for drug discovery and further research Research in Microbiology Vol.157 pp. 291297. Thompson C. J., Chiu M., Christiansen ., Dale G., Folcher M., Li X.-M., Morris R.,N guyen L., RCHTER M., Taubert S., Tenor J., Sstrnk U., Violler P., Weihofen A., 1998-1999 Differantiation in Streptomyces a Procaryotic multicellular developmantal system, Biozentrum: Biennial Report. pp. 1-6. Takeuchi, Y., Satow, Y., Nakamura, K.T., and Mitsui, Y. 1991, Refined crystal structure of the complex of subtilisin BPN' and Streptomyces subtilisin inhibitor at 1.8 resolution. J. Mol. Biol. Vol. 221, pp.309325. Takeuchi, M., Takahashi, S., Enokita,R., . Sakaida, Y., Haruyama, H., Nakamura, T., Katayama, T., Inukal, M., 1992, Galacardines A and B, new glycopeptide antibiotics. J. Antibiot. Vol. 45, pp.297305. Toennies, G., 1951, and Kolb,, J.J. Tecniques and reagents for paper chromatography. Anal. Chem. Umberit, W.W., and Mc Coy, E., 1941, The accurence of actinomycetes of the genus micromonospora in Inland lakes, symp Hydrobiology. Univ. Wis. pp 106-114.

94

Umberit, W.W., and Mc Coy, E., 1956, The antibiotic approach. In The Strategy of Chemotherapy. 8th Symp. Soc. Gen Microbial., London, pp. 29-48. Umezawa, H., Tsuchiya, T., Muto, R.& Umezava, S., 1972, Studies on Aminosugars XXIX. The synthesis of 3-O-Methylkanamycin. Microbiology Bull. Chem. Soc. Jpn. Vol. 45, pp. 2842-2847. Waksman, S.A., 1922, A Method Counting the numbers of fungi in the soil. J. Bact., Vol. 7, pp. 339-341. Waksman, S.A., 1957, The Species concept among the actinomycetes withspecial reference to the genus Streptomyces. Bact. Review, Vol. 21, pp.1-29. Waksman, S.A., 1963, The Actinomycetes and Their Antibiotics. In Advances in Applied Microbiology, Vol 5. pp. 235-295. Ed. by W.W. Umbreit, Academic Pres, New York and London. Waksman,S.A.,1967, Actinomycetes. A Summary of Current Knowledge. The Ronald Pres Company, New York. Wang, L., Zhang,Y., Lu, Z., Shi, Y Liu, Z., Maldonado, L., Goodfellow, M., 2001, Nocardia beijingensis sp. nov., a novel isolate from soil. Int. J. Syst. Evol. Microbiol.Vol. 51 pp. 17831788. Wendisch, F.K., & Kutzner, H.J., 1991, The family Streptomycetaceae. In Prokaryotes. Second Edition Vol. 1. pp. 922-925. Ed. by A. Ballows et.al, Springer Verlag. Williams, S.T & Davies, F.L., 1965, Use of Antibiotics for Selective Isolation and Enumeration of Actinomycetes in soil. J.Gen. Microbiol. Vol 48, pp. 251-261.

95

Williams, S.T & Cross, T., 1971, Actinomycetes. Methods Microbiol. Vol. 4, pp. 295334. Williams, S. T., Goodfellow, M., Alderson, G., Wellington, E.M.H., Sneath, P.H.A.& Sackn, M.J., 1983, Numerical classfcation of Streptomyces and related genera.Journal of General Microbiology Vol.129, pp.1743-1813. Zaehner, H. P. Fiedler, 1995, The need for new antibiotics: possible ways forward, N. J. Russell (ed.), Cambridge University Press, Cambridge, England, pp.67-84 Zitouni, A., Boudjella, H., Lamari, L., Badji, B., Mathieu, F., Lebrihi, A., Sabaou, N., 2005, Nocardiopsis and Saccharothrix genera in Saharan soils in Algeria:Isolaton biological activities and partial characterization of antibiotics. Research in Microbiology Vol.156, pp. 984-993.

nternet Kaynaklar 1. http://www.ncbi.nlm.nih./ 10.05.2007 2. http:// tr.wikipedia.org/wiki/Antibiyotik 07.06.2007

96

ZGEM Ad Soyad: Neslihan BALKAR Doum Yeri: orum Doum Tarihi: 24.07.1982 Medeni Hali: Bekar Yabanc Dili: ngilizce Eitim Durumu: Lise: Halkal Toplu Konut Lisesi Lisans: Afyon Kocatepe niversitesi Yksek Lisans: Afyon Kocatepe niversitesi

97

You might also like