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UNIDADE DE ENSINO SUPERIOR VALE DO IGUAÇU CURSO DE FARMÁCIA DISCIPLINA: TOXICOLOGIA CLÍNICA

APOSTILA DE ANÁLISES TOXICOLÓGICAS
PROFESSORA: Elaine Anton

APRESENTAÇÃO

O presente trabalho é uma compilação de várias técnicas ministradas na disciplina de Toxicologia de outras Universidades, que também estão sendo usadas nos laboratórios de Emergências Toxicológicas dos Centros de Controle de Intoxicações, bem como de algumas análises realizadas em laboratórios da Polícia Técnico-Científica, com a finalidade de sistematizar as aulas práticas da disciplina de Toxicologia.

Profª. Elaine Anton

SUMÁRIO
PROCEDIMENTOS GERAIS NO LABORATÓRIO .................................................... 2 ANÁLISES TOXICOLÓGICAS ................................................................................... 4 DIAGNÓSTICO DAS INTOXICAÇÕES AGUDAS ...................................................... 8 MODELO DE REQUISIÇÃO PARA ANÁLISE TOXICOLÓGICA ................................ 9 MODELO DE FICHA PARA ANÁLISE TOXICOLÓGICA ......................................... 10 MODELO DE LAUDO PARA ANÁLISE TOXICOLÓGICA ........................................ 11 TESTES COLORIMÉTRICOS RÁPIDOS PARA IDENTIFICAÇÃO DE AGENTES TÓXICOS – TOXICOLOGIA DE MEDICAMENTOS ................................................. 13 TESTES RÁPIDO PARA TRIAGEM DE MEDICAMENTOS (IMUNOCROMATOPLACAS) ................................................................................... 17 MARCHA SISTEMÁTICA PARA EXTRAÇÃO DE MEDICAMENTOS DE MATERIAL BIOLÓGICO ............................................................................................................. 19 DETERMINAÇÃO DE PARACETAMOL EM ESPECTROFOTÔMETRO UV-Vis ..... 26 DETERMINAÇÃO DE SALICILATOS EM ESPECTROFOTÔMETRO UV-VIS (MÉTODO DE KAYE) ............................................................................................... 31 IDENTIFICAÇÃO DE AGENTES TÓXICOS ............................................................. 36 TESTE RÁPIDO PARA TRIAGEM DE DROGAS DE ABUSO IMUNOCROMATOPLACAS ..................................................................................... 39 IDENTIFICAÇÃO DE CANABINÓIDES EM ERVA IN NATURA POR CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA – (CCD) ........................................... 42 IDENTIFICAÇÃO DE CANABINÓIDES EM URINA POR CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA DE ALTA EFICIÊNCIA – (CCDAE / HPTLC) .......................... 44 IDENTIFICAÇÃO DE COCAÍNA EM AMOSTRAS DE PRODUTO .......................... 47 TESTES COLORIMÉTRICOS RÁPIDOS PARA IDENTIFICAÇÃO DE AGENTES TÓXICOS ................................................................................................................. 51 IDENTIFICAÇÃO DE AGROTÓXICOS POR CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA (CCD) ..................................................................................................... 52 DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE DA COLINESTERASE PLASMÁTICA .............. 55 DETERMINAÇÃO DE METEMOGLOBINA .............................................................. 58 DETERMINAÇÃO DE CARBOXIEMOGLOBINA NO SANGUE ............................... 62

. Será OBRIGATÓRIA a utilização de guarda-pó nas aulas práticas.1 COMUNICAÇÃO Pelo presente. respeitando-se os horários prédeterminados. estamos levando ao conhecimento dos alunos as seguintes informações: A freqüência às aulas será OBRIGATÓRIA. durante o andamento das análises. Usar luvas e pós-pipetas para manuseio do material biológico. Não torne a colocar no frasco de origem o reagente dele retirado ou nele introduzir objetos estranhos (pipetas. Zelar pela conservação do material utilizado e pela ordem do laboratório. deixando a vidraria usada nos locais indicados. Atender às recomendações para o despejo do material utilizado. Conserve as bancadas livres de materiais que não estão sendo usados. evite assim a contaminação do reagente e possibilitar a sua conservação por mais tempo. Não deixar frascos de reativos abertos.). Recomenda-se muito cuidado na utilização de substâncias corrosivas e inflamáveis. Não fumar. etc. comer ou ingerir líquidos no laboratório. Os alunos serão responsáveis pelas suas amostras. Solventes e líquidos fumegantes deverão ser manipulados dentro das capelas.

responsável e data. acetonas. benzeno. mercúrio. 1. hexano. . sem nenhuma indicação no rótulo. cobre. cátions. Quando o volume de rejeitos atingir 50% do volume total da bombona sobre a mistura. Tendo em vista que esta classe de rejeitos químicos não possibilita nenhum tipo de tratamento prévio dentro do laboratório.2 PROCEDIMENTOS GERAIS NO LABORATÓRIO 1.1. Antes do recolhimento dos rejeitos químicos ativos. zinco. etc). diclorometano.1 Solventes orgânicos clorados (ex: clorofórmio. 1. O procedimento adotado para estes solventes.3 Metais pesados. tolueno. Os frascos contendo rejeitos deverão ser rotulados e perfeitamente identificados com o nome do laboratório. é o mesmo adotado para solventes orgânicos clorados.2 Solventes não clorados (ex: álcoois. éteres. Lembrar que frascos contendo rejeitos químicos ativos. tetracloreto de carbono. Frascos extremamente cheios criam riscos quando transportados. Deixar decantar o precipitado. que estejam em perfeitas condições. devem ser armazenados em recipiente plástico resistente com tampa. dicloroetano. adicionar excesso de soda cáustica e cal virgem. 1. deve-se ter o devido cuidado no sentido da desativação destes. material. Evitar frascos com vazamentos. para que posteriormente sejam recuperados ou eliminados. Rejeitos químicos Para o recolhimento dos rejeitos químicos devem ser utilizados recipientes de vidro ou de plástico resistentes. O recolhimento dos rejeitos químicos não deve ultrapassar 2/3 da capacidade do recipiente. ânions em meio aquoso (ex: chumbo. O tratamento dos rejeitos inorgânicos compreende as seguintes etapas: O material deve ser lançado em bombonas de plástico de 50 litros no final de cada experiência. principalmente com relação à vedação dos mesmos. etc). expõem os funcionários do setor a sérios riscos. etc). citados no item 1.

Certifique-se o material a ser utilizado está devidamente limpo e seco. Lavagem do material .Resíduos de detergentes no material utilizado podem causar alterações nos resultados e contaminar os reagentes. 1. UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA. .gov. O vasilhame deve ser lacrado. carbonatos.A limpeza da vidraria deve ser feita com detergente neutro. Repetir o procedimento até não mais formar nenhum precipitado.A seguir enxaguar duas vezes com água destilada ou deionizada.3 Por sifonagem. Depois de neutralizado.nsf/0/121 c4ea357070a400325642c005de5aa?OpenDcument. Fiscalização sanitária em laboratórios de análises clínicas no município de Belo Horizonte. O sobrenadante final pode ser lançado na pia (estas etapas são realizadas por técnicos da universidade).ufsc. acondicionado em saco plástico branco leitoso e encaminhado para a coleta hospitalar. 2. fosfatos. visto que sais do tipo cloretos. Boletim Oficial. 4. separar o precipitado do sobrenadante em novas bombonas. Descarte materiais biológicos Urina: as amostras de urina devem ser descartadas em recipiente próprio contendo hipoclorito de sódio. Testar se ainda ocorre precipitação com o sobrenadante. 3.br/aplic/boletim. Disponível em: http://www. . Sangue: as amostras de sangue devem ser descartadas em tubos ou frascos bem vedados e à prova de vazamentos em recipientes de paredes rígidas. Acesso em 25/11/2009. o material poderá ser lançado na pia.br/smsa/biblioteca/gevis/port_017_99. Sistema de coleta de resíduos químicos. etc.. . Acesso em 26/04/2006. . Disponível em:notes.pdf.4 Ácidos e bases Soluções aquosas diluídas de ácidos e bases deverão ser colocadas em recipiente tipo béquer e neutralizadas no final de cada experiência. Bibliografia PORTARIA SMSA-SUS/BH Nº 017 de 03 de março de 1999. Os frascos coletores devem ser descartados em saco plástico branco leitoso e encaminhados à coleta de lixo hospitalar.Secar a temperatura ambiente. . na forma diluída não são prejudiciais ao meio. sulfatos.pbh. e devidamente identificados com o símbolo internacional de “Risco Biológico”.Enxaguar três vezes com água corrente.

às expectativas exigidas para a obtenção de resultados confiáveis. . uma análise do tipo forense poderia estar incluída em quaisquer das áreas da Toxicologia anteriormente citadas. isto porque. Por exemplo. que atenda as suas características peculiares.4 ANÁLISES TOXICOLÓGICAS Um laboratório de análises toxicológicas tem grande importância.Avaliação da qualidade do ar. de se quantificar tal substância e se tentar correlacionar o valor obtido com o quadro tóxico exibido. a realização de Análises Toxicológicas dependerá da finalidade destas. quanto das informações que seus profissionais podem fornecer. Em cada uma destas áreas vamos encontrar necessidades diferentes.Limite de Tolerância e Limite Biológico de exposição: controle do nível de exposição e prevenção no ambiente de trabalho. Então. de Medicamento e Social. principalmente aqueles que possuem estreita margem de segurança.Forense: toda análise com propósitos legais. decorrendo daí. Ambiental.Controle terapêutico: nível sanguíneo de fármacos. uma vez que. podemos dividir a toxicologia em 5 áreas principais: Toxicologia Ocupacional. Exemplo: um indivíduo em controle de farmacodependência à anfetamina.Avaliação da qualidade dos Alimentos . pouco valor tem o fato de mencionarmos que este ou aquele agente tóxico foi identificado no sangue do trabalhador. precisamos de profissionais treinados e capazes de lidar com diferentes instrumentos analíticos. tanto do ponto de vista das análises que pode oferecer. na maioria das vezes. sabemos as condições de exposição. Quanto a Finalidade. as análises toxicológicas necessitam de metodologia variada. Com a larga utilização das substâncias químicas na atualidade. . Assim sendo. o método mais adequado etc. Dentro do exposto. . questões como: natureza da substância a ser pesquisada.Dose Diária Aceitável. da água e dos solos.Auxílio diagnóstico nas emergências toxicológicas e outras. isto não ocorre na área de Toxicologia Social. a concentração esperada. pois sua identificação já basta a esta finalidade. . sim. esta poderá ser: . Para atender. há necessidade. Entretanto. um aumento no número de análises tem sido registrado. no entanto. na Toxicologia Ocupacional. não precisamos quantificá-los. amostra a ser utilizada. se encontrarmos o fármaco inalterado ou seus produtos de biotransformação. Para entendermos melhor o que isto significa. de Alimentos. poderemos abordar outros aspectos relacionados a cada sub-item mencionada qual seja: . .

3ª fase . para escolha do mais indicado e que se enquadre dentro da realidade do laboratório. sangue e a saliva. seja ela qual for. de maneira exata. A forma de distribuição da substância no organismo também é um importante fator a ser considerado. na identificação de fenobarbital em conteúdo estomacal proveniente de necrópsia de indivíduo com histórico de uso excessivo desse fármaco (neste caso. Natureza da substância: ou seja. conteúdo estomacal etc. na determinação de resíduos de inseticidas organoclorados (aqui necessitaríamos de um cromatógrafo a gás acoplado a um detector de captura de elétrons). 2ª fase . por exemplo.). sangue. para um gás irritante. Concentração esperada . pois isto poderia definir o destino do trabalhador exposto. de ação local e sem ação sistêmica a melhor amostra seria o ar do ambiente geral ou do ambiente de trabalho. Uma substância poderá ser amplamente biotransformada no organismo e se a pesquisa for efetuada na urina poderemos não encontrá-la e sim. pulmões etc. pouco sensíveis.Separação: eliminação dos componentes indesejáveis onde se encontra a substância objeto de análise. a disponibilidade de equipamentos.disto resultará implicações relativas à sensibilidade das técnicas empregadas: altamente sensíveis.uma revisão bibliográfica especializada seria necessária para avaliação dos métodos utilizados. na verificação de intoxicações letais são as víceras (rins. seus produtos de biotransformação. urina. em exames anti-dopping é a urina. baço. poderíamos. suas propriedades fisico-químicas e como se comporta. Se um indivíduo está exposto a benzeno no seu ambiente de trabalho e recebemos urina para análise. uma substância deverá ser pesquisada neste ou naquele local. ou seja. De que adiantaríamos pesquisar chumbo no soro se esse agente se encontra em torno de 99 % ligado aos eritrócitos? De posse destes dados e de outros complementares relacionados a toxicocinética e a toxicodinâmica. redundaria noutro fato. via de regra apresenta três fases: 1ª fase . utilizar a cromatografia em camada delgada). o que podemos dosar é o fenol urinário ou o ácido trans-trans mucônico. como exame suplementar dosando-se tiocianato urinário. pois dependendo destes fatores. No controle terapêutico a amostra biológica ideal é o sangue. mas sim dizermos o quanto há. Neste caso. cérebro. Exemplos: na avaliação da exposição ocupacional aos compostos liberadores do íon cianeto. não adiantaria colhermos a amostra e dizermos que há a presença deste íon. o sangue seria útil na avaliação do íon cianeto e também a urina. fígado. poderíamos iniciar a análise propriamente dita que. Existem ainda outros fatores a serem considerados.5 Tipo de amostra: a finalidade da amostra está diretamente ligada à finalidade da análise e da substância a ser pesquisada. por exemplo.Identificação e /ou quantificação . Método mais adequado . pois o benzeno é quase que completamente biotransformado e desta maneira excretado. Exemplos: os inseticidas organoclorados são muito lipossolúveis e deverão ser pesquisados preferencialmente no sangue e no tecido adiposo.Extração: retirada do elemento do meio onde se encontra. Isso tudo.

Há que se analisar todo um conjunto de fatores envolvidos com este resultado.sangue. quando estas se fizerem necessárias. Vamos supor que após determinação da digoxina sérica. esse indivíduo não estaria submetido a uma terapia associada que estivesse produzindo sinergismo? A partir daí. rins. cérebro. Essa concentração está contida dentro da faixa considerada terapêutica (1. Esse indivíduo não poderia apresentar uma massa cardíaca sadia menor? Ou.2. ANÁLISE DOS RESULTADOS Após execução de uma Análise toxicológica. este paciente foi enviado ao laboratório para controle terapêutico justamente por exibir sinais de intoxicação. Finalizando o Toxicologista Analítico deve ser.ar expirado. obtemos um resultado.AMOSTRAS BIOLÓGICAS: . etc. antes de qualquer coisa. O histórico do paciente é de fundamental importância para que uma análise toxicológica chegue a bom termo. fígado. Entretanto. vesícula biliar.saliva. então. Entretanto. cabelos. na interpretação de seus achados para formar suas conclusões. . Como proceder diante de uma situação destas? Vemos.urina. isto não representa tudo.vômitos.0 . .víceras (estômago com seu conteúdo. que há a necessidade de se pensar em outros fatores relacionados com o quadro apresentado. não significa muito. . percebemos que deve haver uma preocupação constante quanto aos fatores que envolvem cada caso em particular e que a obtenção de um valor numérico.bile.0 ng / ml). sensibilidade precisão e exatidão.6 Entre uma fase e outra podemos incluir uma fase de purificação. . intestinos. então. . . intimamente familiarizado com os modernos equipamentos e técnicas que possam supri-lo com rapidez.fezes. . soro. . pura e simplesmente. TIPO DE AMOSTRAS 1 . encontramos uma concentração de 2 ng/ml (duas nanograma de digoxina por mililitro de soro).pelo. Deve estar igualmente habilitado na aplicação dos princípios básicos da Toxicologia. plasma. .). .leite materno. um exímio analista. unhas.

. .líquidos provenientes de lavagem estomacal ou de diálise.líquido céfalo raquidiano. 3 OUTRAS .Ar (do ambiente de trabalho). embalagem de medicamentos. etc.Alimento.Ar (do ambiente geral).Relacionadas com intoxicações agudas e/ou letais: copos c/ líquidos.Água.AMOSTRAS NÃO BIOLÓGICAS: (vetor que serve de meio de transporte do agente). etc.Relacionadas com a "Lei anti-tóxico": vegetais. 2 . seringas com líquidos. frascos com agrotóxicos. frascos com produtos de limpeza. . ampolas.gorduras. pós. .7 . seringas com líquidos. . . . .

A Col. B Paracetamol S1 Voláteis Agentes cromogênicos S2 FID / EC / NPD Resultados .8 DIAGNÓSTICO DAS INTOXICAÇÕES AGUDAS Banco de referência Amostras adicionadas Amostras autênticas Salicilatos Fenotiazínicos Imipramínicos Escolha do método de análise Reações diretas Extração seletiva Carbamatos Clorados Benzodiazepínicos Escolha do método de análise Sulfas Metais Paraquat / Diquat Colinesterase Triagem Camada delgada Sistemas solventes Confirmação e quantificação HPLC Fármacos especiais Fase gasosa Col.

endereço e número do telefone) Data/hora da ingestão ou exposição: Discutir sobre necessidades especiais ANTES de Medicamentos prescritos ou usados no enviar as amostras tratamento: Médico: Telefone/beep: Endereço do hospital para relatório (informação): Drogas/venenos reivindicados ou suspeitos: Assinatura: Paciente: Data: Outros nomes: Idade/data de nascimento: Consultante: Sexo: Responsável: Detalhes clínicos/investigação requisitada/prioridades: Número do Protocolo: Amostra Sangue (10 mL heparinizado) Urina (50 mL) Cateter: sim ( ) não( ) Data Hora Conteúdo estomacal (50 mL) Outros (fornecer detalhes) Adaptado de OMS / IPCS.35. . p.9 MODELO DE REQUISIÇÃO PARA ANÁLISE TOXICOLÓGICA REQUISIÇÃO PARA ANÁLISE TOXICOLÓGICA Data/hora da admissão: Para: (preencher o nome do laboratório. Basic Analytical Toxicology. Geneva: WHO. 1995.

etc. Basic Analytical Toxicology. Paraquat/diquat 7. Compostos triclorados 5. p. Ferro 10. Clorados. Etanol 8. 9. 17.39. 15. Fenotiazínicos 3. 12 13. CCD drogas ácidas + básicas 11. Geneva: WHO. Responsável pela Análise: Data / Hora: Observações: Adaptado de OMS / IPCS. 16. 1995. Paracetamol 6. Salicilatos 2. .10 MODELO DE FICHA PARA ANÁLISE TOXICOLÓGICA FICHA TOXICOLÓGICA Paciente: Hospital: Teste requisitado: Amostra Laboratório Médico: Telefone / beep: Prioridade: Data Hora Análise Qualitativa Laboratório Testes Realizados 1. 14. Imipramínicos 4.

11 MODELO DE LAUDO PARA ANÁLISE TOXICOLÓGICA UNIDADE DE ENSINO SUPERIOR VALE DO IGUAÇU UNIGUAÇU LABORATÓRIO DE TOXICOLOGIA Rua Padre Saporiti.edu.br Paciente: Hospital: Médico (a): Protocolo: Suspeita Unidade: Data Coleta: Data Entrada: Tipo de análise Hora: Hora: Resultado Material: Método: Observação: Responsável: . 717 – Rio d’ Areia CEP 84600-600 FONE: (42)3522-6192 e-mail: prof_elaineanton@uniguaçu.

12 TOXICOLOGIA DE MEDICAMENTOS .

Para que seja possível a comparação de coloração. A partir dos resultados obtidos com tais testes. podem ter os oxigênios de suas hidroxilas oxidados ou formar complexos com aquele elemento. Transferir o éter decantado para outro tudo e agitar com 2. b) Ferver cerca de 2 mL de urina em tudo de ensaio sem tampa. Esses produtos apresentam uma coloração que varia do azul ao violeta. . Adicionar 2. Inicialmente forma-se um precipitado esbranquiçado que após ficará púrpura (azul-violáceo). podendo-se então comparar a coloração obtida com a amostra suspeita. Centrifugar por 5 minutos a 2000 rpm.5 mL de água destilada e uma gota de cloreto férrico 10%. Esta reação não é específica. Reagentes: Cloreto férrico 1%: pesar 1 g de cloreto férrico e elevar o volume para 100 mL com água destilada em balão volumétrico. por terem maior número de ligas duplas conjugadas do que seu precursor. c) Em tubo de centrífuga. Como o ácido acetilsalicílico não possui hidroxila fenólica disponível. Esfriar (temperatura ambiente) e adicionar cloreto férrico 10% gota a gota. acidificar 5 mL de urina com cerca de 2 gotas de ácido sulfúrico 6N. Para concentrações maiores do que 150 mg/mL (nas intoxicações agudas) a cor violeta é inconfundível. 1. somente o ácido salicílico é capaz de formar complexos com sais de ferro. Salicilatos A presença de salicilatos pode ser identificada pela adição de solução de cloreto férrico a urina do paciente. A camada aquosa ficará violácea.5 mL de éter etílico e agitar por 1 minuto por inversão. por aproximadamente 2 min. O aquecimento elimina corpos cetônicos que podem estar interferindo na análise. vale como triagem para todos os compostos fenólicos. quando em presença do elemento ferro. Procedimento: a) A 1 mL de urina adicionar 0. Os polifenóis.13 TESTES COLORIMÉTRICOS RÁPIDOS PARA IDENTIFICAÇÃO DE AGENTES TÓXICOS – TOXICOLOGIA DE MEDICAMENTOS Os testes rápidos de coloração e/ou precipitação para identificação de agentes tóxicos têm seu valor como triagem. são utilizados nestes testes controles positivo (adicionado de medicamentos) e negativo (isento de medicamentos).5 mL de cloreto férrico 1%. Derivados fenólicos também dão essa reação. podemos direcionar um pouco mais o trabalho analítico.

Interferentes: constituintes endógenos da urina. Reagentes: Solução aquosa de fenol 1%: colocar 1 g de fenol em balão volumétrico de 100 mL e completar o volume com água destilada. Prodecimento: a) Com reagente FPN A 1 mL de urina adicionar 1 mL do reagente FPN. .: quando colocar o reagente FPN colocá-lo gota a gota pelas paredes do tubo. Paracetamol O paracetamol é em sua maior parte metabolizado por conjugação com ácido glicurônico previamente a excreção urinária. Não agitar o tubo. resultando numa tintura fortemente colorida. 1 mL de HCl concentrado. Procedimento: Em tubo de ensaio adicionar 1 mL de urina. Ácido sulfúrico 6N: diluir 16. Este se conjuga com solução de fenol e hidróxido de amônio.4 mL de hidróxido de amônio em um balão volumétrico de 100 mL e completar o volume com água destilada. O teste descrito abaixo é baseado na reação de muitos destes compostos com íon férrico sob condições ácidas. assim dando um teste qualitativo sensível.7 mL de ácido sulfúrico concentrado em água destilada e levar para 100 mL em balão volumétrico. Solução de hidróxido de amônio 4M: colocar 10. possui mais de 50 metabólitos em humanos. Resultados positivos devem ser confirmados por CCD. A reação com FPN é rápida (5 segundos). 2. por exemplo. indica a presença de fenacetina ou paracetamol. Submeter ao banho de água fervente por 20 minutos. pigmentos biliares. Resfriar a temperatura ambiente (jamais resfriar na torneira). Uma coloração rosa-vermelha indica a presença de fenotiazínicos (a coloração depende da quantidade presente).14 Cloreto férrico 10%: pesar 10 g de cloreto férrico e elevar o volume para 100 mL com água destilada em balão volumétrico.2 mL da urina hidrolisada e adicionar 5 mL de fenol 1% e 3 mL de NH4OH 4M. Retirar 0. resultando em paminofenol. 3. o ácido salicílico não sendo estável em meio fortemente ácido não interfere nesta reação. A hidrólise do conjugado glicurônico se dá por tratamento com ácido clorídrico concentrado. Obs. Clorpromazina e outros fenotiazínicos Fenotiazinícos são extensamente metabolizados. Clorpromazina. Cor azul desenvolvida em 10 min. se a coloração aparecer após alguns minutos provavelmente é interferente.

(Teste de Forrest). Solução estável se mantida em refrigeração a 4oC. o surgimento de coloração. Colorações que variam do amareloesverdeado até verde escuro ou azul sugerem a presença dos antidepressivos tricíclicos (imipramina e desipramina).s.5 mL de cada reagente).p. Antidepressivos tricíclicos (imipramina e derivados) O antidepressivo tricíclico imipramina é usado extensamente. 4. K2Cr2O7 0.p. 100 mL) H2SO4 30 % v/v (30 mL H2SO4 – H2O reagente q. é baseado na reação destes compostos com solução de dicromato de potássio acidificada.p. 100 mL) . Reagentes: FPN: misturar 5 mL de solução aquosa de cloreto Férrico 50 g/L.25%.s.5 mL de amostra (urina ou conteúdo estomacal). a qual também é usada como antidepressivo. Reagente de Forrest: 25 mL da solução aquosa de dicromato de potássio 0.s.2 % (0. 100 mL) HNO3 50 % v/v (50 mL – H2O reagente q.2%. sendo metabolizada por desmetilação para desipramina. Observar.15 b) Com cloreto de ouro A 1 gota de urina adicionar 1 gota de cloreto de ouro. Reagente Cloreto de ouro: misturar partes iguais de ácido tricloroacético 20% e cloreto de ouro a 0.s. 25 mL de solução aquosa de ácido perclórico 20%. Obs: Misturar sempre volumes iguais (ideal para uma análise é 2 mL do reagente de Forrest – 0. 25 mL de solução aquosa de ácido sulfúrico 30%. Uma coloração vermelha indica clorpromazina e outros fenotiazínicos. imediatamente. 45 mL de solução aquosa de ácido Perclórico 20% (20 mL HClO4 em 100 mL H2O) e 50 mL de solução aquosa de ácido Nítrico 50% (50 mL HNO3 em 100 mLde H2O). Procedimento: Em tubo de ensaio colocar 0. O teste descrito abaixo.2 g K2Cr2O7 – H2O reagente q. 25 mL de solução aquosa de ácido nítrico 50%. Adicionar 1 mL do Reagente de Forrest e misturar por 5 segundos.p. 100 mL) HClO4 20 % v/v (20 mL HClO4 – H2O reagente q.

2004. Clin. Bras. 59-236. Farmacognosia. 2004. F. Geneva: WHO. 640..J. . A. Dissertação de Mestrado. Toxic. OMS/IPCS.. Monographs: analytical and toxicological data. B. p. R. S. Basic Analytical Toxicology. R. A. DECKER. 10. 1995. Faculdade de Ciências Farmacêuticas. Spot Tests for rapid diagnosis of poisoning. 36: 143-144. MEREK. C. v. Determinação da salicemia em crianças portadoras de artrite reumatóide juvenil por colorimetria e espectrofluorimetria. F. 1986. S.16 6. Clarke's isolation and identification of drugs. MORAES. Universidade de São Paulo. An. Cap. L.P. A. (ed). Padronização de spot testes para uso em laboratórios com atendimento em emergência toxicológicas. Rev. 1972. M. MOFFAT. III. Bibliografia: COSTA. ITINOSE.. Clin. Lisboa: Fundação Calouste Gulbenkian. W. London: Pharmaceutical Press. p. PIVA. 4: 89-97. 1971.

2. Amostra: A urina deve ser coletada em um recipiente limpo de vidro ou plástico. Caso a urina adicionada ao dispositivo apresente níveis abaixo da sensibilidade de detecção do teste. Ela pode ser refrigerada (2º-8ºC) por 2 dias ou congelada (-20ºC) por um longo período. impedindo que o conjugado anticorpo/colorido ligue-se ao conjugado de droga/proteína retido na região (T) do dispositivo.17 TESTES RÁPIDO PARA (IMUNOCROMATOPLACAS) 1. barbitúricos e antidepressivos tricíclicos. opióides. o conjugado anticorpo/colorido ligado ao conjugado droga/proteína fica na região do teste (T) do dispositivo. . As amostras que forem congeladas devem ser descongeladas e misturadas antes do teste. Caso a urina adicionada ao dispositivo apresente níveis acima da sensibilidade de detecção do teste. É um dispositivo absorvente cromatográfico em que as drogas ou os metabólitos da droga em uma amostra competem com o combinado de droga/proteína retido em uma membrana porosa por um número limitado de locais obrigatórios que apresentam conjugados de anticorpos coloridos. Um método de teste alternativo deve ser usado a fim de obter um resultado analítico mais específico. a droga livre na amostra liga-se ao conjugado anticorpo/colorido. Caso haja amostras com grande quantidade de partículas. indicando uma amostra potencialmente positiva. Limites de detecção: As concentrações de interrupções (cut-off) para cada classe de medicamentos no painel de Quick Screen teste são: BZD Benzodiazepínicos 200 ng/mL OPI Opióides 300 ng/mL BAR Barbitúricos 300 ng/mL TCA Antidepressivos tricíclicos 1000 ng/mL 4. Isto impede o desenvolvimento de uma faixa colorida. Medicamentos: Benzodiazepínicos. Fundamento analítico: TRIAGEM DE MEDICAMENTOS Estes testes fornecem somente um resultado preliminar. O dispositivo do teste emprega uma combinação original de anticorpos monoclonal e policlonal para identificar seletivamente medicamentos e seus metabólitos na urina com um elevado grau de confiança. A cromatografia gasosa com espectrometria de massa (CG/MS) é o método confirmatório preferido. 3. Os Quick Screen testes para medicamentos são testes competitivos rápidos de imuno-análise qualitativa para detecção de medicamentos e seus metabólitos na urina. Outros métodos químicos de confirmação estão disponíveis. estas urinas devem ser clareadas por centrifugação ou deixadas em repouso para sedimentar antes de serem testadas. Isto produz uma faixa colorida do teste que não obstante sua intensidade indica um resultado negativo. A urina que for refrigerada deve alcançar a temperatura ambiente (15º-25ºC) antes de ser testada.

. San Diego: Pharmatech Inc. . Procedimento: . 2005.Abra a dobradura do cartucho no entalhe. Quick Screen teste Opiódes. Bula de kit. Interpretação dos resultados: Positivo Um resultado positivo será indicado quando uma (1) faixa colorida de cor lilás aparecer apenas na região de controle (C). Tome cuidado para não tocar na membrana exposta. Entretanto. Os controles positivos e negativos dentro de 25% da concentração cut-off devem produzir os resultados previstos. Bula de kit. 2005. . 8. remova o aparelho de teste. 2005. 6. Este resultado sugere que a amostra contenha medicamento em um nível abaixo ao da concentração cut-off para aquele medicamento. Negativo Um resultado negativo é indicado quando duas (2) faixas coloridas de cor lilás aparecem. 7. Controle de qualidade: Uma linha processual interna foi incorporada ao dispositivo do teste para ajudar a assegurar o desempenho e a confiabilidade ao Kit. mas não na região de teste (T).Leia o resultado do teste imediatamente. Inválido Um teste deve ser considerado inválido se nenhuma faixa aparecer na região de controle (C). 2005. o uso de controles externos é recomendado. uma na região de controle (C) e outra na região de teste (T). Quick Screen teste Tricíclico Antidepressivo. San Diego: Pharmatech Inc. Bibliografia: Quick Screen teste Barbitúricos. Resultados lidos após terem passados 15 (quinze) minutos não devem ser considerados.Aguarde 10 (dez) minutos. Quick Screen teste Benzodiazepinas.Segure o conta-gotas verticalmente e pingue 05 gotas de urina dentro do reservatório destinado para a amostra. A intensidade da cor do controle positivo não deve ser usada como referência. Bula de kit. San Diego: Pharmatech Inc.18 5. Este resultado sugere que a amostra contenha medicamento em um nível igual ou superior ao da concentração cut-off para aquele medicamento. San Diego: Pharmatech Inc. Bula de kit. . A presença de uma faixa de controle é necessária para confirmar o desempenho da análise.

estando esta semifechada e ligada (abertura deve ser de 0. a evaporação acontece em 10 minutos. . .Evaporar em temperatura ambiente. Assim. Baseia-se em uma extração líquido/líquido.1 Substâncias de caráter ácido e/ou neutro: Colocar 10 mL da amostra num béquer de 20 mL e ler o pH. 2. Extração: Para identificação de medicamentos através de cromatografia em camada de delgada ou outros métodos. os medicamentos e outras substâncias são extraídos de material biológico com solventes orgânicos. vísceras. devemos primeiramente extraí-los do meio em que se encontram. outros. Adicionar 5 gotas de diclorometano. . Confirmar se é realmente água da seguinte maneira: transferir o líquido do fundo do béquer para um eppendorf com auxílio de uma micropipeta. A porta da capela ao lado deve estar totalmente fechada. Dessa forma.0 – 5. extraímos as substâncias em meio ácido. . aplicados em placas cromatográficas e eluidos em sistema solvente.5 cm mais alta do que a altura do béquer). sangue total com anticoagulante. medicamentos suspeitos. 2.Deixar o funil em repouso (± 5 min) para separação das fases (orgânica/aquosa).5 N (+/.Na fase remanescente (aquosa – urina) repetir os itens acima recolhendo o filtrado no mesmo béquer. em pH ácido e básico.19 MARCHA SISTEMÁTICA PARA EXTRAÇÃO DE MEDICAMENTOS DE MATERIAL BIOLÓGICO Esta metodologia é de ordem qualitativa. se . O béquer deve ser colocado a uma distância de aproximadamente 0. Pode haver formação de água de condensação na parede do béquer e posteriormente no fundo. neutro e básico e depois realizamos a sua identificação.0 por meio de solução de H2SO4 0.Filtrar a fase orgânica (inferior) em papel filtro contendo sulfato de sódio anidro (o equivalente a ponta de uma espátula pequena) e recolher o extrato em béquer de 50 mL (Rác). .Ajustar o pH entre 4. . aplicada em suspeitas de intoxicação por medicamentos e outras substâncias e baseia-se na comparação da amostra com um padrão do agente toxicante suspeito. conteúdo estomacal. Os extratos obtidos são concentrados. 1.Extrair com 10 mL de clorofórmio : isopropanol (9:1) agitando vigorosamente por 2 minutos. Amostras: Urina (coletada recentemente ou conservada a 4ºC).3gotas) e transferir a amostra para um funil de separação.5 cm da porta da capela.

Deixar o funil em repouso (± 5 min) para separação das fases (orgânica/aquosa). Reservar o extrato para cromatografar.20 haver formação de 2 fases. confirma-se a presença de água de condensação.Filtrar a fase orgânica (inferior) em papel filtro contendo sulfato de sódio anidro e recolher o extrato em béquer de 50 mL (Ralc). .Evaporar em temperatura ambiente. Adicionar aproximadamente 2 gotas de ácido clorídrico:metanol (1:100 v/v). 4 e 5 recolhendo o filtrado no mesmo béquer. estando esta semifechada e ligada (abertura deve ser de 0. Pode haver formação de água de condensação na parede do béquer e posteriormente no fundo. Podese despreza-la do béquer e proceder somente com o extrato. Adicionar 5 gotas de diclorometano. . solução de NH4OH a 10% até a obtenção de pH 8 a 9 (+/.8 gotas). Confirmar se é realmente água da seguinte maneira: transferir o líquido do fundo do béquer para um eppendorf com auxílio de uma micropipeta. . se haver formação de 2 fases.2 Substâncias de caráter básico e/ou neutro: .5 cm da porta da capela.5 cm mais alta do que a altura do béquer).Na fase remanescente (aquosa – urina) repetir os itens 3. . 2. Reservar o extrato para cromatografar. Podese desprezá-la do béquer e proceder somente com o extrato. Dessa forma. A porta da capela ao lado deve estar totalmente fechada.Extrair com 10 mL de clorofórmio : isopropanol (9:1) agitando vigorosamente por 2 minutos. a evaporação acontece em 10 minutos. O béquer deve ser colocado a uma distância de aproximadamente 0. confirma-se a presença de água de condensação.Adicionar a camada aquosa remanescente no balão de separação. . .

21

3. Fluxograma simplificado da extração de agentes tóxicos de material biológico

Amostra – 10mL
urina, lavado gástrico, e outros
Acidificar (pH 4-5 com H2SO4 0,5N) Extrair c/ 10mL clorofórmio:isopropanol 9:1

Fase orgânica Filtrar sobre Na2SO4 anidro

Fase aquosa Alcalinizar c/ NH4OH 30% até pH 8-9 extrair com 10mL clorofórmio-isopropanol 9:1

Extrato ácido
no

Evaporar Fase aquosa (descartar) Resíduo Ácido Fase orgânica Filtrar sobre Na2SO4 anidro Extrato Alcalino (Rac) Evaporar

Resíduo Alcalino

Obs.: Colocar nos extratos alcalinos 1-2 gotas de HCl diluído em metanol (1 ml de HCl em 100 ml de metanol) para evitar perdas em relação aos derivados anfetamínicos

(Ralc)

22

4. Identificação por cromatografia em camada delgada: Após a evaporação dos resíduos (Rácido e Ralcalino), ressuspendê-los com 5 gotas da mistura de solvente orgânico clorofórmio-isopropanol (9:1). 4.1. Aplicação: Utilizando microcapilares, transferir 3 microgotas das amostras e 3 microgotas dos padrões para as placas cromatográficas ativadas a 110° C por 1 hora. 4.2. Eluição: Sistemas Eluentes: 1. Clorofórmio- acetona ( 9:1). 2. Metanol - amônio (100:1,5 ). Após a aplicação, colocar as placas em cubas previamente saturadas contendo o sistema eluente adequado. Deixar correr até 12 cm, retirar as cromatoplacas e secar em temperatura ambiente até a evaporação total dos eluentes. 4.3. Revelação: A revelação deve ser realizada em três etapas: 1)Observar as cromatoplacas sob luz ultravioleta (UV) de ondas curtas (254 nm) e ondas longas (366 nm). 2) A seguir vaporizar com os agentes cromogênicos específicos. 3) Observar novamente as cromatoplacas sob luz ultravioleta (UV) de ondas curtas (254 nm) e ondas longas (366 nm).

5. Agentes cromogênicos: - Solução de cloreto férrico a 5 % (Salicilatos) - Solução de nitrato mercuroso a 1 % (Barbitúricos) - Reativo de Dragendorff Modificado (Alcalóides e Geral) - Reativo cloroplatínico acidificado (Geral) - Reagente de Forrest (Imipramina) 5.1 Preparação dos agentes cromogênicos: 5.1.1 Solução de cloreto férrico 5%: Pesar 5 g de cloreto férrico (FeCl3) e dissolver em quantidade de água destilada suficiente para completar 100 mL de solução.

23

5.1.2 Nitrato mercuroso 1%: Pesar 1 g de nitrato mercuroso (HgNO3) e dissolver em quantidade de água destilada suficiente para completar 100 mL de solução. 5.1.3 Reativo de Dragendorff Modificado: Adicionar 1,0 g de Iodo para cada 100 mL do Reativo de Dragendorff. Reativo de Dragendorff Solução A: 2,0 g de subnitrato de bismuto 25 mL de ácido acético 100 mL de água destilada Solução B: 40 g de Iodeto de potássio 100 mL de água destilada Solução de uso: 10 mL de A + 10 mL de B + 20 mL de ácido acético + 100 mL de água destilada. 5.1.4 Reativo Cloroplatínico Acidificado: Solução ácido cloroplatínico a 10%........................ 3,0 mL Água destilada ......................................................... 97 mL Solução de iodeto de potássio a 6% ..................... 100 mL Para cada 100 mL de solução adicionar 2 mL de ácido clorídrico concentrado. 5.1.5 Reagente de Forrest: 25 mL de solução aquosa de dicromato de potássio 0,2%; 25 mL de solução aquosa de ácido sulfúrico 30%; 25 mL de solução aquosa de ácido perclórico 20%; 25 mL de solução aquosa de ácido nítrico 50%. Obs: Misturar sempre volumes iguais (ideal para uma análise é 2 mL do reagente de Forrest – 0,5 mL de cada reagente). Solução estável se mantida em refrigeração a 4oC. K2Cr2O7 0,2 % (0,2 g K2Cr2O7 – H2O reagente q.s.p. 100 mL) H2SO4 30 % v/v (30 mL H2SO4 – H2O reagente q.s.p. 100 mL) HClO4 20 % v/v (20 mL HClO4 – H2O reagente q.s.p. 100 mL) HNO3 50 % v/v (50 mL – H2O reagente q.s.p. 100 mL)

24 6. assim diversos fatores podem interferir no resultado da análise.D. Toxicologia Humana e Geral. relata boa sensibilidade para concentrações de 5mg/L.. faz com que se tenha controle do método e segurança na identificação da substância pesquisada. p. Vieira (1979). Ribeirão Preto: USP. D. MELLO. 2 ed. . MACHADO. 1988. devendo estes ser bem controlados durante todo o procedimento analítico. extração eficiente. Assim a associação destes dois parâmetros. M.P. natureza do adsorvente. dos solventes e das placas cromatográficas utilizadas. FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS DE RIBEIRÃO PRETO/USP. 676. Rio de Janeiro: Atheneu.G. 67p. Cálculo do valor de Rf: Rf = distância percorrida pela substância em cm distância percorrida pelo solvente em cm Χ 100 7. 8.. FERNANDES. A verificação dos valores de Rf se dá através da utilização de diferentes sistemas solventes. juntamente com utilização de padrões de referência em todas as análises. 9. saturação da cuba. Análises toxicológicas de urgência: apoio analítico aos centros de intoxicação.M. Sensibilidade: Em sua dissertação de mestrado. Bibliografia: BRITO-FILHO. R. alteração dos valores de Rf em função da temperatura ambiente. Manual de Técnicas Analíticas. A detecção envolve a visualização da substância à luz UV (em 254 ou 366 nm) ou ainda pela aplicação de determinado reagente ou combinação de reagentes (reativos cromogênicos) proporcionando uma reação de cor característica da substância em análise. intensidade da reação de cor quando na aplicação dos reativos cromogênicos. Validade do método: Os principais parâmetros envolvidos na identificação de uma substância por CCD são a detecção e os valores de Rf. Tais fatores podem ser: experiência do analista. Fatores interferentes: A CCD é uma técnica que envolve muitas variáveis. 1984. 10. S. UNICAMP: Centro de Controle de Intoxicações/Laboratório de Toxicologia.

VIEIRA. 1979. Geneva: WHO. London: Pharmaceutical Press. OMS/IPCS. 59-236. Identificação de fármacos em urina por cromatografia em camada delgada: Faculdade de Ciências Farmacêuticas. Monographs: analytical and toxicological data. 2004. C. Clarke's isolation and identification of drugs. S.P. A. Universidade de São Paulo.25 MOFFAT.V. R. (ed). . 1995. Dissertação de Mestrado. p. Basic Analytical Toxicology.

A intensidade desta coloração é proporcional à concentração de acetaminofeno e pode ser medida em espectrofotômetro UV-Visível no comprimento de onda ótimo de 430 nm.2 Hidróxido de sódio 8 M Dissolver 32 g NaOH em 50 mL de água destilada e completar o volume para 100 mL em balão volumétrico. Estabilidade: Armazenar em geladeira a 4°C por no máximo uma semana. O método se baseia na reação do acetaminofeno (N-acetil p-aminofenol) com o ácido nitroso formando assim o 2-nitro-4-acetaminofenol o qual assume uma coloração amarela em meio alcalino. 4.1 Ácido tricloroacético 3% Pesar 3 g de CCl3COOH (ácido tricloroacético) e dissolver em cerca de 50 mL de água destilada.0241 g de nitrito de sódio e dissolver em 5 mL de água destilada.1000 g de paracetamol em pequena quantidade de etanol e transferir para um balão volumétrico de 100 mL.3 Nitrito de sódio 0.07 M Pesar 0. .4 Solução estoque de paracetamol 1. 3. 2. Completar o volume com água destilada. Amostra: Soro ou plasma (soro apresenta menor interferência na metodologia). 4. Obs: Não usar como anticoagulante heparina ou outras soluções que contenham ocresol como preservativo.0 mg/mL Dissolver 0. Princípio do método: Cerca de 25 a 30% do Paracetamol (Acetaminofeno) administrado no organismo se liga às proteínas plasmáticas sendo necessário um pré-tratamento da amostra com ácido tricloroacético para precipitação das proteínas. Solução instável deve ser preparada na hora do uso. Preparo das soluções: 4.26 DETERMINAÇÃO DE PARACETAMOL EM ESPECTROFOTÔMETRO UV-Vis 1. Deve ser preparada sempre que uma nova curva for feita. Completar o volume para 100 mL em balão volumétrico. Coletar a partir da 4a hora da ingestão do paracetamol e registrar o horário da coleta. 4. 4.

Transferir 2 mL do sobrenadante para um tubo de ensaio de 5 mL.0 mg/L: Pipetar 0.Agitar em vórtex e efetuar a leitura da absorbância em 430 nm dentro de no máximo 1 hora. Curva de calibração: A partir da Solução Estoque de paracetamol 1. Adicionar 0.0 mL de solução estoque de paracetamol em balão volumétrico de 10 mL e completar o volume com soro. de cada ponto da curva de calibração. Procedimento: . 6. .5 mL de solução estoque de paracetamol em balão volumétrico de 10 mL e completar o volume com soro. da amostra em duplicata e do soro controle. P 75. Centrifugar por 15 minutos a 2500 rpm. pipetar 500 µL do branco (soro isento de paracetamol). P 150.Utilizando tubos Falcon de 15 mL. P 100.75 mL de solução estoque de paracetamol em balão volumétrico de 10 mL e completar o volume com soro.0 mg/mL e soro (branco). Retirar do banho-maria e adicionar 2 gotas de NaOH 8M.27 5. . preparar a curva de calibração: P 25.0 mg/L: Pipetar 0.0 mg/L: Pipetar 1.5 mL de nitrito de sódio 0.0 mg/L: Pipetar 0.0 mg/L: Pipetar 1.Adicionar 3 mL da solução de ácido tricloroacético 3 % em cada tubo e agitar em vórtex durante 30”.25 mL de solução estoque de paracetamol em balão volumétrico de 10 mL e completar o volume com soro. Colocar os tubos em banho-maria a 37ºC durante 10 minutos.5 mL de solução estoque de paracetamol em balão volumétrico de 10 mL e completar o volume com soro.07 M e homogeneizar. . P 50.

Fluxograma analítico: Branco da Amostra 500 uL de soro ou plasma (sem paracetamol) Curva de calibração e Soro Controle 500 uL de soro ou plasma Amostras em Duplicata 500 uL de soro ou plasma .Vórtex por 30 segundos .Centrífuga.Banho-maria a 37º por 10 minutos . 2500 rpm por 15minutos .07 M .2 gotas de NaOH 8 M .0.Vórtex por 30 segundos Realizar as leituras em espectrofotômetro λ = 430 nm .5 mL de nitrito de sódio 0.2 mL do sobrenadante .28 7.3 mL de ácido tricloroacético 3 % .

oxifenilbutazona. A. POLKLIS. ácido salicílico. HALE. Toxicologia Humana e Geral. 1983. 10. Bibliografia: BRITO-FILHO.29 8. em casos de intoxicação aguda. teofilina. Evalution of a modified colorimetric assay for the determination of acetaminophen in serum. 2 ed. 619. p. Para tanto se deve fazer a coleta da amostra de sangue a partir de 4 horas após a ingesta do fármaco. Rio de Janeiro: Atheneu. Interpretação do resultado: A interpretação do resultado das análises de paracetamol é realizada através do NOMOGRAMA DE RUMACK (Figura 1) pela correlação entre a concentração de paracetamol e o tempo de ingesta. Interferentes: Os medicamentos: fenilbutazona. . P. 1988. Figura 1: Nomograma de RumacK 9. 4-amino salicílico e levodopa. D. A quantificação do paracetamol é importante para avaliação do risco de dano hepático.. onde se tem o pico de absorção. Journal Analytical Toxicology. Uso de heparina como anticoagulante e soluções que contenham o-cresol.W. 7: 249251.

C. C.B. São Paulo: Roca. R. East Norwalk : Appleton e Lange. R. 59-236. K.30 ITINOSE. (ed). 130-131.. OLSON. 1991. E. N. 1994. p. MOFFAT. SZNELWAR. London: Pharmaceutical Press. FERNICOLA. Manual de Toxicologia Analítica. B. .G.G. Clarke's isolation and identification of drugs.). Farm. A. Geneva: WHO.A.. MORAES. Poisoning & drugs overdose. 61-63.. 1987. Basic Analytical Toxicology.F. Bioq. 2004. Rev. Determinação de paracetamol em soro por espectrofotometria na região do visível. p.M. (Ed. Monographs: analytical and toxicological data. p. SZNELWAR. 18 (2): 164-176. OMS/IPCS. 1995. A.

Coletar a partir da 6a hora da ingestão e registrar o horário da coleta. Nos tubos “BA” e “BP” adicionar 1 mL da solução de ácido nítrico 0.42 g/ml e T=70. Procedimento: Colocar em dois tubos de ensaio marcado “A” (Amostra) e “BA” (Branco da Amostra) alíquotas de 0.s. Este último. Reagentes: 1. 4.07 N. Solução de nitrato férrico a 1% em ácido nítrico 0. por possuir uma hidroxila aromática.47 mL de ácido nítrico concentrado em 100 mL de água destilada. Em seguida.2 mL de amostra. Amostra: Soro. 2. 2. adicionar 1 g de de nitrato férrico.07 N: diluir 4. Solução padrão de salicilato – 250 ug/mL: 25 mg de ácido salicílico em q.2 mL da solução padrão de salicilatos. . Efetuar as leituras das absorbâncias em 540 nm usando o branco correspondente. Adicionar 1 mL da solução de nitrato férrico aos tubos “A” e “P”. Adicionar 0. interage com nitrato férrico produzindo um composto colorido que é medido em espectrofotômetro a 540 nm. Solução de ácido nítrico 0.5%) em 1000 mL de água destilada.p. Homogeneizar e aguardar 5 minutos.07 N: diluir 0.7 mL de ácido nítrico concentrado (d=1.31 DETERMINAÇÃO DE SALICILATOS EM ESPECTROFOTÔMETRO UVVIS (MÉTODO DE KAYE) 1. 3. 3. Princípio do Método: Os salicilatos são hidrolisados com ácido nítrico formando ácido salicílico. Em outros dois tubos marcados “P” (Padrão) e “BP” (Branco do Padrão) colocar alíquotas de 0.8 mL de água destilada em todos os tubos. de metanol e completar o volume para 100 mL com água destilada em balão volumétrico .

32 5. Fluxograma analítico: COLOCAR FLUXOGRAMA !! .

onde se tem o pico de absorção. Amostra (mg%) = Absorbância Amostra Absorbância Padrão 7. o tempo de ingesta.33 6. O Nomograma de Done (Figura 2) permite uma avaliação do prognóstico do paciente através da correlação da concentração plasmática de salicilato e. Cálculo: Conc. Para tanto se deve fazer a coleta da amostra de sangue a partir de 6 horas após a ingesta do fármaco. Salic. x 25 Figura 2: Nomograma de Done . Interpretação do resultado: A interpretação do resultado das análises para determinação de Salicilatos é feita através do NOMOGRAMA DE DONE.

L. 1986. MORAES. 3 ed. Illinois : Charles C. Bibliografia: KAYE.P. F. S. 1963. p. Universidade de São Paulo. Thomas. Dissertação de Mestrado. R. S. Handbook of Emergency Toxicology. Determinação da salicemia em crianças portadoras de artrite reumatóide juvenil por colorimetria e espectrofluorimetria. . 116-117. Faculdade de Ciências Farmacêuticas.34 8.

35 TOXICOLOGIA SOCIAL .

5%: pesar 2. Reagentes: Sulfato de cobre 12. Para obtenção da linha base.1 mL de sulfato de cobre 12. adicionar 0. 1. Há o aparecimento de coloração violeta. realizar a leitura somente com o veículo da diluição. 257 nm e 263 nm. 1. A camada etérea deve tornar-se violácea. Diluir a amostra suspeita (pó / drágea) em ácido sulfúrico 0. são utilizados nestes testes controles positivo (amostra que contém o agente tóxico) e negativo (amostra que não contém o agente tóxico). Para que seja possível a comparação de coloração.2 Espectrofotometria Equipamento: espectrofotômetro de varredura (190 nm – 1100 nm).5 g de sulfato de cobre e elevar o volume para 20 mL com água destilada.36 IDENTIFICAÇÃO DE AGENTES TÓXICOS Os testes rápidos de coloração e/ou precipitação para identificação de agentes tóxicos têm seu valor como triagem. Hidróxido de sódio 45%: pesar 45 g de hidróxido de sódio e elevar o volume para 100 mL com água destilada em balão volumétrico. Efedrina 1. A partir dos resultados obtidos com tais testes. por se tratar de um agente tóxico com características básicas. podemos direcionar um pouco mais o trabalho analítico. . podendo-se então comparar a coloração obtida com a amostra suspeita. Junte 1 mL de éter etílico e agite.5% e 1 mL de hidróxido de sódio 45%. Em seguida efetuar a leitura em espectrofotômetro de varredura no intervalo de comprimentos de onda de 200 a 400 nm.5 N. indicando presença de efedrina na amostra.1 Teste colorimétrico Colocar uma pequena porção do material em tubo de ensaio. Interpretação do resultado: a efedrina apresenta picos de absorbâncias em 251 nm.

37 Figura 1: Picos de absorbâncias da efedrina Reagentes: H2SO4 0. Solução de carbonato de sódio 15%: pesar 3 g de carbonato de sódio e elevar o volume para 20 mL com água destilada. Aminas secundárias (metanfetamina): 2.5 N: diluir 1.1 Teste colorimétrico Colocar uma gota de cada solução do reativo de Feigel-angel sobre o material suspeito. Solução de acetaldeído 50%: pesar 50 g de acetaldeído e elevar o volume para 100 mL com água destilada em balão volumétrico. Benzidamina 3.5 mL de ácido sulfúrico concentrado em água destilada e elevar-se o volume para 100 mL em balão volumétrico. Observar o desenvolvimento de coloração marron-esverdeada que indica a presença de cloridrato de benzidamina.1 Teste colorimétrico Adicionar. .2 g de nitroprussiato de sódio e elevar o volume para 20 mL com água destilada. Há o aparecimento de coloração violeta intensa. em uma placa escavada de porcelana. uma gota do reativo de Mandelin à amostra suspeita (pó / drágea) e uma gota do reativo como branco da reação. 2. Reagentes: Reativo de Feigel-angel Solução de nitroprussiato de sódio 1%: pesar 0. 3.

A..J. 4: 89-97. C. 4. MOFFAT. 2004. W. Toxic. Clin. 1971.38 Reagentes: Reativo de Mandelin: dissolver 1. . Spot Tests for rapid diagnosis of poisoning. Bibliografia: DECKER. Clarke's isolation and identification of drugs.5 mL de água destilada e completar para 100 mL com ácido sulfúrico concentrado. London: Pharmaceutical Press. (ed).0 g de vanadato de amônia em 1.

desenvolvendo uma faixa de cor lilás na área teste (identificada de ”C” e “T”) para aquela droga. tetrahidrocanabinol. metanfetamina.39 TESTE RÁPIDO PARA TRIAGEM DE DROGAS DE ABUSO IMUNOCROMATOPLACAS 1. A consideração clínica e o julgamento do profissional devem ser aplicados a qualquer resultado de teste de abuso de drogas. 2. Independente dos níveis da droga em uma amostra ocorre o aparecimento da faixa lilás em cada área controle (marcadas com “C”) devido a uma reação imunoquímica paralela. opióides. A cromatografia gasosa com espectrometria de massa (CG/MS) é o método confirmatório preferido. o anticorpo marcado-conjugado de cor se liga ao antígeno conjugado imobilizado na membrana. a urina se mistura com o conjugado de coranticorpo marcado e migra pela membrana. Inversamente. o ensaio permite a detecção independente e simultânea de seis drogas em uma única amostra. o anticorpo-conjugado de cor se liga a droga livre. O tempo aproximado é de 10 minutos. Estas faixas servem como um controle de qualidade interno e demonstram o reconhecimento do anticorpo. Fundamento analítico: Estes testes fornecem somente um resultado preliminar. Limites de detecção: As concentrações de interrupções (cut-off) para cada classe de drogas no painel de drogas de abuso são: . No procedimento de ensaio. Este teste é um imunoensaio de ligação competitiva onde a droga ou os metabólitos da droga em uma amostra de urina competem com os compostos da droga quimicamente marcados por um anticorpo restrito nos sítios de ligação. 3. Ao utilizar anticorpos que são específicos para as diferentes classes de drogas. Outros métodos químicos de confirmação estão disponíveis. indicando que os reagentes estão quimicamente ativos e que o teste foi realizado de forma correta. impedindo o desenvolvimento da faixa de cor lilás. Se a concentração de uma certa droga for inferior ao limite de detecção do teste. cocaína. se o nível da droga for igual ou superior ao limite de detecção. Um método de teste alternativo deve ser usado a fim de obter um resultado analítico mais específico. Substâncias: Benzodiazepínicos. anfetaminas. Este complexo compete com o antígeno conjugado sobre a membrana. formando um complexo antígeno-anticorpo-corante. particularmente quando os resultados preliminares positivos são observados.

THC) indica um resultado positivo para a droga correspondente. Interpretação dos resultados: Importante: São necessárias duas faixas do controle para validar os resultados do teste.40 THC OPI COC AMP BZD MET Tetrahidrocanabinol Opióides Cocaína Anfetaminas Benzodiazepínicos Metanfetamina 50 ng/mL* 300 ng/mL 300 ng/mL* 1000 ng/mL* 300 ng/mL 500 ng/mL *Concentração de interrupção (cut-off) de triagem recomendada pela Substance Abuse and Mental Health Services Administration. 4. OPI. Mergulhar a extremidade do dispositivo na amostra da urina até a tarja onde se lê: INSERT THIS END por mais de 10 segundos. Se não aparecer a faixa de cor lilás em qualquer uma das áreas (C). . descartar o dispositivo e testar a amostra novamente com um novo dispositivo. A urina que for refrigerada deve alcançar a temperatura ambiente (15º-25ºC) antes de ser testada. As amostras que forem congeladas devem ser descongeladas e misturadas antes do teste. 5. COC. Procedimento: Deixar as amostras dos pacientes e os componentes do kit atingirem a temperatura ambiente. Remover o dispositivo da amostra de urina e colocar em uma superfície plana. Ela pode ser refrigerada (2º-8ºC) por 2 dias ou congelada (-20ºC) por um longo período. estas urinas devem ser clareadas por centrifugação ou deixadas em repouso para sedimentar antes de serem testadas. Negativo A presença de uma faixa de cor lilás em qualquer tira indica que o nível da droga correspondente ou seu metabólito está abaixo do limite da sensibilidade. Amostra: A urina deve ser coletada em um recipiente limpo de vidro ou plástico. BZD. 7. Ler o resultado do teste entre 4 a 7 minutos após a adição da amostra. Caso haja amostras com grande quantidade de partículas. MET. Positivo Ausência de uma faixa de cor lilás em qualquer das seis tiras (AMP. Remover um dispositivo do teste do envelope laminado e identificar a amostra.

. Controle de qualidade: Uma linha processual interna foi incorporada ao dispositivo do teste para ajudar a assegurar o desempenho e a confiabilidade ao Kit. o uso de controles externos é recomendado. repetir o ensaio com um novo dispositivo.41 Inválido Se a linha na área Controle (C) não aparecer num intervalo de 5 minutos. 8. Entretanto. Diadema: Inlab Diagnóstica – Alamar Tecno Científica Ltda. Bibliografia: Multi-Drogas One Step Teste. Os controles positivos e negativos dentro de 25% da concentração cut-off devem produzir os resultados previstos. Bula de Kit. 2002. 9.

sob um béquer com fundo afunilado. a evaporação acontece em 10 minutos. Pode haver formação de água de condensação na parede do béquer e posteriormente no fundo. Aplicação: . . estando esta semifechada e ligada (abertura deve ser 0. Eluição: . prepara-se aproximadamente 30mL de eluente. colocar as placas em cubas de vidro pré-saturadas. Extração de ∆9-THC (∆9-Tetra-HidroCanabinol) . transferir microgotas das amostras e do padrão para as placas cromatográficas ativadas a 110º C por 1 hora.Após a aplicação.Evaporar em temperatura ambiente.Após maceração.5cm mais alta do que a altura do béquer).5cm do fim da placa. . Pode-se desprezá-la do béquer e proceder somente com o extrato. 4. filtrar com papel filtro. Após aplicação e eluição em cromatografia de camada delgada.Deixar eluindo até a linha do solvente chegar a 0. .42 IDENTIFICAÇÃO DE CANABINÓIDES EM ERVA IN NATURA POR CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA – (CCD) Os princípios ativos de plantas da espécie Cannabis sativa podem ser retirados da erva in natura através de extração com solvente orgânico. contendo o sistema eluente Clorofórmio / Tolueno (2:1).Colocar aproximadamente 100 mg da amostra em um gral de porcelana. . se haver formação de 2 fases.5 cm da porta da capela.Ressuspender com 5 gotas de éter de petróleo e aplicar em placa de sílica gel 60 com auxílio de um capilar. 1.Deixar secar naturalmente. Adicionar 5 gotas de éter de petróleo. deixar em repouso por 10 min.Aplicar todo o volume em que foi feita a ressuspensão. O béquer deve ser colocado a uma distância de aproximadamente 0. . . Amostra: erva in natura 2. adicionar uma ponta de espátula de carvão ativado. Confirmar se é realmente água da seguinte maneira: transferir o líquido do fundo do béquer para um eppendorf com auxílio de uma micropipeta. 3. confirma-se a presença de água de condensação. A porta da capela ao lado deve estar totalmente fechada. Adicionar cerca de 20 mL de éter de petróleo e macerar com o pistilo. esses agentes podem ser revelados pela adição de agentes cromogênicos. .Colocar a placa na cuba de forma que o eluente não toque a linha de aplicação das amostras. Utilizando microcapilares. Para as cubas pequenas. pode-se deixar macerando por 12 a 24 horas. Dessa forma.

.... Bibliografia: MOFFAT.............. Clarke's isolation and identification of drugs. 3) Observar novamente as cromatoplacas sob luz ultravioleta (UV) de ondas curtas (254 nm) e ondas longas (366 nm)............ 5... 14....................0 mL H2O destilada q.............0 g HCl concentrado .....A.................... A............... 5.......2 Preparo do agente cromogênico: Benzidina tetrazotada Solução A: Benzidina ... 6.1................... ... 1 L Guardar em frasco escuro Solução B: Nitrito de sódio a 10 % Misturar volumes iguais das soluções A e B no momento de usar.................p....... Agente cromogênico: Benzidina tetrazotada (B..... 2) A seguir vaporizar com os agentes cromogênicos específicos.. C............T.s................... 2004........43 5. London: Pharmaceutical Press....) 5.. Revelação: A revelação deve ser realizada em três etapas: 1) Observar as cromatoplacas sob luz ultravioleta (UV) de ondas curtas (254 nm) e ondas longas (366 nm)....... (ed)...........

. A urina que for refrigerada deve alcançar a temperatura ambiente (15-25ºC) antes de ser testada.Colocar o tubo no banho-maria a (50 a 60°C) durante 15 min para hidrólise. Não colocar em vórtex. . estas urinas devem ser clareadas por centrifugação ou deixadas em repouso para sedimentar antes de serem testadas. a evaporação acontece em aproximadamente 20 minutos. . Extração: .2 µL 10 .Acidificar com 1 mL de HCl 1N para conferir ao meio um pH entre 2-3. A tabela I. Parâmetro Tamanho usual da placa Volume aplicado de cada amostra Número de amostras por placa Diâmetro da mancha Tempo de corrida Limites de detecção por absorção de luz por fluorescência CCD 20 x 20 cm 1 – 5 µL 7 .5cm da porta da capela.Retirar a fase orgânica (superior) com auxílio de uma pipeta Pasteur. A porta da capela ao lado deve estar totalmente fechada. Adicionar 0. Caso haja amostras com grande quantidade de partículas. Pode haver formação de água de condensação .Evaporar em temperatura ambiente. As amostras que forem congeladas devem ser descongeladas e misturadas antes do teste. estando esta semi-fechada e ligada (abertura deve ser 0.Colocar aproximadamente 5mL da amostra em um tubo Falcon de 15mL. pois a formação de espuma é prejudicial. .1 – 0. O béquer deve ser colocado a uma distância de aproximadamente 0. apresenta uma comparação entre CCD e CCDAE.20 1 mm 3 – 20 min ~ 0.Centrifugar por 5 min a 2000rpm. Tabela I – Comparação entre cromatografia em camada delgada e cromatografia em camada delgada de alta eficiência. Dessa forma.5 ng 1. Ela pode ser refrigerada (2-8ºC) por 2 dias ou congelada (-20ºC) por um longo período.Adicionar 5mL de n-hexano e colocar no agitador horizontal em baixa rotação por 25min.5cm mais alta do que a altura do béquer).5mL de NaOH 1N e homogeneizar por inversão.10 3 – 6 mm 30 – 200 min ~ 5 ng CCDAE 10 x 10 cm 0. . Amostra: A urina deve ser coletada em um recipiente limpo de vidro ou plástico. jamais utilizar água para isso. . eficiente e sensível que a CCD convencional.Resfriar a temperatura ambiente. 2. podendo ser dito que se trata de um aperfeiçoamento da mesma.44 IDENTIFICAÇÃO DE CANABINÓIDES EM URINA POR CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA DE ALTA EFICIÊNCIA – (CCDAE / HPTLC) A CCDAE é uma técnica mais rápida. .

Revelação: A revelação deve ser realizada em três etapas: 1) Observar as cromatoplacas sob luz ultravioleta (UV) de ondas curtas (254 nm) e ondas longas (366 nm). . Nebulizar a placa com dietilamina.Usar padrão de maconha com éter de petróleo.HCl 1N: em proveta de 100 mL com tampa. Aguardar 10 minutos e observar a placa. para HPTLC (CCDAE) de cromatografia de alta eficiência com auxílio de um capilar.3 mL de HCl concentrado e completar o volume com água. . c. colocar 80 mL de água destilada. Para as cubas pequenas. 2) A seguir vaporizar com os agentes cromogênicos específicos. - 5. b. Confirmar se é realmente água da seguinte maneira: transferir o líquido do fundo do béquer para um eppendorf com auxílio de uma micropipeta.5cm do fim da placa. colocar as placas em cubas de vidro pré-saturadas. 4. . Pode-se desprezá-la do béquer e proceder somente com o precipitado. adicionar 8. confirma-se a presença de água de condensação. 3) Observar novamente as cromatoplacas sob luz ultravioleta (UV) de ondas curtas (254 nm) e ondas longas (366 nm). 10 x 10 cm. Deixar eluindo até a linha do solvente chegar a 0.1. Agente cromogênico: Fast Blue Seqüência de revelação a.1 % (preparar na hora).2 mL). se haver formação de 2 fases. Colocar a placa na cuba de forma que o eluente não toque a linha de aplicação das amostras. 5.NaOH 1N: pesar 4 g de NaOH e dissolver em 100 mL de água destilada. Adicionar 5 gotas de n-hexano. 2.8:0. prepara-se aproximadamente 20mL de eluente.Aplicar todo o volume em que foi feita a ressuspensão. 3. Aplicação: Ressuspender com 5 gotas de clorofórmio:metanol (3:1) e aplicar todo o volume em placa cromatográfica de silicagel 60.45 na parede do béquer e posteriormente no fundo. Deixar secar naturalmente.1 Preparo dos reagentes: . Nebulizar com solução de Fast Blue BB 0. Eluição: Após a aplicação. contendo o sistema eluente n-heptano / n-butanol / ácido acético ( 18:1. Secar a temperatura ambiente. d. .

Tox. Bras. Identificação de usuários de cannabis por cromatografia em camada delgada de alta eficiência.01 g de Fast Blue em 1 mL de metanol e adicionar 9 mL de água. Bras. 8 (2): 29-40.2 Preparo do agente cromogênico: Fast Blue 0. Rev. . Tox. A F. Revisão dos métodos analíticos para a detecção de canabinóides em material biológico. SPINELLI.1 % : dissolver 0. SILVA. MÍDIO. 21-28. E.. A. O. 8 (2). Bibliografia: REINHARDT. 6. E.46 5. 1995.. Rev. V. 1995.

5 mL de HCl 0. Homogeneizar bem até ficar na cor rosa clara. 3. Adicionar glicerina na mesma proporção do reativo. Seqüência para identificação a) Reativo de Tiocianato de cobalto Colocar uma pequena quantidade (ponta de uma pequena espátula) do pó suspeito em um eppendorf. Reativo de Scott: HCl 6N: mistura-se mesmo volume de ácido clorídrico concentrado com água destilada. podemos direcionar um pouco mais o trabalho analítico. Amostra: Pó suspeito 2.A. OBS: É importante utilizar sempre as mesmas quantidades de tiocianato de cobalto glicerinado 2% e ácido clorídrico 6N. mais 1.47 IDENTIFICAÇÃO DE COCAÍNA EM AMOSTRAS DE PRODUTO 1. Reação microquímica: Em um béquer colocar uma pequena amostra de cocaína e adicionar 0.5 g de tiocianato de sódio ou potássio e misturar em 90 mL de água destilada. são utilizados nestes testes controles positivo (amostra que contém o agente tóxico) e negativo (amostra que não contém o agente tóxico). Reação colorimétrica: Os testes rápidos de coloração e/ou precipitação para identificação de agentes tóxicos têm seu valor como triagem. podendo-se então comparar a coloração obtida com a amostra suspeita. Coloração azul indica indícios sugestivos da possível presença de cocaína.1 N. Adicionar algumas gotas de clorofórmio P. ou placa escavada. Concentrar em lâmina de microscópio umas gotas dessa mistura mais algumas . A partir dos resultados obtidos com tais testes. Coloração azul indica indícios sugestivos da possível presença de cocaína. b) Reação de Scott Acrescentar 2 gotas de HCl 6N no eppendorf ou placa escavada que foram utilizados para a reação do tiocianato. Adicionar 2 gotas de tiocianato de cobalto glicerinado. Para que seja possível a comparação de coloração. Reagentes: Reativo de Tiocianato de Cobalto: pesar 1 g de cloreto de cobalto.

Ácido cloroplatínico 5%: pesar 5 g de ácido cloroplatínico e dissolver em quantidade de água destilada suficiente para completar 100 mL de solução. retirar as cromatoplacas e secar em temperatura ambiente até a evaporação total do eluente. Visualiza-se ao microscópio cristais em forma de folhas de palmeira. Deixar correr por 12 cm. transferir microgotas das amostras e do padrão para as placas cromatográficas ativadas a 110º C por 1 hora.3 – Eluição: Após a aplicação.5.2 – Aplicação: Utilizando microcapilares.Reativo de Draggendorff .1N : diluem-se 1. .Reativo Cloroplatínico Acidificado 4. 4. 4.5).Preparação dos agentes cromogênicos 4. 4. Misturar e em seguida aplicar em placa de cromatografia recoberta com sílica gel.1 Solubilização: Colocar uma pequena amostra do pó suspeito em um béquer e adicionar 1mL etanol. colocar as placas em cubas de vidro pré-saturada. contendo o sistema eluente metanol-amônia (100: 1.1 Reativo de Draggendorff: Solução A: 2. Cromatografia em camada delgada: 4.5 .0 g de subnitrato de bismuto 25 mL de ácido acético 100 mL de água destilada Solução B: 40 g de Iodeto de potássio 100 mL de água destilada Solução de uso: 10 mL de A + 10 mL de B + 20 mL de ácido acético + 100 mL de água destilada.4 – Revelação: Vaporizar as cromatoplacas com um dos agentes cromogênicos: . Reagentes: HCl 0.7 mL de ácido clorídrico concentrado em até 20 mL de água destilada.48 gotas de ácido cloroplatínico a 5%. 4.

.......... Universidade de São Paulo....... ASTOLFI... (ed)..... 2004.. 1979.. 5.............. E.......V. Clarke's isolation and identification of drugs. Buenos Aires : Kapelsuz.... Dissertação de Mestrado................. C............P.................49 4.... ........... A.....3............. 97 mL Solução de iodeto de potássio a 6% ...5......... MOFFAT........ Bibliografia: CALABRESE............ A....................... R....A....... 100 mL Para cada 100 mL de solução adicionar 2 mL de ácido clorídrico concentrado... .... 1972.............. Toxicologia......0 mL Água destilada .......... London: Pharmaceutical Press...... VIEIRA.. S.2 Reativo cloroplatínico acidificado Solução ácido cloroplatínico a 10% ......................J....... Identificação de fármacos em urina por cromatografia em camada delgada: Faculdade de Ciências Farmacêuticas..

50 TOXICOLOGIA OCUPACIONAL .

O tratamento por intoxicação por paraquat. 1. Para que seja possível a comparação de coloração. A partir dos resultados obtidos com tais testes. . Aguardar a efervescência desaparecer. podemos direcionar um pouco mais o trabalho analítico. São Paulo: Zeneca Agrícola.51 TESTES COLORIMÉTRICOS RÁPIDOS PARA IDENTIFICAÇÃO DE AGENTES TÓXICOS Os testes rápidos de coloração e/ou precipitação para identificação de agentes tóxicos têm seu valor como triagem. Paraquat e Diquat A urina ou lavado/conteúdo gástrico podem ser testados quanto a presença de paraquat usando o método baseado na redução do cátion paraquat a um radical iônico azul. A 1mL de urina (lavado/conteúdo gástrico) adicionar 20 mg de bicarbonato de sódio (equivalente à ponta de espátula) e 20 mg de ditionito de sódio. 1998. 2. Bibliografia: ZENECA AGRÍCOLA. e negativo (amostra que não contém o agente tóxico). são utilizados nestes testes controles positivo (amostra que contém o agente tóxico). Misturar. Fazer leitura em fundo branco. podendo-se então comparar a coloração obtida com a amostra suspeita. na presença de um álcali e ditionito de sódio.

Após aplicação e eluição em cromatografia de camada delgada. 1. esses agentes podem ser revelados pela adição de agentes cromogênicos.Retirar a fase inorgânica (superior) através de aspiração com bomba de vácuo ou pipeta Pasteur.5 N para conferir ao meio um pH 4. .Centrifugar por 10 minutos na velocidade de 3000 rpm (não ultrapassar jamais). devidamente coletados. Acertá-lo com H2SO4 – 0. não aspirá-la. estando esta semi-fechada e ligada (abertura deve ser 0.Adicionar 10 mL de diclorometano.Filtrar os extratos sobre sulfato de sódio (Na2SO4) anidro. Pode haver formação de água de condensação na parede do béquer e posteriormente no fundo. A porta da capela ao lado deve estar totalmente fechada. .5cm mais alta do que a altura do béquer). se haver formação de 2 fases.5cm da porta da capela. mantida sob congelamento ou refrigeração no caso da impossibilidade da análise imediata. Amostra: Urina ou lavado gástrico. . . realizando assim a extração ácida. .Evaporar em temperatura ambiente. reunindo esses extratos em um béquer com fundo afunilado. Adicionar 2 gotas de diclorometano. .0.52 IDENTIFICAÇÃO DE AGROTÓXICOS POR CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA (CCD) Os agentes inibidores da enzima acetilcolinesterase podem ser retirados da urina ou lavado gástrico através de extração ácida com solvente orgânico. Confirmar se é realmente água da seguinte maneira: transferir o líquido do fundo do béquer para um eppendorf com auxílio de uma micropipeta. Dessa forma. com data e hora da coleta. Pode-se desprezá-la do béquer e proceder somente com o precipitado. 2. confirma-se a presença de água de condensação. a evaporação acontece em 10 minutos. Se houver formação de camada de emulsão. Extração: . O béquer deve ser colocado a uma distância de aproximadamente 0. agitando primeiramente por 1 minuto no vórtex e depois por 30 minutos no agitador horizontal.Colocar 10 mL da amostra em um tubo Falcon de 50 mL e medir o pH.

5cm do fim da placa. lavado gástrico. Aplicação: . Deixar eluindo até a linha do solvente chegar a 0. Fluxograma para extração de agrotóxicos: Amostra (10mL) urina. Eluição: . Para as cubas pequenas. Deixar secar naturalmente. Aplicar todo o volume em que foi feita a ressuspensão. 5. prepara-se aproximadamente 30mL de eluente (27 mL de clorofórmio : 3mL de acetona). etc Acidificar (pH 4-5 com H2SO4 10%) Extrair com 10mL de diclorometano Fase aquosa (descartar) Fase orgânica Filtrar sobre Na2SO4 anidro Extrato orgânico Evaporar Resíduo (Rácido) CCD 4. Aplicar microgotas de padrão de organofosforado e carbamato.Colocar a placa na cuba de forma que o eluente não toque a linha de aplicação das amostras. .Após a aplicação. com sistema clorofórmio / acetona (9:1).Ressuspender com 5 gotas de diclorometano e aplicar em placa de sílica gel 60 com auxílio de um capilar.53 3. . colocar as placas em cubas de vidro pré-saturada.

Deixar secar em estufa 80°C de 5 a 10 minutos. Bibliografia: UNIVERSIDADE NACIONAL DE LA PLATA . .Carbamatos: Tampar a região da placa usada para a revelação de organofosforados. Disponível em: http://www.Solução B: solução de nitrito de sódio 3%. 7. Revelação: Vaporizar as cromatoplacas conforme a sequência de revelação descrita a seguir: .Cloreto de paládio a 0.5%.54 6. Misturar volumes iguais das soluções A e B (2mL de cada) e borrifar a placa.1 Preparação dos reagentes para revelação: .unlp. Acesso em: 30/08/2006.Solução A: solução de p-nitroanilina a 1% em HCL 2N. Conservar em geladeira. 6. .5%: o cloreto de paládio não dissolve diretamente em água. Deve-se primeiro dissolver 0. .Organofosforados: Tampar a região da placa destinada a revelação de carbamatos com uma placa de vidro. Estabilidade de 1 mês em geladeira.edu.Solução C: solução de hidróxido de sódio 80%. Borrifar a placa com cloreto de paládio a 0.html. Misturar volumes iguais da solução C com etanol absoluto (2mL de cada) e borrifar na placa. .biol.ar/toxicologia/seminarios/parte_2/bibliografia_sem_2. completar o volume para 100mL com água destilada. Pesar 80g de hidróxido e sódio e dissolver em 100mL de água destilada. Pesar 1g de pnitroanilina e dissolver em 100mL de ácido clorídrico 2N. Pesar 3g de nitrito de sódio e dissolver em 10mL de água destilada. .5g em algumas gotas de HCl 20% após.

7 – 50 mmol/L – Diluente 100 mL Estável até data indicada no frasco. Estável até a data indicada no frasco. sem conservantes.55 DETERMINAÇÃO DA ATIVIDADE DA COLINESTERASE PLASMÁTICA 1.25 mmol/L. Reagentes: • Solução de tampão fosfato pH 7. • Substrato 30x3 mL (Reagente de cor): Iodeto de butiriltiocolina – 7 mmol/L. forma o 5-mercaptano-2-nitrobenzóico de coloração amarela (Figura 4).5’– ditiobis – 2 – nitrobenzóico – 0. Pode ser conservada até 07 dias sob refrigeração.5-ditio bis-2-nitrobenzóico (DTNB). . Os anticoagulantes a base de citrato. Se necessário transportar a amostra recomenda-se o congelamento e analisar a amostra imediatamente após o degelo. 4. Amostra: Soro ou plasma – 0.5 mL. Estabilidade: a amostra deve ser preferencialmente fresca.5-ditio bis-2-nitrobenzóico 5-Mercaptano-2-nitrobenzóico + 2-Nitrobenzóico-5-mercaptanotiocolina Figura 4: Reação de catálise da colinesterase 2.Espectrofotômetro UV-Vis. O plasma pode ser utilizado desde que colhido com heparina ou EDTA. Princípio do método: A colinesterase catalisa a hidrólise do iodeto de butiriltiocolina com formação de tiocolina que em uma reação secundária com o ácido 5. quando estocado a temperaturas entre 2 e 8°C. a qual pode ser determinada em espectrofotômetro na região do visível a 405 nm. Iodeto de 5-butiriltiocolina + H2O colinesterase Iodeto de tiocolina + Butirato Iodeto de Tiocolina + Ácido 5. A intensidade da cor é diretamente proporcional a atividade da colinesterase. Equipamento: . fluoreto ou oxalato produzem inibição enzimática leve e por isso não devem ser utilizados. quando estocado a temperaturas entre 2 e 8°C. Ácido 5. 3.

por inversão.0 mL da solução de reação para a cubeta de leitura (faces paralelas devido volume) e adicionar 20 µL do soro (amostra). até dissolução completa. • OBS: a 37°C utilizar amostra diluída 1:2 com solução de cloreto de sódio a 0. Voltar a ler depois de 30. OBS: Os valores de referência devem ser interpretados em função da temperatura de reação. 30 ou 37°C. 90 e 120 segundos. 60. Cálculo: Atividade da enzima (U/L) = ∆A/30seg x 22. Preparo das soluções: Solução de Reação: adicionar 3 mL de tampão fosfato em um frasco de substrato. Parâmetros: Temperatura dos reagentes: 25. Misturar imediatamente e ler a absorbância. Temperatura de leitura (ambiente e reagentes): 25. 6.56 • Cloreto de sódio a 0.9% e continuar o procedimento conforme descrito acima. Determinar a diferença média da absorbância a cada 30 segundos (∆A/30 seg) subtraindo cada leitura da anterior e fazendo a média dos valores. 7. Utilizar a média para os cálculos. Estável por 1 hora quando mantido a temperaturas entre 15 e 25°C.710 . 30 ou 37°C.9% (que não acompanha o Kit) 5. Transferir 3. disparando simultaneamente o cronômetro. Multiplicar o resultado obtido por 2. Tampar e agitar suavemente. Fenda: 1 cm. Reconstituir somente no momento do uso. 8. Método: • • Zerar o espectrofotômetro com ar. Comprimento de onda: 405 nm.

21278-21282 [ NR7 – Programa de Controle Médico de Saúde Ocupacional]. . Zaccara. Brasília. Francisco A. Valores de referência: 25°C 3200 – 9000 U/L 30°C 3962 – 11142 U/L 37°C 4970 – 13977 U/L 10.I. Bibliografia: BRASIL. Índice Biológico Máximo Permitido (IBMP) Depressão da atividade da colinesterase plasmática em 50%. o horário da coleta não é crítica. Com a finalidade de realização de monitorização biológica.C. Bula de kit. Portaria n. 11. Secretaria de Segurança e Saúde no Trabalho.A. indica exposição excessiva. 2000. devendo o trabalhador ser afastado da exposição.57 9. Seção 1. 24 de 29 de dezembro de 1994. em relação à medida realizada pré-ocupacionalmente. Rosário: Wiener Laboratórios S. p. Colinesterasa. desde que realizada a avaliação préocupacional.

Triton X – 100 1%: transferir 1mL de Triton X –100 para um balão volumétrico de 100mL e completar o volume com água destilada.8g de fosfato dissódico 7H2O em 100mL de água destilada e ajustar o pH em 6. .Cianeto de potássio 5%: colocar 5g de cianeto de potássio em um balão volumétrico de 100mL e completar o volume com água destilada. o que possibilita a leitura da hemoglobina total convertida. 3. com data e hora da coleta. mantida sob refrigeração no caso da impossibilidade da análise imediata.Tampão Fosfato pH 6. .8 com HCl ou NaOH diluídos. devidamente coletado com anticoagulante EDTA ou Heparina. O íon cianeto é utilizado para produção de cianometahemoglobina (D2 e D4). Reagentes e outros insumos: . A quantidade de metemoglobina na amostra é medida no comprimento de onda de 632 nm (D1).1mL da solução A com 50. Solução de uso: misturar 49. 2. complexo não mensurável no comprimento de onda de 632 nm. no comprimento de onda de 632 nm (D3).9mL da solução B).58 DETERMINAÇÃO DE METEMOGLOBINA 1. sendo a leitura obtida considerada como a dos interferentes na amostra.Ferrocianeto de potássio 5%: colocar 5g de ferrocianeto de potássio em um balão volumétrico de 100mL e completar o volume com água destilada. Após a adição de ferricianeto de potássio ocorre a oxidação do Fe+2 da hemoglobina a Fe+3 (com conseqüente formação de metemoglobina). Amostra: Sangue total.16g de fosfato monobásico de sódio anidro em 100mL de água destilada. A determinação deve ser feita em no máximo 2 horas após a coleta. Amostras hemolisadas devem ser desprezadas. Padrões. . . Controles.8 (Solução A: dissolver 2. Solução B: dissolver 1. Princípio do teste: O princípio considera a determinação de metemoglobina presente na amostra em relação à hemoglobina total.

A cubeta “B”.Pipetar 0. e medir a absorbância a 632nm (D3). . adicionar 30µL de K3FeCN6. . .59 4. .Pipetar 3mL dessa solução em duas cubetas de espectrofotômetro (marcar como cubeta “A” e cubeta “B”).Ler a absorbância da cubeta “A” em 632nm (D1). .0mL de tampão fosfato e 6. Procedimento detalhado: .0mL de solução detergente Triton X-100 1%. esperar 5 minutos.Adicionar 30µL de KCN a cubeta “B”.2 mL de sangue em um tubo de Falcon de 15mL contendo 4. O lisado tamponado pode ser guardado por 24h a 4ºC sem alteração significante. .Adicionar 30µL da solução de KCN 5% a cubeta ”A”. homogeneizar e ler novamente no mesmo comprimento de onda (D4). homogeneizar e medir novamente a absorbância em 632nm (D2).

60 5.0 mL de solução Triton 1% Colocar 3 mL dessa solução em cada cubeta CUBETA A CUBETA B Leitura em λ = 632 nm D1 30 µL de K3FeCN6.0 mL de tampão fosfato + 6. homogeneizar 30 µL de KCN 5% repouso de 1 min Leitura em λ = 632 nm D3 Leitura em λ = 632 nm 30 µL de KCN 5% repouso de 1 min D2 Leitura em λ = 632 nm D4 . Fluxograma analítico Amostra (em duplicata) 0.2 mL de sangue + 4. esperar 5 min.

FERNICOLA.61 6. MORAES. a concentração de metemoglobina de uma amostra de recente de doador saudável como controle normal. A sensitive kicromethod for the determination of methemoglobin in blood. . Pode-se determinar. R.C.Acta. 1970.I. 8. OBS: Quando o comprimento de onda de D2 for maior do que D1 o resultado da determinação é menor que 2%. 9. indicam exposição excessiva. SHUVAL H. E. recomenda-se a coleta pré e pós jornada de trabalho. Secretaria de Segurança e Saúde no Trabalho. Cálculos: % Metemoglobina = (D1 – D2 / D3 – D4) x 100 7.Chim. Bibliografia: BRASIL. 1991.G. E. SZNELWAR. devendo o trabalhador ser afastado da exposição. Seção 1. São Paulo: Roca. 24 de 29 de dezembro de 1994. Clin. COHEN. Valores de referência: Valores menores ou iguais a 2% são tidos como normais.F.. p. 10.G. 30: 679-682. B. GRENER. Índice Biológico Máximo Permitido (IBMP) Valores de metemoglobinemia superiores a 5%. Manual de Toxicologia Analítica. Controle da qualidade: Amostras controle para determinação de metemoglobina não podem ser encontradas comercialmente. Com a finalidade de realização de monitorização biológica.. HEGESH. BOCHKOUSKY..... Portaria n.A. N. N. R. S. 21278-21282 [ NR7 – Programa de Controle Médico de Saúde Ocupacional]. em paralelo. Brasília.

Amostra: A amostra de sangue deve ser colhida no final da jornada de trabalho em vaccuntainer heparinizado e conservada a 4 °C por no máximo uma semana. Cálculo da % da carboxiemoglobina: % COHb = Sendo: AR = Abs. hemolisante: dilluir o tampão com água 1:10. Técnica: 1. F1) AR (F2 – F1) – F3 + 1 .62 DETERMINAÇÃO DE CARBOXIEMOGLOBINA NO SANGUE 1. 3. Agitar. 2.2 mL do hemolizado com 2. As razões das absorbâncias nestes comprimentos de onda são particularmente sensíveis a quantidade de CoHb presente na amostra.85: KH2PO4 /K2HPO2 0. tampão pH= 6. Diluir 0. Ler as absorbâncias a 420 e 432 nm.9939 Abs Hb 420 x 100 1 – (AR. composto por Hbred e COHb. deixar em repouso por 10 minutos. Preparar semanalmente sol. diluente. colocar 0. tampão. antes e após a jornada de trabalho.4787 Abs Hb 420 F1 = Abs Hb 432 = 1. Para os fumantes devem ser colhidas duas amostras.3 mL de sol. 3. 420 Abs. A hemoglobina é reduzida utilizando ditionito de sódio para se obter um sistema bicomponente. 3. determinado através das absorbâncias em 420nm e 432nm. Preparar antes do uso. Tampar. diluente. 5. Material: sol. 432 F2 = Abs HbCO 432 = 0.1 M sol. usando como branco a sol. Princípio do método: O princípio do método compara os níveis de hemoglobina reduzida e carboxihemoglobina. Em tubo de ensaio com tampa.3330 Abs Hb 420 F3 = Abs HbCO 420 = 1. Deixar a temperatura ambiente por 10 minutos.1 mL de sangue e 12 mL de sol. diluente: dissolver 25 mg de ditionito de sódio em 20 mL de sol. hemolisante. 2. A porcentagem de COHb é calculada correlacionando-se as absorbâncias das amostras com os coeficientes de absortividade molar da Hbred e da COHb nos comprimentos de onda apropriados.

1984. Portaria n..5% para indivíduos não fumantes indicam exposições excessivas. recomenda-se a coleta pré e pós jornada de trabalho. . Secretaria de Segurança e Saúde no Trabalho. 7. 21278-21282 [ NR7 – Programa de Controle Médico de Saúde Ocupacional]. BRASIL. 30(6):871-4. Chem. Brasília. Seção 1. Clin. 24 de 29 de dezembro de 1994. Valores de referência: Valores menores ou iguais a 1% para não fumantes são tidos como normais. C. devendo o trabalhador ser afastado da exposição. p. Bibliografia: BEUTLER. & WEST. 8. – Simplified determination of carboxihemoglobin. Com a finalidade de realização de monitorização biológica. E. Índice Biológico Máximo Permitido (IBMP) Valores de carboxihemoglobinemia superiores a 3.63 6.