PERCOBAAN V

PEMERIKSAAN URINE ATAS INDIKASI BILIRUBIN

1. TUJUAN
Untuk menentukan adanya bilirubin dalam urine.

2. TINJAUAN PUSTAKA
Bilirubin adalah produk utama dari penguraian sel darah merah yang tua. Bilirubin disaring dari darah oleh hati, dan dikeluarkan pada cairan empedu. Sebagaimana hati menjadi semakin rusak, bilirubin total akan meningkat. Sebagian dari bilirubin total termetabolisme, dan bagian ini disebut sebagai bilirubin langsung. Bila bagian ini meningkat, penyebab biasanya di luar hati. Bila bilirubin langsung adalah rendah sementara bilirubin total tinggi, hal ini menunjukkan kerusakan pada hati atau pada saluran cairan empedu dalam hati. Bilirubin mengandung bahan pewarna, yang memberi warna pada kotoran. Bila tingkatnya sangat tinggi, kulit dan mata dapat menjadi kuning, yang mengakibatkan gejala ikterus.

Bilirubin (sebelumnya disebut sebagai hematoidin) adalah produk rincian kuning normal hemekatabolisme. Heme ditemukan dalam hemoglobin, komponen utama dari sel darah merah . Bilirubin diekskresikan dalam empedu dan urin , dan peningkatan kadar dapat mengindikasikan penyakit tertentu.Hal ini bertanggung jawab untuk warna kuning memar , warna kuning air seni (melalui produk pemecahan direduksi, urobilin), warna coklat dari kotoran (melalui konversi kepada stercobilin), dan perubahan warna kuning pada penyakit kuning.

Bilirubin (bahasa Inggris: bilirubin, hematoidin) adalah senyawa pigmen berwarna kuning yang merupakan produk katabolisme enzimatik biliverdin oleh

biliverdin reduktase. Oksidasi bilirubin menghasilkan biliverdin kembali, hingga memberikan atribut antioksidan pada senyawa ini dalam fisiologi selular, selain GSH. Bilirubin merupakan penghambat respon sel T CD4+, tingginya rasio serum bilirubin akan menginduksi apoptosis sel T CD4+ tersebut, sehingga bilirubin dianggap dapat menghentikan penyakit otoimun seperti sklerosis multipel.

Bilirubin Secara Kimia :


Bilirubin terdiri dari sebuah rantai terbuka dari empat pirol -seperti cincin (tetrapyrrole). Dalam heme , sebaliknya, keempat cincin yang terhubung ke sebuah cincin yang lebih besar, yang disebut porfirincincin.
 Bilirubin adalah sangat mirip dengan pigmen phycobilin digunakan oleh ganggang tertentu untuk menangkap energi cahaya, dan untuk pigmen fitokrom digunakan oleh tanaman untuk merasakan cahaya.Semua ini mengandung rantai terbuka empat cincin pyrrolic.
 Seperti ini pigmen lainnya, beberapa ganda obligasi di bilirubin isomerize ketika terkena cahaya. Ini digunakan dalam fototerapi dari bayi kuning:. E, Z-isomer bilirubin yang terbentuk setelah terpapar cahaya lebih larut daripada, Z unilluminated Z-isomer, sebagai kemungkinan ikatan hidrogen intramolekul akan dihapus Hal ini memungkinkan ekskresi bilirubin tak terkonjugasi dalam empedu.
 Beberapa buku teks dan artikel penelitian menunjukkan isomer geometris salah bilirubin. Para isomer alami adalah Z, Z-isomer.


Fungsi Bilirubin : 


Bilirubin dibuat oleh aktivitas reduktase biliverdin pada biliverdin , pigmen

empedu hijau tetrapyrrolic yang juga merupakan produk katabolisme heme. Bilirubin, ketika teroksidasi, beralih menjadi biliverdin sekali lagi. Siklus ini, selain demonstrasi aktivitas antioksidan ampuh bilirubin, telah menyebabkan hipotesis bahwa peran utama fisiologis bilirubin adalah sebagai antioksidan seluler. Pemeriksaan Bilirubin :


Pemeriksaan bilirubin dalam urin berdasarkan reaksi antara garam diazonium dengan bilirubin dalam suasana asam, yang menimbulkan warna biru atau ungu tua. Garam diazonium terdiri dari p-nitrobenzene diazonium dan p-toluene sulfonate, sedangkan asam yang dipakai adalah asam sulfo salisilat.
 Adanya bilirubin 0,05-1 mg/dl urin akan memberikan basil positif dan keadaan ini menunjukkan kelainan hati atau saluran empedu. Hasil positif palsu dapat terjadi bila dalam urin terdapat mefenamic acid, chlorpromazine dengan kadar yang tinggi sedangkan negatif palsu dapat terjadi bila urin mengandung metabolit pyridium atau serenium.

Metabolisme Bilirubin :

Eritrosit secara fisiologis dapat bertahan/ berumur sekitar 120 hari, eritrosit mengalami lisis 1-2×108 setiap jamnya pada seorang dewasa dengan berat badan 70 kg, dimana diperhitungkan hemoglobin yang turut lisis sekitar 6 gr per hari. Sel-sel eritrosit tua dikeluarkan dari sirkulasi dan dihancurkan oleh limpa. Apoprotein dari hemoglobin dihidrolisis menjadi komponen asam-asam aminonya.
 Katabolisme heme dari semua hemeprotein terjadi dalam fraksi mikrosom sel retikuloendotel oleh sistem enzym yang kompleks yaitu heme oksigenase yang merupakan enzym dari keluarga besar sitokrom P450. Langkah awal pemecahan gugus heme ialah pemutusan jembatan α metena membentuk biliverdin, suatu tetrapirol linier.


Besi mengalami beberapa kali reaksi reduksi dan oksidasi, reaksi-reaksi ini memerlukan oksigen dan NADPH. Pada akhir reaksi dibebaskan Fe3+ yang dapat digunakan kembali, karbon monoksida yang berasal dari atom karbon jembatan metena

dan biliverdin. Biliverdin, suatu pigmen berwarna hijau akan direduksi oleh biliverdin reduktase yang menggunakan NADPH sehingga rantai metenil menjadi rantai metilen antara cincin pirol III – IV dan membentuk pigmen berwarna kuning yaitu bilirubin. Perubahan warna pada memar merupakan petunjuk reaksi degradasi ini.

Dalam setiap 1 gr hemoglobin yang lisis akan membentuk 35 mg bilirubin. Pada orang dewasa dibentuk sekitar 250–350 mg bilirubin per hari, yang dapat berasal dari pemecahan hemoglobin, proses erytropoetik yang tidak efekif dan pemecahan hemprotein lainnya. Bilirubin dari jaringan retikuloendotel adalah bentuk yang sedikit larut dalam plasma dan air. Bilirubin ini akan diikat nonkovalen dan diangkut oleh albumin ke hepar. Dalam 100 ml plasma hanya lebih kurang 25 mg bilirubin yang dapat diikat kuat pada albumin. Bilirubin yang melebihi jumlah ini hanya terikat longgar hingga mudah lepas dan berdiffusi ke jaringan.
 Bilirubin I (indirek) bersifat lebih sukar larut dalam air dibandingkan dengan biliverdin. Pada reptil, amfibi dan unggas hasil akhir metabolisme heme ialah biliverdin dan bukan bilirubin seperti pada mamalia. Keuntungannya adalah ternyata bilirubin merupakan suatu anti oksidan yang sangat efektif, sedangkan biliverdin tidak. Efektivitas bilirubin yang terikat pada albumin kira-kira 1/10 kali dibandingkan asam askorbat dalam perlindungan terhadap peroksida yang larut dalam air. Lebih bermakna lagi, bilirubin merupakan anti oksidan yang kuat dalam membran, bersaing dengan vitamin E.


Di hati, bilirubin I (indirek) yang terikat pada albumin diambil pada permukaan sinusoid hepatosit oleh suatu protein pembawa yaitu ligandin. Sistem transport difasilitasi ini mempunyai kapasitas yang sangat besar tetapi penggambilan bilirubin akan tergantung pada kelancaran proses yang akan dilewati bilirubin berikutnya. Bilirubin nonpolar (I / indirek) akan menetap dalam sel jika tidak diubah menjadi bentuk larut (II / direk). Hepatosit akan mengubah bilirubin menjadi bentuk larut (II / direk) yang dapat diekskresikan dengan mudah ke dalam kandung empedu. Proses perubahan tersebut melibatkan asam glukoronat yang dikonjugasikan dengan bilirubin, dikatalisis oleh enzym bilirubin glukoronosiltransferase. Hati mengandung sedikitnya dua isoform enzym glukoronosiltransferase yang terdapat terutama pada retikulum endoplasma. Reaksi

konjugasi ini berlangsung dua tahap, memerlukan UDP asam glukoronat sebagai donor glukoronat. Tahap pertama akan membentuk bilirubin monoglukoronida sebagai senyawa antara yang kemudian dikonversi menjadi bilirubin diglukoronida yang larut pada tahap kedua. Eksresi bilirubin larut ke dalam saluran dan kandung empedu berlangsung dengan mekanisme transport aktif yang melawan gradien konsentrasi. Dalam keadaan fisiologis, seluruh bilirubin yang diekskresikan ke kandung empedu berada dalam bentuk terkonjugasi (bilirubin II). Masalah Klinis :
 Bilirubin Total, Direk
   Peningkatan Kadar : Ikterik obstruktif karena batu atau neoplasma,hepatitis , sirosis hati, mononucleosis infeksiosa, metastasis (kanker) hati, penyakit Wilson. Pengaruh Obat : Antibiotik (amfoterisin B, klindamisin, eritromisin, gentamisin, linkomisin, oksasilin, tetrasiklin), sulfonamide, obat antituberkulosis (asam paraaminosalisilat, isoniazid), alopurinol, diuretic (asetazolamid, asam etakrinat), mitramisin, dekstran, diazepam (valium), barbiturate, narkotik (kodein, morfin, meperidin),   flurazepam, indometasin, metotreksat, metildopa, papaverin, prokainamid, steroid, kontrasepsi oral, tolbutamid, vitamin A, C, K.
 Penurunan Kadar : Anemia defisiensi besi. Pengaruh Obat : Barbiturate, salisilat (aspirin), penisilin, kafein dalam dosis tinggi. Bilirubin Indirek
  Peningkatan Kadar : Eritroblastosis fetalis, anemia sel sabit, reaksi transfuse, malaria, anemia pernisiosa, septicemia, anemia hemolitik, talasemia, CHF, sirosis terdekompensasi, hepatitis.   Pengaruh Obat : Aspirin, rifampin, fenotiazin (lihat biliribin total, direk). Penurunan Kadar : Pengaruh obat (lihat bilirubin total, direk).

3. ALAT DAN BAHAN

A.

Alat :
Tabung reaksi Penjepit tabung reaksi Rak tabung reaksi Gelas ukur Beker glass Pipet tetes Pinset Corong Dipstick urine test strip

B.

Bahan :
Urine sewaktu BaCl2 Reagen Fauchet

4. PROSEDUR KERJA
1. PERCOBAAN HARRISON Prinsip : BaCl2 akan bereaksi dengan sulfat dalam urine membentuk endapan BaSO4 dan bilirubin menempel pada molekul ini. FeCl3 mengoksidasi bilirubin menjadi : - Bilivardin - Bilicyanin - Choletelin      5 ml urine dimasukkan dalam tabung reaksi Tambahkan 5 ml BaCl2 10 %, campur, kemudian saring dengan kertas saring Presipitat pada kertas saring dibiarkan sampai kering Tambahkan 1 tetets reagen Fauchet pada presipitat Hasil positif bila timbul warna hijau atau biru warna hijau warna biru warna kuning

2. PERCOBAAN HAWKINSON    Pada potongan kertas saring yang mengandung BaCl2 diteteskan urine beberapa tetes Biarkan selama 30 detik sampai 2 menit Hasil positif bila terbentuk warna hijau

3. PERCOBAAN BILIRUBIN DENGAN DIPSTICK URINE TEST STRIP   Masukkan dipstick ke dalam tabung reaksi, kemudian tambahkan beberapa tetes urine sampai membasahi seluruh permukaan dipstick tersebut. Tunggu hingga kira-kira 15 detik lalu lihat hasilnya dengan membandingkan warna yang timbul dengan standar warna yang tersedia pada kemasan dipstick.

5. HASIL DAN PEMBAHASAN
A. HASIL :

Tabel Hasil Pemeriksaan Urobilin Urine

KELOMPOK

PEMERIKSAAN PROTEIN DENGAN Asam Asetat Reagen Bang (-) (-) (-) (-) (-) Dipstick Strip (-) (-) (-) (-) (-)

1

(-) (-) (-) (-) (-)

2 3 4 5

Gambar. 1 dan 2

Keterangan : Gambar 1 = Hasil uji pemeriksaan protein dengan asam asetat & reagen bang Gambar 2 = Larutan standar pembanding yang dibuat

PERHITUNGAN PENGENCERAN LARUTAN STANDAR ALBUMIN

a) Pengenceran Larutan Standar Pembanding Albumin dalam 20 ml  Albumin yang ditimbang : 0,5 % = 0,5/100 x 20 ml = 0,1 g/ 20 ml

Pengenceran : 0,25 % = x . 0,5 % = 20 ml . 0,25 % x = 10 ml ad 20 ml

0,125 %

=

x . 0,25 % = 20 ml . 0,125 % x = 10 ml ad 20 ml

0,025 %

=

x . 0,125 % = 20 ml . 0,025 % x = 4 ml ad 20 ml

0,002 %

=

x . 0,025 % = 20 ml . 0,002 % x = 1,6 ml ad 20 ml

b) Pengenceran Larutan Standar Pembanding Albumin dalam 10 ml  Albumin yang ditimbang : 0,5 % = 0,5/100 x 10 ml = 0,05 g/ 10 ml

Pengenceran : 0,25 % = x . 0,5 % = 10 ml . 0,25 % x = 5 ml ad 10 ml

0,125 %

=

x . 0,25 % = 10 ml . 0,125 % x = 5 ml ad 10 ml

0,025 %

=

x . 0,125 % = 10 ml . 0,025 % x = 2 ml ad 10 ml

0,002 %

=

x . 0,025 % = 10 ml . 0,002 % x = 0,8 ml ad 10 ml

B. PEMBAHASAN :
Pada praktikum biokimia klinik kali ini, dilakukan percobaan pemeriksaan protein terhadap sampel urine. Dimana percobaan ini dapat dilakukan dengan tes urine menggunakan pemanasan dengan asam asetat dan dengan menggunakan reagen Bang. Prinsip dari kedua metode pemeriksaan ini adalah sama yaitu protein akan membentuk endapan/menggumpal bila dipanaskan dalam suasana asam. Oleh karena itu hasil pemeriksaan dilihat berdasarkan pengendapan protein yang terjadi dalam suasana asam, karena hasil pemeriksaan dinilai dari kekeruhan, maka urine harus jernih.

Percobaan yang dilakukan pertama kali yaitu adalah pemeriksaan sampel urine dengan pemanasan menggunakan asam asetat. Pada percobaan uji protein melalui pencampuran asam asetat pada urine bertujuan untuk mengetahui adanya kandungan protein yang terkandung pada urine. Dimana dilakukan dengan cara mengambil urine sebanyak 10 ml dan memasukkannya kedalam tabung reaksi yang bersih. Lalu panaskan urine hingga mendidih dengan menggunakan lampu spiritus selama 1-2 menit. Setelah mendidih, segera tambahkan sebanyak 3 tetes larutan Asam Asetat ke dalam tabung. Pengamatan terhadap urine dilakukan dengan melihat apakah terdapat endapan pada urine yang telah dipanaskan tadi dengan membandingkannya dengan larutan pembanding standar albumin yang telah dibuat sebelumnya.

Dari hasil percobaan diperoleh bahwa tidak terdapatnya endapan yang terlihat pada dasar tabung reaksi. Sehingga kadar protein dalam urine dinyatakan negative (-). Hal ini mengindikasikan bahwa urine masih dalam keadaan yang normal/sehat. Penetapan kadar protein dalam urine biasanya dinyatakan berdasarkan timbulnya kekeruhan / terdapatnya endapan pada urine. Karena padatnya atau kasarnya kekeruhan itu menjadi suatu ukuran untuk jumlah protein yang ada, maka menggunakan urine yang jernih menjadi syarat yang penting. Salah satu uji protein urine yang cukup peka adalah melalui pemanasan urine

dengan asam asetat. Pemberian asam asetat dilakukan untuk mencapai atau mendekati titik isoelektrik protein, sedangkan pemanasan dengan api langsung (dalam percobaan kali ini menggunakan lampu spiritus) bertujuan untuk untuk proses denaturasi pada urine agar terjadi presipitasi.

Kekeruhan yang ringan sangat sukar dilihat, maka harus digunakan tabung yang bersih dan bagus. Jika tabung telah tergores tidak dapat digunakan lagi. Sumber reaksi negatif palsu pada tes pemanasan dengan asam asetat adalah pemberian asam asetat berlebihan. Sumber reaksi positif palsu yaitu kekeruhan yang tidak disebabkan oleh globulin atau albumin, kemungkinannya: Nukleoprotein, kekeruhan terjadi pada saat pemberian asam asetat sebelum pemanasan. Mucin, kekeruhan juga terjadi pada saat pemebrian asam asetat sebelum pemanasan. Proteose, presipitat terjadi setelah campuran reaksi mendingin, kalau dipanasi menghilang lagi. Asam-asam renin, kekeruhan oleh zat ini larut dalam alcohol. Protein Bence Jones, protein ini larut dalam pada suhu didih urine, terlihat kekeruhan pada suhu kira-kira 60 derajat celcius.

Pada hasil pengujian kadar protein dalam urine dengan menggunakan reagen bang didapatkan hasil urine yang normal. Karena hasil yang didapatkan melihatkan bahwa kadar protein dalam urine adalah negative (-) setelah dibandingkan dengan larutan standar albumin yang telah dibuat. Sehingga dapat disimpulkan bahwa urine masih dalam keadaan yang normal dan pemilik urine masih memiliki fungsi ginjal yang sehat. Karena kadar protein dalam urinenya tidak ditemukan baik melalui pemeriksaan dengan pemanasan menggunakan asam asetat maupun dengan pemeriksaan menggunakan reagen bang.

Proses

metabolisme

protein

di

dalam

sistem

pencernaan

akan

menghasilkan asam amino yang kemudian ikut dalam peredaran darah. Di dalam

sel akan disintesa dan sebagai hasil akhir adalah asam urat. Asam urat merupakan suatu zat racun jika ada di dalam tubuh maka hepar akan dirombak sedikit demi sedikit menjadi urea dan dikeluarkan ginjal. Jika urine mengandung protein biasanya berupa asam amino. Keadaan yang demikian dapat menunjukkan adanya kelainan pada hepar dan ginjal. Fungsi ginjal adalah membuang sisa metabolisme yang tidak diperlukan oleh tubuh dan mengatur keseimbangan cairan serta elektrolit tubuh. Setiap saat, secara teratur, darah yang beredar di tubuh kita akan melewati ginjal untuk menjalani proses filtrasi di ginjal. Proses filtrasi tersebut akan menghasilkan urine yang membawa serta sisa metabolisme tubuh yang tidak diperlukan lagi. Sedangkan zat-zat yang berguna bagi tubuh, seperti protein, tidak terfiltrasi dan tidak akan keluar melalui urine.

Urine yang terdapat atau ditemukan suatu protein didalamnya disebut proteinuria. Proteinuria ini ditandai dengan adanya kekeruhan setelah diuji dengan suatu metode. Proteinuria ditentukan dengan berbagai cara yaitu: asam sulfosalisilat, pemanasan dengan asam asetat, carik celup (hanya sensitif terhadap albumin).
 Pada praktikum ini kita melakukan pemeriksaan dengan metode pemanasan urine dengan menggunakan asam asetat dan pemeriksaan kandungan protein dalam urine dengan reagen bang.
 Jika pada metode pemanasan dengan asam asetat dan pemeriksaan menggunakan reagen bang ini terbentuk suatu endapan protein, hal ini mungkin disebabkan oleh sifat asam atau adanya keterlibatan suasana asam dalam proses itu sendiri. Namun, jika hasil uji didapati negatif yaitu dengan melihat tidak adanya kekeruhan/endapan maupun gumpalan yang terbentuk pada campuran. Berarti fungsi renal masih bekerja dengan baik dan tidak ada indikasi dari suatu kelainan.

7. KESIMPULAN
Dari percobaan yang telah dilakukan, maka dapat disimpulkan beberapa hal sebagai berikut :    Urine merupakan hasil metabolisme tubuh yang dikeluarkan melalui ginjal yang kemudian akan diekskresikan dari dalam tubuh melalui proses urinasi. Ginjal yang sehat dan urine yang normal tidak terdapat kandungan protein di dalamnya. Urine yang terdapat atau ditemukan suatu protein didalamnya disebut proteinuria. Proteinuria ini ditandai dengan adanya kekeruhan setelah diuji dengan suatu metode.  Pada praktikum kali ini, dilakukan percobaan pemeriksaan protein terhadap sampel urine. Dimana percobaan ini dapat dilakukan dengan tes urine menggunakan pemanasan dengan asam asetat dan dengan menggunakan reagen Bang.   Prinsip dari kedua metode pemeriksaan ini adalah sama yaitu protein akan membentuk endapan/menggumpal bila dipanaskan dalam suasana asam. Pemberian asam asetat dilakukan untuk mencapai atau mendekati titik isoelektrik protein, sedangkan pemanasan dengan api langsung (dalam percobaan kali ini menggunakan lampu spiritus) bertujuan untuk untuk proses denaturasi pada urine agar terjadi presipitasi.  Hasil yang didapatkan melihatkan bahwa kadar protein dalam urine adalah negative (-) setelah dibandingkan dengan larutan standar albumin yang telah dibuat.  Dapat disimpulkan bahwa urine masih dalam keadaan yang normal dan pemilik urine masih memiliki fungsi ginjal yang sehat. Karena kadar protein dalam urinenya tidak ditemukan baik melalui pemeriksaan dengan pemanasan menggunakan asam asetat maupun dengan pemeriksaan menggunakan reagen bang.

DAFTAR PUSTAKA

Baron, D.N, 1990, Patologi Klinik, Ed IV, Terj. Andrianto P dan Gunakan J, Penerbit EGC, Jakarta. Gandasoebrata R. 2007. Penuntun Laboratorium Klinik. Jakarta: Dian Rakyat. Graff SL. 1983. A Handbook of Routine Urinalysis. JB Lippincott Co, Philadelphia. Guyton, A.C, 1983, Buku Teks Fisiologi Kedokteran, edisi V, bagian 2, terjemahan Adji Dharma et al.,E.G.C., Jakarta. Hardjoeno. 2004 . Substansi dan Cairan Tubuh. Lembaga Penerbitan Universitas Hasanuddin. Mc Pherson, A. R., & Sacher, A. R. (2004). Tinjauan Klinis Hasil Pemeriksaan Laboratorium. Jakarta: Panerbit Buku Kedokteran EGC. M.J. NEAL, (2007). Farmakologis Medis. Jakarta: Penerbit Erlangga.