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ASPECTOS PRÁTICOS NA REALIZAÇÃO DO HEMOGRAMA

ANTICOAGULANTES
EDTA (TAMPA ROXA) Atua em nível do íon cálcio (seqüestrador). Principal uso em hematologia. O sangue colhido com anticoagulante deve ser cuidadosamente homogeneizado por inversão de no mínimo 8 vezes para evitar hemólise e a coagulação do sangue. Verificar sempre o volume correto de material para cada tubo. O anticoagulante preferido para hemograma é um dos sais do EDTA. Têm sido usados o K2EDTA, o K3EDTA e o Na2EDTA. O recomendado pelo International Committee (ICSH) é o K2EDTA, tanto em forma seca como em solução, em concentração final entre 1,5 e 2,2 mg/mL. A solução tem a vantagem de permitir uma mistura mais rápida e uma menor freqüência de coagulação indesejada; em tubos a vácuo, a parede é coberta pelo EDTA, e a mistura lenta não é problema. Ao usar-se o EDTA em solução, algumas determinações são afetadas pela diluição, principalmente se for coletado um volume escasso de sangue. O excesso de EDTA tem efeito prejudicial na morfologia dos eritrócitos em distensões coradas. O Na2EDTA é menos solúvel do que os sais potássicos; o K 3EDTA causa desidratação dos eritrócitos e baixa o micro-hematócrito. Eritrócitos, leucócitos e plaquetas são estáveis em sangue total com EDTA por até 24 horas. O esfregaço sangüíneo deve ser feito dentro de 3 horas após a coleta do sangue. Os tubos EDTA são utilizados para análise de sangue total em laboratórios clínicos. Muitos laboratórios usam instrumentos de contagem de glóbulos com um dispositivo aspirador das amostras, que perfura as tampas de borracha e reduz a indesejável manipulação do sangue. Para usá-los, há necessidade de escolha de tubos com rolha de borracha apropriada, que não vaze pelo orifício. CITRATO DE SÓDIO (TAMPA AZUL) Captação dos íons cálcio. Principal uso: estudos da coagulação Os tubos para coagulação contêm em seu interior, solução tamponada de citrato trissódico a 0,129 mol/l (3,8%). A hemodiluição consiste em 1 parte de citrato para 9 partes de sangue. TUBO SECO (TAMPA VERMELHA) Principal uso: bioquímica e sorologia e demais exames que necessitam de soro Os tubos para bioquímica e sorologia são revestidos internamente com partículas de sílica micronizada, as quais ativam a coagulação quando os tubos são gentilmente invertidos.Os tubos para sorologia com gel contêm uma barreira de gel presente no fundo do tubo. Este material possui densidade intermediária entre o sangue coagulado e o soro. Durante a centrifugação, a barreira de gel move-se para cima posicionando-se entre o soro e o coágulo, onde forma uma barreira estável, separando o soro dos outros componentes celulares. O soro pode ser utilizado diretamente do tubo de coleta, eliminado a necessidade de

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por até 48 horas. sob as condições de armazenamento recomendadas. Esta barreira permite a estabilização da maioria dos parâmetros no tubo primário. INTERFERENTES (ERROS) NA COLETA HEMOCONCENTRAÇÃO Demora no garroteamento – aumento dos analitos não permeáveis à parede do vaso HEMÓLISE Liberação de constituintes intracelulares que provocam interferências nas análises Causas:  Venopunção traumática/demorada  Forte pressão de aspiração do sangue  Forte pressão no esvaziamento da seringa  Formação de bolhas/espuma  Ressecamento do sangue na parede do tubo MACRO E MICROCOÁGULOS Início de coagulação indesejada Causas:  Venopunção traumática/múltipla  Demora no preenchimento da seringa  Demora no esvaziamento da seringa  Relação sangue/anticoagulante inadequada – muito sangue para pouco anticoagulante PUNÇÃO MÚLTIPLA  Sobreposição do material  Liberação de interferentes teciduais  Hemólise FALTA DE HOMOGENEIZAÇÃO DO SANGUE NO TUBO  Ação inadequada do anticoagulante no tubo de coleta PREPARO DE DISTENSÃO DE SANGUE A distensão de sangue para exame microscópico pode ser feita de sangue sem anticoagulante (sangue nativo) – venoso ou capilar – ou de sangue anticoagulado com 2 .transferência para outro recipiente.

o uso é obrigatório para investigar alterações como a crenação dos eritrócitos ou a agregação de leucócitos ou plaquetas. A quelação do cálcio pelo EDTA impede a agregação plaquetária.EDTA.Distensão feita com sangue anticoagulado pelo EDTA. entretanto. mostrando a distribuição uniforme das plaquetas 3 . Alguns laboratórios ainda usam essas distensões como rotina. A boa prática laboratorial inclui a anotação da data e da hora da chegada da amostra e a distensão de lâmina imediatamente após o recebimento. que pode ser induzida pela conservação ou pelo EDTA. agregados plaquetários ou crioaglutinação dos eritrócitos. Distensões de sangue capilar mostram agregação plaquetária proeminente (Figura 2) e de sangue venoso nativo mostram pequenos agregados (Figura 3). Desse modo. como a presença de filamentos de fibrina. Distensões de sangue nativo venoso ou de sangue capilar são isentas de artefatos provocados pela conservação e pelo anticoagulante. Por outro lado. fazendo com que as plaquetas se distribuam de modo homogêneo na distensão e seu número possa ser estimado à microscopia (Figura 1). distensões feitas quando o sangue anticoagulado chega ao laboratório têm a vantagem de mostrar artefatos que influenciarão a validade dos resultados dos contadores eletrônicos. fica registrado o tempo decorrido em trânsito e pode ser confirmada a atribuição de alterações morfológicas ao armazenamento prolongado de sangue anticoagulado com EDTA. Figura 1 .

Distensão feita com sangue não-anticoagulado.Figura 2 . mostrando pequeno grau de agregação plaquetária DISTENSÃO MANUAL EM LÂMINA As lâminas de vidro devem estar limpas e desengorduradas. não podem ser porosas. É necessária uma lâmina distensora com quinas cortadas para que a distensão seja mais estreita do que a lâmina. mostrando a agregação plaquetária que habitualmente ocorre Figura 3 . pois isso aumenta a coloração de fundo.Distensão feita com sangue capilar não-anticoagulado. Se for prevista uma cobertura com lamínula. a lâmina distensora também deve ser mais estreita do que a 4 .

A técnica de distensão deve produzir uma película de sangue com uma cauda reta. O operador experiente aprende a diferenciar o sangue com hematócrito (Hct) acima do normal. que é viscoso e exige um ângulo mais agudo para distensões satisfatórias. Uma gota de sangue (nativo ou anticoagulado) é colocada próximo à extremidade da lâmina.Células blásticas de um paciente com leucemia aguda inadvertidamente transferidas para a lâmina de outro paciente pelo uso de um distensor limpo de modo inadequado. uma distensão em forma da impressão de um polegar fará o observador moverse de uma área ótima para identificação das células para outras áreas demasiadamente espessas. O laboratorista que distende as lâminas deve usar luvas. É importante limpar a distensora com um pano seco ou com gaze após cada utilização. Distensoras de acrílico são disponíveis comercialmente e apresentam ótima manuseabilidade. Figura 4 . A lâmina distensora é aplicada a um ângulo de 25 a 30º na frente da gota de sangue e recuada até tocá-la. Se o ângulo da distensora for muito obtuso. que requer um ângulo mais obtuso. para que esta cubra os bordos da distensão e seja facilmente examinada ao microscópio. do sangue com baixo Hct. Uma distensora com bordas lisas é bem mais fácil de manipular é preparada lapidadando-as. Uma vez espalhado o sangue ao longo da borda posterior da distensora. pode ser retirado com um tubo capilar descartável. Sangue anticoagulado. a distensão será muito curta. caso contrário poderão ser transferidas células de uma distensão para outra (Figura 4). 5 . esta é impelida para a frente com um movimento suave e uniforme. de frascos com rolha.lamínula. de modo a distender uma fi na película de sangue sobre a lâmina. ou o movimento muito rápido.

À medida que as distensões são feitas. Trata-se de uma mistura do antigo azul-de-metileno e de eosina para corar o núcleo e o citoplasma do parasito da malária em púrpura e azul. comum ou com ar aquecido. COLORAÇÃO E MONTAGEM Fixação em metanol. A secagem das lâminas deve ser rápida. Presença de água provoca alterações (artefatos) que simula hipocromia (Figura 5). podendo ficar até 20 minutos. Essas alterações podem ocorrer tanto em células normais como em células neoplásicas. Se as distensões secarem lentamente. é útil para esse fim. devem ser rotuladas com o nome do paciente e a data. tendendo para o azul turqueza. ou com um número de identificação. COLORAÇÃO Não há consenso entre os laboratórios quanto à escolha do melhor corante. mas todos os corantes em uso baseiam-se no de Romanowsky. 6 . Figura 5 . um ventilador. linfócitos bipolares. respectivamente. núcleos hipercromáticos e desaparição dos nucléolos. pois evitam a perda de tempo na escolha da face que deve ser voltada para cima. Atraso na fixação provoca alterações na cor. Lâminas opacificadas nas duas faces de uma extremidade são práticas. Quando em pequeno número. haverá contração das células. de modo a torná-las inaparentes. protozoologista russo do final do século XIX.Alterações artefatuais produzidas pela pesença de 5% de água no metanol usado para fixação. as lâminas podem ser rotuladas com pela escrita a lápis na parte espessa da distensão. com aparição de bolhas e vilosidades citoplasmáticas. FIXAÇÃO.

Há significativa variação. azul-de-metileno e eosina. Os termos acidófilo e eosinófilo referem-se à captação do corante ácido. Quando o pH é muito baixo. da mesma forma que a mistura de azur-B. tais tonalidades são obtidas pela tomada de um único corante básico. os grânulos dos eosinófilos coram-se em azul-escuro ou cinza e os grânulos dos neutrófilos coram-se demais. eles são vendidos com a mesma denominação. A Tabela 1 mostra a variedade de cores que um corante de Romanowsky deve produzir. enquanto na América do Norte é o de Wright. que confere cor azul ou azul-violeta aos ácidos nucléicos (fixa-se aos grupos fosfato do DNA e do RNA). A combinação azur-B e eosina é um corante de Romanowsky satisfatório. embora acidófilo seja costumeiramente usado para os componentes celulares que se coram de rosa. além de um corante ácido (aniônico). combinando azur e eosina. enquanto os grânulos que se coram de violeta ou púrpurarosado. em posição horizontal. Soluções de corantes podem necessitar de filtração logo antes do uso para evitar depósito de corante na s distensões. Na verdade. Quando o pH é muito alto. azurófilos. contribui para a cor do núcleo. os componentes basófilos não se coram de maneira adequada. No Brasil há um predomínio de corantes panóticos ditos rápidos de onde o número de etapas é variável. nestas há precipitação de grânulos de corante que dificultam a visualização. o qual pode ser confundido com inclusões nos eritrócitos. que dá melhores resultados. às nucleoproteínas. e eosinófilo. aos grânulos dos basófilos e. Giemsa modificou o método. fracamente. aquecido de modo a produzir análogos – e eosina. que confere cor laranja à hemoglobina e aos grânulos dos eosinófilos e. os leucócitos fica m pálidos. Demonstrou-se por cromatografia que os corantes preparados pelos métodos químicos tradicionais não são puros. Tradicionalmente. Obtém-se uma coloração satisfatória e reprodutível com corantes comerciais de boa qualidade e uma máquina automatizada de coloração. há captação excessiva do corante básico. como o azur-B. como a eosina.Subseqüentemente. Às vezes. inclusive entre lotes de um mesmo fabricante. A coloração deve ser feita no pH correto. Os componentes essenciais dos corantes de Romanowsky são um componente básico (catiônico). para os que se coram de la ranja. com uma coloração excessiva generalizada. 7 . é usada uma combinação Wright-Giemsa. que contém azul-de-metileno policromado – isto é. simulando granulações tóxicas. combinando-se com proteínas nucleares. fornecem melhores resultados do que as são máquinas que cobrem as lâminas com uma fina camada de corante. O corante mais usado no Reino Unido é uma combinação de corantes conhecida como May-GrünwaldGiemsa (MGG). o citoplasma que se cora em azul e os grânulos que se coram em púrpura ditos basófilos. com grânulos eosinófilos de um vermelho brilhante. podendo chegar à apenas uma. As máquinas automáticas de coloração com técnica de imersão. torna-se difícil distinguir a policromatofilia dos eritrócitos. como o azur-B ou o azur-A. aos grânulos dos eosinófilos. em que as lâminas são integralmente mergulhadas no corante. eosina. mas contêm mistura variável de 5 a 10 corantes.

Porto Alegre. Rio de Janeiro. B Cor Púrpura Vermelho-purpúreo Azul Azul-acinzentado Azul-escuro Azul-acinzentado Púrpura-claro ou rosa Púrpura-escuro Laranja Rosa BIBLIOGRAFIA LIMA. Células Sangüíneas. O. Guanabara Koogan.COLORAÇÃO CARACTERÍSTICA DE DIFERENTES COMPONENTES CELULARES COM CORANTE DE ROMANOWSKY Coloração dos componentes celulares Cromatina (incluindo os corpos de Howell-Jolly) Grânulos promielocíticos e bastões de Auer Citoplasma dos linfócitos Citoplasma dos monócitos Citoplasma rico em RNA (isto é. 8 . 1992. 2001. A. granulômero das plaquetas Grânulos específicos dos basófilos Grânulos específicos dos eosinófilos Eritrócitos Fonte: BAIN. Barbara J. citoplasma basófilo) Corpos de Döhle Grânulos específicos dos neutrófilos. grânulos dos linfócitos. et al. Métodos de Laboratório Aplicados à Clínica. Artmed. BAIN. Bárbara.