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PRÁCTICA # 2

“MITOSIS Y MEIOSIS”
OBJETIVOS

 Diferenciar entre las células mitóticas y meioticas la división celular


 Observar e interpretar figuras de distintas fases de la mitosis en las células vegetales de la cebolla
 Por una parte se analizarán las diferentes fases de la espermiogénesis en preparaciones obtenidas
mediante la técnica de aplastado a partir de testículos de ortópteros fijados en etanol y ácido acético en
proporción 3:1. Por otra, estudiaremos la organización de las células que cursan la espermatogénesis y
el túbulo seminífero en cortes de testículo de saltamontes fijado con Bouin e incluido en parafina.

INTRODUCCIÓN

Existe un proceso celular destinado a producir células idénticas genéticamente: la MITOSIS. Por el contrario, la
mayoría de los organismos vivos utilizan parte de su vida o tejidos especializados para producir células
esencialmente diferentes de las progenitoras en cuanto a las combinaciones posibles de su material hereditario.
Este mecanismo celular está enclavado en un proceso especial de división celular: la meiosis.

El proceso de reproducción celular conocido con el nombre de mitosis, puede ser estudiado eligiendo un material
constituido por células que se hallen en continua división. Esta condición la reúnen los meristemos terminales o
primarios, tales como los que se encuentran en el ápice de las raíces.

Un bulbo de cebolla cuya base se mantenga en contacto con el agua durante 4 ó 5 días, nos proporciona
abundante cantidad de raicillas jóvenes, muy apropiadas para la obtención de muestras destinadas a observar.1

En organismos superiores la meiosis tiene lugar en los órganos sexuales tanto masculinos como femeninos,
dentro de un proceso general que se denomina respectivamente espermatogénesis y ovogénesis. Tanto uno
como otro no sólo producen células diferentes genéticamente, sino que reducen el número de cromosomas de
las células a la mitad y las modifica para poder ser fecundadas o fecundar dependiendo del sexo en donde se
realice.

Ciclo celular: Mitosis

Todos los seres vivos, uni- y pluricelulares tienen como misión fundamental la de reproducirse preservando sus
características esenciales a través de las generaciones.

Los fenómenos que tienen lugar durante la reproducción celular corresponden a una de las etapas del proceso
conocido como ciclo celular. Este ciclo resulta de la coordinación de una serie de procesos que involucran la
integración de diferentes señales que conducen a la duplicación de DNA, su condensación, segregación y
posterior descondensación. Dentro de este ciclo, la mitosis es la etapa durante la cual una célula da origen a dos
células hijas con igual dotación de cromosomas. Aunque la mitosis, de por sí es un proceso continuo, para su
estudio se divide en diferentes etapas consecutivas de acuerdo a los cambios morfológicos que va
experimentando la célula y que se continúan con la citocinesis. 2

El ciclo celular es el período comprendido entre la formación de una célula, por división de otra precedente, y el
momento en que ella misma se divide para originar dos células hijas. El ciclo celular se puede dividir en dos
grandes períodos: interfase y mitosis, cada uno de los cuales se subdivide en varias fases o etapas. La interfase
se encuentra subdividida en 3 etapas:

a) Período G1. Comienza la síntesis de RNA y proteínas, la cual perdura durante toda la interfase.
b) Período S donde ocurre la duplicación del ADN.
c) Período G2, fase postsintética que va desde el final de S hasta el comienzo de la mitosis.

Por otro lado, en la mitosis ocurren 2 procesos altamente


sincronizados: la cariocinesis (división del núcleo) y la citocinesis
(división del citoplasma). En la cariocinesis se reconocen distintas
fases: profase, metafase, anafase y telofase. Algunos autores
reconocen a la prometafase como un estadio entre profase y metafase.
La mitosis finaliza con la citocinesis, la cual es diferente en animales y
vegetales.

Para estudiar los parámetros del Ciclo Celular se utilizan tejidos en


constante renovación (tejidos en proliferación), en los que la duración
total del ciclo con determinadas condiciones es constante.

Cuando las células de un meristemo de Allium cepa se encuentran en equilibrio proliferativo, la duración de cada
uno de los períodos del ciclo celular permanece constante. De esta forma, el número de células que están en

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una fase determinada es también constante y proporcional a la duración (en tiempo) de la misma. Teniendo en
cuenta esto se puede calcular la duración relativa de las diferentes fases del ciclo, es decir de la interfase y de la
mitosis, así como de cada una de las etapas de ésta.

Fases de la mitosis

(a) INTERFASE: Núcleos en interfase. La cromatina aparece


bastante homogénea, a excepción de zonas más claras que
corresponden a los nucleolos.
(b) PROFASE: La cromatina comienza a condensarse. A medida
que avanza este estadio desaparece el nucleolo. Los
“cromosomas” aparecen como filamentos delgados.
(d) METAFASE: Cada cromosoma, integrado por dos cromátidas
hermanas, se dispone con su centrómero en el plano
ecuatorial.
(e-f) ANAFASE: Las cromátidas hermanas se separan y comienzan a migrar hacia los polos opuestos de la
célula. Ahora los cromosomas se observan formados por una sola cromátida, con los centrómeros
dispuestos hacia los polos y los telómeros hacia el centro de la célula.
(g) TELOFASE: No es posible individualizar los cromosomas. La cromatina comienza a descondensarse en
ambos núcleos hijos. 3

Espermatogénesis

Ham, en 1677, observa por primera vez en el semen humano la presencia de unos "animáculos" móviles que
muchos científicos de la época consideraron como parásitos o simbiontes. En 1780 Spallanzani comprueba que
si del semen eran eliminados estos cuerpos móviles, éste perdía su capacidad fertilizante. Pero fue en la
segunda mitad del siglo pasado cuando se concluyó que estos "animáculos" eran los gametos masculinos, y se
les denominó espermatozoides. De esta forma se estableció que los espermatozoides se originaban en los
testículos y que poseían núcleo y citoplasma: eran células.

Desde este momento y hasta nuestros días la morfología de los espermatozoides y de las células que les dan
origen han sido ampliamente estudiadas. En una primera etapa de la citología, empleando cortes en parafina, no
sólo se describen gran cantidad de formas distintas de espermatozoides, sino que también se pone gran interés
en el estudio de los epitelios en los que se originan. Posteriormente, con el avance de la técnica y la aparición del
microscopio electrónico, se determina la ultraestructura de los espermatozoides y de las células intermedias en
su formación.

En la figura se observa la reconstrucción fotográfica de una sección de un túbulo seminífero de saltamontes en el


que se observa la disposición secuencial de las células que cursan la espermatogénesis.

La introducción de nuevas técnicas de estudio


como pueden ser las citoquímicas para
microscopía óptica y electrónica, la aplicación de
microscopía de barrido, el empleo de anticuerpos
marcados a nivel morfológico y ultraestructural o
metodologías puramente bioquímicas han
ayudado a un mejor conocimiento del proceso de
formación de los gametos masculinos, la
espermatogénesis.

Desde antiguo recibió gran atención el proceso de cómo se formaban estas células, ya que a partir de una célula
prácticamente indiferenciada, la espermatogonia, se produce una complicada y a veces dramática serie de
cambios morfo-funcionales que desembocan en la formación del espermatozoide: la espermatogénesis.

Podríamos definir a la espermatogénesis como el conjunto de cambios que ocurren en una célula prácticamente
indiferenciada, espermatogonia, y que tienen como final la formación de una célula altamente especializada, con
un número haploide de cromosomas recombinados y capaces de fecundar: el espermatozoide.

Teniendo en cuenta los cambios que se producen en la espermatogonia, y por tanto los nuevos tipos celulares y
los procesos en los que participan, podemos dividir a la espermatogénesis como proceso en las siguientes
etapas:

a) Proliferación. Este período comprende el desarrollo de las espermatogonias, las cuales se dividen no sólo
aumentando la población celular sino manteniendo la población troncal existente. Las divisiones de población
espermatogonial llegan en algunas especies hasta ocho. Así, partiendo de una espermatogonia inicial, van
surgiendo por divisiones sucesivas grupos de ellas, que normalmente se encuentran interconectadas por sus
citoplasmas. El número final de gonias presentes en un cisto, en las especie que lo posean, indicará por lo
tanto las veces que se han dividido a partir de la espermatogonia primordial. De esta forma un cisto con

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doscientas cincuenta y seis gonias revela la existencia previa de ocho divisiones mitóticas. En esta fase de
divisiones rápidas y continuas es fácil observar el cariotipo de la especie.
b) Crecimiento y meiosis. La meiosis se caracteriza por presentar dos divisiones sucesivas del material
hereditario (División I y División II) precedidas por un único período S (de síntesis de ADN). La profase de la
primera división meiótica es extremadamente larga pudiendo durar desde días (en machos) hasta años
(generalmente en hembras). Para su estudio, se ha dividido en base a la morfología del núcleo celular en
varias etapas: leptotene, cigotene, paquitene, diplotene y diacinesis.
PRIMERA DIVISIÓN SEGUNDA DIVISIÓN
INTERCINESIS
MEIÓTICA MEIÓTICA
PROFASE I: PROFASE II
LEPTOTENE PROMETAFASE II
CIGOTENE METAFASE II
PAQUITENE ANAFASE II
DIPLOTENE TELOFASE II
DIACINESIS
PROMETAFASE I
METAFASE I
ANAFASE I
TELOFASE I

En la primera anafase meiótica los cromosomas homólogos, que previamente han recombinado, migran
completos a polos opuestos. Tras una interfase muy corta, y a veces inexistente denominada intercinesis, se
efectúa la segunda división meiótica. Ésta es esencialmente igual que una división mitótica convencional con la
excepción de que cada célula solamente posee un complemento cromosómico de la especie y ya recombinado.
El resultado final es la formación, por cada una de las células que entró en la profase I, de cuatro células
haploides y con una carga "c" de ADN: las espermátidas.

Espermatogénesis de Locusta migratoria en cortes de testículo teñidos


con tricrómico de Masson (I). A.- Detalle de un túbulo seminífero en el
que se aprecia la estructura celular en cistos. B.- Espermatogonia. El
cromosoma sexual aparece marcado (X). C.- Espermatocito en división
(telofase I) en el que se observa el huso de microtúbulos (cabeza de
flecha).

c) Espermiogénesis. Se conoce con este nombre a toda la serie de cambios


tanto citoplásmicos como nucleares que sufren las espermátidas hasta
convertirse en espermatozoides. Estos cambios son muy variables y
dependen de la especie estudiada. No obstante, y como rasgos generales,
podemos decir que se centran en la compactación de la cromatina en el
núcleo, la pérdida de casi la totalidad del citoplasma y la adquisición de un
aparato locomotor por parte de la célula.

Espermatogénesis de Locusta migratoria en cortes de testículo teñidos con


tricrómico de Masson (II). Espermátidas en distintos estados de maduración.
Obsérvese la paulatina condensación de la cromatina y modificación del
núcleo y los adjuntos centriolares (cabezas de
flecha). A.- Espermátidas tempranas, en las que aún no se ha estructurado el
adjunto centriolar. La que se encuentra a la derecha es diploide, aberrante. B.-
Espermátida aberrante, poliploide, con dos adjuntos centriolares. C y D.- Con
esta técnica de tinción se aprecian los flagelos (flecha).

Espermatóforos de Locusta migratoria en aplastado teñido con Feulgen. A.-


Campo claro, donde sólo se aprecian los núcleos. B.- Contraste de fase, que
permite ver los flagelos de las espermátidas (cabezas de flecha).

REACTIVO DE SCHIFF

En química, el reactivo de Schiff (inventado y nombrado por Hugo Schiff) es un reactivo para la detección de
aldehídos.

FORMULA DEL REACTIVO DE SCHIFF, USADO PARA RECONOCER ALDEHIDOS:

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1. Pesar 100 miligramos de fucsina. 2. disolver en 75 ml. de agua destilada, a 80 grados centígrados. 3. enfriar.
4. agregar 2.5 gramos de bisulfito de sodio, disolver. 5. agregar 1.5 ml. de acido clorhídrico concentrado, agitar.
6. aforar a 100 ml. con agua. 7. NO usar después de 14 días de preparado.

Fucsina: Formula: C20-H20-Cl-N3.


Sinónimos: violeta básica, Magenta I, alfa4-(p-aminofenil)-alfa4(imino-2,5-clorhidrato.

EL ACIDO LEUCOSULFONICO ES EL PRODUCTO DE LA REACCION FINAL DEL PROCEDIMIENO PARA


FORMAR EL REACTIVO !NO SON EL REACTIVO INICIAL! AL FINAL NO TENEMOS FUCSINA, ES UN ACIDO
INESTABLE, EL LEUCOSULFONICO.

Tanto si se usa bisulfito de sodio, como gas SO2, el bisulfito de sodio se descompone dando SO2 gaseoso, por
lo cual en ambos métodos, SOLO SE PRODUCE ACIDO LEUCOSULFONICO, incoloro, y que cambia a color
violeta púrpura con un aldehído, al perder acido sulfuroso, por la reacción, pues este es un acido inestable

MATERIAL

 Microscopio  Vaso de precipitados


 Porta y cubre-objetos  un bulbo de cebolla
 Vidrio de reloj  Pinzas finas
 Tiras de papel de filtro  Lanceta estéril
 Pinzas de disección  Cubeta de tinción
 Mechero de alcohol  Caja de petri
 Tijeras  Piceta

REACTIVOS

 Orceína A y B  Agua sulfurosa


 Agua enmangada  HCl
 Reactivo de Schiff  Ácido acético

PROCEDIMIENTO

A) MITOSIS EN CEBOLLA

Preparación de la cebolla

1. llenar un recipiente con agua y colocar un bulbo de cebolla sujeto con dos o tres palillos de manera que la
parte inferior quede inmersa en el agua. Al cabo de 3-4 días aparecerán numerosas raicillas en crecimiento de
unos 3 ó 4 cm. de longitud.
2. cortar con una tijeras unos 2-3mm del extremo de las raicillas y depositarlo en un vidrio de reloj en el que se
han vertido 2-3ml de Orceína A.
3. Calentar suavemente el vidrio de reloj a la llama del mechero durante unos 8 minutos, evitando la ebullición,
hasta la emisión de vapores tenues.
4. con las pinzas tomar no de los ápices o extremos de las raicillas y colocarla sobre un portaobjetos, añadir una
gota de Orceína B y dejar actuar durante un minuto.
5. colocar el cubreobjetos con mucho cuidado sobre la raíz. Con el mango de una aguja enmangada dar unos
golpecitos cobre el cubre sin romperlo de modo que la raíz quede extendida.
6. sobre la preparación colocar unas tiras de papel filtro, 5 o 6. poner el dedo pulgar sobre el papel filtro en la
zona de cubre objetos y hacer una suave presión, evitando que el cubre resbale. Si la preparación está bien
asentada no hay peligro de rotura por mucha presión que se realice.
7. observar al microscopio.

Observación microscópica

1. Se realizará a fuertes aumentos. La Orceína A reblandece las membranas celulares y la B completa el proceso
de tinción. Con la presión sobre el porta de la preparación se logra una extensión y difusión de las células del
meristemo de la cebolla.
2. la preparación presenta el aspecto de una dispersión de células por todo el campo que abarca el microscopio.
Se observan células en diversas fases o estados de división celular. Se ven los cromosomas teñidos de
morado por la Orceína. El aspecto reticulado así como el mayor tamaño de algunos núcleos corresponden a
las células que se encontraban en los procesos iniciales de la división mitótica.

B) MEIOSIS EN ORTÓPTERO

1.- Aplastados de testículo de ortóptero teñidos con Feulgen

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 Seleccionamos testículos de ortópteros fijados en etanol y ácido acético 3:1 al menos una semana antes
y lo colocamos en agua destilada para su hidratación durante 10 minutos. A partir de este momento realizar todo
el proceso en el mismo recipiente, preferiblemente plástico y no vidrio. No utilizar ningún elemento metálico.
 Hidrolizar los testículos en HCl 5N durante 30 min. Transcurrido este tiempo se lavan abundantemente en agua
destilada. Posteriormente se introducen en reactivo de Schiff durante 30 minutos a temperatura ambiente. Este
proceso es preferible realizarlo en oscuridad. Se lavan los testículos, que tendrán un color violeta, en agua
sulfurosa y posteriormente en agua del grifo, donde se almacenarán hasta la confección de los aplastados.
 Separamos un par de túbulos del testículo y los colocamos sobre un portaobjetos. Sobre ellos se coloca
inmediatamente una gota de ácido acético al 50% en agua destilada y se deja un par de minutos. ¡Cuidado, no
dejar secar el material!
 Se coloca sobre el túbulo un cubreobjetos y utilizando la punta de un lápiz y con presión muy suave se
dispersa el material.
 Con un trozo de papel de filtro se elimina el acético que ha rebosado por los laterales del cubreobjetos y, con
cuidado de no moverlo, se realiza el aplastado presionando fuertemente con el dedo pulgar sobre una
superficie plana.
 Observar los aplastados en el microscopio tratando de determinar las diferentes etapas del proceso meiótico,
así como las espermátidas en los diferentes estadíos de la espermiogénesis.

2.- Secciones de testículo de ortóptero teñido con tricrómico de Masson

El análisis de cortes de parafina supone la realización de tres procesos: la inclusión del material en un medio
sólido, el corte y desparafinado del mismo y la tinción de los cortes (Apéndice).
Las secciones de testículo se observarán en el microscopio determinando la disposición de los túbulos
seminíferos en el conjunto, así como las zonas apicales y basales de los túbulos.

Células del testículo del saltamontes Chorthippus jucundus teñidas con orceína
lacto-propiónica. A.- Núcleo de una espermatogonia en interfase. El
cromosoma sexual ha sido señalado con una X. B.- Metafase espermatogonial.
C.- Núcleo prepaquiténico. Posiblemente corresponde a un núcleo en leptotene.
D.- Paquitene medio. E.- Paquitene tardío. F.- Diplotene. Se ha señalado la
posición de los quiasmas en un bivalente monoquiasmático (M7), en uno con
dos quiasmas (M4) y en un tercero que presenta cuatro (L1).

Espermatocitos de Chorthippus jucundus teñidos con orceína


lacto- propiónica. A.- Diplotene tardío-diacinesis. B.-
Metafase-I. C.- Anafase- I. El cromosoma sexual X migra
completo al polo superior de la célula. D.- Telofase- I. E.-
Intercinesis/Profase-II. La célula de la parte superior de la
fotografía posee el cromosoma X, mientras que la de la parte
inferior carece de él.
Células del testículo de Chorthippus jucundus teñidas con orceína lacto-
propiónica. A.- Metafase- II. Se observa la disposición radial de los
cromosomas. B.- Anafase- II. Las cromátidas están comenzando a
separarse. C.- Anafase- II. D.- Telofase-II. E.- Espermátidas tempranas. La
situada en la parte superior de la fotografía posee el cromosoma sexual
(X), mientras que la de la parte inferior carece de él. F,G,H- Espermátidas
en diferentes estados de maduración.4

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RESULTADOS

A) MITOSIS EN CEBOLLA

Durante la práctica, donde estudiamos células en


proceso de mitosis en la raíz de la cebolla
encontramos todas las fases de replicación
anafase, telofase, metafase, profase y diacinesis
logrando ver las diferentes formas en la que el
núcleo y sus cromosomas se ven en este tipo de
proceso celular.

FASE OBSERVACIONES IMAGEN

Se observa el núcleo en interfase; La cromatina


Núcleo aparece bastante homogénea, a excepción de zonas
interfásic más claras que corresponden a los nucleolos.
o

La cromatina comienza a condensarse. A medida que


avanza este estadio desaparece el nucleolo. Los
Profase: “cromosomas” aparecen como filamentos delgados.
En la imagen esto no se observa muy bien pero al
microscopio si.

Cada cromosoma, integrado por dos cromátidas


Metafase hermanas, se dispone con su centrómero en el plano
ecuatorial.

Las cromátidas hermanas se separan y comienzan a


migrar hacia los polos opuestos de la célula. Ahora
Anafase los cromosomas se observan formados por una sola
cromátida, con los centrómeros dispuestos hacia los
polos y los telómeros hacia el centro de la célula

La cromatina comienza a descondensarse en ambos


núcleos hijos ya que no es posible individualizar los
Telofase cromosomas; esto se observa como 2 núcleos dentro
de una misma célula.

Se observa como un núcleo dividiéndose en dos


Diacinesi partes; es decir: la división del citoplasma.
s

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B) MEIOSIS EN ORTÓPTERO

Citógenos:

Túbulo seminífero:

Espermatóforo:

DISCUSIÓN DE RESULTADOS:

 Se realizaron 2 prácticas: una para observar la mitosis (con los meristemos de la cebolla) y otra para la
observación de la meiosis (en las gónadas de un ortóptero: grillo).
 En la mitosis, se llegaban a distinguir un poco los cromosomas tras el proceso de tinción que llevaron a
cabo, posteriormente fijando con bálsamo de Canadá el portaobjetos debido a que se observaban claramente
todas las fases de la mitosis.
 Como se describió en los resultados y ya que se pusieron las observaciones e imágenes en orden del ciclo
celular se puede observar como estas células se encontraban en continua división para su replicación o
división celular, cuya finalidad como se observó en las imágenes es el dar origen a dos células hijas con igual
dotación de cromosomas.
 Durante el otro proceso de meiosis el cual solo lo efectúan las células de reproducción, óvulos y
espermatozoides no fue posible observar las estructuras de interés indicadas para la práctica (células en
reproducción) debido a que el grillo que se utilizó para el estudio fue demasiado joven e inmaduro sexualmente
para poder lograr tener buenas imágenes del proceso de meiosis, por lo cual tan solo se observaron algunos
citógenos, el tubo seminífero en el que se observa la disposición secuencial de las células que cursan la
espermatogénesis y por último los espermatóforos.
 Se empleó la tinción de Feulgen para evidenciar núcleos celulares, ya que tiñe DNA al hidrolizar el anillo
furazónico del DNA.

CONCLUSIÓN

Durante esta práctica, se estudió e identificaron los principales cambios morfológicos que se presentan durante
la profase, metafase, anafase, telofase y citocinesis en células meristématicas de raíces de cebolla Allium cepa
(cebolla), por su simplicidad de manejo y el gran tamaño de sus células. La preparación presentó el aspecto de
una dispersión de células por todo el campo que abarca el microscopio. Se observaron células en distintas fases
o estados de división celular. Con esta técnica de tinción se ven los cromosomas impregnados por la orceína en
color morado rojizo. También se debieron haber observo las fases de la división mitótica, sin embargo debido a
que el grillo utilizado era muy pequeño reproductivamente, no se lograron observar estas divisiones celulares,
solo algunos de los componentes de sus células sexuales, pero esta parte de la práctica se podrá estudiar con la
teoría de la introducción, en donde viene descritas estas fases con ayuda auxiliar de las imágenes que describen
a cada una de estas fases.

REFERENCIAS

7
1
http://www.arrakis.es/~rfluengo/mitosiscebolla.html
2
http://www.unicartagena.edu.co/librose/LABORATORIO%20No%209.%20MITOSIS.pdf
3
http://genetica.fcien.edu.uy/materiales/PRACTICOS/mitosis/mitosis.pdf
4
http://www.uam.es/departamentos/ciencias/biologia/citologia/practica1.htm