You are on page 1of 12

TEHNOLOGIA ADN RECOMBINANT

Descifrnd enigmele structurii genelor, savanii au nceput s se preocupe de izolarea i sinteza lor. n urm cu 30 de ani cei care credeau n reuita acestor deziderate erau puini i nimeni nu bnuia explozia actual a ingineriei genetice i consecinele cu adevrat extraordinare pe care le va avea. Primii pai au fost fcui de Beckwith i Shapiro, care n 1969 au izolat i fotografiat operonul lactozei. Un an mai trziu G. Khorana reuete sinteza artificial a primelor gene de procariote. Cu aceeai tehnic se sintetizeaz gena ce codific somatostatina un hormon hipofizar (1977). Dup descoperirea transcriptazei inverse se reuete sinteza altor gene de mamifere (pentru hemoglobin, ovalbumin, insulin etc.). Genele obinute nu erau ns active, deoarece nu aveau un sistem propriu de replicare, nici secvenele necesare declanrii transcripiei i apoi a sintezei proteinelor pe care le codific. Aceste dificulti au fost depite, introducnd genele artificiale n plasmidele unor bacterii sau virusuri. Pentru inseria genelor n plasmide se folosesc enzime speciale care taie ADN n locuri specifice enzime de restricie (Premiul Nobel, 1978). Realizrile ingineriei genetice au un mare interes teoretic i practic incontestabil. Izolarea sau sinteza genelor a dus la obinerea artificial a unor produi naturali de mare valoare (insulina, somatostatina, interferonul), dar speranele justificate pe care savanii i le pun n acest domeniu sunt mult mai mari. 183

Nu este vorba numai de o nou industrie farmaceutic care s produc antibiotice, hormoni, vaccinuri antivirale ci i de posibilitile reale de a realiza o terapie cauzal terapie genic, corectnd genele mutante sau nlocuindu-le i rezolvnd, astfel, marea problem a incurabilitii boli lor genetice. Actualmente exist toate posibilitile tehnice pentru studierea direct sau indirect a acizilor nucleici purttori ai mesajului ereditar. Gena de interes poate fi extras din organism, supus unor modificri structurale, introdus n alt organism, poate fi obinut produsul ei proteic. Toate procedeele manipulrii acizilor nucleici se reunesc n termenul genetic tehnica ADN recombinant. Pentru studiul acizilor nucleici sunt necesare urmtoarele procedee: - extragerea i purificarea moleculelor de ADN (sau ARN) din celule; - izolarea fragmentului de ADN de interes; - multiplicarea fragmentelor izolate; - analiza secvenelor de interes (determinarea succesiunii bazelor, determinarea expresiei, determinarea poziiei n genom).

Izolarea acizilor nucleici


Pentru analiza ADN poate fi utilizat orice celul nucleat, indiferent de esutul din care face parte (de ex., la om pot fi folosite celulele dintr -o pictur de snge, din saliv, fire de pr, esut epitelial, etc.). Pentru izolarea fragmentelor de ADN se utilizeaz metode biochimice care includ lizarea celulelor, denaturarea proteinelor, nlturarea proteinelor prin prelucrarea cu proteaze, centrifugarea difereniat, purificarea cu solveni organici. Pentru izolarea unei anumite moleculele de ARNm se utilizeaz celulele esuturilor n care are loc expresia genei 184

Fig. 11.1. Clivarea ADN cu enzime de restricie. Producerea fragmentelor cu capete adezive i neadezive

respective (de ex., ARNm pentru insulin poate fi izolat doar ale pancreasului; ARNm pentru globine din celulele eritroblatilor etc.).

Obinerea fragmentelor de interes


n ADN genomic secvenele codificatoare alterneaz cu cele necodificatoare. Pentru izolarea fragmentului ADN de interes pot fi aplicate dou ci: - direct, prin clivarea enzimatic a moleculelor de ADN genomic i selectarea fragmentelor de interes; - indirect, prin obinerea ADN complementar (ADNc) pe baza ARNm. Restricia ADN Clivarea enzimatic a moleculelor de ADN se efectueaz cu ajutorul unor enzime de restricie (ER) care recunosc secvene specifice dublucatenare, numite situsuri de restricie. 185

ER sunt enzime ntlnite la procariote care, n natur, sunt responsabile de clivarea ADN-ului exogen (de ex., ADN virual). SR reprezint nite succesiuni specifice formate, de regul, din 4-6-8 pb ce formeaz palindroame (fig. 11.1). Secvenele respective n ADN-ul gazdei sunt metilate i nu pot fi recunoscute de ER proprii. Ca rezultat al aciunii diferitor ER se pot obine fragmente de ADN cu capete monocatenare adezive (lipicioase) sau cu capete neadezive. ADN-ul din genomul eucariotelor (inclusiv genomul uman) conine diferite SR dispersate la ntmplare de-a lungul macromoleculei. Utiliznd ER pot fi obinute fragmente de ADN cu lungimi diferite. Comparnd fragmentele de restricie se poate construi harta de restricie a moleculei de ADN localizarea SR pentru diferite restrictaze. Sinteza ADNc Din esuturi se izoleaz setul de ARNm specific. Pe baza ARNm cu ajutorul reverstranscriptazei (ADN-polimeraza-ARN-dependent) se sintetizeaz molecule complementare de ADN (ADNc). ADNc se deosebete de ADN genomic prin lipsa intronilor i este identic cu secvena exonilor. Sinteza ADN complementar include mai multe etape (Fig. 11.2): (1) izolarea ARNm;

(2) adugarea secvenelor oligo(dT) care servesc n calitate de primer pentru polimerizare;

(3) enzima reverstranscriptaza sintetizeaz o caten complementar de ADN pe baza matriei de ARN; reverstranscriptaza formeaz o bucl la captul 3' al catenei ADNc.

Clonarea ADN
Procesul de obinere a unui numr mare de copii a secvenei ADN de interes cu utilizarea tehnicilor ADN recombinant poart denumirea de clonare. Procesul poate fi realizat att in vivo , ct i in vitro (PCR). 187

Clonarea ADN n vivo Clonarea ADN n vivo const n izolarea unui fragment de ADN, introducerea lui prin ligare ntr-un vector i multiplicarea lui ntr-o celul gazd. Vectorii de clonare sunt molecule de ADN care se replic independent de cromozomul celular, chiar i atunci cnd sunt introduse artificial n structura lor fragmente de ADN strin. Pentru replicare vectorul are nevoie de dou elemente: punctul ORI de iniiere a replicrii i gena pentru proteinele SSB care pregtesc matria pentru replicare. n calitate de vectori se utilizeaz plasmidele R, bacteriofagul , virusul simian SV-40, cosmidele, cromozomii artificiali bacterieni (BAC), cromozomii artificiali ai drojdiilor (YAC), etc. Selectarea vectorului de clonare se face n funcie de dimensiunile fragmentului multiplicat: fragmentele mici de pn la 15 kb pot fi clonate n plasmide, fragmentele cu o lungime de pn la 50 kb n cosmide i bacteriofagi, fragmentele mai mari de 300 kb pot fi clonate n cromozomii artificiali BAC sau YAC. n calitate de gazd de clonare sunt utilizate: celula bacterian (pentru plasmide, cosmide, bacteriofagi, BAC), celulele drojdiilor (pentru plasmide, YAC), celulele vegetale (plasmide, virusuri), celulele animale (virusuri). Exist vectori care se pot replica n mai multe gazde vectorii navet. Moleculele hibride formate din ADN vector i ADN pentru cercetare poart denumirea ADN recombinant. Obinerea ADN recombinant necesit urmtoarele procese (fig. 11.3): - izolarea ADN pentru clonare (o secven de ADN sau o gen) i selecia vectorului de clonare; - clivarea ADN de interes i a vectorului cu aceeai enzim de restricie ce produce capete adezive; - introducerea secvenei de ADN n vector prin ligarea fragmentelor rezultate din digestia cu ER cu ajutorul enzimei 188

Fig. 11.3. Clonarea fragmentelor de ADN n vectori plasmidici ADN-ligaza. ADN-ligaza unete complementar capetele adezive ale fragmentelor prin legturi fosfodiesterice. Moleculele recombinate se introduc n gazda de clonare. Dup un anumit timp, datorit replicrii independente a vectorului se obin copii numeroase ale genei de interes. Moleculele recombinate sunt izolate din celula-gazd purificate, dup care fragmentul de interes se extrage cu ajutorul aceleai ER. Clonele ADN obinute pot fi utilizate pentru determinarea structurii primare, cartarea restrictiv, producerea sondelor moleculare, analiza funciei genelor corespunztoare, sinteza proteinelor solicitate (de ex., insulina, somatotropina, interferonul etc.). 189

Amplificarea ADN in vitro Reacia de polimerizare n lan (PCR Polimerase Chain Reaction) reprezint tehnica de amplificare in vitro a secvenelor de ADN aplicnd fenomenul de hibridare ADN-ADN i proprietatea de replicare semiconservativ. Hibridarea se produce dup recunoaterea specific a unor fragmente nucleotidice de pe o caten a ADN-ului de interes, de ctre nite secvene scurte de ADN, numite primeri. Primerii iniiaz sinteza catenelor complementare de ADN care se realizeaz cu o ADN-polimeraz termorezistent (Taq-polimeraza). PCR decurge prin succesiunea ciclic a urmtoarelor etape (Fig. 11.4): 1. denaturarea ADN prin nclzire la o temperatur ~960C; 2. legarea primerilor la temperatura de renaturare ~500C; 3. elongarea fragmentelor complementare la temperatura 720C. Aceste etape se repet de 25-35 ori. Produsele din ciclul anterior servesc ca matrie pentru sinteza noilor catene (astfel n I ciclu dintr-o molecul de ADN de interes se obin 2 molecule, n ciclul II 4 molecule, n ciclul 3 8 molecule etc., dup 30 cicluri se obin peste 1 mlrd copii).

Biblioteci de ADN
Coleciile fragmentelor de ADN clonate dintr-o celul, esut sau organism formeaz biblioteci de ADN. Acestea sunt utile pentru identificarea genelor solicitate. Biblioteca genomic Colecia de clone ce conine cel puin o copie a fiecrei secvene de ADN al genomului se numete bibliotec

genomic. O bibliotec genomic este util pentru a gsi i izola o gen de interes prin screeningul cu sonde specifice. Bibliotecile genomice se obin prin dou tehnici: 1. ADN genomic este digerat complet cu o enzim de restricie, iar fragmentele rezultate sunt clonate fie printr-un vector derivat din bacteriofagul , fie ntr-un vector cosmidic. 2. O alt cale este digestia parial cu ER, care recunosc secvene de 4 pb. Prin digestie parial doar o parte din SR este tiat de ER. Biblioteci cromozomiale Dimensiunea genomului uman este att de mare, nct sunt necesare mii de clone pentru a reprezenta ntregul genom. De aceea sunt obinute biblioteci ADN pentru fiecare cromozom n parte biblioteci cromozomiale. Pentru om sunt necesare 24 de biblioteci diferite. Deci, dac o gen este localizat pe un cromozom cunoscut cu metode genetice, cercetarea va fi limitat la biblioteca acelui cromozom. Izolarea cromozomilor este posibil datorit dimensiunii i morfologiei diferite ale cromozomilor, care pot fi separai cu ajutorul citometriei n flux. Acum sunt disponibile biblioteci preparate din toi cromozomii umani. Biblioteci de ADNc Colecia de clone obinute pe baza ADN complementar se numete bibliotec ADNc. Fiind sintetizat pe matria moleculelor de ARNm, ADNc va corespunde numai genelor aflate n stare de activitate transcripional, reproducnd doar genele funcionale specifice celulei respective. ADNc este clonat n vectori plasmidici sau n vectori derivai din bacteriofagul . Spre deosebire de fragmentele obinute prin digestie cu ER, moleculele de ADNc nu posed capete adezive, 192

de aceea pentru introducerea n vector la moleculele de ADNc se adaug adaptori care conin capete adezive.

Hibridarea acizilor nucleici


O proprietate natural a acizilor nucleici este capacitatea de hibridizare. Hibridrile de acizi nucleici constau di unirea a dou fragmente monocatenare n structuri bicatenare stabile n condiii adecvate de temperatur, concentraie ionic i pH. Hibridarea este condiionat de complementaritatea secvenelor de baze azotate, componente ale celor dou catene. Din complementaritate rezult i omologia de mperechere. Tipuri de hibridare: 1. ADN ADN n care sonda este una dintre monocatenele de ADN; 2. ARN ADN unde sonda este reprezentat de una din cele dou catene ale heteroduplexului. Una din cele mai importante aplicaii ale fenomenului de hibridizare este obinerea sondelor moleculare. Sondele moleculare sunt fragmente de ADN sau ARN marcate sau nu (radioactiv), care prin fenomenul de hibridare pot recunoate n mod complementar fragmente de interes, pe o molecul de acid nucleic destinat cercetrii. Din punct de vedere aplicativ, sondele nucleare reprezint cile de acces direct la nivelul ADN, acestea putnd detecta unele gene mutante, chiar n stadiul prenatal. Tipuri de sonde moleculare: 1. sonde calde marcate radioactiv cu izotopi de 32P sau 35S care sunt foarte sensibile, dar au o durat scurt de via i sunt periculoase pentru cei ce le manipuleaz; se vizualizeaz prin autoradiografie (impresie pe filmul fotografic); 193

2. sondele reci fragmente de acid nucleic, marcate cu un produs chimic neutru: direct, cu enzime sau fluorocromi sau indirect, cu biotin. Se vizualizeaz n funcie de tipul de marcaj. Dei sunt mai puin sensibile, au avantajul de a fi inofensive pentru cercettor.