BAB I PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang Protein adalah makromolekul yang paling melimpah di dalam sel hidup dan protein juga mempunyai berbagai peranan biologis karena protein merupakan instrumen molukuler yang menyampaikan informasi genetik. Protein adalah

sumber asam amino yang mengandung unsur-unsur C, H, O, dan N yang tidak dimiliki lemak atau karbohidrat. Sesuai dengan peranan itu, protein berasal dari kata Yunani proteios, yang artinya pertama. Apabila organisme sedang

kekurangan energi, maka protein ini dapat digunakan sebagi sumber energi. Kandungan energi protein rata-rata 4 kkal/g atau setara dengan kandungan energi karbohidrat. Asam amino adalah asam karboksilat yang mempunyai gugus amino, mempunyai rumus dasar R-CHNH2COOH dimana R adalah gugus rantai samping. Asam amino merupakan monomer pembentuk protein, mempunyai

peranan penting dalam metabolisme sel hidup. Adanya gugus rantai samping tersebut menyebabkan sifat berbeda antara asam-asam amino dan juga berbedanya sifat protein. Gugus amino asam amino dan gugus karboksil memperlihatkan semua reaksi yang dapat diharapkan dari fungsi ini, misalnya pembentukan garam, pengesteran, dan asilasi. Gugus rantai samping juga menghasilkan reaksi spesifik dengan pereaksi tertentu. Oleh karena itu, pada percobaan ini akan diuji reaksi spesifik asam amino dengan pereaksi ninhidrin, Hopkins-Cole, dan garam nitroprussida. Begitupun dengan protein akan diidentifikasi dengan reaksi biuret dan millon.

1.2 Maksud dan Tujuan Percobaan 1.2.1 Maksud Percobaan Maksud dari percobaan ini adalah untuk mempelajari dan memahami reaksi-reaksi spesifik dari asam amino dan protein.

1.2.2

Tujuan Percobaan Tujuan dari percobaan ini adalah :

1. Mengidentifikasi adanya gugus α-amino bebas pada asam amino dan protein melalui tes ninhidrin. 2. Mengidentifikasi adanya gugus sulfuhidril spesifik pada asam amino sistein dengan nitroprussida dalam amoniak. 3. Mengidentifikasi protein melalui tes biuret. 4. Mengidentifikasi adanya gugus indol spesifik pada asam amino triptofan melalui tes Hopkis-Cole. 5. Mengidentifikasi adanya gugus hidroksifenil spesifik pada asam amino tirosin melalui tes Millon

1.3 Prinsip Percobaan Mengidentifikasi asam amino dan protein dengan menggunakan beberapa pereaksi tertentu yang digunakan melalui beberapa tes yaitu tes ninhidrin, reaksi gugus rantai samping, tes Biuret, tes Hopkins-Cole dan tes Millon yang hasilnya ditandai dengan adanya perubahan warna dan endapan yang menunjukkan bahwa adanya reaksi uji positif pada asam amino dan protein.

BAB II TINJAUAN PUSTAKA

Asam amino adalah asam karboksilat yang mempunyai gugus amino. Asam amino yang terdapat sebagai komponen protein yang mempunyai gugus NH2 pada atom karbon α dari posisi gugus COOH ( Poedjiadi, 1994).

R

CH NH2

COOH

Pada umumnya asam amino larut dalam air dan tidak larut dalam pelarut organik non polar seperti eter, aseton, dan kloroform. Sifat asam amino ini

berbeda dengan asam karboksilat maupun dengan sifat amina. Asam karboksilat afilatik maupun aromatik yang terdiri dari beberapa atom karbon umumnya kurang larut dalam air tetapi larut dalam pelarut organik, demikian pula amina pada umumnya tidak larut dalam air, tetapi larut dalam pelarut organik. Asam amino mempunyai titk lebur yang lebih tinggi ( Poedjadi, 1994). Asam karboksilat dan gugus fungsi amina secara bersamaan berda dalam asam amino. Asam amino dengan satu gugus amino dan satu gugus karboksil. Gugus amino diprotonasi dan hadir sebagai ion amonium, sedangkan gugus karboksil kehilangan protonnya dan hadir sebagai anion karboksilat. Struktur dipolar ini konsisten dengan sifat asam amino yang seperti garam, yang memiliki titik leleh agak tinggi dan kelarutannya dalam pelarut organik relatif rendah. Asam amino bersifat amfoterik, artinya berperilaku sebagai asam dan mendonasikan proton pada basa kuat, atau dapat juga berperilaku sebagai basa dan menerima proton dari asam kuat. Ini dapat dinyatakan dalam kesetitimbangan untuk asam amino (Hart, dkk., 2003).

Atom α-karbon dari asam amino, terkecuali glisin, masing-masing dihubungkan pada empat gugus kimia yang berlainan yang merupakan karakteristik suatu atom karbon asimetris dan pusat khiral. Serta hubungannya didalam ruang dengan atom karbon asimetrik yang valensi-valensinya tersusun secara tetrahedral, isomer-isomer molekul tersebut dapat digambarkan dengan model tiga dimensi. Jika gugus R identik dalam tiap model dan di dalamnya tidak mengandung pusat-pusat asimetrik lainnya, maka kedua model tersebut saling merupakan baayangan cermin satu terhadap yang lain, dan masing-masing isomer optis aktif. Kedua isomer tersebut memutar bidang cahaya terpolarisasi dengan arah yang berbedah. Pasangan isomer semacam ini di sebut enantiomorf. Suatu senyawa yang memutar bidang cahaya, terpolarisasi searah jarum jam dikatakan memutar ke kanan, sebagai lawan senyawa yang memutar ke kiri, sayangnya sifat ini tidak mempunyai hubungan yang sederhana dengan pengaturan meruang gugus-gugus disekeliling pusat khiral (Ismadi, 1993). Ninhidrin adalah reagen berguna untuk mendeteksi asam amino dan menetapkan konsentasinya dalam larutan. Senyawa ini merupakan hidrat dari triketon siklik, dan bila bereaksi dengan asam amino, menghasilkan zat warna ungu. Hanya atom nitrogen dari zat warna ungu yang berasal dari asam amino, asam amino selebihnya terkonversi menjadi aldehida dan karbon dioksida.

Jadizat warna ungu yang sama dihasilkan dari semua asam amino α dengan gugus amino primer dan intensitas warnanya berbanding lurus dengan konsentrasi asam amino yang ada. Hanya prolina yang mempunyai gugus amino sekunder, bereaksi berbeda dan menghasilkan zat warna kuning tetapi itu pun dapat digunakan untuk analisis (Hart, dkk., 2003).

Asam aspartat dan asam glutamat memiliki dua gugus karboksil dan satu gugus amino. Dalam asam kuat ketiga gugus tersebut berada dalam bentuk asam. Jika pH dinaikkan dan larutan menjadi lebih basa, setiap gugus secara berturutturut melepaskan protonnya. Titik isoelektrik untuk asam aspartat yaitu pH saat asam amino ini terutama berada dalam bentuk dipolar netral adalah 2,87. Keadaan ini berbeda untuk asam amino dengan dua gugus basa dan hanya satu gugus karboksil (Hart, dkk., 2003). Analisis campuran asam amino yaitu mempunyai keistimewaan bersama semua asam amino adalah gugus amino dan gugus karboksil. Sedikit perbedaan sifat-sifat ionik gugus ini memungkinkan pemisahan asam-asam amino. Mesin-mesin yang serba otomatis, yang disebut penganalisis asam amino, menggunakan kromatografi pertukaran ion untuk melakukan pemisahan ini. Asam amino yang telah dipisahkan direaksikan dengan ninhidrin (Ismadi, 1993). Menurut klasifikasi asli yang modifikasi, protein dapat dibagi menjadi tiga golongan yaitu protein serat, protein bujur telur, protein gabungan. Protein serat adalah bentuk protein yang tidak larut yang ditemukan dalam kulit, rambut, jaringan pengikat dan tulang. Protein ini dapat dibagi lagi menjadi collagen yaitu protein pokok dari jaringan pengikat, tulang, gigi, dan tendon, dan keratin, protein pokok dari kulit, kuku, sayap dan rambut. Protein bujur telur bentuknya bujur telur dan umumnya larut dalam air. Protein ini dengan menggunakan klasifikasi yang lebih modern dan lebih mudah diklasifikasi menurut fungsinya. Cara klasifikasi lama protein bujur telur ini dapat dibagi menjadi beberapa sub bagian empat diantaranya adalah albumin dapat diidentifikasi karena larut didalam air dan larutan garam. Albumin yang khas terdapat dalam darah dan putih telur.

Protein gabungan adalah protein yang bergabung dalam senyawa bukan protein. Misalnya protein dalam hemoglobin bergabung dengan besi yang mengandung heme bukan protein ( Fessenden, 1997). Protein dalam bentuk asalnya mempunyai tiga, kadang-kadang empat tingkat struktur. Tingkat pertama disebut struktur primer yaitu urutan atau order dari asam amino dalam rantai protein. Struktur dengan tingkat yang lebih tinggi yang berhubungan dengan bentuk konformasi dari protein. Struktur sekunder adalah bentuk dari rantai protein yang panjang yang dijadikan satu oleh ikatan hidrogen antara proton dari amida dan gugus karbonil amida (Fessenden, 1997). Asam aspartat merupakan satu dari 20 asam amino penyusun protein. Asparagin merupakan asam amino analognya karena terbentuk melalui aminasi aspartat pada satu gugus hidroksilnya. Asam aspartat bersifat asam, dan dapat digolongkan sebagan asam karboksilat (Hidayat, 2011). Alanin (Ala) atau asam 2-aminopropanoat merupakan salah satu asam amino bukan esensial. Bentuk yang umum di alam adalah L-alanin (S-alanin) meskipun terdapat pula bentuk D-alanin (R-alanin) pada dinding sel bakteri dan sejumlah antibiotika. L-alanin merupakan asam amino proteinogenik yang paling banyak dipakai dalam protein setelah leusin. Gugus metil pada alanina sangat tidak reaktif sehingga jarang terlibat langsung dalam fungsi protein (enzim). Alanina dapat berperan dalam pengenalan substrat atau spesifisitas, khususnya dalam interaksi dengan atom nonreaktif seperti karbon. Dalam proses pembentukan glukosa dari protein (Hidayat, 2011). Sistein merupakan asam amino bukan esensial bagi manusia yang memiliki atom S, bersama-sama dengan metionin. Atom S ini terdapat pada gugus tiol (dikenal juga sebagai sulfhidril atau merkaptan). Karena memiliki atom S,

sistein menjadi sumber utama dalam sintesis senyawa-senyawa biologis lain yang mengandung belerang. Sisteina dan metionin pada protein juga berperan dalam menentukan konformasi protein karena adanya ikatan hidrogen pada gugus tiol (Hidayat, 2011).

BAB III METODE PERCOBAAN

3.1 Bahan Larutan glisin, larutan alanin, larutan asam aspartat, larutan ninhydrin 0,1%, larutan albumin, larutan glioksilik, larutan natrium nitoprussida 1%, kristal cysteina hydroklorida, NH4OH, akuades, NaOH 2,5 M, CuSO4 0,01 M, asam sulfat pekat, pereaksi millon, tissue roll, kertas label, spiritus dan karet.

3.2 Alat Tabung reaksi, pipet tetes, pipet skala 2 mL, rak tabung, lampu spiritus, sikat tabung, gegep, labu semprot dan sendok tanduk.

3.3 Prosedur Percobaan 3.3.1 Tes Ninhidrin Disiapkan 4 tabung reaksi yang kering dan bersih kemudian dimasukkan 3 mL albumin, glisin, alanin dan asam aspartat pada masing-masing tabung. Ditambahkan 0,5 mL larutan Ninhidrin 0,1% pada masing-masing tabung lalu dipanaskan hingga mendidih. Diamati perubahan warnanya. 3.3.2 Reaksi gugus rantai samping (gugus R) Beberapa kristal Cysteina hidroklorida dimasukkan ke dalam tabung reaksi, kemudian dilarutkan dengan 5 mL akuades. Lalu ditambahkan 0,5 mL Natrium nitroprussida 1% dan 0,5 mL NH4OH. Diamati perubahan yang terjadi.

3.3.3 Reaksi Biuret Disiapkan 4 tabung reaksi yang kering dan bersih kemudian dimasukkan 3 mL albumin, glisin, alanin dan asam aspartat ke dalam masing-masing tabung. Ditambahkan 1 mL NaOH 2,5 M ke dalam masing-masing tabung lalu dikocok dengan baik. Kemudian ditambahkan setetes CuSO4 0,01 M dan dikocok. Jika ada perubahan warna, ditambahkan lagi setetes atau lebih CuSO4.

3.3.4 Reaksi Hopkins-Cole Disiapkan 4 tabung reaksi yang kering dan bersih kemudian dimasukkan 2 mL larutan gliosilik pada masing-masing tabung. Ditambahkan 3 mL larutan albumin, glisin, alanin dan asam aspartat lalu dikocok. Kemudian ditambahkan lagi setetes demi setetes asam sulfat pekat. Diamati perubahan yang terjadi.

3.3.5 Reaksi Millon Disiapkan 4 tabung reaksi yang kering dan bersih kemudian dimasukkan 3 mL albumin, glisin, alanin dan asam aspartat pada masing-masing tabung. Ditambahkan 4 tetes pereaksi Millon pada masing-masing tabung lalu dipanaskan. Diamati perubahan yang terjadi. Kemudian ditambahkan pereaksi Millon yang berlebih lalu dipanaskan kembali dan diamati lagi perubahan yang terjadi.

4.1 Hasil 4.1.1 Tabel Pengamatan Tes Ninhidrin Larutan Protein dan Larutan Asam Amino Albumin Warna Dengan ninhidrin Setelah pemanasan Bening Biru pekat

No. 1.

2.

Alanin

Bening

Biru muda

3.

Glisin

Bening

Ungu

4.

Asam Aspartat

Bening

Bening

4.1.2 Tabel Pengamatan Tes gugus R dari asam amino sistein Warna Dengan natrium Dengan ammonium nitroprusida hidroksida Keruh Keruh agak kecoklatan

No.

Larutan contoh

1.

Kristal cystein hidroklorida

2.

Alanin

Keruh

Kuning

3.

Glisin

Keruh

Kuning

4.1.3 Tabel Pengamatan Tes Biuret Warna No. Larutan contoh NaOH 2,5 M CuSo4 0,01 M CuSO4 0,01 M berlebih Bening

1.

Asam Aspartat

Bening

Bening

2.

Albumin

Keruh

Keruh

Bening kekuningan Bening

3.

Glisin

Bening

Bening

4.

Alanin

Bening

Bening

Bening kebiruan

4.1.4 Tabel pengamatan Tes Hopkins-Cole Warna Dengan natrium Dengan ammonium nitroprusida hidroksida Bening 2 fase

No.

Larutan contoh

1.

Glisin

2.

Asam aspartat

Bening

2 fase

3.

Alanin

Bening

2 fase

4.

Albumin

Keruh

3 fase

4.3 Pembahasan 4.3.1 Tes Ninhidrin Pada tes ninhidrin, penambahan ninhidrin pada ketiga larutan asam amino tidak memberikan perubahan secara visual, sedangkan larutan protein dalam hal ini albumin menjadi bening keruh. Setelah pemanasan, larutan asam amino mengalami perubahan warna menjadi tidak berwarna kecuali glisin berubah warna menjadi kekuningan. Berdasarkan teori, tes ninhidrin akan memberikan warna yang sama pada semua asam amino α, kecuali prolin yang merupakan asam amino sekunder. Pada albumin sendiri yang merupakan polimer asam amino terbentuk larutan berwarna kuning. Sedangkan pada albumin yang merupakan polimer asam amino dengan tes ninhidrin memberikan warna putih keruh, setelah pemanasan warnanya berubah menjadi kecoklat-coklatan, warna yang terbentuk merupakan warna spesifik tes ninhidrin untuk protein albumin. Adapun hasil yang telah didapat menunjukkan bahwa pada larutan asam amino pada tes ninhidrin larutan akan berubah dari bening menjadi keruh. Kompleks yang terbentuk adalah

mengandung dua molekul ninhydrin yang bereaksi dengan amonia asam amino setelah asam amino dioksidasi. Hal ini menunjukkan bahwa asam amino glisin, alanin dan asam aspartat mengandung gugus α-amino bebas, dan ini tidak terjadi pada albumin karena pada molekul ini terjadi substitusi gugus α-amino

4.3.2 Tes gugus R dari Asam Amino Sistein Pada uji reaksi gugus samping digunakan beberapa kristal sistein hidroklorida yang dilarutkan dalam akuades, hal ini bertujuan untuk melarutkan kristal sisteina hidroklorida sehingga mudah bereaksi dengan natrium

nitroprussida dan NH4OH. Natrium nitroprussida berfungsi sebagai pemberi

kompleks warna sedangkan NH4OH berfungsi sebagai larutan basa untuk mempercepat terjadinya reaksi. Karena asam amino sistein mempunyai gugus –HS yang dapat bereaksi dengan nitroprussida dalam suasana basa yang akan menghasilkan warna merah. Hasil ini menunjukkan bahwa dalam asam amino sistein terdapat gugus sulfuhidril.

4.3.3 Tes Biuret Berdasarkan tabel di atas dapat dilihat dengan jelas perubahan yang terjadi pada larutan protein dan larutan asam amino. (albumin) terbentuk kompleks biru. Dimana pada larutan protein

Hal ini dikarenakan oleh terbentuknya

kompleks Cu2+ dengan gugus CO dan NH dari rantai peptida dalam suasana basa. NaOH disini berfungsi memberikan suasana basa pada larutan asam amino dan protein. Selanjutnya larutan tersebut dicampurkan dengan larutan CuSO4 dimana glisin, asam aspartat dan alanin tidak mengalami perubahan warna karena asam amino tidak memiliki ikatan polipeptida seperti yang dimiliki oleh protein sedangkan pada albumin jika direaksikan dengan CuSO4 maka akan menghasilkan larutan yang berwarna ungu. Hal ini terjadi karena protein memiliki ikatan polipeptida yang apabila bertemu dengan pereaksi biuret akan membentuk kompleks Cu dengan gugus CO dan gugus NH dari rantai polipeptida dalam suasana basa. Dari percobaan ini didapatkan bahwa albumin memberikan reaksi positif terhadap penambahan CuSO4. Penambahan CuSO4 berlebih

memperlihatkan perubahan intensitas warna semakin tua.

4.3.4 Tes Hopkins-Cole Dari tabel terlihat bahwa protein dalam hal ini albumin mengandung asam amino

triptofan yang mempunyai gugus indol spesifik, karena dapat direaksikan dengan pereaksi Hopkins-Cole yang mengandung asam glioksilat. Pereaksi ini dibuat dari asam oksalat dengan serbuk magnesium dalam air. Setelah dicampur dengan pereaksi Hopkins-Cole, asam sulfat ditambahkan sehingga membentuk lapisan di bawah larutan protein kemudian akan terjadi cincin ungu pada batas antara kedua lapisan tersebut. Namun lama kelamaan akan berubah warna menjadi kuning.

4.3.5 Tes Millon Berdasarkan tabel di atas, terlihat jelas bahwa setelah penambahan pereaksi Millon terbentuk endapan putih yang segera berubah warnanya menjadi merah saat dipanaskan. Bila ditambahkan reagen Millon berlebih dan dipanaskan lagi maka endapan merahnya akan tertarik ke permukaan (terjadi proses koagulasi) dan cairan di bawahnya menjadi bening. Adanya warna merah bata yang dihasilkan pada saat penambahan albumin dengan Millon menunjukkan reaksinya positif sebab pereaksi Millon dapat bereaksi dengan gugus fenol dari asam amino yang terdapat pada albumin. Albumin yang mengandung tirosin akan memberikan uji positif yang mengandung gugus fenol.

BAB V KESIMPULAN DAN SARAN

5. 1 Kesimpulan Dari hasil percobaan yang telah dilakukan, dapat ditarik kesimpulan yaitu: Pada tes ninhidrin, asam aspartat, alanin dan glisin memberikan hasil memberikan hasil positif yaitu dengan terbentuknya kompleks ungu dan pada albumin terbentuk warna coklat. Hal ini sesuai dengan teori bahawa semua asam amino dan protein memberikan hasil positif dengan reaksi ninhidrin. Pada reaksi gugus rantai samping (gugus R), asam amino sistein yang berbentuk kristal cysteina hidroklorida memberi hasil positif dengan

menghasilkan warna merah anggur yang menunjukkan bahwa asam amino tersebut mengandung gugus sulfhidril. Pada reaksi Biuret, albumin memberikan hasil positif dengan membentuk kompleks ungu yang menunjukkan adanya ikatan peptida. Sedangkan pada glisin, asam aspartat dan alanin memberikan hasil negatif karena tidak terdapat ikatan peptida. Pada reaksi Hopkins-Cole, albumin memberikan hasil positif karena terbentuk cincin flokulasi berwarna ungu. Ini disebabkan karena adanya asam amino dengan gugus indol spesifik yaitu triptofan yang terkandung dalam albumin sedangkan pada alanin, glisin, dan asam aspartat memang tidak memberikan hasil positif karena tidak mengandung asam amino triptofan. Pada reaksi Millon, albumin memberikan hasil positif dengan membentuk endapan putih yang berubah menjadi merah bata karena mengandung asam

amino tirosin sedangkan pada alanin, glisin, dan asam aspartat.

1.2 Saran 5.2.1 Untuk Percobaan Sebaiknya digunakan asam-asam amino yang lain agar dapat diketahui dengan baik reaksi-reaksi spesifik yang terjadi pada asam–asam amino dan protein tersebut sehingga hasilnya dapat dibandingkan dan wawasan praktikan bertambah.

1.2.2

Untuk Laboratorium Alat dan bahan masih ada yang kurang dan ruangan sudah bagus, dan

aman digunakan dalam pratikum.

DAFTAR PUSTAKA

Fressenden, J.R., dan Fressenden, S.J., 1997, Dasar-Dasar Kimia Organik, Binarupa Aksara, Jakarta. Hart, H., dkk., 2003, Kimia Organik, Erlangga, Jakarta. Hidayat, H.E., 2011, Asam Amino Penyusun Protein, (http://hernandi-asam amino.com), Diakses Pada Hari Jumat Tanggal 28 Februari 2014 Pukul 19.00 WITA. Ismadi, M., 1993, Biokimia, Gadja Mada Universiti Press, Jakarta. Poedjiadi, A., 1994, Dasar-dasar Biokimia, UI-Press, Jakarta

BAGAN KERJA

A. Tes Ninhidrin 3 mL albumin     Hasil Dimasukkan ke dalam tabung reaksi Ditambahkan 0,5 mL larutan Ninhidrin 0,1 % Dipanaskan hingga mendidih Diamati

Diulangi percobaan di atas dengan menggunakan asam amino alanin, glisin dan asam aspartat

B. Tes Gugus R dari Asam Amino Sistein
Kristal Cysteina HCl

     Hasil

Dimasukkan ke dalam tabung reaksi Dilarutkan dengan 5 mL akuades Ditambahkan 0,5 mL Natrium Nitroprussida 1 % Ditambahkan 0,5 mL NH4OH Diamati

C. Tes Biuret 3 mL albumin     Hasil Dimasukkan ke dalam tabung reaksi Ditambahkan 1 mL NaOH 2,5 M, dihomogenkan Ditambahkan setetes CuSO4 0,01 M, diamati Ditambahkan lagi CuSO4 berlebih, diamati

Diulangi percobaan di atas dengan menggunakan asam amino alanin, glisin dan asam aspartat

D. Tes Hopkins-Cole 2 mL albumin     Hasil Dimasukkan ke dalam tabung reaksi Ditambahkan 2 mL pereaksi Hopkins, dihomogenkan Ditambahkan 4 mL H2SO4 pekat Diamati

Diulangi percobaan di atas dengan menggunakan asam amino alanin, glisin dan asam aspartat

E. Tes Millon 5 mL albumin     Hasil Dimasukkan ke dalam tabung reaksi Ditambahkan 4 tetes pereaksi Millon, diamati Dipanaskan, ditambahkan pereaksi Millon berlebih Diamati