You are on page 1of 31

Makalah Tentang high performance liquid chromatograPHy

Disusun Oleh: Nama Kelas NIM : ROBERTO : KA01 : 1512022

KIMIA DASAR 2

HANAFIAH

SEKOLAH TINGGI MANAJEMEN INDUSTRI Jl.Letjend Suprapto No.26 Cempaka Putih, Jakarta Pusat 10510

KATA PENGANTAR

Salam Sejahtera bagi kita semua. Suatu kelegaan dan kebahagiaan bagi saya, bahwa saya telah berhasil menyelesaikan penulisan makalah tentang High Performance Liquid Chromatography. Makalah ini saya kembangkan dengan model penyajian yang menarik agar dapat dipahami secara utuh. Pendekatan dan penyajian makalah ini pada prinsipnya tetap membahas kegunaan,prinsip cara kerja alat, perawatan dan cara pemeliharaan, serta kelebihan dan kekurangan High Performance Liquid Chromatography (Kromatografi Cair Berkinerja Tinggi). Saya menyadari bahwa tak ada gading yang tak retak, begitu juga makalah ini tidak luput dari kekurangan. Oleh karena itu, kritik, saran, dan masukan dari para teman-teman sangat saya harapkan. Ucapan terima kasih saya hanturkan kepada semua pihak yang telah membantu proses penulisan dan penyelesaian makalah ini. Semoga makalah ini dapat menambah wawasan dan pengetahuan tentang bagi teman-teman dan para pembaca sekalian.

Jakarta, Juni 2013

Penulis

ROBERTO

BAB I PENDAHULUAN
1.1 LATAR BELAKANG

Di zaman yang modern seperti sekarang ini, perkembangan Ilmu Pengetahuan dan Teknologi melaju dengan pesatnya. Tuntutan kebutuhan hiduplah yang menjadikan manusia giat mengembangkan ilmu pengetahuan dan teknologi. Berbagai ilmu dikembangkan, mulai dari ilmu sosial hingga ilmu eksak. Seperti salah satu ilmu eksak yaitu ilmu kimia. Dalam praktiknya secara umum ilmu kimia, yaitu ilmu yang mempelajari tentang sususnan, sifat, dan reaksi suatu unsur atau zat dalam berbagai jenis benda material. Dalam ilmu kimia banyak aspek-aspek penelitian yang dilakukan. Seperti halnya, yang paling spesifik yaitu pemisahan molekul- molekul dari senyawa zat nya, atau yang disebut dalam ilmu kimia yaitu Kromatografi. Kromatografi terbagi menjadi berbagai macam lagi. Salah satunya yaitu “Kromatografi Cair KinerjaTinggi” atau yang biasa di kenal HPLC. Kemajuan dalam teknologi kolom, sistem pompa tekanan tinggi, dan detektor yang sensitif telah menyebabkan perubahan kromatografi kolom cair menjadi suatu sistem pemisahan dengan kecepatan dan efisiensi yang tinggi. Metode ini dikenal sebagai kromatografi cair kinerja tinggi. Teknologi kolom didasarkan atas penggunaan kolom berlubang kecil (diameter dalam antara 2 mm hingga 5 mm) dan isi kolom berupa partikel kecil (3µm hingga 50 µm), yang memungkinkan tercapainya keseimbangan secara cepat antara fase gerak dan fase diam. Teknologi kolom partikel kecil ini memerlukan sistem pompa tekanan tinggi yang mampu mengalirkan fasa gerak pada tekanan tinggi sampai 300 atmosfer, agar tercapai laju aliran beberapa ml per menit. Oleh karena

Suatu fase diam yang terikat secara kimia pada penyangga lebih mudah pemakaiannya dengan beraneka ragam pelarut serta suhu yang lebih tinggi. sehingga keseimbangan antara fase gerak dan fase diam dapat tercapai dengan cepat. Bahan pengisi kolom lainnya dengan diameter yang lebih kecil. umumnya fasa gerak perlu dijenuhkan terlebih dahulu dengan fase diam cair. . antara 3 µm hingga 10 µm. yang mengurangi hambatan terhadap pemindahan masa. Suatu fase diam cair harus mempunyai sifat praktis tak bercampur dengan fase gerak. Fase diam berupa polimer yang disalutkan pada penyangga umumnya lebih dapat bertahan. Fase diam dapat berupa cairan atau polimer. Dalam hal ini pengisian ke dalam kolom harus dibuat dalam bentuk bubur untuk mendapatkan efisiensi kolom yang tinggi. (faktor kapasitas = kadalah perbandingan waktu yang diperlukan selama berada dalam fase diam terhadap waktu yang diperlukan selama berada dalam fase gerak). Komposisi fase gerak berpengaruh nyata terhadap kinerja kromatografi dan harus dikendalikan dengan cermat. Dengan teknologi ini kromatografi cair dalam banyak hal dapat menghasilkan pemisahan yang sangat cepat seperti pada kromatografi gas. dengan keunggulan zat-zat yang tidak menguap atau tidak tahan panas dapat dikromatografi tanpa peruraian atau tanpa perlunya membuat derivat yang dapat menguap. yang disalut atau terikat secara kimia pada permukaan penyangga sebagai lapisan tipis. hampir seluruhnya berpori dan memberikan pemisahan yang lebih efisien dari pada partikel pengisi kolom berukuran antara 30 µm hingga 50 µm. maka diperlukan detektor yang sensitif. Komposisi dapat mempunyai pengaruh yang jauh lebih besar terdadap faktor kapasitas daripada suhu. agar fase diam tidak terbawa dari kolom.sering digunakan jumlah zat uji yang kecil (umumnya lebih kecil dari 20 µg) untuk isi kolom tersebut di atas. Partikel tersebut dapat pula dibuat bersifat adsorpsi atau dilapisi dengan suatu fase diam. berbeda dengan partikel berukuran antara 30 µm hingga 50 µm yang dapat diisikan dalam bentuk kering.

konsentrasi ionik. dan perbedaan dalam afinitas akan menyebabkan terjadinya pemisahan kromatografi. sulfonat atau karboksilat. Beraneka ragam senyawa non ionik dapat dikromatografi dengan kromatografi adsorpsi. dikenal sebagai kromatografi fase balik. pH fase gerak. maka senyawa non-polar yang larut dalam hidrokarbon. seperti vitamin larut lemak dan antrakinon. Pada kromatografi partisi digunakan fase gerak dan fase diam dengan polaritas yang berbeda. dengan bobot molekul kurang dari 1000. Fase gerak yang non-polar dapat dimodifikasi dengan suatu pelarut yang lebih polar. dengan memilih fase diam dan fase gerak yang tepat. Fase diam pada kromatografi penukar ion umumnya resin organik sintetik dengan gugus aktif yang berbeda-beda. Sebaliknya pada resin penukar anion teredapat gugus aktif bermuatan positif yang akan zat-zat dengan gugus fosfat.Tiga bentuk kromatografi cair kinerja tinggi yang paling banyak digunakan : 1. Senyawa larut air yang ionik atau yang dapat terionisasi akan mengalami tarikan oleh resin. Pada resin penukar kation terdapat gugus aktif yang bermuatan negatif dan resin ini digunakan untuk pemisahan zat-zat bersifat basa. Jika fase gerak bersifat non polar dan fase diam polar. . Jika fase gerak bersifat polar dan fase diam non-polar. misalnya amina. dapat dipisahkan berdasarkan atas afinitasnya terhadap fase diam. yang bermuatan negatif. dan senyawa organik tertentu yang berfungsi untuk memodifikasi dapat mempengaruhi tertariknya zat terlarut. suhu. seperti golongan alkohol dan amina dapat dikromatografi. Kromatografi penukar ion terutama digunakan untuk pemisahan zat-zat larut dalam air yang ionik atau yang dapat terionisasi dengan bobot molekul kurang dari 1500. dan variabel-variabel tersebut dapat diatur agar diperoleh derajat pemisahan yang diinginkan. untuk mengurangi retensi dan mengubah pemisahan. maka zat yang bersifat polar. 3. jenis ion. Modifikasi pelarut fase gerak yang polar dengan pelarut yang kurang polar menyebabkan berkurangnya afinitas serta retensi senyawa pada kolom. 2.

Mengenalkan teknik High Performance Liquid Chromatography.2 TUJUAN Makalah ini disusun guna memenuhi tugas kelompok mata kuliah Kimia Dasar 2 oleh Bpk. Mengetahui prinsip dasar dari Kromatografi cair kinerja tinggi atau high performance liquid chromatography (HPLC). Adapun tujuan lain adalah sebagai berikut: 1. Hanafiah. termasuk operasional dasar instrumen dan mempelajari pengaruh pengaturan sejumlah parameter.FASE GERAK ZAT CAIR FASE DIAM ZAT PADAT ZAT CAIR Kromatografi cair-padat (KCKT) Kromatografi cair-cair (KCC) GAS Kromatografi gas-padat (KGP) Kromatografi gas-cair(KGC) KROMATOGRAFI KROMATOGRAFI GAS GAS-CAIR GAS-PADAT KROMATOGRAFI CAIR PERTUKARAN ION KROMATOGRAFI PARTISI EKSKLUSI PENYERAPAN CAIRPADAT KROMATOGRAFI KERTAS KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS 1. . 2.

diharapkan dapat : 1. Mengetahui proses Kromatografi cair kinerja tinggi atau high performance liquid chromatography (HPLC) secara kualitatif dan kuantitatif. 1. Mengetahui instrumenisasi dari Kromatografi cair kinerja tinggi atau high performance liquid chromatography (HPLC). 4.3 MANFAAT Dari makalah ini. . 2. Menambah pengetahuan bagi penulis dan pembaca mengenai metode analisis instrumen khususnya Kromatografi cair kinerja tinggi atau high performance liquid chromatography (HPLC) baik secara kualitatif maupun secara kuantitatif.3. Memudahkan mahasiswa dalam kegiatan analisis instrumen Kromatografi cair kinerja tinggi atau high performance liquid chromatography (HPLC).

dan protein-protein dalam cairan fisiologis. cairan ditekan terjadi gesekan maka digunakan pendingin dan tekanan tinggi (cairan ditekan menggunakan pompa kemudian didorong. KCKT paling sering digunakan untuk : menetapkan kadar senyawa-senyawa tertentu seperti asam-asam amino. jika ditarik cairan masuk). atau produk-produk degradasi dalam sediaan farmasi. dan High pressure (tekanan tinggi 76 bar biasanya memakai satuan kpa/kilo paskal). Tekanan harus 76 bar. Pada HPLC terdapat kolom terbuka yaitu : Low pressure (tekanan rendah). produk hasil samping proses sintesis.asam nukleat.BAB II PEMBAHASAN 2. menetukan kadar senyawa-senyawa aktif obat. .1 PENGERTIAN HPLC Kromatografi Cair Tenaga Tinggi (KCKT) atau biasa juga disebut dengan High Performance Liquid Chromatography (HPLC) merupakan metode yang tidak destruktif dan dapat digunakan baik untuk analisis kualitatif dan kuantitatif. Temperatur pada HPLC digunakan untuk menjaga temperatur dalam kolom konstan sehingga KD tetap. Pada HPLC terdapat oven untuk pemanas karena pada partikel kecil. asam. antara fase diam dan fase gerak terjadi gesekan sehingga temperatur meningkat maka harus diturunkan (dengan pendingin liebig/ ion exchange) karena ikatannya bisa lepas dan bisa juga terjadi bleeding.

Berdasarkan pada kedua pemisahan ini.2. HPLC juga dapat dikelompokkan berdasarkan pada sifat fase diam dan atau berdasarkan pada mekanisme sorpsi solut. Pemisahan kromatografi adsorbsi biasanya menggunakan fase normal dengan menggunakan fase diam silika gel dan alumina. Pada silika dan alumina terdapat gugus hidroksi yang akan berinteraksi dengan solut. meskipun demikian sekitar 90% kromatografi ini memakai silika sebagai fase diamnya. dengan jenis-jenis HPLC sebagai berikut: 1. sering kali HPLC dikelompokkan menjadi HPLC fase normal dan HPLC fase terbalik. Kromatografi Adsorbsi Prinsip kromatografi adsorpsi telah diketahui sebagaimana dalam kromatografi kolom dan kromatografi lapis tipis. Gugus silanol pada silika mempunyai .2 JENIS-JENIS HPLC Pemisahan dengan HPLC dapat dilakukan dengan fase normal (jika fase diamnya lebih polar dibanding dengan fase geraknya) atau fase terbalik (jika fase diamnya kurang non polar dibanding dengan fase geraknya). Selain klasifikasi di atas.

2. Sebagai fase gerak adalah campuran metanol atau asetonitril dengan air atau dengan larutan bufer. Kromatografi penukar ion dengan fase gerak air. Fase diam yang paling populer digunakan adalah oktadesilsilan (ODS atau C18) dan kebanyakan pemisahannya adalah fase terbalik. peranan pH sangat krusial karena kalau pH fase gerak tidak diatur maka solut akan mengalami ionisasi atau protonasi. Sejauh ini yang digunakan untuk memodifikasi silika adalah hidrokarbon-hidrokarbon non-polar seperti dengan oktadesilsilana. Dalam beberapa hal digunakan pelarut campuran misalnya air-alkohol dan juga pelarut organik. oktasilana.reaktifitas yang berbeda. Terbentuknya spesies yang terionisasi ini menyebabkan ikatannya dengan fase diam menjadi lebih lemah dibanding jika solut dalam bentuk spesies yang tidak terionisasi karenanya spesies yang mengalami ionisasi akan terelusi lebih cepat. Kenaikan kadar garam dalam fase gerak menurunkan retensi solut. meskipun demikian yang paling luas penggunaannya adalah polistiren resin. retensi puncak dipengaruhi oleh kadar garam total atau kekuatan ionik serta oleh pH fase gerak. Hal ini . atau dengan fenil. Ada banyak penukar ion yang beredar di pasaran. Kromatografi penukar ion KCKT penukar ion menggunakan fase diam yang dapat menukar kation atau anion dengan suatu fase gerak. Kromatografi fase terikat Kebanyakan fase diam kromatografi ini adalah silika yang dimodifikasi secara kimiawi atau fase terikat. Untuk solut yang bersifat asam lemah atau basa lemah. karenanya solut dapat terikat secara kuat sehingga dapat menyebabkan puncak yang berekor. Kebanyakan pemisahan kromatografi ion dilakukan dengan menggunakan media air karena sifat ionisasinya. 3.

disebabkan oleh penurunan kemampuan ion sampel bersaing dengan ion fase gerak untuk gugus penukar ion pada resin. Kromatografi Pasangan ion Kromatografi pasangan ion juga dapat digunakan untuk pemisahan sampel-sampel ionik dan mengatasi masalah-masalah yang melekat pada metode penukaran ion. pemisahan terjadi karena interaksi-interaksi biokimiawi yang sangat spesifik. akan terelusi terlebih dahulu. . 4. dalam pemisahan dengan eksklusi ukuran ini tidak terjadi interaksi kimia antara solut dan fase diam seperti tipe kromatografi yang lain. kemudian molekul-molekul yang ukuran medium. atau berdifusi lewat fase diam. Molekul solut yang mempunyai BM yang jauh lebih besar. Kromatografi Eksklusi Ukuran Kromatografi ini disebut juga dengan kromatografi permiasi gel dan dapat digunakan untuk memisahkan atau menganalisis senyawa dengan berat molekul > 2000 dalton. Dengan demikian. 5. dan terakhir adalah molekul yang jauh lebih kecil. Kromatografi Afinitas Dalam kasus ini. Hal ini disebabkan solut dengan BM yang besar tidak melewati porus. Sampel ionik ditutup dengan ion yang mempunyai muatan yang berlawanan. akan tetapi lewat diantara partikel fase diam. Fase diam yang digunakan dapat berupa silika atau polimer yang bersifat porus sehingga solut dapat melewati porus (lewat diantara partikel). Kromatografi jenis ini dapat digunakan untuk mengisolasi protein (enzim) dari campuran yang sangat kompleks. 6. Fase diam mengandung gugus-gugus molekul yang hanya dapat menyerap sampel jika ada kondisi-kondisi yang terkait dengan muatan dan sterik tertentu pada sampel yang sesuai (sebagaimana dalam interaksi antara antigen dan antibodi).

Applications of DHPLC DHPLC include the detection deteksi of single tunggal nucleotide (SNPs).2.vitamin yang larut dalam air.  Digunakan untuk menentukan berat molekul polimer dan masalah-masalah biokimia.  Asam-asam nukleat dapat dipisahkan dengan kolom penukar ion yang dikombinasikan dengan kolom butiran berlapis zat berpori. This procedure can separate doublestranded DNA molecules that differ by as little as one .  Dapat memisahkan vitamin.0 kilobyte) telah membuatnya menjadi metode yang disukai untuk berbagai aplikasi dalam bidang biologi molekuler. Aplikasi dalam ilmiah Perkembangan yang baru-baru ini HPLC telah menjadi pengembangan metode HPLC denaturing (DHPLC). Kecepatan analisis (sekitar 5 menit per sampel) dan ukuran fragmen DNA yang dapat dianalisis (hingga 2.The speed of analysis (approximately 5 minutes per sample) and the size of DNA fragment that can be analyzed (up to 2.  Zat.  Dapat digunakan untuk memurnikan dan mengidentifikasi suatu senyawa.0 kilobytes) has made it a preferred method for a variety of applications in the field of molecular biology. heroin dan semacamnya telah dapat dipisahkan dengan rezin ZipaxSAX. Prosedur ini dapat memisahkan molekul DNA untai-ganda yang berbeda sekecil satu pasangan basa . Aplikasi termasuk .zat dengan kepolaran berbeda yaitu antara sedikit polar sampai polar dapat dipisahkan dengan HPLC berdasarkan partisi cair-cair.3 BEBERAPA KEGUNAAN HPLC HPLC dengan prinsip kromatografi banyak digunakan pada industri farmasi dan pestisida.  Morfin.

konvulsi akibat keracunan. Mempunyai Indikasi untuk status epileptikus. antikonvulsan. These are single base-pair variations in DNA that can give valuable information on genetic variation within a population. ansietas atau insomnia. Diazepam termasuk obat antiansietas.dan juga dapat membantu untuk mengidentifikasi gen yang menyebabkan penyakit manusia tertentu. rumus kimiaC23H27N. Kemudian sampel yang sudah melalui proses preparasi selanjutnya diinjeksikan ke sistem HPLC. Prinsip cara uji diazepam ini adalah dengan mengekstraksi menggunakan pelarut atau campuran pelarut yang sesuai. .nukleotida polimorfisme (SNP). kejang demam. They can also help to identify the genes that cause certain human diseases. Dan aplikasi lain dari kromatrogarafi HPLC adalah dalam dunia farmasi digunakan untuk menganalisis. Senyawa ini berbentuk kristal agak kekuningan yang tidak larut dalam air. dan sedatif. Contoh analisis menggunakan kromatrografi HPLC:  Analisis Diazepam dalam darah Diazepam (Valium) merupakan Senyawa golongan psikotropika. Ini adalah satu dasar pasangan variasi dalam DNA yang dapat memberikan informasi berharga tentang variasi genetik dalam suatu populasi. dan sebagai obat penenang.

Sebaliknya. solute-solut yang kuat berinteraksi dengan fasa diam maka solute-solut tersebut akan keluar dari kolom lebih lama.2. Di dalam kolom terjadi pemisahan komponen-komponen ampuran. Setiap komponen campuran yang keluar kolom dideteksi oleh detector kemudian direkam dalam bentuk kromatogram. Solut-solut yang kurang kuat interaksinya dengan fasa diam akan keluar dari kolom lebih dulu.4 PRINSIP KERJA HPLC Dengan bantuan pompa fasa gerak air dialirkan melalui kolom ke detector. Cuplikan dimasukkan ke dalam aliran fasa gerak dengan cara penyuntikan. . Karena perbedaan kekuatan interaksi antara solut-solut terhadap fasa diam.

Oleh karena itu. Diagram skematik sistem kromatografi cair seperti ini : a. Zat air harus jernih sekali untuk menghindarkan penyumbatan pada kolom. pompa. Zat cair harus bertindak sebagai pelarut yang baik untuk cuplikan yang akan dianalisis. Fasa gerak Fasa gerak dalam HPLC adalah berupa zat cair dan disebut juga eluen atau pelarut. Persyaratan fasa gerak HPLC: 1. 3. kolom. 2.INSTRUMEN ALAT Instrumentasi HPLC pada dasarnya terdiri atas: wadah fase gerak. fasa gerak dapat berinteraksi dengan solut-solut. alat untuk memasukkan sampel (tempat injeksi). Selain berfungsi sebagai pembawa komponenkomponen campuran campuran menuju detector. Zat cair harus murni sekali untuk menghindarkan masuknya kotoran yang dapat mengganggu interpretasi kromatografi. dan suatu komputer atau integrator atau perekam. . wadah penampung buangan fase gerak. fasa gerak dalam HPLC merupakan salah satu faktor penentu keberhasilan proses pemisahan. detektor.

Menghasilkan tekanan sampai 600psi (point/in2) 2. Fasa gerak yang baik memberikan factor kapasitas k‟ p ada rentang yang sesuai. 5. tidak mudah terbakar. methanol. Fasa gerak yang digunakan seperti air. b) HPLC fasa terbalik: HPLC dengan kombinasi antara fasa diam nonpolar dan fasa gerak polar. a. Umumnya kekentalan tidak melebihi 0. Sedangkan fasa gerak yang digunakan adalah heksana atau ipropileter. Zat air tidak kental. murah. sebaiknya menggunakan fasa gerak yang memberikan k‟ antara 2-5. Jenis fasa gerak berdasarkan kepolaran fasa diam dan fasa gerak: a) HPLC fasa normal: HPLC dengan kombinasi antara fasa diam polar dan fasa gerak non-polar. atau asetinitril. atau trietilenaglikol yang dilapiskan pada partikel silica. Zat cair harus mudah diperoleh. Kecepatan alir berkisar antara 0. Fasa diam yang digunakan seperti silica. dan tidak beracun. Pompa Pompa dalam HPLC dapat dianalogkan dengan jantung pada manusia yang berfungsi untuk mengalirkan fasa gerak cair melalui kolom yang berisi serbuk halus. Untuk cuplikan dengan 2-3 komponen.1-10 ml/menit 4. Persyaratan pompa yang digunakan dalam HPLC: 1. Keluaran bebas pulsa 3. 6.4. alumina. Sesuai dengan detector. Bahan tahan korosi Tiga jenis pompa yang digunakan dalam HPLC: a) Pompa reciprocating .5 cP (centi Poise).

Piston berupa gelas dan berkontak langsung dengan pelarut. Ketika piston mundur maka bola gelas bawah terangkat dan pelarut masuk.Pompa ini terdiri dari ruangan kecil tempat pelarut yang dipompa dengan cara gerakan piston mundur-maju yang dijalankan oleh motor. Pompa ini juga menghasilkan aliran yang cenderung tidak bergantung pada tekanan balik kolom dan viskositas pelarut. . b) Pompa displacement Pompa ini menyerupai syringe (alat suntik) terdiri dari tabung yang dilengkapi pendorong yang digerakkan oleh motor. sebaliknya ketika piston maju maka bola bawah menutup saluran pelarut dan pelarut yang telah berada di ruang pompa didorong masuk ke dalam kolom.

Setelah menyambungkan kembali kolom maka pelarut dialirkan kembali. 3. . Pompa jenis ini murah dan bebas pulsa. akan tetapi keterulangan injeksi syringe ini sedikitb lebih baik dari 2-3% dan sering lebih jelek. sambungan pada ujung kolom dibuka dan cuplikan disuntikan langsung ke dalam ujung kolom. Akan tetapi mempunya keterbatasan kapasitas dan tekanan yang dihasilkan (<2000 psi) serta kecepatan alir bergantung pada viskositas pelarut dan takanan balik kolom. Injeksi syringe Syringe disuntikan melalui septum (seal karet) dan untuk ini dirancang syringe yang tahan tekanan sampai 1500 psi. Injeksi „stop-flow‟ Injeksi ini adalah jenis injeksi syringe kedua tapi di sini aliran pelarut dihentikan sementara. Untuk memasukkan cuplikan ke dalam aliran fasa gerak perlu dua langkah: a) Sejumlah volume cuplikan disuntikkan ke dalam loop dalam posisi “load”. b. Pemasukan cuplikan Beberapa teknik pemasukan cuplikan ke dalam system HPLC: 1. cuplikan masih berada dalam loop b) Kran diputar untuk mengubah posisi “load” menjadi posisi “injeksi” dan fasa gerak membawa cuplikan ke dalam kolom.c) Pompa pneumatic Dalam pompa ini pelarut didorong oleh gas bertekanan tinggi. 2. Kran cuplikan Jenis pemasukan uplikan ini disebut juga loop.

Kolom mikrobor mempunyai 3 keuntungan yang utama dibanding dengan kolom konvensional. . karenanya jenis kolom ini sangat bermanfaat jika jumlah sampel terbatas misal sampel klinis. yakni: a) Konsumsi fase gerak kolom mikrobor hanya 80% atau lebih kecil dibanding dengan kolom konvensional karena pada kolom mikrobor kecepatan alir fase gerak lebih lambat (10 -100 μl/menit). b) Adanya aliran fase gerak yang lebih lambat membuat kolom mikrobor lebih ideal jika digabung dengan spektrometer massa. c) Sensitivitas kolom mikrobor ditingkatkan karena solut lebih pekat. Kolom merupakan bagian HPLC yang mana terdapat fase diam untuk berlangsungnya proses pemisahan solut/analit.c. Kolom dan Fase diam Ada 2 jenis kolom pada HPLC yaitu kolom konvensional dan kolom mikrobor.

Permukaan silika adalah polar dan sedikit asam karena adanya residu gugus silanol (Si-OH). Silika yang tidak dimodifikasi akan memberikan waktu retensi yang bervariasi disebabkan karena adanya kandungan air yang digunakan. kolom mikrobor ini tidak setahan kolom konvensional dan kurang bermanfaat untuk analisis rutin. dalam prakteknya. sedang. maupun tinggi. silika yang tidak dimodifikasi.Meskipun demikian. Kebanyakan fase diam pada HPLC berupa silika yang dimodifikasi secara kimiawi. . Silika-silika aminopropil dan sianopropil (nitril) lebih cocok sebagai pengganti silika yang tidak dimodifikasi. Silika dapat dimodifikasi secara kimiawi dengan menggunakan reagen-reagen seperti klorosilan. Contoh Pembuatan fasa diam dengan reaksi antara silika dengan alkilklorosilana (reaksi silanisasi) : CH3 Si OH + Cl Si CH3 R Si O CH3 Si CH3 R + HCl Oktadesil silika (ODS atau C18) merupakan fase diam yang paling banyak digunakan karena mampu memisahkan senyawa-senyawa dengan kepolaran yang rendah. Oktil atau rantai alkil yang lebih pendek lagi lebih sesuai untuk solut yang polar. atau polimer-polimer stiren dan divinil benzen. Reagen-reagen ini akan bereaksi dengan gugus silanol dan menggantinya dengan gugus-gugus fungsional yang lain.

dan golongan detektor yang spesifik yang hanya akan mendeteksi analit secara spesifik dan selektif. detektor fluoresensi. c. stabil dalam pengopersiannya. tidak peka terhadap perubahan suhu dan kecepatan alir fase gerak. Detektor HPLC Detektor pada HPLC dikelompokkan menjadi 2 golongan yaitu: detektor universal (yang mampu mendeteksi zat secara umum. Idealnya. signal yang dihasilkan berbanding lurus dengan konsentrasi solut pada kisaran yang luas (kisaran dinamis linier). Karakteristik detector HPLC: Dasar Pendeteksian Jenis Maksimum Peka sensitifitas terhadap kecepatan alir Absorbsi UV Absorbsi IR Flourometri Indek bias Spesifik Spesifik Spesifik Umum 2 x 10-16 10-6 10-11 1 x 10-7 Tidak Tidak Tidak Tidak Rendah Rendah Rendah + 10-4 0 C Sensitivitas suhu . dan elektrokimia. yakni mampu mendeteksi solut pada kadar yang sangat kecil. suatu detektor harus mempunyai karakteristik sebagai berikut: a. mempunyai respon terhadap solut yang cepat dan reprodusibel. f. mempunyai sensitifitas yang tinggi. mempunyai sel volume yang kecil sehingga mampu meminimalkan pelebaran pita. d. b. seperti detektor UV-Vis. dan tidak bersifat selektif) seperti detektor indeks bias dan detektor spektrometri massa.a. e. tidak bersifat spesifik.

Oleh karena itu biasanya untuk sample jenis ini dilakukan tahapan preparasi sample yang lebih rumit agar sample yang siap diinjeksikan ke HPLC sudah cukup bersih dari impuritis.5% 0C Ya 2. Dalam kromatogram akan terdapat peak-peak yang menggambarkan banyaknya jenis komponen dalam sample. Parameter percobaan sama antara standar dan sampel 2. Sample farmasi biasanya jauh . Identifikasi dapat diandalkan apabila waktu retensi sampel dibandingkan dengan larutan standar. Hal ini akan menyulitkan dalam identifikasi dan perhitungan konsentrasi. Sample yang mengandung banyak komponen didalamnya akan mempunyai kromatogram dengan banyak peak. Hasil analisa HPLC diperoleh dalam bentuk signal kromatogram. Penentuan berdasarkan waktu retensi sampel dan standar yang sama 3. Bahkan tak jarang antar peak saling bertumpuk (overlap). HPLC digunakan untuk analisa kualitatif didasarkan pada waktu retensi untuk identifikasi.Konduktometri Spesifik Spektometri massa elektrokimia Spesifik Umum 10-8 10-10 10-12 Ya Tidak 2% 0C Tidak ada 1. Sedangkan beberapa hal yang harus diperhatikan agar HPLC dapat dipergunakan untuk penentuan secara kuantitatif adalah: 1.5 ANALISA KUALITATIF DAN KUANTITATIF Aplikasi analisis HPLC adalah untuk penentuan kualitatif dan penentuan kuantitatif. Penentuan kadar dilakukan berdasarkan hubungan (korelasi) dengan menggunakan larutan standar seri pada waktu retensi tertentu. Yaitu berdasarkan area kromatogram dan tinggi puncak kromatogram.

lebih mudah karena sedikit mengandung komponen selain zat aktif. Komputer dapat digunakan untuk mengontrol kerja system HPLC dan mengumpulkan serta mengolah data hasil pengukuran HPLC. konsep yang dipinjam dari teori distilasi. jumlah peak menyatakan jumlah kompone sedangkan luas peakmenyatakan konsentrasi komponen dalam campuran. jumlah teori plat dapat diformulasi sebagai: . Efisiensi kolom biasanya dinyatakan secara matematika dengan istilah plet teori. Penerapannya dalam kromatografi. Untuk peak-peak berbentuk simetri seperti terjadi pada kebanyakan peak-peak kromatografi gas. jumlah teori plat N. untuk kolom ditentukan dari lebar peak dan waktu retensi. Contoh hasil analisa HPLC Seperti pada kromatografi gas. Sample ini umumnya hanya melalui proses pelarutan saja.

menyatakan waktu retensi dan ⁄ menyatakan leher peak pada setengah tinggi. Akan tetapi untuk peak-peak yang tidak simetri disarankan menggunakan persamaan: Gambar grafik asimetri: .

adalah lebar peak pada ketinggian 10% atau A+B. dan B adalah lebar setengah peak sebelah kiri. adalah waktu retensi. selektivitas (α). Bila harga berarti senyawa 1 dan 2 keluar dari kolom bersama-sama. Derajat pemisahan (Rs) dalam kromatografi cair kinerja tinggi-pun dinyatakan dengan istilah resolusi yang di formulasi sebagai berikut: Berdasarkan persamaan di atas. . sebaliknya bila harga maka senyawa 1 keluar dari kolom lebih cepat dari pada senyawa 2. dan adalah masing-masing factor kapasitas senyawa 1 dan senyawa 2. semakin baik pemisahan. Harga selektivitas dapat sama dengan satu atau lebih besar dari satu. Dengan kata lain senyawa 1 tidak dapat dipisahkan dari senyawa 2. Berdasarkan gambar. A adalah lebar sebelah kanan. di sini selektivitas cukup dinyatakan sebagai: Dimana: α adalah selektivitas. Semakin besar harga . terlihat bahwa resolusi dipengaruhi oleh tiga factor yaitu efisiensi (N).Peak asimetri dengan parameter A dan B untuk menghitung haraga N. dan retensi (k‟). lebih sederhana dari kromatografi gas. Tujuan utama dari kromatografi cairan kinerja tinggi sama dengan kromatografi gas adalah mendapat pemisahan yang sempurna.

Nilai H menurun dengan: 1. Jarak diantara puncak maksimal menunjukkan selektivitas system. Meningkatkan panjang kolom. Ukuran partikel kolom yang kecil 2. Pemisahan pada temperature tinggi 5. Laju alir fase gerak yang rendah 3. Fase gerak yang kurang kental 4. Semakin lebar suatu peak kromatogram maka dapat dikatakan pemisahan semakin kurang efisien. Molekul-molekul sample yang kecil 6. Parameter efisiensi pemisahan dinyatakan dlam bentuk HETP (height equivalent to a theoretical plate) yang diformulasikan sebagai berikut: Dimana: H L N : HETP (height equivalent to a theoretical plate) : panjang kolom dalam centimeter : jumlah total theoretical plate Nilai H menunjukkan ukuran efisiensi yang diberikan kolom tiap unit panjang kolom. Nilai H yang kecil menyatakan kolom yang lebih efisien dan nilai N yang besar. Objek yang paling penting dalam KCKT adalah meminimalkan nilai H sehingga nilai N maksimum dan efisiensi kolom paling tinggi. Efisiensi dan selektivitas merupakan descriptor pelengkap yang tergantung pada . Lebar punak kromatografi menunjukkan efisiensi.Efisiensi Pemisahan: Tingkat efisiensi pemisahan dengan kromatografi tercermin pada pek-peak kromatogram yang dihasilkan.

laju alir.6 Kelebihan dan Kekurangan HPLC Kelebihan High Performance Liquid Chromatografi:  Isolasi zat yang tidak mudah menguap (non volatile)  Isolasi zat yang secara termal tidak stabil  Dapat diopersikan pada suhu kamar  Mampu memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran  Sudah digital sehingga penggunaannya cepat.parameter-parameter kromatografi yang berbeda-beda. mudah dan lebih praktis  Kecepatan analisis dan kepekaan yang tinggi  Dapat dihindari terjadinya dekomposisi / kerusakan bahan yang dianalisis  Resolusi yang baik  Dapat digunakan bermacam-macam detektor  Kolom dapat digunakan kembali  Mudah melakukan "sample recovery" Kekurangan High Performance Liquid Chromatografi:  Larutan harus dicari fase diamnya terlebih dulu  Hanya bisa digunakan untuk asam organic  Harus mengetahui kombinasi yang optimum antara pelarut. Efisiensi lebih tergantung pada kualitas packing kolom. ukuran partikel. dan gradien elusi . analit. 2. dan optimasi instrumental. sedangkan selektivitas lebih tergantung pada komponen fasa diam dan analit itu sendiri.

 Harganya mahal sehingga penggunaannya dalam lingkup penelitian yang terbatas .

Yang paling membedakan HPLC dengan kromatografi lainnya adalah pada HPLC digunakan tekanan tinggi untuk mendorong fasa gerak. deterktor. Alat yang berperan penting di dalamnya. alatnya terdiri dari kolom (sebagai fasa diam) dan larutan tertentu sebagai fasa geraknya. kolom. Kerja HPLC pada prinsipnya adalah pemisahan analit-analit berdasarkan kepolarannya. Sedangkan beberapa hal yang harus diperhatikan agar HPLC dapat dipergunakan untuk penentuan secara kuantitatif adalah: 1. Beberapa kegunaan HPLC yaitu HPLC dengan prinsip kromatografi banyak digunakan pada industri farmasi dan pestisida. dan fase gerak. . dan kecepatannya untuk sampai ke detektor (waktu retensinya) akan berbeda. antara lain yaitu pompa. KCKT (kolomnya) dibedakan menjadi: Kromatografi fase normal dan fase terbalik. Dilihat dari jenis fase diam dan fase gerak. Penentuan kadar dilakukan berdasarkan hubungan (korelasi) dengan menggunakan larutan standar seri pada waktu retensi tertentu. Parameter percobaan sama antara standar dan sampel 2. injektor. Yaitu berdasarkan area kromatogram dan tinggi puncak kromatogram. Campuran analit akan terpisah berdasarkan kepolarannya. hal ini akan teramati pada spektrum yang puncak-puncaknya terpisah. HPLC digunakan untuk analisa kualitatif didasarkan pada waktu retensi untuk identifikasi.BAB III KESIMPULAN Kromatografi Cair Tenaga Tinggi (KCKT) atau biasa juga disebut dengan High Performance Liquid Chromatography (HPLC) merupakan metode yang tidak destruktif dan dapat digunakan baik untuk analisis kualitatif dan kuantitatif. Identifikasi dapat diandalkan apabila waktu retensi sampel dibandingkan dengan larutan standar. Penentuan berdasarkan waktu retensi sampel dan standar yang sama 3.

Jika makalah ini begitu banyak kekurangan harap para pembaca makalah ini memakluminya. para pembaca dapat memberi masukan seperti kritik. seperti makalah ini yang banyak sekali kekurangan. Atas perhatiannya saya ucapkan terima kasih sebesar-besarnya bagi para pembaca. Juni 2013 Penulis ROBERTO . Apabila terlalu banyak kesalahan. Saya sadar bahwa makalah ini mempunyai kekurangan yang begitu banyak. Akhir kata saya ucapkan. karena tidak ada gading yang tak retak. Semoga makalah ini dapat menambah wawasan dan pengetahuan tentang High Performance Liquid Chromatography bagi para pembaca sekalian. Karena berkat para pembaca makalah ini menjadi bagus dan bermanfaat. dan lain sebagainya. saran.PENUTUP Saya ucapkan terima kasih sebesar-besarnya kepada para pembaca.Terima Kasih!! Jakarta. Makalah ini saya usahakan dibuat dengan baik karena waktu. saya harus lebih cepat membuat makalah ini.

Johnson. Bella. 2006. 1994. Semarang: IKIP Semarang Press. Hendayana. . Bandung: ITB Bandung. Roy J.Org | Situs Kimia Indonesia | HPLC (High Performance Liquid Chromatography) ~ Lansida Dasar Analisis Vitamin C dengan Metode HPLC | BLoG kiTa . Bandung: ITB Bandung.DAFTAR PUSTAKA Gritter. Medan: Fakultas Farmasi Universitas Sumatra Utara. Skripsi ‘Optimasi Fase Gerak Laju Alir pada Penetapan Kadar Campuran Guaifenesin dan Dextrometorfan HBr dalam Sirup dengan Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT). Edward L. Bandung: PT Remaja Rosdakarya Offset. dkk. 1991. Dasar Kromatografi Cair.2009. 1991. Sumar. Lisa. Pengantar Kromatografi Edisi Kedua. Kimia Pemisahan Metode Kromatografi dan Elektroforesis Modern. dkk. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (HPLC) | Chem-Is-Try. Kimia Analitik Instrumen Edisi Kesatu. dkk.